Expresión de ADN
recombinante
Biología Molecular - Licenciatura en Biotecnología
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - UNR Dra. María Gabriela Mediavilla
El ADN recombinante es una molécula de ADN formada por
recombinación de fragmentos de ADN de orígenes diferentes.
Para qué
•
Análisis de la función en la célula huésped, estudios de localización, etc.: no se requiere purificación.•
Estudios de la proteína in vitro, cristalografía, espectroscopía, producción de anticuerpos, etc.: producción a baja y mediana escala.•
Producción de la proteína a gran escala: por ejemplo para comercialización.Pasos a optimizar
•
Elección de la secuencia a clonar
•
Elección del vector apropiado y del huésped
apropiado
•
Cómo optimizar la expresión de la proteína de interés
•
Método correcto de extracción y clarificación
•
Esquema de purificación
Sistemas de expresión
Bacterias: Escherichia coli.
Simple, barato y veloz. Muchos vectores y cepas comerciales.Eucariotas
Levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis.
Células de insecto: Sf9, Sf21 (tejido de ovario de la pupa de
Spodoptera frugiperda) mediante baculovirus.
Modificaciones post-traduccionales más complejas, mejor plegado.
Células de mamíferos: mediante plásmidos, adenovirus,
retrovirus, etc. Cultivo con muchos requerimientos.
Plantas
Elección del sistema
Tamaño: las proteínas citoplasmáticas pequeñas (<100 aas.) y péptidos se expresan mejor en E. coli y como proteínas de fusión. Las >100 aas. son problemáticas en cualquier sistema. En E. coli suelen ser inestables y formar cuerpos de inclusión insolubles; en células de mamífero pueden surgir problemas para distinguirlas de su homóloga endógena.
Cantidad: Si se necesita mucha cantidad conviene explorar variascombinaciones vector/huésped/esquema de purificación.
Actividad: Si no es necesaria (ej. producción anticuerpos), entonces sirven los cuerpos de inclusión o los tags para purificación por afinidad. Actividad necesaria, es importante mantenerla o re-establecerla; la facilidad de la purificación se vuelve secundaria.
Estudios estructurales: Es mejor expresarla como proteína soluble (minimizar el mal plegamiento y la desnaturalización in vitro).https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/choice_expression_systems/comparison_expression_systems/index.html
Alta densidad
Cepa huésped (ejemplo)
BL21 (DE3) pLysS:
o
Defectiva en las proteasas lon y OmpT (membrana externa)
oSensible a rifampicina (se puede inhibir la ARNpol endógena)
oLisógeno λDE3: contiene secuencia de la ARNpol del
bacteriófago T7 (bajo control promotor lac)
o
Si tiene el plásmido pLys expresa la lisozima de T7 en niveles
bajos: se une a T7 ARNpol e impide la transcripción (ayuda a
la ruptura celular: específica para el peptidoglicano de la
membrana externa)
Expresión en E. Coli
Set 1: expresión en una cepa estándar (
BL21
(DE3)
) usando varios vectores con diferentes
“tags” y proteínas de fusión.
Tag: FLAG,octapéptido (DYKDDDDK)
Expresión en E. Coli
Set 2: expresión desde un vector estándar en un
número de distintas cepas de la bacteria.
La elección de la cepa depende de la naturaleza
heteróloga de la proteína:
• Si contiene muchos codones raros (cepas que co-expresan
tRNAs para ellos):
Expresión en E. Coli
1 colonia aislada
Cosecha: centrifugación a 6000 g
por 20 min. Conservar a -20ºC
https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/index.html
•Hasta 50 mL
•37ºC hasta DO600 = 0,4-1 •Antibiótico
Clarificación y purificación
•
Objetivos: preparación de la muestra para su ulterior purificación, remoción de material particulado y otros contaminantes (ADN, lípidos) no compatibles con cromatografía.______________________________________
•
Si es secretada al medio, generalmente es suficiente una centrifugación o filtración.•
En general, se deben extraer de la célula productora que debe lisarse lo que depende del tipo celular y la densidad del cultivo.Elección del tampón de pH para lisis
•
Estabilidad de la proteína con respecto al pH y el compuesto
buffer
•
Compatible con el proceso de purificación subsiguiente: no sería
recomendable un paso adicional de cambio de buffer.
•
Se usan en concentración 20-50 mM
Observaciones
(tampones)
•
La mayoría muestran dependencia de pH con la temperatura. Especialmente los que contienen TRIS. El pKa cambia de 8,06 a 25ºC a 8,85 a 0ºC.•
HEPES interfiere con el ensayo de Lowry para determinar concentración de proteínas (no con el de Bradford). Puede formar radicales bajo varias condiciones (no se debe usar cuando se estudian radicales). (tabla de interferencias en el apéndice)•
TRIS posee una amina potencialmente reactiva y participa en varias reacciones enzimáticas. Su pH es afectado, además de la T, por la concentración: decrece 0,1 unidades luego de una dilución de 10 veces.•
Los tampones fosfato son incompatibles con el uso de cationes divalentes (ej. iones Mg2+).Aditivos
•
Para mejorar la estabilidad de la proteína•
Para mantenerla en soluciónSÓLO USAR CUANDO
ES REALMENTE NECESARIO
Inhibidores de proteasas
• La disrupción de la célula lleva a la liberación de enzimas proteolíticas que pueden disminuir el rendimiento. Para controlar la proteólisis no deseada puede ser necesario agregar un “cocktail” de proteasas a la suspensión celular. Algunos de estos compuestos no son muy estables en solución acuosa por lo que es muy importante que sean agregados al tampón de lisis a partir de una solución madre en agua o un solvente orgánico (metanol, etanol, isopropanol o DMSO) inmediatamente antes de usar. Se pueden agregar al medio de cultivo.
AEBSF 0,1-1 mM E-64 5-40 µM 10mM DMSO aminopeptidasa B leucina aminopeptidasa Bestatin 40-400 µM 4 mM DMSO
Observaciones
(inhibidores de proteasas)
•
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) tiene una vidamedia corta en solución acuosa. La solución stock debe diluirse inmediatamente antes de usar. Pefablock es una alternativa menos tóxica y más soluble y estable.
•
El uso de EDTA y EGTA no es compatible con la presencia de iones Mg2+ (requeridos para la unión denucleótido) en el tampón o con la cromatografía de afinidad en columnas de Ni2+.
Tampón de lisis
•
A pesar de que es imposible dar una solución de lisis general un
buen tampón de partida sería:
Mammalian cells 1-10 mM AEBSF 0,8-8 μM Aprotinin 40-400 μM Bestatin 14-140 μM E-64 20-200 μM Leupeptin 15-150 μM Pepstatin A
Método descripción E. coli Levaduras Insectos
Sonicación Pulsos cortos: 5-10’’, con intervalos en hielo, 10-30’’ (calentamiento). Rotura ADN (no hace falta DNAsa).
1-6 L; <50 g células
Homoge_ neización
Con prensas: las células se presurizan y la presión es liberada de golpe (clásico French Press); mantener frío, evitar la formación de espuma.
Con homogeneizadores manuales (tipo Dounce) o eléctricos (ej. Ultra-Turrax)
Prensa: 2-3 pasadas, 6000-10000 psi. Prensa: >3 pasadas, 6000-10000 psi. Dounce: 10-20 golpes, (0,1% Tritón X-100 o NP-40). >25 mL se usa uno eléctrico. Congelar y moller
con N2líquido y mortero. El polvo se puede guardar indefinidamente a -80ºC y se reconstituye con 5 vol. de buffer.
sí sí
Enzimas líticas de pared
digestión de la pared (se requiere
permeabilizar la membrana externa: TRIS, EDTA). Se debe usar DNAsa. Para
grandes volúmenes resulta costoso.
Lisozima: Tris (permeabiliza ME) y EDTA. Combinado con sonicación Zimolasa/ liticasa: produce esferoblastos. No tienen pared celular
Autólisis Se mezcla con tolueno (o compuestos como el hidróxido de amonio) a T.A. por 24-48 hs. Evita crecimiento bacteriano, permeabiliza membrana con liberación de hidrolasas. El más antiguo. No recomendable, libera mucha proteasas. Vortexeado + cuentas de vidrio
0,4-0,5 mm. Varios ciclos de 30-60 seg (enfriando en hielo). Ruptura del 50-95 %. 15 mL (se escala con aparato especial).
Remoción del ADN
•
Digestión enzimática por adición de DNAsa I (1
µg/ml) al lisado celular. En hielo, 10-15 min.
•
Tratamiento para precipitación con polietilenimina
(0,1% (p/v)) or sulfato de protamina (1% (p/v))
seguido de centrifugación. Agregar al lisado e incubar
30 min a 4°C.
Cuantificación
Métodos espectrofotométricos: tres categorías
1.
Unión de colorante:•
Bradford: une Coomassie (G-250) en medio acídico, que sufre un corrimiento en su espectro deabsorbancia (de marrón, máx. 465 nm, a azul, máx. 605 nm); se lee a 595 nm y es proporcional a la concentración de proteínas. Phe, Pro, Arg y Trp.
•
NanoOrange: muy sensible, fluorescente.2.
Ion cobre en medio alcalino:•
Biuret: los Cu2+ son quelados por la unión peptídica y se reducen a Cu+ dando color lila (545 nm). Reaccióndependiente de temperatura.
BIURET
Cuantificación
• Lowry: ulterior detección del Cu+ con reactivo de Folin
-Ciocalteu (ácido fosfomolíbdico/fosfotungsténico), color azul, 650-750 nm. Grupos fenólicos: tirosina y triptófano.
• BCA: ulterior detección con ácido bicinconínico. C/ Cu+-BCA
3. Abs 280 (Nanodrop)
• Amino ácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano)
LOWRY
Cuantificación
•
Curva de calibración siempre (BSA).
•
Bradford (5’ TA) NanoOrange (5’ a 95°C), Nanodrop rápidos.
Los demás requieren incubación en baño a 37°C (generalmente
30’).
•
Estabilidad del color y lectura de todas las muestras en un
rango de tiempo.
Otro sitio para obtener información
http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/Comparision_of_Methods.htm
Electroforesis de proteínas
•
Objetivo: separación de proteínas en base a su PM y carga.•
Método analítico. Aunque se puede eluir del gel una proteína separada y obtenerla en solución.•
Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), electroforesis en gel de poliacrilamida. Técnica ampliamente utilizada para separar macromoléculas (proteínas y ácidos nucleicos) de acuerdo a su movilidad electroforética. Esta movilidad es función de su longitud, conformación y carga.Electroforesis de proteínas
• Muestras: cualquier material conteniendo proteínas (o ác. nucleicos) tanto de origen biológico (fracciones sub-celulares, células, tejidos procariotas o eucariotas, virus, muestras ambientales, proteínas purificadas) como sintético.
• Puede ser tratada con un agente desnaturalizante (SDS) o analizadas en su forma
nativa (muchas veces seguido de tinción enzimática).
• SDS: sodium dodecyl sulfate; detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras secundarias y terciarias no unidas por puentes disulfuro. Se une proporcionalmente a la masa de la proteína confiriéndole una carga neta negativa según su peso molecular y otorgándole una forma de habano por lo que la relación carga/masa es igual para todas las proteínas en la mezcla y por lo tanto migran según su PM.
• Se suele calendar a temperatura cercana a la ebullición en presencia de un agente reductor (ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/β-ME)), para reducir los puentes disulfuro presentes en algunas estructuras terciarias y cuaternarias (separando subunidades de oligómeros): reducing SDS-PAGE.
Electroforesis de proteínas
Electroforesis de proteínas
(funciones de los componentes)
‣ diversos porcentajes de acrialmida para diferentes rangos de tamaños de proteínas
‣ pH 8,8: los iones Cl-y glicina corren por
delante de las proteínas.
gel separación gel concentración
‣ bajo porcentajes de acrialmida
‣ pH 6,8: los iones glicina y Cl-corren
casi a la misma velocidad por detrás y por delante de las proteínas,
respectivamente, comprimiendo la zona.
200 V ~35’ 20 mA 1 h
Western blot
PVDF o NC
Electrotransferencia húmeda
Código de color negro/rojo
Electrotransferencia semi-seca EVITAR BURBUJAS!!! Video en https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html • cátodo (-) • papel filtro • PAGE • membrana • papel filtro • ánodo (+) 15V 30’ 30V ON o 100V 1h
