En el presente experimento, la temperatura (18 y 24 °C) y la salinidad (34 ups) se mantuvieron entre los límites de tolerancia de P. interruptus, considerando los límites definidos para las larvas filosoma estadio I: TCmin= 12 °C y TCmax= 31 °C; SCmin= 20-25 ups y SCmax= 50-52 ups (Serrano-Flores, 2001). El oxígeno disuelto se mantuvo con porcentajes de saturación superiores al 90% y con concentraciones de 8.98±0.4 y 7.84±0.3 mg·L-1 (18 y 24 °C, respectivamente), el amonio (N·NH
4) se
mantuvo en concentraciones indetectables y el pH fue de 7.92±0.1 y 7.85±0.1 (18 y 24 °C, respectivamente). Los valores de estos factores están en el intervalo recomendado para el cultivo de organismos marinos por Poxton y Allouse (1982), y por Timmons y Ebeling (2010). Por otro lado, las concentraciones de ozono (300-450 mV, PO-R), permanecieron dentro de los límites recomendados para las larvas de la especie J. edwardsii, cultivadas por Ritar et al. (2006), quienes utilizaron la cantidad de ozono necesaria para producir entre 390 y 440 mV de potencial O-R y filtraron el agua a través de carbón activado y arena de coral antes de suministrarla a los cultivos larvales.
En el presente trabajo, se registraron varios eventos de muda adicionales, o instars, respecto a algunos de los estadios para P. interruptus (Johnson, 1956). Así como se observaron estas mudas adicionales, no se pudieron identificar en los estadios IV y V, aunque en un estudio nutricional con esta especie, Pinto-Jiménez (com. per.) identificó un instar del estadio IV. Entre las causas que promueven la presencia o ausencia de estadios de desarrollo intermedios (instars) en los crustáceos decápodos, se encuentran: la cantidad y tipo de alimento (presas vivas y alimento formulado), sus características nutricionales, la temperatura, la salinidad y el fotoperiodo (Templeman, 1936a, b; Broad, 1957; Reeve, 1969a, b; Sandifer, 1973; Knowlton, 1974; Sulkin, 1978; Braine et al., 1979; Criales y Anger, 1986; Vijayakumaran y Radhakrishnan, 1986; Kittaka e Ikegami, 1988; Wehrtmann, 1991; Radhakrishnan y Vijayakumaran, 1995; Kittaka et al., 2001; Duggan y McKinnon, 2003; Goldstein et al., 2008; Smith et al., 2009; Oliphant et al., 2013). Los instars pueden ser parte de un desarrollo normal o se pueden considerar como desviaciones (Johnson, 1956; Gore, 1985).
En el presente estudio, las mudas adicionales se observaron a partir del estadio II. En el instar del estadio II (EII+), la diferencia con su estadio anterior fue tener una longitud total mayor y presentar setas en el primordio del cuarto pereiópodo, sin cumplir con otras características del estadio III (como segmentación del cuarto par de pereiópodos y poseer un primordio en el quinto par de pereiópodos). El instar EII+ no se había documentado con anterioridad en la literatura (Mitchell, 1971; Dexter, 1972; Vea-Campa, 2003; López-Zenteno, 2004; Galicia-Galicia, 2006; Bautista-Soto, 2016). Además de este instar, se describieron 4 formas más, presentes tanto en el estadio II, como en el instar II+, sin embargo, no se pudo cuantificar su proporción con respecto a la población total.
Del mismo modo, para el estadio III se identificó un instar (III+), el cual tuvo una longitud total mayor en comparación con el estadio precedente. Este instar es similar al observado por Dexter (1972), quien pudo cuantificar la proporción de los diferentes instars en la población. En el presente trabajo, se observó un evento único de muda masiva y se diferenció por haber sucedido al estadio III y porque no cumplía con las características morfológicas que identifican a una filosoma estadio IV (Johnson, 1956), por lo que se clasificó como estadio III+.
Dexter (1972), cultivó larvas de P. interruptus en forma individual y observó diferentes formas del estadio III, muy similares a las que se encontraron en este trabajo, mismas que se catalogaron como “instars”. En el presente trabajo, las larvas no se cultivaron de forma individual, por lo que es difícil precisar, al momento de analizar la morfología, el estadio previo de los organismos. Una de las discrepancias en la clasificación de las larvas del estadio III con respecto al trabajo de Dexter (1972), es que su clasificación ubica en el estadio III a las larvas que en éste trabajo se clasificaron como estadio II+, ya que la clasificación se basó exclusivamente en el trabajo de Johnson (1956), en el que se diferencian los estadios II y III. Ya que la filosoma II no tiene setas en el tercer par de pereiópodos, y solo se observan los primordios del cuarto par de pereiópodos. Para resolver estas discrepancias es necesario actualizar y homologar los criterios de identificación de estadios, para contar con una referencia más actual para describir la ontogenia de esta especie en trabajos futuros.
Los trabajos previos, relacionados con el cultivo de las larvas de P. interruptus, solo han logrado cultivarlas hasta el estadio VI y no se tiene información de estadios posteriores (Mitchell, 1971; Dexter, 1972; López-Zenteno, 2004).
Como ya se mencionó, diferentes causas pueden propiciar que una larva mude en más de una ocasión (instar), antes de pasar a un estadio particular, o que mude en forma directa de un estadio a otro. (Faxon, 1879; Gurney, 1942; Lebour, 1940; Gurney y Lebour, 1941). El método de muestreo en el medio natural, puede evitar que se identifique un determinado instar, del mismo modo, las condiciones físico-químicas del medio, la disponibilidad y calidad de alimento, tanto para los progenitores (origen genético y biológico de las larvas), como para las larvas al momento de su eclosión y a lo largo de su ontogenia, pueden modificar el patrón de muda, reduciendo o incrementando el número de estadios (Gurney, 1942; Forster, 1951; Reeve, 1969a; Braine et al., 1979; Rabalais y Gore, 1985).
En la especie Palinurus elephas se ha documentado el “salto” de instars. En sus primeras experiencias, Kittaka e Ikegami (1988), lograron cultivar todas las etapas larvales, desde huevo hasta puerulus, e identificaron aproximadamente 9 mudas y con una supervivencia de un solo individuo. En
ensayos posteriores, lograron perfeccionar la técnica del cultivo, y además de obtener una mayor supervivencia (12 organismos hasta puerulus); lograron completar el desarrollo de la fase filosoma en 6 mudas hasta el estadio puerulus (Kittaka et al., 2001). Otro ejemplo claro de éste proceso facultativo de muda se ha descrito en más de una ocasión en Panulirus homarus (Vijayakumaran y Radhakrishnan, 1986; Radhakrishnan y Vijayakumaran, 1995), en donde se detectó que con densidades de alimento de más de 40 nauplios de Artemia en 60 mL, pasaban del estadio III al IV en sólo dos mudas, evitando así, una muda intermedia, y con menores densidades de alimento, las larvas mudaban 3 veces entre el estadio III y IV.
Duggan y McKinnon (2003) describieron en Panulirus ornatus, un número diferente de estadios en comparación con los que describieron Smith et al. (2009), que no detectaron una muda entre los estadios III y V, por lo que concluyeron que su método de cultivo mejorado, permitió omitir un paso en la sucesión de mudas.
La frecuencia y el número de mudas entre estadios (instars) pueden ser, entre muchas otras variables, provocadas por la temperatura (Templeman, 1936a; Sandifer, 1973; Criales y Anger, 1986; Oliphant et al., 2013). Esta variable es fundamental en el desarrollo de los organismos y entre los efectos más sobresalientes del incremento de la temperatura, el más importante es el aumento de la tasa metabólica, esto es, el incremento de las tasas de los procesos catabólicos y anabólicos (Randall, 2000; Hochachka y Somero, 2002).
Una de las respuestas más conspicuas y generales de los organismos, es que aquellos que se desenvuelven en climas fríos, tienen un mayor tamaño que los que se desarrollan en temperaturas más cálidas. Esta premisa es el fundamento de la “regla de Bergman” (Bergman, 1847) y de la “regla del tamaño-temperatura” (Atkinson, 1996). La primera describe la asociación entre el tamaño del cuerpo del individuo y la temperatura de su hábitat natural, mientras que la segunda se limita al análisis a nivel de laboratorio (Angilletta y Duhnham, 2003). Aunque ambos estatutos incluyen a seres vivos endotermos y ectotermos, la regla del tamaño-temperatura ha tomado más importancia en el ámbito experimental, y se ha enfocado en el estudio de diversos organismos ectotermos, pues entre estos, se han generado evidencias de que estas reglas no se pueden aplicar de manera generalizada, diseñándose modelos matemáticos, que incluyen las relaciones entre la temperatura y las tasas de desarrollo y crecimiento, para predecir si un organismo ectotermo se ajustará a esta regla (van der Have y de Jong, 1996; Angilletta y Dunham, 2003; Walters y Hassall, 2006).
El crecimiento de las larvas de P. interruptus fue afectado en forma positiva por la temperatura en la presente investigación, ya que a los 75 DDE, la longitud total fue de 3.11 y 4.69 mm para las larvas
cultivadas a 18 y 24 °C respectivamente (Figura 9). El desarrollo inicial hasta el estadio filosoma III, pareciera no haber sido afectado por la temperatura (Figura 8), ya que las larvas cultivadas a 18 y 24 °C tenían una longitud similar (2.95 y 3.09 respectivamente, Tabla 3).
Atkinson (1994, 1995) analizó la relación entre el crecimiento y la temperatura descrita en 109 trabajos con organismos ectotermos y observó que en el 83% de los casos el crecimiento era afectado negativamente por una temperatura mayor, por lo que se ajustaban a la regla del tamaño- temperatura y solo en el 11.9%, una temperatura menor propició un mayor crecimiento.
Las numerosas especies de langostas habitan en ambientes con características climáticas muy diversas y con grandes variaciones ambientales que se registran a lo largo de su ontogenia (Adams et al., 2006; Adams y Ebersole, 2009; Briones-Fourzán y Lozano-Álvarez, 2006). Algunos estudios relacionados con la fase larvaria han ayudado a corroborar la validez de esta regla, como en P. cygnus, en donde Marinovic (1996) observó que las larvas cultivadas a 25 °C, crecían menos que las cultivadas a 20 °C. Lo mismo identificaron Liddy et al. (2004), con larvas cultivadas a 25 °C, las cuales fueron más pequeñas, comparadas con las cultivadas a bajas temperaturas (19 y 22 °C). En Jasus edwardsii, Tong et al. (2000a) estudiaron el efecto de cinco temperaturas de cultivo (12, 15, 18, 21 y 24 °C) sobre el crecimiento larval y observaron que las larvas cultivadas a 18 °C, eran más grandes, y las cultivadas a 21 °C, tenían un tamaño relativamente más pequeño. Bermudes y Ritar (2008) cultivaron larvas de la misma especie en diferentes niveles de temperatura y fotoperiodo, y observaron que también tenían un mayor crecimiento a temperaturas bajas. Por otro lado, Carlberg y Van Olst (1976), en su trabajo con larvas de Homarus americanus, probaron temperaturas altas (19 °C) y bajas (entre 15 y 16 °C), propiciándose el desarrollo de organismos de mayor tamaño entre 15 y 16 °C, en comparación con las larvas cultivadas a 19 °C.
En contraste con las evidencias que confirman la regla del tamaño-temperatura, también hay evidencia que contradice esta regla. Matsuda y Yamakawa (1997), observaron que el cultivo de larvas de Panulirus japonicus, a 26 °C, propició el desarrollo de ejemplares significativamente más grandes, en comparación con las larvas cultivadas a 20 °C, en las que el crecimiento era menor y mucho más lento. Además establecieron que a 26 °C, los estadios iniciales tenían un mejor desempeño, mientras que en los estadios intermedios, su desempeño mejoraba a 24 °C. Moss et al.
(2001) estudiaron el efecto de la temperatura (en un intervalo de 18 a 27 °C) y de la ración de alimento en el crecimiento y supervivencia de las larvas de Sagmariasus verreauxi, y notaron que a temperaturas intermedias (21 y 24 °C) las larvas crecieron más y que determinados estadios se debían cultivar preferentemente a 21 °C y otros a 24 °C, empero concluyeron que esta especie creció más conforme su temperatura de cultivo se incrementaba. En un trabajo más reciente, Fitzgibbon et
al. (2012), estudiaron el efecto de la temperatura en el desarrollo, respiración y consumo de alimento de larvas de S. verreauxi; sus conclusiones coinciden con las de Moss et al. (2001), sin embargo, recomiendan que los estadios tempranos se cultiven a 26 °C y los estadios intermedios y tardíos a 23 °C.
No obstante, en otras especies de crustáceos decápodos, como cangrejos y camarones, se ha confirmado que sí se ajustan a la regla antes mencionada, es decir, a bajas temperaturas o temperaturas intermedias (dentro de su límite de tolerancia), crecen de un mayor tamaño (Rothlisberg, 1979; Johns, 1981; Minagawa, 1990; Kumlu et al., 2000), mientras que otros, crecen más y más rápido a altas temperaturas (Oliphant et al., 2013).
De acuerdo con el crecimiento de las larvas de P. interruptus observado en este trabajo, éstas siguen una tendencia opuesta a la establecida en la regla del tamaño-temperatura, puesto que a temperaturas más elevadas, alcanzaron mayor longitud. Estos resultados confirman las observaciones de Dexter (1972) y López-Zenteno (2004). Sin embargo, el desarrollo larval de P. interruptus no se ha completado hasta llegar a puerulus, por lo cual sólo se puede especular si el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de las filosomata más avanzadas será parecido al observado en P. japonicus y Sagmariasus verreauxi (Matsuda y Yamakawa, 1997; Moss et al., 2001; Fitzgibbon et al. 2012), o si una temperatura constante a lo largo del cultivo pudiera beneficiarlas más, como en las larvas del camarón Palaemoetes varians (Oliphant et al., 2013).
Pese a que los resultados de Dexter (1972) y López-Zenteno (2004), referentes a la dependencia del crecimiento con respecto a la temperatura, concuerdan con los de este trabajo, una comparación de las longitudes de las larvas filosoma de los tres estudios indica diferencias (Tabla 5). La longitud de las larvas en este trabajo, fue mayor que la de otros cultivos (Mitchell, 1971; Dexter, 1972; Vea-Campa, 2003; López-Zenteno, 2004; Galicia-Galicia, 2006; Pinto-Jiménez, 2016). Sin embargo, al compararlas con las longitudes que Johnson (1956) registró para larvas que provenían de muestras del medio natural, las longitudes de las larvas del estadio III en adelante reportadas por este autor resultaron más grandes.
Tabla 5. Comparación de rangos o promedios de longitud total (mm) ± Desv. est. de larvas filosoma de P. Interruptus en diferentes estadios, observadas por diferentes autores (los valores separados por un punto y coma, indican los resultados de experimentos diferentes)
Estadio Autor
Johnson
(1956) Mitchell (1971) Dexter (1972) Vea-Campa (2003)
López- Zenteno (2004)1 Galicia- Galicia (2006) Pinto- Jiménez (2016) Presente trabajo I 1.2 - 1.5 1.2 - 1.7 1.4±0.1 1.6±0.1 1.7±0.1; 1.7±0.1 1.6±0.1 1.7±0.1; 1.7±0.1 II 2.4 - 2.8 1.5 - 2.1 1.8±0.1; 1.7±0.2 2.2±0.1 2.1±0.1; 2.1±0.1 2.1±0.1 2.1±0.1 ; 2.2±0.1 2.1±0.1; 2.2±0.1 II+ 2.6±0.1; 2.7±0.1 III 3.3 - 3.8 2.1 - 3.0 2.1±0.1; 2.3±0.2 2.5±0.1 2.6±0.1; 2.7±0.1 2.6±0.1 ; 2.6±0.1 3.0±0.2; 3.1±0.3 III+ 2.4±0.2; 2.7±0.1 3.5±0.2 III++ 2.6±0.1; 3.0±0.1 IV 4.6 - 5.2 2.9 - 3.0 3.0±0.1 3.7±0.2; 3.6±0.5 3.7±0.3 ; 3.7±0.2 3.7±0.2 V 6.0 - 6.8 3.5 - 3.7 3.6±0.1 4.0±0.2; 4.2±0.2 4.3±0.4 VI 7.9 - 8.5 3.7 - 3.7 3.7±0.0 4.6±0.3; 4.5±0.3 4.5±0.3 VI+ 5.0 VI++ 5.4 VI+++ 6.2
1 Se tomaron los resultados del tercer experimento de dicho autor.
Una condición que pudo resultar limitante para el crecimiento de las larvas en el estudio de López- Zenteno (2004), es que las cultivó a mayores densidades (90, 150 y 100 larvas·L-1), en comparación
con la de este estudio (70 larvas·L-1). Pocos han sido los experimentos con langostas espinosas que
se han llevado a cabo con más de 5 larvas por litro. Sin embargo, han sido cultivadas larvas de Jasus edwardsii, a seis densidades (5, 10, 20, 40, 80 y 160 larvas·L-1) por Smith y Ritar (2006). Ellos
encontraron un efecto de la densidad de, ya que las que fueron cultivadas a 5, 10, y 20 larvas·L-1
fueron más grandes (a partir del estadio III y IV), que en densidades superiores a 40 larvas·L-1, y las
más pequeñas se obtuvieron cuando se cultivaban a una densidad de 160 larvas·L-1. No obstante, la
supervivencia no varió. Por otro lado, en un estudio más reciente con S. verreauxi, se cultivaron larvas a 20 y 60 filosomata·L-1 (Jensen et al., 2013) y sus resultados indicaron que las filosomata
cultivadas a bajas densidades fueron más largas, anchas y con mayor peso seco, que las cultivadas a altas densidades. La razón principal que se presume podría ser la causante de estos resultados, es que en altas densidades, las larvas están en constante interacción entre ellas, interrumpiendo su comportamiento alimenticio y evitando que se alimenten lo suficiente.
Adicionalmente, la calidad de la dieta puede contribuir a mejorar el crecimiento. En este estudio se siguió la recomendación de Bautista-Soto (2016), quien evaluó el enriquecimiento del alimento vivo (nauplios de Artemia franciscana) con una emulsión elaborada a base de aceite de órbita de atún (Omegamex®), rica en ácido docosahexaenoico (DHA). Además, se siguieron también las recomendaciones de Chakraborty et al. (2010), quienes indican que un enriquecimiento de 3 h es suficiente para mejorar el contenido general de ácidos grasos poliinsaturados en nauplios, metanauplios y juveniles de Artemia.
A partir de los 40 DDE, las larvas se alimentaron con juveniles y adultos de Artemia, el protocolo de producción del alimento vivo en esta etapa involucró el uso de dos alimentos comerciales (comúnmente utilizados para la producción de rotíferos), OriOne® y Origreen® (Skretting, Noruega), los cuales contienen una mezcla en polvo de proteínas vegetales, aceite de pescado, algas, fosfolípidos, emulsionantes, minerales y vitaminas. Cabe destacar que el empleo de estos ingredientes en el protocolo de cultivo fue meramente heurístico, pues en la literatura concerniente al cultivo de larvas filosoma, no se habla de la utilización de estos aditivos en los protocolos de producción de alimento vivo.
Las experiencias más recientes de cultivo con otras especies de langosta, indican que el uso de gónada de mejillón es adecuado para la alimentación de larvas a partir del estadio V. En este trabajo se utilizó filete de salmón para alimentar a las larvas en estadio IV, V y VI, (ya que por la temporada del año, no se disponía de mejillones maduros sexualmente) y se observó que lo consumían, pero su uso ocasionó el deterioro de la calidad del agua. Por esta razón, se reanudó el uso de adultos de
Artemia, alimentados con los productos antes mencionados. Con este alimento las larvas continuaron creciendo, aunque la mortalidad fue muy importante, aparentemente, por la infestación con una bacteria epibionte. Después de este episodio de mortalidad quedó una sola larva, la cual se siguió alimentando con adultos de Artemia y se desarrolló hasta la etapa filosoma VI+++. Durante los últimos días, el suministro de alimento disminuyó, debido a fallas en el sistema de producción de
Artemia por lo que es porbable que el consumo no fue suficiente para la larva filosoma). En el futuro será importante evaluar el uso de alimento vivo cultivado con alimentos diseñados para el crecimiento y enriquecimiento, como los utilizados en este estudio.
La reducción del periodo de intermuda en crustáceos decápodos, es otro de los efectos del incremento en la temperatura y se ha documentado ampliamente (Hadley, 1906; Templeman, 1936a, b; Costlow et al., 1960; Sandifer, 1973; Rothlisberg, 1979; Minagawa, 1990; Marinovic, 1996; Matsuda y Yamakawa, 1997; Kumlu et al., 2000; Tong et al., 2000a; Carlberg y Van Olst, 1976; Kittaka
Fitzgibbon et al., 2012; Oliphant et al., 2013). No obstante, a pesar de que la reducción en el tiempo de desarrollo entre los estadios, puede ser adecuada para el cultivo de las larvas filosoma, un incremento o decremento en la temperatura, fuera del límite de tolerancia biológico de la especie, generalmente desencadena una respuesta negativa en su alimentación y por ende, en el crecimiento, e inclusive, si esta condición térmica estresante se mantiene, sobreviene la muerte.
Se ha observado en las larvas de Panulirus japonicus y Homarus americanus, que una temperatura de cultivo fuera de los límites de tolerancia induce una disminución en la ingesta de alimento (Inoue, 1965; Carlberg y Van Olst, 1976). De manera similar, las larvas de H. americanus cultivadas a 16 y 19 °C, comían más que las larvas cultivadas a mayor temperatura (Carlberg y Van Olst, 1976). En el presente trabajo, no se analizó la cantidad de alimento consumido, pero se observó que en ambos tratamientos, siempre que había alimento, las larvas filosoma se congregaban tratando de capturarlo. Sin embargo, en el tratamiento con la temperatura más baja, las larvas eran menos activas y, por ende, es probable que la cantidad de alimento consumido, fuese menor que en las larvas en el tratamiento con la temperatura más alta. Inoue (1965), observó que las larvas de
Panulirus japonicus, disminuían su ingesta de alimento cuando se sobrepasaban los límites inferior y superior del rango óptimo (22-28 °C), contrastando con el presente estudio. Cabe resaltar que los límites de tolerancia térmica (Serrano-Flores, 2001), no fueron sobrepasados en los distintos niveles de los tratamientos.
La supervivencia es otra variable que se ve afectada cuando las larvas se cultivan a una temperatura fuera de los límites de tolerancia térmica, dependiendo de la especie y estadio, como en las larvas de los camarones Pandalus jordani y Panaeus semisulcatus (Rothlisberg, 1979; Kumlu et al., 2000), las de los cangrejos Cancer irroratus y Ranina ranina (Johns, 1981; Minagawa, 1990), o las de las langostas espinosas P. cygnus, P. japonicus, J. edwardsii y S. verreauxi, (Marinovic, 1996; Matsuda y Yamakawa, 1997; Tong et al., 2000a; Fitzgibbon et al., 2012). Es por esto que en algunos cultivos se opta por disminuir o incrementar la temperatura en el cultivo, dependiendo del estadio en cuestión.
En el presente bioensayo, a pesar de que no se cuantificó la supervivencia al mismo tiempo en ambos tratamientos, fue evidente que ésta declinó de forma tal, que a los 53 DDE, la supervivencia de las larvas cultivadas a las dos temperaturas, era casi la misma. No obstante, las temperaturas seleccionadas, no sobrepasaron los límites de tolerancia térmica especificados para larvas filosoma I de P. interruptus (Serrano-Flores, 2001), por lo que no se considera que la temperatura haya sido la causa de la alta mortalidad. En contraste, las larvas de Pandalus jordani (Rothlisberg, 1979), Cancer irroratus (Johns, 1981), Panulirus japonicus (Matsuda y Yamakawa, 1997) y Panaeus semisulcatus
(Kumlu et al., 2000), tuvieron una menor supervivencia cuando se cultivaron en temperaturas próximas a sus límites de tolerancia, ya fueran superiores o inferiores.
Las temperaturas utilizadas para el cultivo de P. interruptus en este trabajo se mantuvieron en 18 y 24 °C, con un magen de variación muy reducido. En las larvas de P. cygnus, el cultivo con temperaturas constantes resultó benéfico (Marinovic, 1996). En contraste, para otras especies,