Superior de Ensenada, Baja California
Maestría en Ciencias
en Acuicultura
Efecto de dos temperaturas en el desarrollo larval de la
langosta roja
Panulirus interruptus
Tesis
para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
Maestro
en Ciencias
Presenta:
Benito Arturo Niebla López
Benito Arturo Niebla López
y aprobada por el siguiente Comité
Dr. Eugenio Díaz Iglesias
Dr. Benjamín Barón Sevilla
Codirector de tesis
Codirector de tesis
Dra. Beatriz Cordero Esquivel
Dra. Bertha Eugenia Lavaniegos Espejo
Dra. Diana Tentori Santa Cruz
Benito Arturo Niebla López © 2016
Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor y director de la tesis.
Dr. Benjamín Barón Sevilla
Coordinador del Posgrado en Acuicultura
Resumen de la tesis que presenta Benito Arturo Niebla López como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Acuicultura
Efecto de dos temperaturas sobre el desarrollo larval de la langosta roja Panulirus interruptus
Resumen aprobado por:
Dr. Eugenio Díaz Iglesias Dr. Benjamín Barón Sevilla Codirector de tesis Codirector de tesis
La langosticultura comenzó hace más de un siglo y desde entonces se han estudiado las condiciones de cultivo óptimas para el desarrollo larval de varias especies de langostas, entre ellas Panulirus interruptus, con el fin de desarrollar su cultivo comercial. De las especies de langostas que se capturan en México, P. interruptus aporta los mayores ingresos económicos, pero su pesquería se encuentra ya en su máximo sostenible. Con el objetivo de definir un protocolo de cultivo larval, en el presente trabajo se evaluó el efecto de dos temperaturas (18 y 24 °C) sobre el desarrollo larval, los cambios morfológicos, el crecimiento, la duración del periodo de intermuda y la supervivencia. Respecto a los cambios morfológicos de las larvas filosoma, a 18 °C se identificó un instar entre el estadio II y el III, y a 24 °C se identificaron los siguientes instars: uno entre el estadio II y III, uno entre el III y el IV, y tres instars posteriores al estadio VI. Asimismo, se describieron tres formas del estadio II, dos formas del estadio III y tres formas del estadio VI. Para analizar las diferencias en el crecimiento entre ambas temperaturas, se midió la longitud total (mm), de las larvas de cada estadio larval de ambos tratamientos. Una prueba de t indicó que no habían diferencias significativas entre los estadios I y II entre los dos tratamientos, pero sí entre los estadios II+ y III entre ambos tratamientos. Igualmente, se realizó una prueba de comparación de pendientes entre las curvas de crecimiento, resultando significativamente mayor para las larvas cultivadas a 24 °C. La duración del periodo de intermuda de las larvas cultivadas a 18 °C, fue mayor que en las larvas cultivadas a 24 °C. La supervivencia no se pudo cuantificar por igual en ambos tratamientos. Las larvas cultivadas a 18 °C sobrevivieron durante más tiempo en promedio, aunque una de las larvas en el tratamiento a 24 °C alcanzó la edad de 142 días después de la eclosión y un estadio de desarrollo caracterizado como el tercer instar del estadio VI.
Abstract of the thesis presented by Benito Arturo Niebla López as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Aquaculture.
Effect of two temperatures on the larval development of the red lobster Panulirus interruptus
Abstract approved by:
Dr. Eugenio Díaz Iglesias Dr. Benjamín Barón Sevilla Codirector de tesis Codirector de tesis
The lobster culture began more than a century ago, studying the optimal culture conditions for larval development of several lobster species, including Panulirus interruptus, in order to develop their commercial rearing. From all the lobster species harvested in Mexico, P. interruptus produces the highest economical income, but the fishery is at its maximum sustainable. In order to define a larval rearing protocol, in the present study phyllosoma larvae were reared at two temperatures (18 and 24 °C) to evaluate larval development, morphological changes, growth, intermoult period and survival. Regarding to morphological changes, an instar between stages II and III, was identified at 18 °C and at 24 °C, the following instars were identified: one instar between stages II and III, one instar between stages III and IV, and three instars after stage VI. In addition, three forms of stage II, two forms of stage III, and three forms of stage VI were described. To analyze the differences in growth between both temperatures, total lenght (mm) was meassured for each larval stage. The t-test comparing sizes of stage I and II did not show significant differences between the two treatments, but there were differences between instars II+ and stages III, among treatments. Similarly, the slope comparison of growth curves resulted significantly higher for the larvae grown at 24 °C. The intermolt period of the larvae reared at 18 °C was higher than in larvae reared at 24 °C. Survival could not be equally quantified in both treatments. The larvae reared at 18 °C survived longer on average, though one of the larvae in treatment at 24 °C, reached the age of 142 days after hatch and a developmental stage characterized as the third instar of stage VI.
Dedicatoria
Agradecimientos
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE) y al
Departamento de Acuicultura por haberme otorgado la oportunidad de realizar mi maestría.
Al consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por la beca otorgada para realizar
esta tesis.
Al Dr. Eugenio Díaz Iglesias (Euyín), mi codirector, por compartir su conocimiento y abrirme
las puertas de su hogar, permitiéndome ser casi parte de su familia.
Al Dr. Benjamín Barón Sevilla (Benyi), mi otro codirector, que aunque no quería formar parte
de mi comité en un principio, terminó dedicándole tiempo, dinero y esfuerzo propios a esta
investigación. Gracias por ser más que un codirector y apoyarme en otras áreas,
compartiendo también conocimientos y experiencias.
A la Dra. Beatriz Cordero Esquivel, por ser mi codirectora al principio, después
abandonarme… y finalmente ser una excelente profesora y parte de mi comité. Gracias por
permitirme ser parte del Laboratorio de Microalgas.
A la Dra. Bertha Eugenia Lavaniegos Espejo, por ser miembro de mi comité y por esas
pláticas aleatorias cuando la visitaba a su cubículo, y gracias también por compartir
conocimiento.
A la Dra. Diana Tentori Santa Cruz, por aceptar ser miembro de mi comité de tesis, tan
inesperadamente y esperar tanto tiempo mi titulación. Gracias también por recordarme a
Serguéi Prokófiev.
A la Dra. Marysabel Báez Hidalgo, por su grandísimo e interminable apoyo en temas
estadísticos, y sobre todo, por permitirme entrar en su hogar.
A la M. en C. Yanet Guerrero Rentería, por su apoyo en el análisis de muestras de las larvas,
y por las platicadas en esas fiestas de karaoke, fiestas que queda debiéndome.
A los técnicos Uvinaí Salgado y Jesús Mariscal, por ser unos excelentes elementos del
departamento de Acuicultura y excelentes personas, en general. Merecen este y muchos
agradecimientos más, pues su labor, dedicación y compromiso con su trabajo, los convierte
en personas de esas que escasean.
A los técnicos, el M. en C. José Espinoza, el M. en C. Adrián Celaya Ortega y a Luis Alberto
Murillo Valenzuela, por encargarse del bombeo del agua de mar que suministra la línea del
departamento de Acuicultura. Sin su labor, la magia no sucedería.
Al técnico Carlos Carballo, alias “el Charles-Boy”, por ayudar en algunos requerimientos del
experimento.
A Elizabeth Avilés Becerril, por auxiliarme con la edición de la tesis, que fue una reverenda
tortura, te agradezco mucho Eli
J
.
Al guardia Reyes Escobar Vicencio, alias “el Reyes”, por ayudarme a construir “la cueva de las
langostas” y por muchos otros apoyos más, casi un técnico de apoyo.
Al guardia Mario René Reinoso (Don Mario), por mantenerse preocupado por el nacimiento
de las larvas y mantenerme informado las noches que él vigilaba.
A Vicente Esteban Villagrana Vázquez, por apoyarme en la vigilancia de mi sistema y
mantenerme informado, además de acordarse de mí.
A Rosalío Lozano Lozano, alias “el Chalío”, por recibirme con una sonrisa todos los días que
asistí al CICESE, además de por recordar mi nombre. ¡Ánimo Chalío!
A todos mis compañeros de maestría
, si excepción. Cada uno me enseñó algo nuevo.
A mis amigos: Bety (la gnomo), Romy (Mi oaxaquita bonita :3), Quique (videojuegos y
caballitos de mar), César (Sr. Busca pleitos…), Connie (esposa del Sr. Busca pleitos xD),
Abelardo (el gran técnico), Ana (LA Ana…), Eduardo (el Sr.), Juan (roomie, el gran reijuepu…),
Gabo (más que un hermano, eres mi brother), Paúl (un macho alfa lomo plateado), Jonathan
(integrante Langosta), Ara (Sra. Nalgadas), José Antonio (Sr. Langosta II), Marco Antonio (Sr.
Orden mundial), Joshy (mi dude el Fa), Pablo (el mae), Rigoberto (Sr. Karaoke), Humberto (el
de Guasave), Juanpa (el Hermoso xD), Erik (te la rifaste), Karlita (
J
), Fany (mi polla), a
Diamanda (Diam), Bryan (Ángel (Dr. Feelgood) y a Athziri Longoria Sánchez (la A
J
). Y
obviamente a todos aquellos que omití por olvido y descuido, características poco comunes
en mí… 8-).
A todos los que en el pasado han trabajado con larvas de langosta, gracias a ellos, la
información que obtuvieron y recopilaron, nos resulta muy valiosa a los que continuamos
con su trabajo. A Ingrid Miriam Bautista Soto, principalmente, ya que me permitió “asesinar”
a sus larvas… (e.e) para poder aprender de esa experiencia y mejorar en lo posible
A José Estrada y todo el staff del Comedor del pueblo, “Comiditas”, “Lirl Fuds”, etc. Por
haberme provisto de comida buena, bonita y barata, ubicados en la plaza la joya, aquí en
Ensenada. Si lees esto y eres estudihambre, te lo recomiendo.
A mi primo Claudio Ulises Bedeán López (el simio :3), por ser un muy buen amigo, primo y
casi hermano.
A mi primo Rodrigo Rodrigo Niebla Bertotti, por amenazar con visitarme pero nunca se hizo
(e.e)… además por los mensajes de apoyo moral, emocional, mental y físico xD.
A mis “tíos” Francisco Alejandro Palacios Blancarte y Norma Patricia Rojo Lugo, por tratarme
como de su familia aquí en Ensenada.
A mi tío Juan García Abdeslem, por preocuparse por mí y apoyarme todo lo que estaba a su
alcance.
A Claudia Elena Álvarez Hernández, por ser mi maestra y soportar cuando desafino, además
de ser una excelente guía en el área del derecho.
Tabla de contenido
Página
Resumen en español ……….. ii
Resumen en inglés………. iii
Dedicatoria..……… iv
Agradecimientos………. v
Lista de figuras……….. ix
Lista de tablas……… xi
Capítulo 1. Introducción………. 1
1.1. Acuicultura……… 1
1.2. Producción pesquera y acuícola de Crustáceos……….. 1
1.3. Captura de langostas en el mundo……….. 2
1.4. Pesquería de langosta en México………. 2
1.5. Aspectos biológicos del género Panulirus……… 3
1.6. Panulirus interruptus………. 8
1.7. Influencia de la temperatura en los procesos biológicos de los crustáceos……… 11
1.8. Antecedentes……….. 13
Capítulo 2. Justificación……….. 17
Capítulo 3. Hipótesis………. 18
Capítulo 4. Objetivos……… 19
4.1. Objetivo general………... 19
4.2. Objetivos particulares………... 19
Capítulo 5. Materiales y métodos……… 20
5.1. Origen de las hembras ovígeras……….………... 20
5.2. Monitoreo del desarrollo embrionario………..……….. 21
5.3. Colecta de larvas……… 21
5.4. Diseño experimental…..……… 22
5.5. Cultivo individual de las larvas filosoma……… 22
5.6. Cultivo masivo de las larvas filosoma………. 23
5.7. Tratamiento del agua y monitoreo de las propiedades físico-químicas……….………… 24
5.8. Producción del alimento vivo……….. 24
5.9. Enriquecimiento del alimento vivo……….. 26
5.10. Caracterización y clasificación de los cambios morfológicos en las larvas filosoma. 26 5.11. Análisis estadístico……….. 28
Capítulo 6. Resultados………. 29
6.1. Condiciones de cultivo……….. 29
6.2. Descripción de los cambios morfológicos de las larvas………. 29
6.3. Evaluación del crecimiento……… 34
6.4. Análisis de los eventos de muda……… 38
6.5. Análisis de la supervivencia……… 42
Capítulo 7. Discusión………. 46
Capítulo 8. Conclusiones……… 59
Capítulo 9. Recomendaciones……… 60
Lista de figuras
Figura Página
1 Diagrama que muestra el incremento en duración de los ciclos de intermuda sucesivos, basado en los braquiuros (tomado de Passano, 1960)………. 6
2 Distribución de la langosta espinosa Panulirus interruptus (marcada en anaranjado) en las costas del Pacífico y Golfo de California (adaptado de Phillips, 2013)………. 9
3 Filosoma estadio I de Panulirus interruptus. Iniciales: a1, primera antena; a2, segunda antena; cs, espina coxal; en, endopodito; ex, exopodito; mxp3, tercer maxilípedo; p1, p2, p3, primero, segundo y tercer pereiópodos (tomada de Johnson, 1956)……… 27
4 Distintas formas de larvas filosoma de P. interruptus estadio II, observadas durante el cultivo masivo. A, estadio II descrito por Johnson (1956) para muestras provenientes del medio natural. B, C y D, formas observadas en este estudio. Flechas pequeñas, primordio del cuarto par de pereiópodos. Flechas grandes, exopodito del tercer par de pereiópodos……… 30
5 Distintas formas de larvas filosoma de P. interruptus estadio III observadas durante el cultivo masivo. A, estadio III descrito por Johnson (1956) para muestras provenientes del medio natural. B y C, formas observadas en este estudio. Flechas gruesas, cuarto par de pereiópodos. Flechas delgadas, abdomen o pleón.……… 31
6 Distintas formas de larvas filosoma de P. interruptus estadio VI observadas durante el cultivo masivo. A, estadio VI descrito por Johnson (1956) para muestras provenientes del medio natural. B, C y D, formas observadas en este estudio. Flechas, seta del exopodito del cuarto par de pereiópodos.……….. 32
7 Instars posteriores al estadio VI observadas durante el cultivo masivo de larvas filosoma de P. interruptus, nombradas cronológicamente. Dentro del óvalo se muestra una amplificación del pleón, con los dos primordios del quinto par de pereiópodos, seis primordios de los acúleos del lado izquierdo y seis del lado derecho, y los dos primordios de los urópodos. Flechas negras, primordio del quinto par de pereiópodos. Flechas blancas, primordio del tercer acúleo. Flechas grises, primordio de los urópodos………. 33
8 Crecimiento de larvas filosoma de Panulirus interruptus por estadio de desarrollo. Se muestra la longitud total (LT) promedio ± error estándar para cada temperatura. 36
10 Análisis del crecimiento de las larvas filosoma de Panulirus interruptus cultivadas a 18 y 24 °C. Ajuste de los datos a un modelo lineal. Se indican las nubes de datos y los intervalos de confianza correspondientes……….. 38
11 Distribución porcentual promedio de los diferentes estadios de desarrollo de las larvas filosoma de Panulirus interruptus con respecto a la edad, cultivadas a 18 °C.… 41
12 Distribución porcentual promedio de los diferentes estadios de desarrollo de las larvas filosoma de Panulirus interruptus con respecto a la edad, cultivadas a 24 °C.… 41
13 Porcentaje de supervivencia acumulado para las larvas filosoma de Panulirus interruptus a 18 °C.……….. 43
14 Porcentaje de supervivencia acumulado para las larvas filosoma de Panulirus interruptus a 24 °C..………. 43
Lista de tablas
Tabla Página
1 Valores promedio de las propiedades fisicoquímicas medidas en los cultivos de larvas filosoma de Panulirus interruptus a 18 y 24 °C (± Desviación estándar). n=5..…. 29
2 Longitud total (LT) mínima, máxima y promedio (mm) de cada estadio de desarrollo de las larvas filosoma de Panulirus interruptus cultivadas a dos temperaturas.………… 35
3 Duración promedio del periodo de intermuda1 (días) de las larvas filosoma de
Panulirus interruptus cultivadas a 18 y 24 °C (± Desviación estándar)………..………. 39
4 Edad promedio1 (días después de la eclosión, DDE) de cada estadio larval de
Panulirus interruptus cultivado a 18 y 24 °C (± la Desviación estándar)….………. 40
5 Comparación de rangos o promedios de longitud total (mm) ± Desv. est. de larvas filosoma de P. Interruptus en diferentes estadios, observadas por diferentes autores (los valores separados por un punto y coma, indican los resultados de experimentos diferentes)………..……….
Capítulo
1
.
Introducción
1.1.
Acuicultura
La acuicultura ha tomado un papel importante en los últimos años, por su capacidad de producir alimentos provenientes del medio acuático. En 2012 llegó a suplir casi la mitad de la producción de pescados y mariscos, en comparación con la pesca, y se estima que para el 2030 su contribución será superior al 50% de la producción mundial total (FAO, 2014). Así, con el fin de mejorar los rendimientos de algunas especies de interés económico, los negocios acuícolas, dedicados a la producción comercial, se han dedicado a la generación de semilla y engorda en sistemas extensivos e intensivos (González et al., 2004).
En la antigüedad, la acuicultura se manejaba como una actividad extensiva de baja producción en comparación con la pesca, sin embargo, actualmente no sólo sus ingresos han sido comparables con los de la pesca, sino que además, se ha logrado producir proteína de alta calidad de manera sostenible, en buena medida por la incorporación de técnicas de cultivo que involucran el control de todas las variables físico-químicas inmersas en el cultivo de organismos marinos y dulceacuícolas (Parker, 2002; Hutchinson, 2006; Nash, 2011) .
1.2.
Producción pesquera y acuícola de Crustáceos
Para el año 2013, la producción mundial de las pesquerías marinas y continentales fue de 92,572,586 t, de las cuales 80,885,079 t corresponden a la captura de organismos marinos. De esta última cifra, 6,014,947 t corresponden a crustáceos marinos, es decir, el 7.4% de la captura mundial, y esta cifra va en aumento cada año. Entre las principales especies sujetas a la pesca, en orden de importancia por tonelaje, están: el camaroncillo akiami (Acetes japonicus), la jaiba gazami (Portunus trituberculatus), el camarón norteño (Pandalus borealis), el camarón fijador arquero (Trachypenaeus curvirostris), langostino jumbo (Penaeus monodon), jaiba azul (Portunus pelagicus), y el krill antártico (Euphausia superba).
encuentran: el camarón patiblanco (Litopenaeus vannamei), el langostino jumbo (Penaeus monodon), otros camarones marinos, cangrejos de fango, langostas, cangrejos de río, cangrejo chino (Eriocheir sinensis) y camarones de agua dulce (FAO, 2012).
De acuerdo con los datos reportados por la FAO en el 2012, en el continente americano la captura de crustáceos representa el 21.7% de la producción total acuícola. Sudamérica (Brasil y Perú) ha mantenido un crecimiento continuo en la producción acuícola general, mientras que en América del Norte (Canadá y México), la producción ha disminuido en los últimos años (FAO, 2012).
1.3.
Captura de langostas en el mundo
Al ser la langosta un crustáceo de alto valor comercial, se ha explotado de forma tal, que en un futuro, la producción proveniente de organismos del medio natural no será sostenible (FAO, 2008). Aunque su valor comercial es muy importante, sus capturas fueron pequeñas en comparación con los otros crustáceos según las estadísticas de 2010 (FAO, 2012). En el 2013, la producción acuícola de “Bogavantes y langostas” fue de 1,045 toneladas, mientras que la captura proveniente del medio natural fue de 289,222 t (FAO, 2016a).
Existen diversas especies de langosta alrededor del mundo, distribuidas en condiciones climáticas distintas, mientras que otras comparten ecosistemas similares. Entre las principales especies se encuentran Homarus americanus, Acanthacaris caeca, Panulirus interruptus, P. argus, Metanephrops challengeri, P. ornatus, P. homarus, P. versicolor, P. japonicus, entre otras. Algunos países americanos que explotan este recurso son Brasil, Cuba, Honduras, Nicaragua, México, Estados Unidos y Canadá. En otras regiones del mundo, como Australia, Nueva Zelanda, India, Vietnam y Japón, además de explotar este recurso también lo cultivan (Briones-Fourzán, 1988; Ehrhardt, 2000; Butler et al., 2006).
1.4.
Pesquería de langosta en México
silvestres de langostas que se distribuyen en México se encuentran en un estado de sobrepesca y otras están colapsadas, por sus implicaciones ecológicas y económicas, como el efecto negativo de la pesca en los ecosistemas y el deterioro de las pesquerías (Arreguín-Sánchez y Arcos-Huitrón, 2011). No obstante, la evaluación por parte del Marine Stewardship Council le ha otorgado a la pesquería de P. interruptus la recertificación de pesquería sostenible (MSC, 2016).
A pesar del hecho de que las pesquerías de langosta se encuentran en un estado de sobrexplotación, como se reportó en 2009, éstas tienen un alto valor económico. La producción pesquera nacional ascendió a 1,746,277 t en 2013, con un valor de $19,913,988,000 MXN. La captura de langosta aportó 3,535 t, equivalentes a $494,005,000 MXN (esto es el 2.5% de la producción nacional), ocupando el quinto lugar nacional, respecto a la aportación económica de los otros grupos de organismos explotados. Considerando su valor por tonelada, se ubica en el segundo lugar nacional ($140 mil MXN por tonelada), quedando por debajo del abulón (con cerca de $180 mil MXN) y por encima del camarón (con poco menos de $60 mil MXN) (SAGARPA, 2014).
1.5.
Aspectos biológicos del género
Panulirus
Las langostas se clasifican en el Orden Decapoda (Scholtz y Richter, 1995). Pertenecen a la Familia Palinuridae, caracterizadas por no poseer quelas, presentar antenas largas y espinosas, y en la mayoría de las especies, por tener un órgano estridente en la base de las antenas. En los integrantes del Género Panulirus la muda es un evento frecuente a lo largo de su vida, pues existen otros decápodos que tienen una muda final, con la cual culmina su crecimiento (Hiatt, 1948). El ciclo de muda se caracteriza por diferentes etapas, en las que se producen cambios fisiológicos y se describen a continuación (Drach, 1939; Travis, 1955; Passano, 1960; Lockwood, 1967; Marlin, 1979). En cada etapa del ciclo de muda se producen cambios fisiológicos:
- Etapa A
• A1 (Recién mudado), se da la absorción de agua en algunos tejidos, lo que le permite al
• A2 (Suave), continúa la mineralización de la cutícula, permitiendo que el crustáceo pueda
sostenerse, sin embargo, el exoesqueleto aún permanece suave y el contenido de agua del organismo está por arriba del 80%.
- Etapa B (Caparazón de papel)
• B1, comienza la secreción de la endocutícula (capa calcárea).
• B2, inicia la formación de la endocutícula y el crecimiento del tejido, que sustituye el
espacio ganado por el agua.
- Etapa C (Duro)
• C1, mayor periodo de crecimiento del tejido.
• C2, continúa el crecimiento del tejido y el contenido de agua disminuye al 76%.
• C3, se completa el exoesqueleto y se forma la capa membranosa. El integumento ya está
rígido, pero la calcificación se encuentra incompleta en las partes lateral y frontal del caparazón.
• C4, o “intermuda”, aquí se da la mayor acumulación de reservas orgánicas, además de
que la calcificación está completa y la capa membranosa yace debajo de la zona calcificada. También el crecimiento de tejido está completo y el contenido de agua disminuye al 61%.
- Etapa D (Proecdisis)
• D0, se produce la activación epidérmica y del hepatopáncreas. Es una etapa preparatoria
para la muda subsecuente, en la que ocurre la reabsorción de calcio y las capas de la nueva cutícula son secretadas. Se detiene la alimentación y se movilizan las reservas.
• D1, se forma la epicutícula, secretada por la epidermis (hipodermis), además, aparecen
las nuevas espinas en la base de las viejas.
• D3, se da una gran reabsorción del calcio de la vieja cutícula, dando lugar a algunas
grietas en el caparazón.
• D4 (A punto de mudar), se reabsorbe el calcio de las suturas ecdisiales, dando como
resultado la dehiscencia que permitirá el escape del organismo por ese espacio.
- Etapa E (Muda), el organismo escapa del viejo exoesqueleto y permite la admisión rápida de agua en su interior.
Cada vez que el crustáceo decápodo muda, las etapas subsecuentes de su ciclo de muda se incrementan en duración de manera proporcional, una característica ilustrada por la espiral de Passano (1960) (Figura 1).
Figura 1. Diagrama que muestra el incremento en duración de los ciclos de intermuda sucesivos, basado en los
braquiuros (tomado de Passano, 1960).
Cuatro familias del Orden Decapoda se conocen específicamente como langostas: Scyllaridae,
Nephropsidae, Homaridae y Palinuridae. Esta la última es la más representativa de todas y sus especies se conocen como langostas espinosas o de roca (Gracía y Kensler, 1980). El género Panulirus está conformado por 47 especies, distribuidas en 8 géneros. Se distinguen por tener largas antenas espinosas y por la carencia de quelas en los pereiópodos, aunque las hembras pueden presentarlas en el quinto par. Habitan en ambientes más tropicales que los géneros Jasus y Palinurus, aunque también se desarrollan en ambientes subtropicales alrededor del mundo.
La reproducción de las langostas espinosas comienza con la migración de los adultos, desde sus refugios en zonas costeras (arrecifes de coral, áreas rocosas, mesetas calcáreas, etc.), que pueden ir de 0-150 m de profundidad, en sitios donde las corrientes son fuertes, para facilitar la propagación y liberación de las larvas al momento de su eclosión. Sin embargo, según Williams (1986), P. argus
Herrnkind y Lipcius, 1989; Lozano et al., 1982; Lozano-Álvarez et al., 1993; Phillips et al., 1980; Phillips, 1983; Pitcher et al., 1992; Skewes et al., 1997; Acosta y Robertson, 2003).
El desarrollo de las langostas comienza con la fertilización de los huevos, para lo cual, el macho deposita un espermatóforo en la parte externa del abdomen (sternum) de la hembra. Durante la oviposición, los huevos son fertilizados y quedan adheridos a los apéndices abdominales de la hembra, donde se incuban por un periodo de hasta 10 semanas hasta el momento de la eclosión, cuando comienzan su fase larvaria o filosoma (Royce, 1972; Patek et al., 2006; King, 2007). Las larvas filosoma atraviesan varios estadios de desarrollo, separados por una o más mudas, para posteriormente pasar por las fases de puerulus o postlarva, juvenil y finalmente adulto. Otras langostas no pertenecientes a los palinúridos, como las de la familia Scylaridae, tienen un estadio larval inicial llamado naupliosoma. En relación con el Género Panulirus, no hay un consenso en cuanto a la existencia de un estadio naupliosoma, pues es posible que esta etapa sea producto de una eclosión prematura (Baisre, 1964; Gracía y Kensler, 1980; Silberbauer, 1971; Wahle y Fogarty, 2006).
La fase larvaria de las langostas de la familia de los palinúridos, suele durar entre 4 y 14 meses, dependiendo de la especie. Las que habitan en zonas más cálidas o tropicales, como Panulirus ornatus o P. argus, la duración de la etapa larval es mas corta. Por el contrario, aquellas que habitan en climas más fríos, como P. cygnus o algunas poblaciones de P. interruptus, la duración es mayor. Durante la fase larval, se presentan mudas sucesivas hasta alcanzar el estadio de puerulus, en aguas oceánicas lejos de la costa (Phillips et al., 1979; Rothlisberg, 1988; Dennis et al., 2001; Phillips et al., 2006; Goldstein et al., 2008; Shepherd y Graham, 2013). Finalmente, una vez transcurrida la etapa larval, el puerulus se dirige a la zona costera, hasta que llega a un ambiente apto para su maduración y crecimiento. Dependiendo del tipo de hábitat que las langostas ocupan, se clasifican como:
1.6.
Panulirus interruptus
Figura 2. Distribución de la langosta espinosa Panulirus interruptus (marcada en anaranjado) en las costas del Pacífico y Golfo de California (adaptado de Phillips, 2013).
Los hábitos alimenticios de P. interruptus son muy similares entre las estaciones del año, sin embargo, las presas elegidas como principal alimento, sí varían, inclusive entre sexos y entre los diferentes estadios de vida (juveniles y pre-adultos o adultos jóvenes) en una misma zona. La dieta se compone preferencialmente de gasterópodos, peces, crustáceos decápodos, moluscos, algas calcáreas y pastos marinos (Díaz-Arredondo y Guzmán-del-Próo, 1995; Lindberg, 1955; Winget, 1968). No obstante, un estudio más reciente refiere que consumen preferentemente crustáceos anfípodos e isópodos. En vista de la diversidad de alimentos se les cataloga como omnívoros oportunistas (Castañeda-Fernández et al., 2005). Por otro lado, las langostas en general, en sus estadios tempranos de desarrollo, son depredadas por peces pelágicos (Howard, 1988; Phillips y Sastry, 1980), mientras que los juveniles y adultos de P. interruptus, según Winget (1968), pueden ser presa de depredadores como Octopus spp., Pimelometopon pulchrum, Scorpaenichthys marmoratus,
Las langostas alcanzan la madurez sexual alrededor del quinto o sexto año de vida, cuando alcanzan una longitud del cefalotórax (LC) de 65 mm, casi 20 mm menos que la talla comercial (82.5 mm) (Ayala-Martínez, 1976; Briones-Fourzán y Lozano-Álvarez, 2000; Chapa, 1964; Gracia y Kensler, 1980; Lindberg, 1955). Por su morfología externa, las hembras son las únicas que se pueden catalogar como “maduras” sexualmente, ya que los dos esternitos posteriores del esternón, se vuelven más suaves y carnosos cuando están maduras, además de que pueden llevar un espermatóforo, ovarios maduros, o freza (Chubb, 1994; Vega-Velázquez, 2003). En contraste, los machos juveniles que se aproximan al estado de madurez sexual (LC menor de 55 mm) tienen los gonoporos hinchados (en el quinto par de patas), indicativos de la formación del espermatóforo (Marlin, 1979).
P. interruptus se reproduce anualmente en un solo evento de desove y eclosión; el periodo reproductivo comienza al acercarse la primavera y termina alrededor del otoño. Según Vega-Velázquez y Espinoza-Castro (2004), el mayor número de langostas hembra con espermatóforo se encuentra en el mes de julio, aunque algunos estudios previos hablan de un periodo de máxima intensidad reproductiva en junio y otros durante agosto-septiembre (Ayala-Martínez et al., 1988; Gracia y Kensler, 1980; Pineda et al., 1981).
Después de que el macho implanta su espermatóforo en la hembra, ésta oviposiciona entre 50,000 y casi dos millones de huevos (Lindberg, 1955; Marlin, 1979; Pineda et al., 1981). Una vez transcurrido el tiempo de maduración de la freza o desarrollo embrionario, que puede durar entre 9 y 10 semanas, dependiendo de la temperatura de incubación (Allen, 1916), ocurre la eclosión, para dar paso a la fase larval. Ésta está conformada por 11 estadios filosoma planctónicos (Johnson, 1956) y cuya duración es de c. 8 meses, para continuar con su siguiente fase de vida como puerulus (Johnson, 1959), que se considera una larva bentónica, que muda para convertirse en juvenil, el cual crece aceleradamente hasta alcanzar la madurez sexual (Marlin, 1979).
Existen diversos factores que afectan la presencia y abundancia de larvas de P. interruptus en la región oceánica, entre los que se encuentran la temperatura, el oxígeno disuelto, la circulación del agua, la temperatura y la disponibilidad de alimento, entre otras (Johnson, 1960; Pringle, 1986; Ruiz, 2013). La temperatura del océano a 10 m de profundidad, en el área de distribución de P. interruptus, va desde los 10 hasta los 28°C (Johnson, 1960). Peñaloza-Mayorazgo (2008) analizó larvas filosoma recolectadas frente a la costa occidental de Baja California durante 1998-1999 y registró una abundancia larval del 68% en un rango de temperatura de 18 a 22°C, con un intervalo de salinidad de 33.1 a 34.6 ups. En general, se reconoce que la mayoría de los estadios iniciales de las larvas se encuentran cerca de la costa, mientras que los estadios más avanzados, están más alejados (Gracia y Kensler, 1980; Johnson, 1956; Ortuño-Manzanarez, 2010). También se han registrado organismos de estadios finales (filosomata X y XI) cerca de la costa, probablemente acarreados por contracorrientes, inclusive en el área de distribución de los adultos (Ayala-Martínez y Chávez, 1985; Johnson, 1960).
Respecto al comportamiento alimenticio de las larvas de P. interruptus, se ha observado en laboratorio que tienen una preferencia por presas de cuerpos blandos, como medusas, ctenóforos y quetognatos (Mitchel, 1971). Desafortunadamente, no hay estudios de la alimentación de P. interruptus en el medio natural, que permitan conocer los requerimientos nutricionales de las larvas de esta especie. No obstante, la mayoría de las larvas de langostas espinosas de otras especies comparten características ontogenéticas. Cox y Johnston (2003) compilaron la información de las larvas filosoma relacionada con la morfología, tanto interna como externa, alimentación, requerimientos nutricionales, digestión, pruebas con dietas, densidades y tamaño de alimento, entre otros aspectos. Entre sus conclusiones sugieren que los requerimientos del ácido graso docosahexaenoico (DHA) son mayores que los que actualmente se han estado utilizando para alimentar filosomata en laboratorio. Además, indican que a medida que transcurre cada etapa del desarrollo, las larvas adquieren la capacidad de digerir presas más grandes, por lo que, en condiciones de cultivo, es necesario incorporar estas recomendaciones a los protocolos de alimentación.
1.7.
Influencia de la temperatura en los procesos biológicos de los
crustáceos
producción de calor (organismos de sangre caliente); y como poiquilotermos aquellos organismos cuya temperatura corporal fluctúa con respecto a la ambiental (organismos de sangre fría). Sin embargo, hay otra clasificación basada en el origen del calor corporal, pudiendo ser endotermos (generan su propio calor y están protegidos contra pérdidas de calor hacia el medio) y ectotermos (no tienen un buen “aislante” y por lo tanto intercambian calor con el ambiente) (Randall et al., 2000).
Las especies que habitan el lecho marino son muy diversas y pueden presentar cualquiera de los cuatro tipos de regulación térmica descritos. En relación con los crustáceos, en general se les cataloga como poiquilotermos, pues no tienen la capacidad para controlar su temperatura corporal; aunque esto no significa que no puedan mantener su estado de homeostasis, pues existe una gran diversidad de crustáceos que pueden acelerar o desacelerar su metabolismo en función de las temperaturas a las que se encuentran (Cameron y Mangum, 1983; Florkin, 1960; Vernberg, 1983).
Este grupo de organismos ha desarrollado diversas adaptaciones que les permiten contrarrestar los efectos adversos de la temperatura, como los cambios en la viscosidad del agua y la solubilidad del oxígeno, haciendo que sea más difícil el intercambio de gases a temperaturas altas (por su baja concentración de oxígeno) y a temperaturas bajas (por su alta viscosidad). Es así como Cameron y Mangum (1983), proponen que dichas modificaciones fisiológicas se llevan a cabo a nivel de las branquias (modificando los patrones de flujo de los fluidos, agua y hemolinfa) y a nivel de los tejidos en general, tanto en la entrega como en la recepción del oxígeno (como resultado del incremento en el flujo de la sangre).
La razón por la cual la sangre puede modificar su capacidad de entregar oxígeno a los tejidos, está ligada al incremento de la frecuencia cardiaca, desencadenada por la alta temperatura, como sugieren DeFur y Mangum (1979). Además, el incremento de la temperatura puede inducir, en la estructura de la molécula de hemocianina, cambios intrínsecos (disminución de la afinidad por el oxígeno) y extrínsecos (la caída en el pH en la sangre, además de cambios en las presiones parciales post y prebranquiales) (Mauro y Mangum, 1982a, b).
en los crustáceos terrestres es una adaptación que conlleva dos efectos antagónicos, pues permite enfriar el cuerpo y soportar temperaturas en el aire más elevadas, pero al mismo tiempo, deseca al organismo y no deja que éste soporte altas temperaturas, fuera de su zona de tolerancia.
En relación con las larvas de crustáceos, éstas atraviesan por un número particular de estadios antes de llegar a la etapa juvenil, y la temperatura puede modificar la ontogenia en estas etapas. Por ejemplo, un incremento de la temperatura de cultivo, disminuye el tiempo de desarrollo y produce un incremento de la frecuencia de mudas y un tamaño final más pequeño (principalmente en cirrípedos y decápodos), comparado con el de las larvas cultivadas a temperaturas más bajas (Anger, 2001).
La temperatura también puede inducir procesos de migración vertical en las larvas, lo que modifica su patrón de distribución en el plancton. Del mismo modo se ha observado que las larvas de decápodos que habitan en latitudes altas, tienen una respuesta estenotérmica (soporta variaciones muy pequeñas de temperatura), mientras que aquellas que se localizan en climas templados, usualmente son euritermas (soportan una amplia variación de temperaturas). Igualmente, se sabe que las etapas larvales tienen una tolerancia fisiológica menor que la de los juveniles y adultos, y que en general, en la mayoría de las especies, al disminuir la temperatura, el metabolismo también disminuye. En otras especies, en circunstancias particulares, la tasa metabólica se incrementa, como medida de alerta para escapar hacia zonas con temperaturas más tolerables (Anger, 2001).
1.8.
Antecedentes
El cultivo de la langosta se practica desde hace tres siglos. Comenzó con el cultivo de Panulirus japonicus en Japón (Hattori y Oishi, 1899). La alimentación de las larvas de P. japonicus incluyó larvas de peces y carne de langosta y se cultivaron en recipientes pequeños con agua sin turbulencia. Durante varias décadas se han venido perfeccionando las técnicas de cultivo de larvas filosoma de diversas especies de langosta, en las que se ha destacado la importancia de la alimentación, la temperatura, el fotoperiodo, la calidad del agua y los aspectos sanitarios en su crecimiento y desarrollo (Hall et al., 2013).
El cultivo de los estadios de desarrollo temprano, desde huevo hasta puerulus se ha conseguido en
Palinurus elephas (Kittaka e Ikegami, 1988; Kittaka, 1997b; Kittaka et al., 2001), Jasus lalandii
(Kittaka, 1988), J. edwardsii (Illingworth et al., 1997), un híbrido entre J. lalandii y J. edwardsii (Kittaka
japonicus (Yamakawa et al., 1989; Kittaka y Kimura, 1990), P. longipes (Matsuda y Yamakawa, 2000),
P. penicillatus (Matsuda et al., 2006), P. echinatus (Abrunhosa et al., 2008), P. ornatus (Duggan y McKinnon, 2003; Smith et al., 2009) y de acuerdo a Goldstein et al. (2008), P. homarus también se ha cultivado exitosamente desde huevo hasta su etapa de pre-juvenil. En P. interruptus, no se ha dominado el cultivo larval, sin embargo se tienen avances modestos. Mitchell (1971) cultivó las larvas hasta el estadio VI. Posteriormente, Dexter (1972) también logró cultivarlas hasta el estadio VI. El factor que limitó el éxito del cultivo hasta la etapa de puerulus fue la dificultad de contar con alimento en cantidad suficiente y de calidad nutricional adecuada. López-Zenteno (2004) desarrolló un cultivo de larvas filosoma, utilizando dos sistemas de cultivo, eutrófico o verde (inoculado con microalgas en densidad suficiente para evitar la proliferación de microorganismos patógenos) y oligotrófico o azul (implementado con filtros de cartucho de 10, 5 y 1 μm y luz UV), pero el deterioro de la calidad del agua y la proliferación microbiana, produjo la mortalidad de las larvas en el estadio VI.
Por otro lado, diferentes grupos de investigación dedicados al estudio del cultivo larvario de las langostas, han evaluado los efectos de algunos factores ambientales, como la temperatura y el fotoperiodo, con la intención de definir las condiciones óptimas para su cultivo. Se han publicado varios trabajos donde se analizan los efectos de la temperatura sobre el desarrollo larval.
La temperatura puede afectar la ingestión de alimento, cuando las temperaturas de cultivo sobrepasan los límites inferiores o superiores de la especie, las larvas disminuyen su consumo, como en larvas de P. japonicus (Inoue, 1965). Las bajas temperaturas pueden ocasionar una disminución de la ingesta de alimento en ciertos estadios de desarrollo, sin embargo, en otros pueden provocar una respuesta opuesta, tal es el caso de S. verreauxi (Moss et al., 2001; Fitzgibbon et al., 2012). No obstante, un incremento de la temperatura, estimula la ingesta de alimento en las larvas de J. edwardsii (Tong et al., 2000a; Bermudes y Ritar, 2004, 2008).
intermedias, los estadios iniciales de J. edwardsii pueden tener un mayor tamaño (Bermudes y Ritar, 2008). Por el contrario, en P. cygnus, un decremento en la temperatura, puede generar organismos más grandes, posiblemente por los tiempos de permanencia mas prolongados, que incremenan la posibilidad de atrapar más presas (Liddy et al., 2004). El estudio de los efectos de la temperatura de cultivo en las larvas de P. japonicus, P. cygnus, J. edwardsii, S. verreauxi indican que un incremento en la temperatura (dentro de los límites), reduce sustancialmente los tiempos de intermuda (Matsuda y Yamakawa, 1997; Tong et al., 2000a; Moss et al., 2001; Liddy et al., 2004; Bermudes y Ritar, 2008; Fitzgibbon et al., 2012).
La exposición de las larvas a temperaturas demasiado altas, como en S. verreauxi (Fitzgibbon et al., 2012), o muy bajas, como en J. edwardsii (Tong et al., 2000a) o S. verreauxi (Moss et al., 2001), puede disminuir la supervivencia en forma drástica. No obstante, en larvas de P. cygnus (Liddy et al., 2004), la temperatura pareció no influir en la supervivencia de los organismos, y en las larvas de P. japonicus, la temperatura alta pudo haber afectado indirectamente la supervivencia, al promover la descomposición del alimento (Matsuda y Yamakawa, 1997). Una diferencia de temperaturas entre estadios puede mejorar la supervivencia, como lo indican los resultados de investigaciones en P. japonicus (Murakami et al., 2007), J. edwardsii (Bermudes y Ritar, 2008) o S. verreauxi (Moss et al., 2001; Fitzgibbon et al., 2012).
En larvas de J. edwardsii, los resultados de la influencia de la temperatura sobre la excreción amoniacal y el consumo de oxígeno, permiten concluir que conforme aumenta la temperatura, su efecto sobrec el metabolismo disminuye (Bermudes y Ritar, 2004). En contraste, en las larvas de S. verreauxi, el consumo de oxígeno se incrementa al dismiuir la temperatura por debajo de su temperatura óptima (Fitzgibbon et al., 2012).
La temperatura de incubación y el fotoperiodo también afectan el desarrollo ovárico y/o embrionario, así como la calidad larvaria de algunas especies de langostas. En general, la respuesta a una temperatura elevada consiste en un aceleramiento del desarrollo embrionario, que se ve expresado en una eclosión precoz (Sachlikidis et al., 2010, con P. ornatus), y en larvas más grandes, como en J. edwardsii (Tong et al., 2000b). No obstante, también se han observado efectos opuestos, es decir, organismos significativamente más pequeños y con menos proporción de ácido eicosapentaenoico (Smith et al., 2002), e inclusive, una mayor eclosión de naupliosomas inviables y larvas pequeñas (Smith et al., 2003).
crecimiento. Si el régimen de luz u obscuridad es continuo, el crecimiento las larvas disminuye, como en J. edwardsii (Bermudes y Ritar, 2008). A nivel embrionario, la incubación de los huevos de J. edwardsii en un fotoperiodo de ciclo comprimido y temperaturas altas, provocan una alta inviabilidad larval y un efecto negativo en la composición bioquímica de las supervivientes (Smith et al., 2003). En relación con el desarrollo ovárico y el desove, una fotofase más prolongada, combinada con una temperatura alta, inducen el desarrollo ovárico y el desove en P. japonicus (Matsuda et al., 2002).
Capítulo
2. Justificación
Capítulo 3. Hipótesis
Capítulo 4.
Objetivos
4.1.
Objetivo general
Evaluar el efecto de dos temperaturas de cultivo sobre el desarrollo larval de Panulirus interruptus.
4.2.
Objetivos particulares
1. Describir los cambios morfológicos durante el desarrollo de las larvas cultivadas a 18 y 24 °C.
2. Evaluar el crecimiento y supervivencia de larvas de P. interruptus.
Capítulo 5
.
Materiales
y
métodos
5.1.
Origen de las hembras ovígeras
Se recolectaron 7 hembras ovígeras en la localidad del Rosario, Baja California, entre los meses de mayo y septiembre, en colaboración con el personal del Centro Regional de Investigaciones Pesqueras (CRIP) de Ensenada y de la Asociación Pesquera REGASA de El Rosario, Baja California, con el permiso respectivo por parte de la Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca (CONAPESCA).
Las hembras capturadas se colocaron en una hielera provista de un difusor de aire, conectado a una bomba de aire de baterías, para que los huevos no se expusieran a condiciones de anoxia. Se hicieron dos recambios de agua durante el periodo de la colecta, con la intención de disminuir sustancias nitrogenadas producto de la orina proveniente de las hembras, que pudieran afectar a los huevos. Las hembras fueron trasladadas al Laboratorio de Langosta del Departamento de Acuicultura del CICESE, con aireación constante, durante el traslado se hicieron otros dos recambios de agua. En el laboratorio las hembras ovígeras se mantuvieron en un tanque con 450 L de agua de mar, provisto de refugios, constituidos por bloques de concreto, para cada una de las langostas.
El tanque de mantenimiento estuvo provisto de un sistema de recirculación, con una capacidad de 650 L y que consistió del estanque de cultivo, un biofiltro de 56.6 dm3 (BBF2P, Aquatic
Eco-Systems™), un par de enfriadores de 1/5 HP (TLD-2, Delta Star Aqua Logic, Inc.), que mantuvieron la temperatura del agua entre 17 y 24°C. Para eliminar la presencia de patógenos, el agua se irradió con luz UV (QL-25, Lifegard Ultraviolet Sterilizer) y se eliminaron las sustancias orgánicas disueltas con un fraccionador de espuma. Se utilizó un tanque de compensación de 150 L para la distribución del agua. El agua se impulsó con una bomba centrífuga de 1/4 HP (Sweetwater® High-Efficiency Pump, SHE2.4, 230V Aquatic Eco-Systems™).
Las hembras se alimentaron diariamente a saciedad, con 2 mejillones vivos (Mytilus galloprovincialis) por langosta. Esta dieta se determinó con base a observaciones previas en que se les proporcionó cantidades variables de mejillones para que los comieran, hasta ver que no dejaran mejillones al día siguiente.
Las concentraciones de nitritos (NO2), nitratos (NO3) y el nitrógeno amoniacal total (NAT) se
cuantificaron semanalmente, mediante un procedimiento comercial (AMMONIA AQUARIUM TEST KIT, Instan Ocean®).
5.2.
Monitoreo del desarrollo embrionario
El desarrollo embrionario se analizó cada 4 días revisando la freza de las hembras, sujetando firmemente a la hembra del cefalotórax, volteándola con los pleópodos hacia arriba y extendiéndole el abdomen, siempre debajo del agua, para evitar la exposición de los huevos a la hipoxia. Cada dos semanas se tomó una muestra de huevos de cada langosta, incrementando la frecuencia conforme se apreciaba un desarrollo avanzado del embrión. La muestra de huevos se analizó en un microscopio EVOS XL (Life Technologies).
5.3.
Colecta de larvas
Diariamente se tomó una muestra de huevos, tanto en el día como en la noche, para describir el desarrollo embrionario durante la etapa final de incubación de los huevos, hasta observar los pedúnculos oculares y el cambio de coloración de la freza, de anaranjado a rojo y de rojo a café, que es indicativo de que los embriones están próximos a eclosionar.
5.4.
Diseño experimental
Para evaluar el efecto de la temperatura sobre el desarrollo, las larvas se cultivaron a 18 y 24 °C. En un primer bioensayo, las larvas se colocaron en forma individual en recipientes de 250 mL, con 15 repeticiones para cada tratamiento. Simultáneamente, en un segundo bioensayo se hizo un cultivo masivo con una densidad de 70 filosomata·L-1, en recipientes de 20 L con un volumen útil de 15 L, en
las dos temperaturas por triplicado.
Posteriormente, en una segunda fase experimental, se omitió el cultivo individual, y únicamente se llevó a cabo el cultivo masivo, ahora con 5 repeticiones para cada tratamiento de temperatura, con las mismas condiciones que el cultivo masivo anterior.
5.5.
Cultivo individual de las larvas filosoma
Para el cultivo individual se realizó una modificación a la técnica descrita por Matsuda y Yamakawa (2000), Matsuda et al. (2006) y Goldstein et al. (2008) para las langostas P. longipes, P. penicillatus y
P. argus ,respectivamente, utilizada por Bautista-Soto (2016). Las unidades de cultivo fueron recipientes de vidrio con un volumen útil de 200 mL. El agua fue tratada inicialmente con cloranfenicol a una concentración de 10 mg·L-1 y cada día se hacía un cambio del 20% del volumen de
agua de mar filtrada y desinfectada con luz UV y ozono. Además, cada quinto día, la larva se pasaba a un recipiente limpio, provisto de agua de mar tratada con cloranfenicol y este procedimiento se repitió hasta el final del bioensayo. Las larvas se alimentaron con nauplios de Artemia franciscana de dos días de edad a una densidad de 3 nauplios·mL-1, enriquecidos con una emulsión rica en ácidos
5.6.
Cultivo masivo de las larvas filosoma
En el primer bioensayo masivo, cada tratamiento (18 y 24 °C) se hizo por triplicado. El diseño y funcionamiento de los recipientes de cultivo se hizo de acuerdo al modelo propuesto por Hughes et al. (1974), y se modificó como propusieron López-Zenteno (2004) y Galicia-Galicia (2006), para propiciar la formación de corrientes de afloramiento que mantienen en suspensión a las larvas. Se mantuvo un flujo continuo de agua (0.8-1 L·min-1). Para eliminar los microorganismos que
potencialmente pudieran afectar a las larvas, el agua de mar que se suministró a cada tanque de cultivo se desinfectó con luz UV y ozono. Para la alimentación se siguió un protocolo similar al del cultivo individual, es decir, se suministraron nauplios de Artemia 48 h de vida, de 1 a 2 mm de longitud y a una densidad de 3 organismos·mL-1.
En el segundo bioensayo se tuvieron 5 repeticiones para cada tratamiento. Los flujos de agua se mantuvieron a 0.8 L·min-1 al inicio y en forma gradual se incrementaron hasta 1.8 L·min-1, de acuerdo
al grado de desarrollo larval. La determinación del flujo y su incremento paulatino se realizó heurísticamente, de tal modo que la corriente de agua fuera capaz de mantener a las larvas en suspensión, sin que la corriente de salida las mantuviera enredadas en la malla de salida, pero permitiendo la salida de desechos (Kittaka, 1993; Illingworth et al., 1997). Cabe destacar que los flujos utilizados en este trabajo fueron similares a los utilizados por otros autores: 0.32, 0.38 y 1.27 L·min-1, por Hughes et al. (1974); >12.7 L·min-1, por Kittaka (1997a); 0.5 y 0.8 L·min-1, por Ritar
(2001); 1.0 y 1.2 L·min-1, por Matsuda y Takenouchi (2005).
El régimen alimenticio fue similar al sugerido por Matsuda y Yamakawa(2000), Matsuda et al. (2006) y Goldstein et al. (2008), con algunas modificaciones en cuanto a cantidad y modo de dosificación, en forma particular a partir del estadio IV de desarrollo, cuando las larvas filosoma se alimentaron principalmente con Artemia de una longitud entre 0.5 y 1 cm de longitud total y a una densidad de 1.8 a 2 organismos·mL-1, así como con trozos de gónada de mejillón y músculo de salmón. La Artemia
5.7.
Tratamiento del agua y monitoreo de las propiedades físico-químicas
Con el fin de asegurar la mejor calidad del agua, en el cultivo individual de las larvas se usó agua de mar sintética (Marine Salt Mix, Coralife), para lo cual, se disolvió sal hasta alcanzar 34 ups en agua potable, en recipientes de 20 L. A continuación se desinfectó con hipoclorito de sodio (0.5-3 mL·L-1)
por 24 h y se neutralizó con tiosulfato de sodio (150 mg·L-1). Este procedimiento se repitió en forma
consecutiva, de acuerdo con las necesidades del experimento individual.
Para el cultivo masivo, se utilizó agua de mar filtrada de la red de abastecimiento del Departamento de Acuicultura del CICESE, pasada a través de filtros de 50, 10, 5 y 1 µm, irradiada con luz UV, mediante una lámpara QL-25 (Lifegard Ultraviolet Sterilizer) y posteriormente almacenada en un reservorio cerrado de 250 L para cada temperatura; a cada uno de los reservorios se les inyectó ozono producido mediante un ozonizador MZ 250 (ClearWater Tech, California, USA), que era abastecido de aire filtrado a 1 µm de manera independiente, por una bomba de diafragma (Sweetwater® Linear II Diaphragm Air Pumps, modelo SL56A), para proporcionar el flujo de aire necesario para producir un potencial de óxido-reducción de ozono superior a 300 mV. Para evitar que el suministro de ozono fuera excesivo, se utilizó un medidor/controlador de ozono Redox ORP-MC510 (Milwaukee). El agua enriquecida con ozono se pasó por un filtro de carbón activado de 10 micras, para suministrarla a las unidades de cultivo.
A lo largo del experimento, se controlaron las condiciones fisicoquímicas del cultivo, realizando mediciones de la temperatura (°C), oxígeno disuelto (mgO2·L-1), pH, ozono (mV, PO-R) y
concentración de amonio (mgNH4·L-1) en los tanques de cultivo. Dichas mediciones fueron efectuadas
con el mayor cuidado, para no ocasionar ningún disturbio a los organismos. Los resultados del potencial óxido-reductor del ozono no incluyen variación, ya que el sistema de control funciona de manera automática, para mantener un valor constante e impedir que sea mayor que 450 mV y las medidas se hacen en el tanque de compensación que es común para todos los tratamientos.
5.8.
Producción del alimento vivo
a las recomendaciones de Sorgeloos (1977) y las modificaciones de López-Zenteno (2004), las cuales indican que para desencapsular los quistes, estos se hidratan con agua corriente durante 1 a 2 h con aireación constante e intensa, desde el fondo del recipiente. Transcurrido el periodo de hidratación de los quistes, se suspende la aireación y se sedimentan para separar los quistes viables de los no viables. Una vez concentrados los quistes viables se les agregó una solución 1:1 de agua:cloro, preparada con hipoclorito de sodio comercial (Cloralex®), se agitaron en forma constante y vigorosa durante aproximadamente 3-5 min (o hasta que se observó un cambio de coloración de café oscuro a anaranjado), finalmente se enjuagaron hasta eliminar toda presencia de cloro y cuando fue necesario, el cloro residual se neutralizó con tiosulfato de sodio. Los quistes desencapsulados se colocaron en un tanque de eclosión (con fondo cónico) a una temperatura de 28 °C y 22 ups, con una iluminación de 350 lux y aireación vigorosa y continua.
Para la segunda etapa del cultivo, se produjeron nauplios siguiendo los métodos de hidratación y desencapsulación descritos anteriormente y se cultivaron juveniles y adultos de A. franciscana
modificando el procedimiento descrito por López-Peraza (2014). Se utilizó un tanque de cultivo de 1 m3 con tubo de nivel en el centro, provisto de una malla de 150 micras para retener los nauplios.
Para mantener la calidad del agua se utilizó un sistema de recirculación, constituido por un biofiltro de cama dinámica con medio Kaldnes K-1, conectado al tanque de cultivo mediante el principio de los vasos comunicantes. El agua se succionó del biofiltro mediante una bomba FranklIn Electric de 3/4 HP no sumergible, y se impulsó hacia el tanque de cultivo, el biofiltro y un fraccionador de espuma.
El procedimiento de cultivo consistió en la siembra de nauplios recién eclosionados, a una temperatura de 26 °C, aireación e iluminación constantes y alimentados con una mezcla de levadura para panadería (saf-instant®) y Ori-One®, en una proporción de 30 g de levadura y 20 g de Ori-One®, mismos que eran mezclados en un litro de agua, con ayuda de una licuadora convencional, hasta que la mezcla se disolvía completamente. Dicha mezcla se agregaba en dos raciones, a las 9 y 20 h, para no sobresaturar el cultivo con alimento. La Artemia de la longitud adecuada se recolectaba utilizando una criba de 200 µm de apertura y se procedía a enriquecerla (metodología descrita más adelante).
5.9.
Enriquecimiento del alimento vivo
El enriquecimiento del alimento vivo se llevó a cabo con aceite de órbita ocular de atún Omegamex® (La Paz, Baja California Sur, México) y Ori-Green, composición: 7% de humedad, 105 mg·g-1 peso seco de HUMA, 43% proteínas, DHA/EPA 4, 30% lípidos (Orig-Go, SKRETTING). Se preparó una emulsión en agua con el 3% de aceite, siguiendo las indicaciones de Bautista-Soto (2016), se verificó que el tamaño de las micelas que se producen al agitar una mezcla del aceite y agua de mar en una licuadora durante al menos 1 min, tuvieran un diámetro menor a 30 μm. La emulsión se agregó a la solución a enriquecer, en una proporción de 1 mL·L-1 de agua de mar y con una concentración de
60-70 mil nauplios·L-1. El alimento-enriquecedor OriOne® (composición: 5% de humedad, 37 mg·g-1 de
peso seco de HUFA, 56% proteínas, DHA/EPA >5, 17% lípidos), se utilizó para la alimentación y previo enriquecimiento parcial de la Artemia juvenil y adulta, que se destinó al cultivo de las larvas filosoma VI, a razón de 0.228 g de OriOne®·L-1 de solución a enriquecer (de acuerdo a una extrapolación
derivada de las proporciones establecidas por el fabricante y tomando como base la concentración de 70 mil nauplios·L-1). El tiempo de enriquecimiento varió de 3 a 6 h, tiempos que están
comprendidos en el protocolo de enriquecimiento con aceite, utilizado por Chakraborty et al. (2010). El alimento enriquecido se desinfectó en un baño de formalina a una concentración de 100 ppm (Ritar, 2002) y se lavó profusamente con agua de mar filtrada e irradiada con luz UV por 5 min.
5.10.
Caracterización e identificación de los cambios morfológicos en las
larvas filosoma
Figura 3. Filosoma estadio I de Panulirus interruptus. Iniciales: a1, primera antena; a2, segunda antena; cs, espina coxal; en, endopodito; ex, exopodito; mxp3, tercer maxilípedo; p1, p2, p3, primero, segundo y tercer pereiópodos (tomada de Johnson, 1956).
En el presente estudio, se buscó resaltar la diferencia entre estadio e instar. Siendo el primero, una etapa larval específica, caracterizada por una o más diferencias morfológicas que la hacen “única” de acuerdo a una clasificación previamente realizada (Goldstein et al., 2008), mientras que el instar se refiere a una muda intermedia detectada en cultivo entre dos estadios consecutivos (Mikami y Greenwood, 1997).
Para apreciar los rasgos tan particulares y microscópicos de las larvas, se procedió a tomar fotografías aproximadamente dos veces por semana. Para ello, la larvas se aspiraron con la ayuda de una pipeta automática (Eppendorf Research®, Eppendorf AG) con capacidad de retener 5 mL. Ésta estaba equipada con una punta con su extremo inferior recortado, de tal manera que el orificio
a1 c2
cs
mxp3
p1
p2
p3
ex en
0.5
agrandado permitiera el libre paso de una filosoma con agua, sin lastimarla, pero que al mismo tiempo fuera capaz de mantener la succión por vacío de la muestra, sin que ésta se purgara sin presionar el émbolo. Una vez aspirada la muestra, ésta se depositaba en uno de los 9 pocillos de una caja multi-pozos. De cada tanque se sustraían 5 larvas para ser fotografiadas, mismas que eran colocadas en un pocillo diferente para evitar la mezcla y repetición de las muestras. Con el fin de obtener un muestreo lo más aleatorizado posible, y al mismo tiempo, no tan agresivo e invasivo, las larvas eran escogidas de distintos puntos tanto de la superficie como de una profundidad de 5 cm.
Las fotografías fueron tomadas en un microscopio estereoscópico (Olympus) equipado con una cámara fotográfica INFINITY3 (Lumenera, Co.) que permitía la captura de las imágenes, mismas que se analizaron con la ayuda del programa INFINITY Capture Imaging Software (Lumenera, Co.). Adicionalmente se utilizó un microscopio EVOS XL (Life Technologies), para observar alguna muestra que podía corresponder a un estadio nuevo o a un instar, realizándose generalmente, fuera del día de muestreo calendarizado previamente. A partir de las fotografías de las larvas se tomaron medidas de su longitud total (LT), desde el extremo anterior del cefalotórax (entre las antenas) hasta el extremo posterior del pleón (donde se encuentra el ano); longitud del cefalotórax (LC), ancho del cefalotórax (AC), ancho del tórax (AT) y la longitud del pleón (LP). La longitud total se utilizó como medida del cremiento, para realizar comparaciones entre tratamientos de temperaturas y entre estadios de desarrollo, tomándose las medidas de las larvas en cada uno de los estadios, sin considerar el día de la eclosión en el que se encontraban.
Para cuantificar la duración del periodo de intermuda o tiempo promedio de intermuda80, se
consideró el momento en el que se tenía el 80% de individuos de dos estadios consecutivos. También se cuantificó la edad de inicio de cada estadio, definida como el número de días después de la eclosión (DDE) en que se identificaba la primera larva filosoma de un estadio específico en el tanque de cultivo (Tabla 5).
5.11.
Análisis estadístico
Capítulo
6
. Resultados
6.1.
Condiciones de cultivo
En la Tabla 1, se muestra un resumen de las propiedades fisicoquímicas en cada tratamiento (18 y 24 °C). En ambos tratamientos la temperatura se mantuvo controlada durante el experimento, con una variación mínima (C. V. <2.2%). En cuanto al oxígeno disuelto (OD), en el tratamiento a 18 °C se tuvo una concentración de oxígeno de casi un miligramo más que en el tratamiento a 24 °C, y los niveles de saturación de oxígeno en ambos sistemas se mantuvieron por encima del 90%. El pH fue similar en ambos tratamientos y se mantuvo dentro de los límites establecidos para el agua de mar. Las lecturas del ozono (O3), registradas a lo largo de un día variaron entre 300 y 450 mV, no obstante se
observaron variaciones momentáneas de 180 a 510 mV. El amonio siempre mostró valores no detectables (ND) en ambos tratamientos.
Tabla 1. Valores promedio de las propiedades fisicoquímicas medidas en los cultivos de larvas filosoma de
Panulirus interruptus a 18 y 24 °C (± Desviación estándar). n=5
18 °C
24 °C
Temperatura (°C)
18.2±0.4
24.2±0.4
OD (mg
O2·L
-1)
8.98±0.4
7.84±0.3
pH
7.92±0.1
7.85±0.1
O
3(mV)
1300-450
300-450
N·NH
4(mg
NH4·L
-1)
ND
2ND
21 Potencial Óxido-Reducción en milivoltios 2 ND: “no detectable”.
