Manual de Practicas Laboratorio BQ

(1)

GUIA DE PRACTICA LABORATORIO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS MÉDICAS

SECCION BIOQUIMICA

PROMOCION LII

2015

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DOCENTES DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA MÉDICA

SECCION BIOQUIMICA MÉDICA

DR. JUAN MANUEL VALLADOLID ALZAMORA. (JMVA)

([email protected])

Prof. Principal Tiempo Completo.

COORDINADOR DE CURSO

Ms. JORGE PLASENCIA ALVAREZ. (JPA)

_{Prof. Auxiliar Tiempo Completo.}

Coordinador Adjunto del Curso.

Dra. MARIA ESTHER DAISY REYES BELTRAN. (MRB)

_{Prof. Principal Dedicación Exclusiva.}

Ms. WALTER OBESO TERRONES.(WOT)

([email protected])

Prof. Principal Tiempo Completo.

Jefe del departamento de Ciencias

Básicas Medicas.

Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA. (JHS)

_{Prof. Principal Tiempo Completo.}

Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO. (CAA)

_{Prof. Asociado Tiempo Completo.}

Ms. ANGEL ALFREDO LARIOS CANTO. (ALCA)

([email protected])

Prof. Auxiliar Tiempo Parcial.

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PRACTICA N° 01

DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS

I. INTRODUCCION:

Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos y álcalis fuertes, sales pesadas, pH ,etc.

Las enzimas se encuentran en muy pequeñas concentraciones en los materiales biológicos. Resulta un trabajo arduo y complicado individualizarlas o purificarlas. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares a la naturaleza proteica que las caracterizan , desde el punto de vista experimental se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos . De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo afectan los agentes físicos y químicos la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad.

Se busca asi poner en evidencia la naturaleza proteica de las enzimas y sus propiedades comunes al ser expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos que hacen variar su comportamiento y actividad catalítica.

II. REACTIVOS A UTILIZAR:

a. NaOH 1N b. Almidón soluble 1% c. Amilasa 1% d. Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6 e. CuSO4 20% f. Solución Iodada g. Acido Tricloroacético 20% h. NaCl 0.15 M i. HCl 3 N j. HCl 0.05 N

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Armar el siguiente sistema (A):

TUBOS

COMPONENTES (en ml) I II III IV V VI

Amilasa al 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 NaOH 1N - 2.4 - - - - HCl 3N - - 2.4 - - - Ácido Tricloroacético 20% - - - 2.4 - - CuSO4 al 20% - - - - 2.4 - Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 2.4 - - - - 2.4

a. Observar el aspecto y color producido e interpretar.

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b. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo 10 minutos a temperatura ambiente. c. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.

d. Durante este lapso construir el siguiente sistema (B):

TUBOS

Almidón al 1.0% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 NaCl 0.15 M 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 Agua Destilada 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

e. Preincubar por dos minutos a 37°C.

f. Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).

g. Dejar en incubación a 37°C. por 20 minutos. h. A continuación armar el siguiente sistema:

TUBOS

HCl 0.05N 5 5 5 5 5 5 De los tubos de reacción del

sistema (B), agregar:

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Solución yodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 i. Observe el color producido e interprete los resultados.

IV. CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el mecanismo de acción de las sales pesadas sobre la proteína (enzima)? 2. ¿Cómo actúan los ácidos y bases fuertes sobre la proteína (enzima)? Ejemplos 3. ¿Cómo actúa la temperatura sobre la estructura proteica de la enzima?

4. ¿Cómo repercute la modificación de la estructura proteica, producida por agentes físicos y químicos, sobre la actividad enzimática?

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PRACTICA N° 02

DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS

El punto isoeléctrico (PI) es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína. Cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores, iguales o mayores al PI, la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos, produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica A parte de otras propiedades que presentan las proteínas, cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI, algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan. Aprovechando este comportamiento, se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.

La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las proteínas y por tanto de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas, que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo.

II. REACTIVOS A UTILIZAR:

- NaOH al 10%. - Ácido acético 1N - Papel Indicador de pH

- Solución de caseína en Acetato de Sodio 0.1N

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9

TUBOS

REACTIVOS (en ml.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ácido Acético 1N 3.2 - - - - Agua Destilada 6.8 5 5 5 5 5 5 5 5

 Mezclar el tubo N° 1

 Extraer 5ml. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2. Mezclar

 Extraer 5ml. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3. Completando del mismo modo hasta completar la serie.

 En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla, se extrae 5 ml. de solución y se elimina .

 Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. de caseína en acetato de sodio 0.1N en cada tubo.

TUBOS

CONTENIDO ( ml.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Contenido Anterior 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Caseína 0.1N (sal) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0  Mezclar al instante por inversión .

 Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos.

 Anotar en el cuadro que se da a continuación

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TUBOS N°. EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Emplear los símbolos siguientes :

O = no cambia + = opalescencia, x = precipitado

 Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.

 Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson – Hasselbach.

 Verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de papel. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.

Ecuación de Henderson – Hasselbach

pK del Ácido Acético = 4.7

Ejemplo :

Si la concentración de la sal es de 1 ml. de acetato de sodio 0.1 N en todos los casos, la concentración de ácido acético varía. Así en el tubo N° 1 es de 1.6 ml. de ácido 1 N (16 ml. 0.1N). En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml. al 0.1 N. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4.0 ml. 0.1 N. Etc.

Cálculo de pH para el tubo N° 3 :

pH = pK + log. 1 = 4.7 – 0.6 = 4.1 TUBO N° 3 : pH = 4.1 4

NOTA : Traer calculados los pH al laboratorio IV. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es el punto isoeléctrico?.

2. ¿Conoce el punto isoeléctrico de la caseína?

3. ¿Qué importancia tiene el punto isoeléctrico de las proteínas y de las enzimas?

4. ¿Por qué razones precipita la proteína cuando el pH del medio es igual al pH Isoeléctrico de la proteína?

5. ¿El pH neutro del medio es igual al pH Isoeléctrico? De sus razones.

[ sal ] pH = pK + log.

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PRACTICA N° 03

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Los seres vivos obtienen y gastan la energía más rápidamente debido a la presencia de catalizadores biológicos llamados enzimas. Tal como ocurre con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin afectar el equilibrio final; y sólo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de sustrato.

Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que la acción catalítica de las enzimas es de carácter específico; o sea, cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, habría entonces tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes existen en un organismo vivo.

Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente.

En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) después de un tiempo

determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.

2. Verificando los productos liberados (PRODUCTOS FORMADOS) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.

El presente trabajo experimental tiene como finalidad determinar la actividad enzimática, utilizando a la enzima amilasa con capacidad de producir degradación del almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa como ejemplo de un sistema enzimático.

II. REACTIVOS A UTILIZAR:

- Solución de almidón pH 6.0 al 1%. - NaCl 0.1M

- Enzima al 1% (amilasa salival). - HCl 0.05N

- Solución yodada. - Reactivo Folin Wu:

a. Solución Cúprica alcalina. b. Solución fosfomolíbdica.

 Armar el siguiente sistema :

TUBOS

COMPONENTES I II

Solución de almidón 1% pH 6.0 5 ml. 5 ml. Solución de NaCl 0.1M 1 ml. 1 ml. Agua destilada 4 ml. 3 ml.

 Colocar los tubos en baño maria a 37°C por 5 minutos.

 Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.

 Volverlos a colocar en baño maria a 37°C durante 10 minutos.

A. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.

De cada uno de los tubos de incubación transferir 0.5 ml. a su correspondiente del cuadro siguiente, inmediatamente de cumplidos los 10 minutos.

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TUBOS

HCl 0.05 N 5 ml. 5 ml. De los tubos I y II: Etapa A 0.5 ml. 0.5 ml. Solución yodada 0.5 ml. 0.5 ml.

MEZCLAR: Observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color

resultante.

B. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin Wu) TUBOS

De los tubos I y II: etapa A 1ml. 1ml. Solución Cúprica alcalina 1ml. 1ml. Hervir 8 minutos

Enfriar

Solución fosfomolíbdica 1ml. 1ml. Agua destilada 2ml. 2ml.

Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante

IV CUESTIONARIO:

1. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? 2. Cómo se puede objetivar la presencia del sustrato residual?

3. ¿Cómo demostrar si se ha producido ó no reacción enzimática en un experimento realizado? 4. ¿Cómo se pueden objetivar los productos de una reacción enzimática?

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PRACTICA Nº 04

ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA

En la naturaleza existen sustancias cuya acción sobre una enzima dada se traduce en la disminución de su actividad. Estas sustancias son conocidas como inhibidores enzimáticos. No se considera en ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes, alcoholes y calor que producen notables alteraciones en la estructura especial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en dos grandes grupos reversibles e irreversibles, que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima, eliminamos por algún método, como podría ser la diálisis, el proceso de inhibición, y la enzima recupera su actividad original, se dice que el inhibidor es reversible. A la inversa, si la enzima continúa inhibida después de la reacción del exceso de inhibidor, se dice que el inhibidor es irreversible.

Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y la enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciales experimentalmente. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas, a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas.

En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora de revierte al aumentar la concentración de sustrato. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activo enzima-sustrato. De allí el nombre de competitivo, por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazar se mutuamente de la enzima.

La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio distinto al cual se une el sustrato. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor, pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor, que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo enzima-inhibidor. Desde el punto de vista cinético, el Km no varía, pero la Vm disminuye.

II. REACTIVOS A UTILIZAR

- Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2 - Succinato de sodio 0.1 M - Succinato de sodio 0.5 M - 2 – 6 Diclorofenolindofenol - Malonato de sodio 0.1 M - Cloruro de mercurio - Homogenizado hepático 10 %

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Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente.

Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color). Anotar y luego agregar a los tubos II, III, IV.

Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.

IV. CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo?

2. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo?

3. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible?

4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica – succinato, además del malonato utilizado en el presente experimento. 5. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva

reversible, sin considerar el cloruro de mercurio.

6. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica.

TUBOS COMPONENTES (ml) I II III IV V Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 2.0 1.8 1.3 1.3 1.0 Succinato de sodio 0.1 M - 0.2 0.2 0.2 - Succinato de sodio 0.5 M - - - - 0.5 Cloruro de mercurio 0.1 M - - - 0.5 - Malonato de sodio 0.1 M - - 0.5 - 0.5 2 – 6 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Homogenizado 10 % 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 COMPONENTES II III IV Succinato de sodio 0.5 M - 0.5 0.5 Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 0.5 - -

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PRACTICA N° 05

FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES

ENZIMÁTICAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS, PH, TIEMPO

TEMPERATURA, IONES INORGÁNICOS

En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reacción que catalizan, presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (tiempo,

temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, iones, etc,) sobre la serie infinita

de enzimas que se conoce. Este patrón general, como se comprenderá, varia en forma característica para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.

La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.

- Solución de almidón al 1 % - Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 - Buffer acetato 0.1M pH 4.6 - Buffer borato 0.1M pH 9.0 - Solución de NaCl al 2 % - Amilasa dializada al 0.25 % - HCl 0.05N

- Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) - Solución cúprico alcalina.

- Solución fosfomolíbdica.

Armar el siguiente sistema:

- Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37°C, por cinco minutos, para el equilibrio de la temperatura.

- El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0°C y 4°C durante cinco minutos.

TUBOS DE ENSAYO

COMPONENTES (en ml.) I II III IV V VI VII VII

Solución de almidón al 1 % 1.0 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Buffer acetato 0.1M pH 4.6 - - - 5.0 - - - - Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 5.0 5.0 5.0 - 5.0 - 5.0 5.0 Buffer borato 0.1M pH 9.0 - - - 5.0 - - Solución de NaCl al 2 % 1.4 - 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 Agua destilada 2.6 3.4 1.0 2.0 2.0 2.0 2.4 2.0

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- Agregar el preparado enzimático a los tubos: del II al VIII, según se indica y tomar el tiempo.

(Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) Mezclar y continuar la incubación.

Los controles de la actividad enzimática:

- Por el sustrato residual, se realizará en toda la serie de tubos, del I al VIII, a los 20 minutos de incubación.

- Por los productos formados, se realizará solamente en los tubos III y V, a los 20 minutos de incubación. De acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan.

 CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL

El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo, de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 0.5 ml. del incubado de su correspondiente tubo.

Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos; valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.

 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS

El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa) de la siguiente manera:

Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos. Armar el siguiente sistema :

COMPONENTES TUBOS

III V

Incubado correspondientemente a los tubos III y V 1.0 ml. 1.0 ml. Solución cúprico alcalina 1.0 ml. 1.0 ml.

Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y agregar:

COMPONENTES TUBOS

III V

Solución fosfomolíbdica 1.0 ml. 1.0 ml. Agua destilada 5.0 ml. 5.0 ml.

Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.

TUBOS DE ENSAYO

COMPONENTES (ml.) I II III IV V VI VII VIII

Preparado enzimático (ml) 0.0 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.2 0.6

TUBOS DE ENSAYO

COMPONENTES (ml.) I II III IV V VI VII VIII

Incubado correspondiente de cada uno de los tubos

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

HCl 0.05N 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Solución iodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

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CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL:

(cambio de color) A los 20 minutos:

CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color)

A los 20 minutos

1. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas?

2. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato?

3. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas?

4. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática?

5. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas?

6. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas?

I II III IV V VI VII VIII

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PRACTICA Nº 06

DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDO-REDUCCIÓN

I. INTRODUCCION:

Los carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. Estos sistemas están constituidos por proteínas, fosfolípidos, grupos prostéticos y átomos metálicos.

De acuerdo a su estructura y función, las enzimas que intervienen en estos procesos se encuentran clasificados en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. Las enzimas de óxido - reducción tienen una distribución característica intracelularmente, encontrándosele de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP. La finalidad del presente trabajo es objetivar la distribución intracelular de las enzimas de óxido - reducción usando los indicadores redox 2-6 diclorofenilindofenol y p-fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación diferencial mediante el método de Schreider y col.

- Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4 - 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 % - Succinato 0.1M

- p–fenilendiamina 1%

- Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0.25 M - Fracción nuclear del homogenizado.

- Fracción mitocondrial del homogenizado. - Fracción microsomal soluble del homogenizado. - KCl 0.154 M

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular

- Sacrificar una rata albina, inmediatamente hacer un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado; el cual se coloca en una placa petri y se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos

- Homogenizado al 10%: Pesar 10g. de hígado. Cortar en trozos pequeños ycolocar en el homogenizador potter, agregar solución KCl 0.154 M. Hacer presión manualmente con el émbolo, girando hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC.

- El homogenizado se centrifuga a 800 rpm. por 10 minutos en una centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.

- El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 rpm. por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fracción microsomal con el citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial.

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Mezclar.

Dejar en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.

Armar el siguiente sistema, usando p–fenilendiamina

Mezclar.

Dejar en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.

1. ¿Qué es el 2,6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria?

3. Grafique usted en una cadena de óxido–reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2,6 diclorofenolindofenol y p–fenilendiamina.

4. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial?

5. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido–reducción? 6. Haga un esquema de la centrifugación diferencial

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 2–6 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Succinato de sodio 0.1M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Fracción nuclear - 0.5 - - - Fracción mitocondrial - - 0.5 - - Fracción microsomal soluble - - - 0.5 - Homogenizado total - - - - 0.5 COMPONENTES 1 2 3 4 5 Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 p-fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Fracción nuclear - 0.5 - - - Fracción mitocondrial - - 0.5 - - Fracción microsomal soluble

- - - 0.5 - Homogenizado total - - - - 0.5

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PRACTICA Nº 07

DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS:

GLUCOSA PRE Y POST PRANDIAL

Históricamente, la glucosa fue una de las primeras sustancias determinadas en sangre y, probablemente, la que más métodos se han sugerido para su determinación en otros constituyentes. La glucosa en sangre, proviene de dos orígenes: de origen exógeno que proviene de los alimentos, y de origen endógeno, que proviene del hígado por glucogenólisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina, por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto.

En el caso del hígado, el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva, siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión, sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazón y el músculo esquelético.

El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de Na+. Este proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. En este caso la glucosa entra en la célula, posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el Na+. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvería a salir de la célula.

Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro.

El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque nos permite tener una idea general del mecanismo de homeostasis existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento.

El propósito de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y post prandial en personas normales y/o patológicas.

II. REACTIVOS A UTILIZAR

- Estándar : Solución de glucosa 1 g./l

- GOD/POD : Solución de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). - Reactivo 4- AF: Solución de 4 – aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. - Reactivo Fenol : Solución de Fenol 55 mmol/l.

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES :

OBTENCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE :

Se tomarán dos nuestras de sangre : La primera:

La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. La segunda:

Esta muestra se tomará después de una hora, como máximo, después de la ingesta alimenticia.

En esos momentos, se extraerán 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodérmica de 10 ml. y con aguja N° 20.

II UNIDAD

(17)

La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa.

Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco), S (Standard), Dpre. (Desconocido preprandial) y Dpost. (Desconocido post prandial).

COMPONENTES B S Dpre. Dpost. Standard --- 20 ul. --- ---- Muestra (Suero pre.) --- --- 20 ul. ---- Muestra (Suero post.) --- --- --- 20 ul. Reactivo de trabajo. 2 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml.

Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37º C

Leer en Espectrofotómetro a 505 nm. ó en fotocolorímetro con filtro verde (490–530 nm.) llevando el aparato a cero con el blanco.

Cálculo de los resultados :

Glucosa pre prandial (g/l) = Dpre.xf donde f = 1,00 g/l S

Glucosa post prandial (g/l) = Dpost. x f

A los tubos problema se les resta el blanco antes de multiplicar por el factor (f)

1. ¿Qué valores de glicemia espera encontrar en las muestras pre y post prandial? 2. ¿Qué variaciones fisiológicas de la glicemia puede señalar?

3. ¿Qué enzimas participan en la digestión de los carbohidratos? 4. ¿Cómo se realiza la absorción de los carbohidratos?

5. Cuáles son los valores normales de glicemia?

BI

OQ

UI

MI

CA

MÉ

DI

CA

(18)

PRACTICA Nº 08

REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA: EFECTO DE LA INSULINA

La glucosa sanguínea proviene de glucógeno hepático, aminoácido, otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino.

En condiciones normales, en ayunas, la glicemia es muy constante y tiene en el hombre un valor entre 80 a 120 mg por 100 ml de sangre (según el método de Folin- Wu). Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis, lipogénesis y otras semejantes.

Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea; cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro.

La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia), una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. La administración de insulina va seguida de hipoglicemia cuya magnitud depende de la dosis administrada; el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo, a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes.

La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, de manera que cada vez que se eleva la glicemia, se produce más insulina que tiende a aminorarla.

La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina.

- Conejos adultos de más de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. - Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml.

- Jeringas hipodérmicas de 2,5 cc. ó 5,0 cc. - Reactivo de glicemia enzimática (GOD-PAP)

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. EFECTO DE LA INSULINA SOBRE LA GLICEMIA

Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar.

Dosis de la solución de insulina cristalina (Lilly) (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal.

Utilizar una jeringa hipodérmica de 2,5 ml. ó 5,0 ml. que facilita la medida de la dosis.

EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINITRACION DE INSULINA.

 Extraer una primera muestra de sangre por punción cardíaca y transferirla a un tubo de ensayo de 13x100 mm. Servirá para establecer los valores basales de glicemia.

 Inyectar por vía subcutánea la cantidad calculada de insulina.

 Luego extraer muestras de sangre a los 15´, 30´ y 60 ´ minutos después de inyectada la insulina, lo que hace un total de tres muestras en una hora.

(19)

método de la glucosa oxidasa.

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON INSULINA.

Utilizar 5 tubos de ensayo: Bco. (Blanco), Basal (B), Prob 15 min., prob. 30, prob. 60 min. Armar el siguiente sistema:

COMPONENTES Bco Basal 15 min 30 min 60 min.

Muestra basal --- 20 ul. --- --- --- Muestra 15 min --- --- 20 ul --- --- Muestra 30 min --- --- --- 20 ul --- Muestra 60 min --- --- --- --- 20 ul. Reactivo de trabajo. 2 ml 2 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml.

Cálculo de los resultados:

Glucosa prob. (g/l) = abs prob x f

Anotar los resultados en relación al tiempo.

- Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo

1. Explique usted brevemente la regulación de la glicemia, como resultado, en términos generales, de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre.

2. Explique de manera suscinta el efecto de la insulina sobre la glicemia: con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.

3. ¿Cuál es el efecto metabólico de la insulina sobre el hígado y sobre los músculos y qué efectos produce sobre la glicemia?

(20)

REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA: EFECTO DE LA ADRENALINA

La glucosa sanguínea proviene directamente de diversas fuentes : glucógeno hepático, aminoácido, otros carbohidratos y de glucosa absorbida por los intestinos.

La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis, lipogénesis y otras semejantes.

El organismo dispone de mecanismos reguladores que de diferentes maneras aceleran o retardan la entrega o el retiro de glucosa desde o hacia los tejidos. Los mecanismos reguladores son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la utilización de la glucosa sanguínea; cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro.

La adrenalina, hormona secretada por la médula suprarrenal, tiene acción hiperglicemiante; ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado, además de actuar en el músculo, por la ausencia en este de la glucosa 6- fosfatasa, la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa.

La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, si aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado.

La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina.

V. REACTIVOS A UTILIZAR

- Conejos adultos de más de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. - Solución de adrenalina: 0.1 mg/ml.

- Jeringas hipodérmicas de 2,5 cc. ó 5,0 cc. - Reactivo de glicemia enzimática (GOD-PAP)

VI. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar.

Dosis de la solución de adrenalina (0,1 mg/ml) inyectar 0,025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0,25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis.

EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINITRACION DE ADRENALINA.

 Extraer una primera muestra de sangre por punción cardíaca y transferirla a un tubo de ensayo de 13x100 mm. Servirá para establecer los valores basales de glicemia.

 Inyectar por vía subcutánea la cantidad calculada de adrenalina.

 Luego extraer muestras de sangre a los 15´, 30´ y 60 ´ minutos después de inyectada la adrenalina, lo que hace un total de tres muestras en una hora.

 Centrifugar las muestras a 1500 rpm x 10 minutos; separar el suero.

 Con cada una de las citadas muestras de suero realizar la determinación de glucosa según el método de la glucosa oxidasa.

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON ADRENALINA.

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COMPONENTES Bco Basal 15 min 30 min 60 min.

Muestra basal --- 20 ul. --- --- --- Muestra 15 min --- --- 20 ul --- --- Muestra 30 min --- --- --- 20 ul --- Muestra 60 min --- --- --- --- 20 ul. Reactivo de trabajo. 2 ml 2 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml.

Cálculo de los resultados :

Glucosa prob. (g/l) = abs prob x f

Anotar los resultados en relación al tiempo.

- Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo

II.

CUESTIONARIO:

1. Explique usted brevemente la regulación de la glicemia, como resultado, en términos generales, de la tasa de llegada e índice de salida de glucosa de la sangre.

2. Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia; con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.

3. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y qué efecto produce sobre la glicemia?

(22)

PRACTICA Nº 09

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

La prueba de Tolerancia a la glucosa es un test que permite establecer la respuesta insulínica frente a un estímulo fisiológico por glucosa.

La rápida absorción de glucosa desencadena la liberación de insulina pre-formada en las células beta del páncreas, en cantidad suficiente para cubrir las necesidades se aumenta la captación de la glucosa por los tejidos especialmente por el hígado en donde se utiliza y almacena como glucógeno.

La ingesta de glucosa es seguida de un aumento transitorio en el nivel de la glicemia, debido a que la velocidad de absorción intestinal excede a la capacidad del hígado y los tejidos para su utilización. En sujeto normal, el nivel máximo de glucosa después de la absorción rara vez pasa de 150 mg/100 ml. El organismo vuelve a ajustar el nivel de la glicemia, a los valores del estado de ayuno con un período de una hora y media o dos horas y media de iniciada la prueba.

En condiciones normales de utilización de glucosa la elevación y reajuste de la glicemia se aparta del patrón normal teniendo estas variaciones valor diagnóstico y pronóstico.

A través de la prueba, la orina de personas aparentemente sanas se presenta siempre libre de glucosa. La desventaja de esta prueba es que incluye un factor que no guarda relación con la respuesta insulínica, la velocidad de absorción a partir del tubo digestivo.

La finalidad del trabajo experimental es establecer la capacidad del organismo para manejar una dosis fija de glucosa administrada por vía oral en condiciones estándar.

- Reactivos para glicemia por el Método Enzimático. - Solución de glucosa al 25 %

- Reactivos de Benedict.

III. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES : Procedimiento

- El paciente debe ser preparado para esta prueba, indicándole una dieta diaria que contenga 300 g. de Hidratos de carbono, durante los tres días anteriores de la prueba.

- En niños el período de ayuno varía: así, en niños menores de cuatro meses basta un ayuno de 4 horas, entre cuatro y ocho meses hacen falta 6 horas de ayuno y entre ocho meses y dos años , 8 horas.

- 0btener una muestra de sangre y por micción voluntaria recoger una muestra de orina del paciente en ayunas (Basales).

- Administrar por vía oral una solución de glucosa al 25% (75 gr. en 300 ml), si se desea, puede mejorarse el sabor de la solución con jugo de limón.

- Extraer muestras de sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos. - Colectar muestras de orina a los 60 y 120 minutos.

- Determinar la concentración de glucosa en cada una de las muestras de sangre obtenidas, conforme al método Enzimático.

- Determinar cualitativamente la presencia de glucosa en las muestras de orina con el reactivo cualitativo de Benedict.

- En un papel milimétrado graficar los resultados obtenidos de glicemia en cada muestra, contra el tiempo.

- Durante la prueba, el paciente debe permanecer en estado de reposo y no debe fumar. La prueba de tolerancia puede ser modificada por el ejercicio, fiebre, enfermedades agudas y estados post– traumáticos.

CIFRAS NORMALES

La tolerancia normal de la glucosa y sus posibles variaciones se muestran en el siguiente cuadro:

Determinación Basal IC. IIC. IIIC. Tiempo Ayunas 30 min. 1 hr. 2 hrs.

(23)

Glucosa en orina no hay no hay no hay no hay

OBSERVACION: En caso de realizar esta prueba en niños, se recomienda la administración de 1.75g por kilo de peso.

1. Describa y explique usted el comportamiento de la curva de tolerancia a la glucosa, a los 30, 60, 90 y 120 minutos.

2. ¿Qué efecto producirá en la curva de tolerancia a la glucosa, un estado de tirotoxicosis y en el Síndrome de mala absorción intestinal?

3. Si a los 30 min. en la prueba de tolerancia a la glucosa usted obtiene una glicemia de 185 mg % ¿Cómo explicaría este hecho? ¿Existiría o no glucosuria?

4. ¿Qué recomendaciones, sobre dieta y actividad física, indicaría usted a un paciente al que se le va a aplicar una prueba de tolerancia a la glucosa?

5. Diga cómo influye sobre la curva de tolerancia a la glucosa: algunos desórdenes endocrinos y algunas drogas farmacológicas. Diga así mismo cómo influye el embarazo. 6. ¿En que casos indicará al paciente realizar una Prueba de Tolerancia a la glucosa? 7. ¿Qué es el dintel renal a la glucosa?

8. Explique las relaciones que puede establecer entre los resultados de la curva de tolerancia a la glucosa y la determinación de glucosa en orina.

(24)

PRACTICA Nº 10

DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA Y SU

DIFERENCIACIÓN DE OTRAS SUSTANCIAS REDUCTORAS EN ORINA

En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. Sin embargo, es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0,5 y 1,5 g/l. Loa azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa.

La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales, y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina, pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal).

Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye, la glucosa en orina aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). Por el contrario, cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %.

En la orina, además de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar:

a) Otros azúcares reductores: lactosa, fructosa, galactosa y pentosas.

b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico, creatinina, ácido úrico, ácido glucurónico, ácido ascórbico.

c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato, cloral, formaldehído, etc.

Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina, pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico.

La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático), de uso generalizado en clínica. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno, por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucurónico más peróxido de hidrógeno. Este, en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua.

La glucosa oxidasa, en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona), el cual es hidratado a ácido glucónico. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2 ). El peróxido de hidrógeno

en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul.

La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict.

- Reactivo de Benedict.

- Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly).

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict.

1. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml.

2. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min.Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo.

3. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. 4. Agregar orina problema: 5 gotas.

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Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina.

Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Procedimiento:

1. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5- 10 ml.

2. 0bservar si a los 60 segundos, después de humedecida la cinta, adquiere o no color azul. 3. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa

aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa.

1. Diga usted qué resultados posibles se daría al tratar una muestra problema de orina, primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa.

2. ¿Qué presunciones plantearía usted si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo, y sin embargo al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa da negativo?

3. Explique usted por qué el reactivo de Benedict es inespecífico para determinar glucosa?

4. Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones en relación a la glicemia del paciente podría usted plantear?

5. Diga usted el fundamento del reactivo de Benedict y de la glucosa oxidasa.

6. Diga Usted en que casos obtendría resultados falsos negativos utilizando la prueba de la glucosa oxidasa?

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PRACTICA Nº 11

DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION

EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA

PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES

Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contracciones peristálticas. La principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas amfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática se incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que forma una superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea

La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares.

- Cloroformo

- Aceite vegetal, de olivo - Solución de sales biliares - Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 - Emulsificación de aceite vegetal

- Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) - NaOH 0.1N

III. PROCEDIMIENTO

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm.

COMPONENTES Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Aceite de olivo(gotas) 3 3 3 Agua destilada (ml) 5 3 - Cloroformo (ml) - - 2 Sales Biliares (ml) - 2 - Agitar enérgicamente los tubos

Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos

III UNIDAD

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Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 – 25 x 150 mm.

COMPONENTES (ml) TUBOS I II III IV

Emulsificación de aceite vegetal - 3 3 3 Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 2 2 2 2 Solución de sales biliares 1 % 2 2 - 2 Solución de extracto pancreático 1 % 2 - 2 2 Agua destilada 3 2 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación.

TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo

de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados.

Anotar los resultados para su interpretación.

1. Haga un esquema de la estructura de las sales biliares 2. Explique Ud. el mecanismo de acción de las sales biliares 3. Explique la acción de la lipasa y la colipasa

4. ¿Cuáles son los productos de la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos? 5. ¿Cuál sería el efecto de la falta de sales biliares?

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PRACTICA Nº 12

IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS

EN ORINA

La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado, a nivel mitocondrial, produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). Estos son el ácido acetoacético, el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético, incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la acetona también por la respiración.

Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas, y en sangre hasta 1mg/dl. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado, en 1a dieta pobre en carbohidratos.. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus, el hiperinsulinismo, en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis, en los vómitos, en el síndrome de Fanconi, en toda hipercatabolia como la fiebre, hipertiroidismo. En la Diabetes mellitus, el aumento de la lipólisis, de la beta oxidación y de la cetogénesis, al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica, la denominada cetoacidosis diabética. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre y/u orina.

II. REACTIVOS

- Sulfato de amonio, cristales.

- Nitroprusiato de sodio, solución al 10% en H2O

- Cloruro Férrico, solución al 5% en H2O.

INVESTIGACION DE ACETONA Prueba de Legal

El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos, especialmente de acetona, rinde un color azul violeta. Procedimiento:

COMPONENTES TUBO

Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio.

Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo,

sin mezclar) 1ml

_________________________________________________________________________ Prueba de Rothera

Es otra variante, se hace utilizando nitroprusiato en polvo, de la siguiente manera:

En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada excavación. Diluir la orina al 1/10, 1/20, 1/30, etc. Agregar una gota de cada una de las diluciones en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. Observa la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml.

Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso, para calcular la concentración en orina diluida, se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta.

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Uso de tira reactiva. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Esperar 20 segundos, leer en

escala colorimétrico, estimando la concentración como negativo, 5, 15, 50, 150 mg/dl.

INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO

Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. Se basa en que en presencia de cloruro férrico, el ácido

acetoacético rinde una coloración rojo burdeos. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada):

COMPONENTES TUBO

Orina filtrada 5 ml

Cloruro Férrico, solución 5% en agua gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético

1. Hacer un esquema de la síntesis y degradación de los cuerpos cetónicos 2. Importancia energética de los cuerpos cetónicos

3. Causas de aumento de los cuerpos cetónicos

4. Métodos para la determinación de los cuerpos cetónicos 5. Importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos

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PRACTICA Nº 14

DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO

El colesterol es un componente importante de las biomembranas, regulando su fluidez. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica, y el resto en la VLDL y HDL. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL.y son fuente de energía para los tejidos., su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol.de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica .El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol, el HDL, y el LDL. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl, limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). El HDL colesterol, 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40, normal a 40 a 59, alto o protector mayor o igual a 60. El LDL colesterol, 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl, En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl, limítrofe de 150 a 199, Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499, severa 500 o más

La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar, la hipercolesterolemia poligénica, la hiperlipidemia familiar combinada, la disbetalipoproteinemia. Entre las secundarias: La diabetes, el lipoteroidismo, el síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, cirrosis biliar.. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares, o secunadrias a otras enfermedades. Son hipertrigliceridemias primarias, la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia, l ahipertrigliceridemia familiar. Son causas secundarias: la diabetes, el hipotiroidismo, la gota, el alcoholismo, el uso de anticonceptivos orales, etc.. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL, obesidad central, resistencia a la insulina, hiperglicemia e hipertensión, en el denominado síndrome metabólico.

En la presente práctica, se realizará la determinación de colesterol sanguíneo, por el método enzimático y la determinación de HDL, previa precipitación de las otras lipoproteínas.

II. REACTIVOS:

- Reactivo enzimático para la determinación de colesterol. - Reactivo precipitante de HDL.

- Reactivo enzimático pára la determinación de triglicéridos

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO

Armar el siguiente sistema: utilizando tubos de 15 x 125 mm.

Componente Blanco Problema Estándar

Suero 10 ul

Estándar 200 mg/dl 10 ul Reactivo enzimático 1 ml 1 ml 1 ml Incubar a 37º por 10 min.

Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolorímetro.

Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar. Luego calcular el Factor (F):

200 mg/dl

F = --- Absorbancia del standar

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DETERMINACIÓN DE HDL-COLESTEROL (HUMAN)

En un tubo de prueba medir 0.50 ml de reactivo precipitante y agregar 0.25 ml de muestra de suero. Mezclar y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Usar el sobrenadante límpido como muestra de la siguiente forma:

Sobrenadante 100 ul Reactivo de trabajo 1 ml

Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C. Retirar del baño y enfriar. Leer en espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULOS:

HDL Colesterol (mg/dl) = Absorbancia Desconocido x 180

DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS

Componentes blanco problema Estándar

Suero 10ul

Estándar 10ul

Reactivo enzimático 1ml 1ml 1ml Incubar a 37º por 5 min.

Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolorímetro.

Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar. Luego calcular el Factor (F):

200 mg/dl

F = --- Absorbancia del standard

Problema (mg/dl) = F (Absorbancia de la muestra problema)

DETERMINACIÓN DEL LDL

Aplicar la fórmula de Friedwald:

LDL = Colesterol Total – ( HDL + TG/5 )

1. Señale la importancia del colesterol.

2. Señale los valores de referencia del Colesterol, HDL-Colesterol y LDL-Colesterol. 3. Causas de hipercolesterolemia.

4. Importancia del HDL como antiaterogénico. 5. Importancia de la LDL como aterogénico.

6. Haga un esquema de la estructura de los triglicéridos. 7. Causas de hipertrigliceridemia.