ANEXO 3
BIBLIOTECA ALFONSO BORRERO CABAL, S.J. DESCRIPCIÓN DE LA TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO FORMULARIO
TÍTULO COMPLETO DE LA TESIS DOCTORAL O TRABAJO DE GRADO
EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA A ANTISÉPTICOS USADOS A NIVEL HOSPITALARIO DE CEPAS MULTIRESISTENTES DE INTERES A NIVEL CLÍNICO
SUBTÍTULO, SI LO TIENE
AUTOR O AUTORES
Apellidos Completos Nombres Completos
Cruz Rodríguez Andrea del Pilar
DIRECTOR (ES) TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO
Apellidos Completos Nombres Completos
Hernández Libardo
Arias Palacios Janeth del Carmen
FACULTAD Ciencias
PROGRAMA ACADÉMICO Tipo de programa ( seleccione con “x” )
Pregrado Especialización Maestría Doctorado
X
Nombre del programa académico Microbiología Industrial
Nombres y apellidos del director del programa académico Janeth del Carmen Arias Palacios
TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE: Microbiólogo Industrial
PREMIO O DISTINCIÓN (En caso de ser LAUREADAS o tener una mención especial):
CIUDAD AÑO DE PRESENTACIÓN DE LA
TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO
NÚMERO DE PÁGINAS
Bogotá 2012 28
TIPO DE ILUSTRACIONES ( seleccione con “x” ) Dibujos Pinturas Tablas, gráficos y
diagramas Planos Mapas Fotografías Partituras
X X X
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DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVE EN ESPAÑOL E INGLÉS
Son los términos que definen los temas que identifican el contenido. (En caso de duda para designar estos
descriptores, se recomienda consultar con la Sección de Desarrollo de Colecciones de la Biblioteca Alfonso
Borrero Cabal S.J en el correo [email protected], donde se les orientará).
ESPAÑOL INGLÉS
Multiresistencia Multidrug
Antisépticos Antiseptics
Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
Escherichia coli Escherichia coli
RESUMEN DEL CONTENIDO EN ESPAÑOL E INGLÉS
(Máximo 250 palabras - 1530 caracteres)
Actualmente la desinfección hospitalaria necesita de muchos más controles gracias a la tolerancia o resistencia adquirida de algunas bacterias frente a los agentes desinfectantes usados en el proceso de esterilización en las instalaciones médicas, generando así muchas infecciones que están causando complicaciones en los cuadros clínicos de los pacientes. El objetivo de éste estudio fue determinar la resistencia o tolerancia de cepas multiresistentes a antibióticos (Staphylococcus aureus Meticilino Resistente SARM y Escherichia coli BLEES) frente a cuatro productos antisépticos (Alcohol Etílico 61%P/P+Clorhexidina Base 1%P/P, Alcohol Etílico 65%P/P, Gluconato de Clorhexidina 4%P/V y Alcohol Etílico 70%V/V) con respecto a diferentes tiempos de contacto. Para conocer la viabilidad de las cepas de trabajo, se realizaron dos pases en agar tripticasa soya y su respectiva confirmación morfológica con Tinción de Gram. Con el fin de conocer la tendencia de crecimiento de cada cepa se realizaron curvas de crecimiento en caldo tripticasa soya en erlenmeyer de 250mL con un VET 80% y un inoculo a una concentración 3x108células/mL; el proceso se llevó a cabo por un tiempo de 24 horas a una temperatura de 37°C con una agitación de 100rpm, se tomaron 10 muestreos para cada una de las cepas y la lectura de crecimiento se realizó por absorbancia a 540nm. Para poder realizar la cuantificación de biomasa se tuvo en cuenta la curva de calibración de MacFarland y poder graficar Células/ml vs. Tiempo. Por otro lado se evaluó la resistencia frente a los cuatro antisépticos, los cuales fueron trabajados en ciego y dados por Laboratorios Vicar Farmacéutica. La evaluación se llevó a cabo colocando en contacto 8mL del antiséptico con 2mL de suspensión celular estandarizada al tubo 2 del patrón de MacFarland durante el tiempo de estudio (0, 4, 8, 16, 32, 64, 128 segundos), para frenar la reacción se utilizó 0.5mL de Caldo Letheen en cada uno de los tubos; para evaluar el crecimiento se realizó la lectura por absorbancia a 540nm utilizando como blanco 8mL del antiséptico, 2mL de solución salina y 0.5mL de Caldo Letheen; para la gráfica se tuvo en cuenta la curva patrón de MacFarland y así graficar Células/mL Vs. Tiempo. Como resultado se observó que ambas cepas multiresistentes de trabajo presentaron una sensibilidad frente a los agentes antisépticos A, B y E ya que ninguna presentó crecimiento sobresaliente en el tiempo de estudio y hubo una disminución total en su concentración; mientras que ambas cepas tuvieron una concentración constante al ponerse en contacto con el producto G, presentando crecimiento hasta los 128 segundos.
De acuerdo a los resultados observados se puede concluir que las dos cepas evaluadas presentan una sensibilidad frente a los productos A, B y E, lo cual los convierte en productos aptos para la desinfección principalmente de manos en áreas clínicas, ya que con un bajo tiempo de contacto se logra reducir totalmente la concentración de las cepas multiresistentes. En cuanto al producto G se observó una resistencia de ambas cepas, lo que obligaría a una mejora en la fórmula del antiséptico para poder realizar un ensayo con la nueva formulación y establecer si es necesario aumentar el tiempo de contacto del ensayo y así asegurar la inhibición bacteriana.
Currently the hospital disinfection needs of many more controls through tolerance or acquired resistance of some bacteria against disinfecting agents used in the sterilization process in medical facilities, generating many infections that are causing complications in the patients' clinical . The aim of this study was to determine the resistance or tolerance of strains multiresistant to antibiotics (methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli ESBL MRSA) against four antiseptics (Ethyl Alcohol 61% w / w Chlorhexidine Base + 1% P / P, Alcohol Ethyl 65% w / w, Chlorhexidine Gluconate 4% W / V and Ethyl Alcohol 70% V / V) for different contact times. To determine the viability of the strains was done using two passes on trypticase soy agar and morphological confirmation respective Gram stain. To know the trend of growth of each strain growth curves were performed in trypticase soy broth in 250 mL Erlenmeyer flask with a VET 80% and inoculum at a concentration 3x108células/mL, the process was carried out by a time 24 hours at a temperature of 37 ° C with an agitation of 100 rpm, 10 samples were taken for each of the strains and growth reading was performed by absorbance at 540nm. In order to perform the quantification of biomass was taken into account the calibration curve and to plot MacFarland cells / ml vs. Time. On the other hand resistance was evaluated against the four antiseptics, which were examined in blind and given Vicar for Pharmaceutical Laboratories. The evaluation was carried out by placing in contact with 2mL antiseptic 8mL of standardized cell suspension to the tube 2 MacFarland pattern during the study period (0, 4, 8, 16, 32, 64, 128 seconds), to control the reaction was used 0.5mL of Letheen broth in each of the tubes to assess the growth was performed by absorbance reading at 540nm using as white 8mL of antiseptic, 2 mL of saline and 0.5mL of Letheen broth, for the graph was into account the standard curve plot MacFarland and so cells / mL vs. Time. As a result it was observed that both strains had a multiresistant work sensitive to antiseptic agents A, B and E because none showed outstanding growth in the study period and there was an overall decrease in their concentration, while both strains had a concentration constant contact with the product G, showing growth up to 128 seconds. According to the results observed can be concluded that the two strains studied had a sensitivity to products A, B and E, which makes products suitable for disinfection of hands mainly in clinical areas, because with a low time contact is achieved totally reduce the concentration of multi-resistant strains. On the product G resistance was observed for both strains, which would require improved antiseptic formula to perform a test with the new formulation and determine the need to increase the contact time of the trial and thus ensure the inhibition bacterial.
EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA A ANTISÉPTICOS USADOS A NIVEL HOSPITALARIO DE CEPAS MULTIRESISTENTES DE INTERES A NIVEL CLÍNICO
ANDREA DEL PILAR CRUZ RODRIGUEZ
Director
LIBARDO HERNANDEZ
Codirectora
JANETH ARIAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.
EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA A ANTISÉPTICOS USADOS A NIVEL HOSPITALARIO DE CEPAS MULTIRESISTENTES DE INTERES A NIVEL CLÍNICO
Presentado por
ANDREA DEL PILAR CRUZ RODRIGUEZ
APROBADO
_____________________________________ Dra. Ingrid Schuller
Decano Académico
_____________________________________ Dra. Janeth del Carmen Arias
EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA A ANTISÉPTICOS USADOS A NIVEL HOSPITALARIO DE CEPAS MULTIRESISTENTES DE INTERES A NIVEL CLÍNICO
Presentado por
ANDREA DEL PILAR CRUZ RODRIGUEZ
APROBADO
_____________________________________ Libardo Hernández, Químico Farmacéutico Director
_____________________________________ Janeth del Carmen Arias, Bacterióloga
Codirector
_____________________________________ Diana Aldana, Microbióloga Industrial
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
RESUMEN
Actualmente la desinfección hospitalaria necesita de muchos más controles gracias a la tolerancia o resistencia adquirida de algunas bacterias frente a los agentes desinfectantes usados en el proceso de esterilización en las instalaciones médicas, generando así muchas infecciones que están causando complicaciones en los cuadros clínicos de los pacientes. El objetivo de éste estudio fue determinar la resistencia o tolerancia de cepas multiresistentes a antibióticos (Staphylococcus aureus Meticilino Resistente SARM y Escherichia coli BLEES) frente a cuatro productos antisépticos (Alcohol Etílico 61%P/P+Clorhexidina Base 1%P/P, Alcohol Etílico 65%P/P, Gluconato de Clorhexidina 4%P/V y Alcohol Etílico 70%V/V) con respecto a diferentes tiempos de contacto. Para conocer la viabilidad de las cepas de trabajo, se realizaron dos pases en agar tripticasa soya y su respectiva confirmación morfológica con Tinción de Gram. Con el fin de conocer la tendencia de crecimiento de cada cepa se realizaron curvas de crecimiento en caldo tripticasa soya en erlenmeyer de 250mL con un VET 80% y un inoculo a una concentración 3x108células/mL; el proceso se llevó a cabo por
un tiempo de 24 horas a una temperatura de 37°C con una agitación de 100rpm, se tomaron 10 muestreos para cada una de las cepas y la lectura de crecimiento se realizó por absorbancia a 540nm. Para poder realizar la cuantificación de biomasa se tuvo en cuenta la curva de calibración de MacFarland y poder graficar Células/ml vs. Tiempo. Por otro lado se evaluó la resistencia frente a los cuatro antisépticos, los cuales fueron trabajados en ciego y dados por Laboratorios Vicar Farmacéutica. La evaluación se llevó a cabo colocando en contacto 8mL del antiséptico con 2mL de suspensión celular estandarizada al tubo 2 del patrón de MacFarland durante el tiempo de estudio (0, 4, 8, 16, 32, 64, 128 segundos), para frenar la reacción se utilizó 0.5mL de Caldo Letheen en cada uno de los tubos; para evaluar el crecimiento se realizó la lectura por absorbancia a 540nm utilizando como blanco 8mL del antiséptico, 2mL de solución salina y 0.5mL de Caldo Letheen; para la gráfica se tuvo en cuenta la curva patrón de MacFarland y así graficar Células/mL Vs. Tiempo. Como resultado se observó que ambas cepas multiresistentes de trabajo presentaron una sensibilidad frente a los agentes antisépticos A, B y E ya que ninguna presentó crecimiento sobresaliente en el tiempo de estudio y hubo una disminución total en su concentración; mientras que ambas cepas tuvieron una concentración constante al ponerse en contacto con el producto G, presentando crecimiento hasta los 128 segundos. De acuerdo a los resultados observados se puede concluir que las dos cepas evaluadas presentan una sensibilidad frente a los productos A, B y E, lo cual los convierte en productos aptos para la desinfección principalmente de manos en áreas clínicas, ya que con un bajo tiempo de contacto se logra reducir totalmente la concentración de las cepas multiresistentes. En cuanto al producto G se observó una resistencia de ambas cepas, lo que obligaría a una mejora en la fórmula del antiséptico para poder realizar un ensayo con la nueva formulación y establecer si es necesario aumentar el tiempo de contacto del ensayo y así asegurar la inhibición bacteriana.
INTRODUCCIÓN
La resistencia de las bacterias a múltiples sustancias es un problema de salud pública que se viene observando a nivel mundial después de la aparición de los antibióticos. El uso indiscriminado de los antibióticos y la presión selectiva ambiental realizada por antisépticos y desinfectantes ha generado una respuesta de supervivencia en los microorganismos, que los capacita para evadir con eficiencia la acción bactericida de algunos agentes (8).
La resistencia bacteriana es un mecanismo por el cual las diferentes bacterias sobreviven al efecto de los antimicrobianos desarrollándose de tal manera que se convierten en cepas multiresistentes capaces de generar infecciones severas en los humanos. Evolutivamente, este tipo de microorganismos ha generado diferentes procesos por los cuales logran inhibir la acción del antibiótico, gracias a las malas prácticas en el uso por parte de la sociedad (8). A nivel hospitalario, la gran mayoría de agentes antimicrobianos empleados para el tratamiento de infecciones por bacterias, son aquellos considerados de primera línea. Por tal motivo, surge un problema social que abarca desde el uso limitado de estos antibióticos frente a una cepa bacteriana multiresistente, disminución de la calidad de vida del paciente y elevación en el costo para las entidades de salud por el alargamiento de estancias hospitalarias.
En la actualidad se intenta dilucidar si hay mecanismos compartidos entre antibióticos, antisépticos y desinfectantes que les permita a las bacterias y otros microorganismos activar genes que potencialmente expresen los mecanismos propuestos hasta ahora como respuesta evolutiva a la intervención humana (8).
Las infecciones producidas por bacterias con múltiples resistencias a los antimicrobianos, que se encuentran en las unidades de cuidados intensivos (UCI), constituyen un serio problema al cual se deben enfrentar a diario tanto médicos como microbiólogos.
La problemática que pretende solucionar esta investigación, se basa en la prevalencia de cepas resistentes a antibióticos encontradas a nivel hospitalario, y que se han convertido en un problema de salud pública; por tal motivo, lo que se espera es buscar la relación que existe entre la resistencia bacteriana a antimicrobianos y antisépticos más usados a nivel hospitalario, usando como referencia cepas multiresistentes del Cepario de Bacterias de la Pontificia Universidad Javeriana.
PREGUNTA DE INVESTIGACION
Las bacterias resistentes o multiresistentes a los antimicrobianos pueden también desarrollar resistencia o tolerancia a los antisépticos más usados a nivel hospitalario.
MARCO TEÓRICO Resistencia a los antibióticos
La resistencia bacteriana puede definirse como la capacidad de un microorganismo para crecer en presencia de un antimicrobiano a dosis terapéuticas.
El fenómeno de la resistencia a los antibióticos se ha documentado desde el momento en que aparecen los antibióticos del orden de la penicilina, donde al poco tiempo se documentó la resistencia de algunas cepas bacterianas frente a este grupo y a la meticilina como es el caso de Staphylococcus aureus, causando una mayor morbilidad, mortalidad y ocasionando efectos sociales y económicos (1). De aquí surge la necesidad de desarrollar otras sustancias con efecto bactericida, sin causar daño en el cuerpo humano, surgiendo grupos como los aminoglucósidos, betalactámicos etc.
La resistencia bacteriana a diferentes sustancias como antibióticos y desinfectantes es uno de los principales problemas en cuestión de salud, ya que las infecciones por cepas multiresistentes han venido en aumento y en contraposición el desarrollo de nuevos productos antimicrobianos en el tiempo es lenta. Una descontrolada automedicación por
parte de la sociedad, combinado con la mala dosificación y el tiempo de suministro del medicamento, son los principales factores que llevan a la resistencia. Adicionalmente, los tratamientos sin resultado positivo a nivel intrahospitalario proporcionan resistencia a las cepas especialmente Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae, entre otros (2).
Los agentes antimicrobianos tienen cuatro principales puntos de acción en la bacteria, los cuales son: la interferencia en la síntesis de pared celular (beta-lactámicos); inhibición en la síntesis de proteínas (macrólidos, aminoglucósidos, tetraciclinas y cloranfenicol); intervención en la síntesis de ácidos nucléicos (fluoroquinolonas, sulfonamidas y trimetropin); y por último la intervención en las rutas metabólicas (trimetropin y sulfametoxazol) (3).
La resistencia bacteriana está clasificada en dos grupos: los que tienen una resistencia natural como es el caso de la bacteria Pseudomonas aeruginosa frente a las benzilpenicilinas y trimetropin sulfa, característica dada por la alta impermeabilidad de su membrana celular convirtiéndola en un patógeno peligroso a nivel intrahospitalario (4). En el otro grupo se encuentran los que tienen una resistencia adquirida, que se caracteriza por un cambio o mutación puntual en la ADN dada por la presencia de plásmidos, secuencias de ADN que transportan los genes de resistencia, con capacidad de replicarse de manera independiente a la batería genética de la célula (5).
Existen tres categorías básicas de resistencia a antibióticos, el primero es la inactivación del antibiótico donde éste es hidrolizado por enzimas secretadas por la bacteria. El segundo mecanismo es la alteración del punto diana modificando pared celular, unidades ribosomales etc. (6). El tercer mecanismo es la disminución de la permeabilidad celular, esta permeabilidad está dada por la diferencia en la composición de la pared de bacterias Gram positivas y Gram negativas, donde éstas últimas ponen más resistencia en la penetración de los fármacos debido a sus gruesas capas de lipopolisacáridos. Adicionalmente, se habla de permeabilidad de membrana interna donde se modifican las cargas eléctricas alterando el transporte aniónico el cual se encarga de internalizar el antibiótico (5)(7).
Antisépticos
Los antisépticos son bactericidas o sustancias que destruyen o inhiben el crecimiento de microorganismos y que son seguros para su aplicación en tejido vivo (8).
El uso generalizado de antisépticos y desinfectantes genera expectativas sobre la resistencia bacteriana provocada por la presión ambiental que ejercen los antibióticos, y enfoca el interés hacia la posible resistencia cruzada con antibióticos (9).
Sea cual sea el tipo de célula microbiana, es probable que haya una secuencia común de eventos en la interacción del antiséptico o desinfectante con la superficie celular, seguido de la penetración en la célula y la acción en el sitio blanco. La interacción en la superficie celular puede producir un efecto significativo sobre la viabilidad de la célula, pero la mayoría de los agentes antimicrobianos parecen tener su sitio activo intracelularmente; además las capas más externas de las células microbianas pueden, tener un efecto significativo en su susceptibilidad (o la falta de susceptibilidad) a los antisépticos y desinfectantes (9).
Mecanismos de acción de los antisépticos.
1. Ruptura de la membrana citoplasmática. Algunos agentes como los detergentes, se
concentran en la membrana y alteran sus propiedades fisicoquímicas, esto lleva a la muerte o a la inhibición celular.
2. Alteración de los grupos SH. Muchas de las enzimas celulares no pueden actuar si sus
grupos SH no permanecen libres y en estado reducido. Los agentes oxidantes, como el cloro, yodo y los peróxidos, actúan sobre estos grupos SH libres, produciendo lesiones celulares irreparables que la llevan a la muerte.
3. Coagulación de proteínas. La mayoría de las enzimas de la célula se encuentran en
estado coloidal. Si estas proteínas se coagulan y precipitan se vuelven inactivas produciéndose la muerte celular (10).
Resistencia microbiana a los antisépticos
Existen diversos tipos de resistencia bacteriana a los antisépticos, como la resistencia intrínseca; donde las bacterias Gram negativas y micobacterias se relacionan con mayor resistencia a los antisépticos y desinfectantes, tal vez a causa del carácter único de sus paredes celulares que contienen polisacáridos y lípidos, lo cual lleva a excluir agentes que de otro modo podrían actuar sobre blancos intracelulares
La resistencia por plásmidos; en ocasiones las bacterias contienen plásmidos o sea pequeñas cadenas de ADN en el citoplasma que se replican de manera autónoma, los cuales pueden contener genes para resistencia al mercurio y organomercuriales, cadmio, arsénico y hexaclorofeno, sea por detoxificación y eliminación del agente antiséptico de la célula invasora (bacteria) o por alteración de la permeabilidad de la superficie celular; esta resistencia suele vincularse con plásmidos que especifican resistencia a los antibióticos (11).
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM)
Es un tipo de bacteria estafilocócica que no responde a algunos antibióticos que se usan frecuentemente para tratar infecciones por estafilococos (12).
El Staphylococcus aureus es un tipo común de bacteria. En aproximadamente 1 de cada 4 personas saludables, la bacteria vive en la piel o en los conductos nasales, pero no causa ningún problema o infecciones. Se dice que estas personas son colonizadas con el estafilococo (12).
Si los estafilococos entran al cuerpo de una persona a través de una incisión, llaga, sonda o tubo de respiración, pueden causar una infección (12).
En su variedad meticilino resistente, se presenta como uno de los patógenos hospitalarios más importantes, al ser un patógeno emergente y las infecciones que produce se comportan como enfermedades emergentes. Las enfermedades emergentes son aquellas que han aparecido recientemente en la población o aquellas que ya existían pero han incrementado rápidamente su incidencia o su extensión geográfica (14).
La principal característica de esta bacteria es ser sensible a todos los antimicrobianos excepto a los betalactámicos (13).
En el pasado, la mayoría de las infecciones por estafilococos respondían a un grupo de antibióticos llamados betalactámicos. Estos antibióticos abarcan meticilina y otros antibióticos más comunes, tales como oxacilina, penicilina y amoxicilina (12).
Las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (SARM) se empezaron a observar dos años después de la introducción de la meticilina como agente antimicrobiano para el tratamiento de infecciones causadas por S. aureus. En las últimas cuatro décadas SAMR ha sido considerado como un patógeno emergente causante de infecciones nosocomiales y comunitarias y ha constituido conjuntamente con la resistencia a la vancomicina uno de los retos terapéuticos y de control de infección más importantes de los últimos años (15).
Las cepas de SAMR son resistentes a cefalosporinas y carbapenems, además de penicilinas semisintéticas, como meticilina, oxacilina y nafcilina; generalmente resistente a macrólidos, clindamicina y aminoglicósidos y usualmente susceptible a trimetoprima-sulfametoxazol, tetraciclina, rifampicina, y los nuevos antibióticos (linezolid, quinopristina-dalfopristin, tigeciclina y daptomicina) (13).
La resistencia a meticilina es determinada por la presencia de una proteína fijadora de penicilina (PFP) con afinidad disminuida a la penicilina. El gen mecA codifica esta proteína y está localizado en el cromosoma mec (SCCmec) del estafilococo Tipos I y V (13). El gen mecA es el responsable de la resistencia a la meticilina en los estafilococos. Este gen, de aproximadamente 2 kb, se encuentra integrado en el ADN bacteriano y puede estar asociado a otros determinantes genéticos como plásmidos, transposones y secuencias de inserción. La transcripción del gen mecA genera una proteína, denominada PBP2a ó PBP2’, con actividad transpeptidasa y con baja afinidad por los antibióticos β-lactámicos. En presencia de estos antibióticos, todas las PBP de S. aureus están inhibidas, a excepción de la PBP2a, la cual sería la responsable de seguir con la síntesis de la pared celular bacteriana, por lo tanto, los estafilococos portadores del gen mecA y de su proteína PBP2a deben considerarse resistentes a todos los antibióticos β-lactámicos sin excepción, incluyendo carbapenemas y cefepime (15).
Aproximadamente 2 de cada 100 personas portan una cepa de estafilococo que es resistente a estos antibióticos. Ser resistente significa que un antibiótico es incapaz de tratar y curar una infección con este tipo de bacterias (12).
En el laboratorio las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para determinar la resistencia a meticilina por parte de S. aureus se realiza probando los antibióticos penicilina G (10 U), oxacilina (1μg), ceftriazona (30 μg), amoxacilina ácido clavulánico (20/10 μg), gentamicina (30 μg), ciprofloxacina (5 μg), clindamicina (2 μg), eritromicina (15 μg), vancomicina (30 μg), tetraciclina (30 μg) y cloranfenicol (30 μg); en donde la bacteria que presente resistencia principalmente a penicilina, eritromicina y oxacilina se considera como SAMR (15).
Escherichia coli productora de β lactamasas de espectro extendido (BLEES)
Escherichia coli puede producir enzimas betalactamasas obedeciendo a un origen
cromosómico o extracromosomico (mediada por plásmido) (19).
Las BLEES son enzimas producidas por enterobacterias, que hidrolizan los antibióticos ß lactámicos incluyendo cefalosporinas de tercera y cuarta generación, monobactámicos que derivan de enzimas tipo TEM y SHV principalmente (descritas también de CTX, PER, OXA) y el aztreonam. Estas enzimas derivaron de mutaciones de las ß lactamasas de amplio espectro TEM y SHV, presentes en la mayoría de las enterobacterias, pero principalmente de
K. pneumoniae y E. coli (aunque han sido identificadas en Proteus, Serratia, Enterobacter y Salmonella).
Se localizan en plásmidos y son transferibles de cepa a cepa entre especies bacterianas. Diferentes mecanismos pueden mediar una expresión de alto nivel que lleve al surgimiento de variantes productoras de BLEES, entre estos se incluyen alteraciones en el promotor o traslocaciones del gen al plásmido. A su vez las BLEES se pueden adquirir por:
1. Transferencia de plásmidos
2. Transferencia de genes de resistencia mediada por cromosomas 3. Mutaciones espontáneas
4. Selección de gérmenes resistentes favorecida por el uso de antibióticos de amplio espectro, especialmente cefalosporinas de tercera generación, aunque se han descrito otras moléculas como el cefoxitin y la gentamicina que favorecen su aparición (16) (17).
El problema epidemiológico de las BLEE es de extraordinaria magnitud. A diferencia de las ß lactamasas cromosómicas, la resistencia de las ß lactamasas plasmídicas es transferible. El que se encuentren codificadas en plásmidos conjugativos, posibilita la diseminación de este mecanismo de resistencia no sólo entre distintas cepas de la misma especie sino también entre diferentes especies bacterianas. Además, las BLEE frecuentemente se incluyen en transposones o integrones, lo cual determina su asociación con otros determinantes genéticos de resistencia transferibles, como los que conllevan resistencia a los aminoglucósidos o al cotrimoxazol (18).
OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL
Determinar si las bacterias multiresistentes a antibióticos presentan resistencia a los antisépticos más usados a nivel hospitalario.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Seleccionar 2 especies bacterianas multiresistentes a antibióticos provenientes del Cepario de Bacterias de la Pontificia Universidad Javeriana.
• Establecer la tendencia de crecimiento de cada microorganismo a evaluar, por medio de la realización de curvas de crecimiento.
• Determinar la resistencia bacteriana frente a diferentes productos antisépticos en 7 tiempos de exposición para determinar la concentración mínima de inhibición.
• Interpretar los resultados obtenidos en la determinación de la resistencia, estableciendo la relación entre concentración y respuesta vs. tiempo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizó un diseño experimental mediante el cual se evaluó la resistencia o tolerancia a antisépticos usados a nivel hospitalario mediante experimentos de laboratorio, con el cual se pudo estimar el comportamiento de las cepas frente al efecto de los desinfectantes
Se tomaron dos cepas que presentan multiresistencia a antibióticos más usados a nivel hospitalario, seleccionadas del Cepario de Bacterias de la Pontificia Universidad Javeriana de las cuales se evaluó la resistencia o tolerancia a cuatro productos antisépticos usados a nivel hospitalario en dos variables; el tiempo de exposición y la concentración.
Curvas de Crecimiento
Se tuvo en cuenta la curva patrón de MacFarland.
Luego de obtenidas las cepas, se procedió a realizar pases para verificar su pureza y viabilidad. Posteriormente se llevaron a cabo las curvas de crecimiento de las cepas para evaluar el comportamiento de las mismas, se preparó un inoculo con cada cepa a una
concentración 3x108células/mL correspondiente al tubo No. 1 del patrón de MacFarland; luego se realizó la mezcla del inoculo en un volumen de medio TSA, se tomó la muestra correspondiente al tiempo 0 de la curva, se procedió a incubar a 37°C con una agitación de 100rpm, se tomaron muestras en 10 tiempos establecidos durante las 24 horas en las que se realizaron las curvas y finalmente se tomaron las lecturas de la absorbancia a 540nm, con estos datos y la curva patrón de MacFarland se hizo la curva de crecimiento Cell/mL. vs. Tiempo. (Anexo 1)
Valoración de Antisépticos
Teniendo ya el comportamiento de cada microorganismo, se realizó la valoración de los desinfectantes frente a cada cepa, estableciendo las condiciones experimentales estandarizadas, tales como:
9 Las cepas a utilizar: Staphylococcus aureus Meticilino Resistente SARM y
Escherichia coli BLEES.
9 Los antisépticos: A. Alcohol Etílico 61%P/P + Clorhexidina Base 1%P/P. B. Alcohol Etílico 65%P/P. E. Gluconato de Clorhexidina 4%P/V. G. Alcohol Etílico 70%V/V. 9 La temperatura: Ambiente.
9 Concentraciones: Concentración de antiséptico entregada.
9 El tiempo de contacto del antiséptico con el inoculo del microorganismo: se trabajaron 7 tiempos de contacto (0, 4, 8, 16, 32, 64, 128 segundos)
Suspensión de Ensayo
Del cultivo de trabajo de cada microorganismo se realizó una suspensión, tomando asadas del cultivo y depositándolas en un erlenmeyer con solución salina ajustándolo a una concentración correspondiente al tubo No. 2 del patrón de MacFarland.
Determinación de la actividad Bactericida
En un tubo se mezclaron 2mL de la suspensión de cada microorganismo con 8mL del antiséptico y se dejó actuar por el tiempo de contacto a una temperatura ambiente. Luego se adicionaron 0.5mL de neutralizante con el fin de frenar la reacción, finalizado dicho procedimiento se realizaron las lecturas de absorbancia para cada tiempo de contacto con cada antiséptico. Cada uno de los experimentos se realizó por triplicado. (Anexo 2)
Nota: Adicionalmente se contó con cepas control que son las mismas especies con carácter sensible a las cuales se les realizará el mismo procedimiento para realizar una curva de susceptibilidad.
Organización e interpretación de los resultados
Para la organización de los datos experimentales se empleó una matriz en la cual se registraron los resultados obtenidos en cada una de las réplicas a las condiciones de tiempo, microorganismo y antiséptico evaluados. Para la interpretación de la resistencia o tolerancia de las cepas frente a los antisépticos, se realizó una relación entre respuesta (células/ml) vs tiempo los cuales fueron representados mediante curvas de dispersión.
RESULTADOS Y DISCUSION
Las cepas evaluadas fueron adquiridas a través del Cepario de Bacterias de la Pontificia Universidad Javeriana; estas cepas demostraron ser de carácter multiresistente a los
antibióticos ampliamente usados a nivel clínico; las cuales además son estrictamente caracterizadas por el mismo Cepario, teniendo como base las características universales de ambas bacterias, ya sea el carácter meticilino resistente o productor ve beta lactamasas.
Curvas de crecimiento de Staphylococcus aureus SARM y Escherichia coli BLEES
El éxito en la elaboración de una curva de crecimiento radica en la correcta preparación de un inoculo microbiano teniendo en cuenta diversos factores tales como: ser un cultivo totalmente puro, metabólicamente activo, encontrarse en su fase exponencial de crecimiento y se debe contar con un volumen adecuado para garantizar el crecimiento esperado en determinado tiempo.
A continuación se presentan los resultados obtenidos en la lectura de absorbancias para la curva de crecimiento de S. aureus SAMR y E. coli BLEES las cuales se llevaron a cabo en un tiempo de 24 horas. (Ver tabla 2). Adicionalmente se presentan las curvas de crecimiento Células/mL vs Tiempo. (Ver gráfico 2) con el fin de conocer la tendencia de crecimiento de cada cepa.
Tabla 1. Curva patrón de MacFarland
TUBO CELL/mL ABS
1 3,00E+08 0,18 2 6,00E+08 0,35 3 9,00E+08 0,50 4 1,20E+09 0,59 5 1,50E+09 0,67 6 1,80E+09 0,73 7 2,10E+09 0,80 8 2,40E+09 0,87 9 2,70E+09 0,95 10 3,00E+09 1,00
Gráfico 1. Curva patrón de MacFarland
y = 3E‐10x + 0,1921 R² = 0,9664 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0,00E+00 1,00E+09 2,00E+09 3,00E+09 4,00E+09
ABS
CONCENTRACION CELL/mL CURVA PATRON MACFARLAND
Tabla 2. Datos de absorbancias obtenidos de las curvas de crecimiento de SAMR y E. coli
BLEES
SAMR E. coli BLEES
TIEMPO ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL
0 0,352 0,351 0,352 0,352 5,32E+08 0,351 0,353 0,353 0,352 5,34E+08 30min 0,392 0,393 0,394 0,393 6,70E+08 0,392 0,394 0,394 0,393 6,71E+08 1 0,398 0,398 0,398 0,398 6,86E+08 0,457 0,461 0,46 0,459 8,91E+08 2 0,587 0,588 0,587 0,587 1,32E+09 0,697 0,696 0,696 0,696 1,68E+09 4 0,692 0,697 0,691 0,693 1,67E+09 0,895 0,897 0,898 0,897 2,35E+09 6 0,725 0,722 0,724 0,724 1,77E+09 0.977 0,973 0,974 0,974 2,60E+09 8 0,912 0,917 0,916 0,915 2,41E+09 0,845 0,848 0,847 0,847 2,18E+09 12 0,997 0,991 0,994 0,994 2,67E+09 0,736 0,744 0,737 0,739 1,82E+09 18 0,791 0,792 0,799 0,794 2,01E+09 0,737 0,741 0,738 0,739 1,82E+09 24 0,653 0,653 0,656 0,654 1,54E+09 0,614 0,615 0,614 0,614 1,41E+09
Gráfico 2. Gráfico integrado de curvas de crecimiento de SAMR y E. coli BLEES
De acuerdo a los resultados expresados en la gráfica se puede observar que ambas cepas tienen un comportamiento similar en cuanto a sus tiempos de adaptación hasta la hora 1, a partir de allí empieza a observarse un crecimiento exponencial sugiriendo que la composición del medio de cultivo es adecuada para sus crecimientos. Para SAMR se observa que el pico más alto de su crecimiento se da en un tiempo de 12 horas, luego de eso se supone una fase estacionaria que no es posible observarse ya que hay un intervalo muy largo entre el muestreo de la hora 12 y la hora 18, a partir de la cual se observa una clara fase de muerte. El comportamiento del crecimiento de E. coli BLEES es un tanto diferente al de SAMR al tener su punto máximo de crecimiento a la hora 6 y una fase estacionaria que es posible notarla. Es importante resaltar que el crecimiento de E. coli BLEES en cuanto a la biomasa, fue mayor en relación a la presentada por SAMR, razón por la cual se supone que la cepa E.
coli BLEES requiere de menos exigencias para su crecimiento en relación con la cepa de
SAMR.
Valoración de resistencia a los antisépticos
Se realizó la determinación de la sensibilidad presentada por las cepas SAMR y E. coli BLEES frente a cuatro productos antisépticos Alcohol Etílico 61%P/P + Clorhexidina Base
0,00E+00 5,00E+08 1,00E+09 1,50E+09 2,00E+09 2,50E+09 3,00E+09 C ELL/mL TIEMPO (h) GRAFICO INTEGRADO CURVAS DE CRECIMIENTO SAMR Y E. coli BLEES SAMR E. coli BLEES
1%P/P, Alcohol Etílico 65%P/P, Gluconato de Clorhexidina 4%P/V y Alcohol Etílico 70%V/V, aplicando siete tiempos de contacto de estudio. (0, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 segundos).
Adicionalmente se realizó el control tomando las mismas bacterias del estudio pero con un carácter sensible. Los resultados arrojados permitieron mostrar que los cuatro productos utilizados fueron capaces de ejercer un control frente a estas bacterias al lograr una disminución total el su crecimiento tal como se muestra en las tablas y gráficos 3 y 4.
Tabla 3. Evaluación de sensibilidad de los productos frente a S. aureus sensible
S. aureus Sensible
TIEMPO A CELL/mL B CELL/mL E CELL/mL G CELL/mL
0 0,351 5,30E+08 0,352 5,33E+08 0,351 5,30E+08 0,352 5,33E+08 4 0,359 5,56E+08 0,361 5,63E+08 0,321 4,30E+08 0,356 5,46E+08 8 0,299 3,56E+08 0,285 3,10E+08 0,274 2,73E+08 0,287 3,16E+08 16 0,264 2,40E+08 0,263 2,36E+08 0,203 3,63E+07 0,274 2,73E+08 32 0,201 2,97E+07 0,214 7,30E+07 0,168 ‐8,03E+07 0,223 1,03E+08 64 0,156 ‐1,20E+08 0,164 ‐9,37E+07 0,134 ‐1,94E+08 0,166 ‐8,70E+07 128 0,117 ‐2,50E+08 0,121 ‐2,37E+08 0,106 ‐2,87E+08 0,122 ‐2,34E+08
Gráfico 3. Evaluación de sensibilidad de los productos frente a S. aureus sensible
Tabla 4. Evaluación de sensibilidad de los productos frente a E. coli sensible
E. coli Sensible
TIEMPO A CELL/mL B CELL/mL E CELL/mL G CELL/mL
0 0,349 5,23E+08 0,349 5,23E+08 0,35 5,26E+08 0,351 5,30E+08 4 0,355 5,43E+08 0,363 5,70E+08 0,322 4,33E+08 0,35 5,26E+08 8 0,301 3,63E+08 0,286 3,13E+08 0,276 2,80E+08 0,284 3,06E+08 16 0,259 2,23E+08 0,267 2,50E+08 0,205 4,30E+07 0,27 2,60E+08 32 0,204 3,97E+07 0,218 8,63E+07 0,167 ‐8,37E+07 0,222 9,97E+07 64 0,158 ‐1,14E+08 0,162 ‐1,00E+08 0,134 ‐1,94E+08 0,169 ‐7,70E+07 128 0,112 ‐2,67E+08 0,124 ‐2,27E+08 0,102 ‐3,00E+08 0,125 ‐2,24E+08
‐4,00E+08 ‐2,00E+08 0,00E+00 2,00E+08 4,00E+08 6,00E+08 8,00E+08 0 20 40 60 80 100 120 140 C ELL/mL TIEMPO (s) EVALUACION DE SENSIBILIDAD DE LOS ANTISEPTICOS FRENTE A S. aureus SENSIBLE A B E G
Gráfico 4. Evaluación de sensibilidad de los productos frente a E. coli sensible
Los datos obtenidos en la evaluación del alcohol etílico con Clorhexidina 1% sobre SAMR y
E. coli BLEES se muestran en la tabla 5.
Tabla 5. Evaluación de sensibilidad del producto A frente SAMR y E. coli BLEES PRODUCTO A
SAMR E. coli BLEES
TIEMPO ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL
0 0,349 0,349 0,35 0,349 5,24E+08 0,348 0,347 0,348 0,348 5,19E+08 4 0,423 0,425 0,424 0,424 7,73E+08 0,419 0,417 0,418 0,418 7,53E+08 8 0,561 0,563 0,564 0,563 1,24E+09 0,527 0,528 0,526 0,527 1,12E+09 16 0,476 0,48 0,481 0,479 9,56E+08 0,426 0,427 0,427 0,427 7,82E+08 32 0,361 0,356 0,355 0,357 5,51E+08 0,362 0,36 0,357 0,360 5,59E+08 64 0,254 0,256 0,258 0,256 2,13E+08 0,226 0,227 0,224 0,226 1,12E+08 128 0,112 0,115 0,116 0,114 ‐2,59E+08 0,12 0,119 0,121 0,120 ‐2,40E+08
Gráfico 5. Gráfico integrado de la evaluación de sensibilidad del producto A frente SAMR, E. coli BLEES y cepas sensibles
‐4,00E+08 ‐2,00E+08 0,00E+00 2,00E+08 4,00E+08 6,00E+08 8,00E+08 0 20 40 60 80 100 120 140 CELL/mL TIEMPO (s) EVALUACION DE SENSIBILIDAD DE LOS ANTISEPTICOS FRENTE A E. coli SENSIBLE A B E G ‐3,00E+08 2,00E+08 7,00E+08 1,20E+09 1,70E+09 0 20 40 60 80 100 120 140 CELL/mL TIEMPO (s) EVALUACION DE SENSIBILIDAD DEL PRODUCTO A FRENTE A SAMR, E. coli BLEES Y CEPAS SENSIBLES SAMR E. coli BLEES S. aureus E. coli
Los datos obtenidos en la evaluación del Alcohol Etílico 65%P/P sobre SAMR y E. coli BLEES se muestran en la tabla 6.
Tabla 6. Evaluación de sensibilidad del producto B frente SAMR y E. coli BLEES PRODUCTO B
SAMR E. coli BLEES
TIEMPO ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL
0 0,349 0,349 0,35 0,349 5,24E+08 0,348 0,347 0,348 0,348 5,19E+08 4 0,436 0,435 0,434 0,435 8,10E+08 0,422 0,422 0,421 0,422 7,65E+08 8 0,528 0,528 0,527 0,528 1,12E+09 0,566 0,565 0,565 0,565 1,24E+09 16 0,462 0,464 0,464 0,463 9,04E+08 0,496 0,495 0,495 0,495 1,01E+09 32 0,359 0,359 0,359 0,359 5,56E+08 0,36 0,361 0,361 0,361 5,62E+08 64 0,227 0,219 0,217 0,221 9,63E+07 0,236 0,236 0,236 0,236 1,46E+08 128 0,121 0,122 0,12 0,121 ‐2,37E+08 0,116 0,117 0,116 0,116 ‐2,53E+08
Gráfico 6. Gráfico integrado de la evaluación de sensibilidad del producto B frente SAMR, E. coli BLEES y cepas sensibles
Los datos obtenidos en la evaluación del Gluconato de Clorhexidina 4%P/V sobre SAMR y E.
coli BLEES se muestran en la tabla 7.
Tabla 7. Evaluación de sensibilidad del producto E frente SAMR y E. coli BLEES PRODUCTO E
SAMR E. coli BLEES
TIEMPO ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL
0 0,349 0,349 0,35 0,349 5,24E+08 0,348 0,347 0,348 0,348 5,19E+08 4 0,409 0,401 0,409 0,406 7,14E+08 0,413 0,414 0,415 0,414 7,40E+08 8 0,472 0,476 0,472 0,473 9,37E+08 0,389 0,391 0,391 0,390 6,61E+08 16 0,346 0,342 0,348 0,345 5,11E+08 0,37 0,373 0,376 0,373 6,03E+08 32 0,295 0,291 0,293 0,293 3,36E+08 0,298 0,299 0,3 0,299 3,56E+08 64 0,224 0,224 0,225 0,224 1,07E+08 0,246 0,243 0,239 0,243 1,69E+08 128 0,113 0,114 0,112 0,113 ‐2,64E+08 0,111 0,112 0,11 0,111 ‐2,70E+08 ‐3,00E+08 2,00E+08 7,00E+08 1,20E+09 1,70E+09 0 20 40 60 80 100 120 140 CE LL/mL TIEMPO(s) EVALUACION DE SENSIBILIDAD DEL PRODUCTO B FRENTE A SAMR, E. coli BLEES Y CEPAS SENSIBLES SAMR E. coli BLEES S. aureus E. coli
Gráfico 7. Gráfico integrado de la evaluación de sensibilidad del producto E frente SAMR, E. coli BLEES y cepas sensibles
Los datos obtenidos en la evaluación del Alcohol Etílico 70%V/V sobre SAMR y E. coli BLEES se muestran en la tabla 8.
Tabla 8. Evaluación de sensibilidad del producto G frente SAMR y E. coli BLEES PRODUCTO G
SAMR E. coli BLEES
TIEMPO ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL ABS 1 ABS 2 ABS 3 PROM CELL/mL
0 0,349 0,349 0,35 0,349 5,24E+08 0,348 0,347 0,348 0,348 5,19E+08 4 0,403 0,403 0,403 0,403 7,03E+08 0,408 0,405 0,405 0,406 7,13E+08 8 0,427 0,425 0,427 0,426 7,81E+08 0,435 0,433 0,433 0,434 8,05E+08 16 0,526 0,527 0,524 0,526 1,11E+09 0,464 0,465 0,461 0,463 9,04E+08 32 0,492 0,491 0,492 0,492 9,99E+08 0,531 0,532 0,533 0,532 1,13E+09 64 0,475 0,472 0,479 0,475 9,44E+08 0,487 0,89 0,487 0,621 1,43E+09 128 0,436 0,439 0,438 0,438 8,19E+08 0,452 0,452 0,454 0,453 8,69E+08
Gráfico 8. Gráfico integrado de la evaluación de sensibilidad del producto G frente SAMR, E. coli BLEES y cepas sensibles
‐3,00E+08 ‐1,00E+08 1,00E+08 3,00E+08 5,00E+08 7,00E+08 9,00E+08 1,10E+09 0 20 40 60 80 100 120 140 C ELL/mL TIEMPO (s) EVALUACION DE SENSIBILIDAD DEL PRODUCTO E FRENTE A SAMR, E. coli BLEES Y CEPAS SENSIBLES SAMR E. coli BLEES S. aureus E. coli ‐3,00E+08 2,00E+08 7,00E+08 1,20E+09 1,70E+09 0 20 40 60 80 100 120 140 C ELL/mL TIEMPO (s) EVALUACION DE SENSIBILIDAD DEL PRODUCTO G FRENTE A SAMR, E. coli BLEES Y CEPAS SENSIBLES SAMR E. coli BLEES S. aureus E. coli
Evidentemente en los primeros segundos de tiempo de contacto hay un incremento en la concentración de cada bacteria en todos los productos, lo cual indica dos cosas, primero, que la cepa está totalmente viable y que tiene las condiciones adecuadas para continuar con su crecimiento, y segundo, que en esos pocos segundos de contacto ninguno de los productos ejerce un efecto ni bactericida ni bacteriostático sobre las cepas, lo cual indica que los productos, unos más que otros, necesitan de un tiempo más prolongado de contacto para ejercer un control sobre las bacterias multiresistentes. Aunque los productos A, B y E logren reducir casi totalmente la carga microbiana con la que inicia el ensayo, necesitan de mucho tiempo más de contacto para ejercer su efecto del que deberían tomarse, ya que por lo menos el alcohol glicerinado o más comúnmente conocido como gel antibacterial dura en las manos tan solo máximo 30 a 40 segundos.
Al comparar los resultados de éste estudio con los datos del control, se observó que al trabajar con los cuatro productos hubo cierta disminución en cuanto al crecimiento de las dos bacterias. En los productos A, B y E se puede decir que la disminución fue casi total en los tiempos 128, 128 y 64 respectivamente, mientras que con el producto G aun en el tiempo 128 hay una cantidad considerable de microorganismos, lo cual podría llevarnos a una tolerancia de las dos bacterias frente a este antiséptico. Pero en general se podría decir que no existe una relación entre la resistencia de las cepas evaluadas frente a los antibióticos, y la resistencia presentada frente a los antisépticos ampliamente utilizados a nivel clínico. Según estudios de diferentes autores quienes evaluaron la resistencia de Gram positivos y Gram negativos en hospitales colombianos en un estudio que duro tres años donde evaluaron los perfiles de resistencia de quince hospitales de Bogotá obtuvieron los siguientes resultados de incidencia: S. aureus meticilino resistentes (SAMR) en 56%; y Escherichia coli productora de BLEES en 9.7% (20).
Los resultados obtenidos en este ensayo en cuanto a SAMR y E. coli BLEES y el alcohol glicerinado coinciden con un estudio realizado en el que se dieron cuenta que la presencia de SAMR disminuyó significativamente al realizarse lavados de manos con alcohol glicerinado antes y después de las intervenciones a pacientes, sopesando que el producto G no presento muy buenos resultados en la disminución de la carga microbiana; mientras que los perfiles de susceptibilidad de E. coli permanecieron similares (21), aunque en nuestro estudio los perfiles de susceptibilidad de E. coli, sobre todo con el producto E se vieron disminuidos, mientras que con el producto G si permanecieron constantes.
La resistencia presentada por las bacterias Gram negativas se describe principalmente por la producción de enzimas beta lactamasas incluyendo la pérdida o modificación de porinas disminuyendo así la permeabilidad de la membrana (24). La producción de enzimas capaces de hidrolizar los carbapenems, metilasas, acetil-transferasas, nucleotidil-transferasas y fosfotransferasas que inactivan, especialmente, los aminoglucósidos y bombas de expulsión capaces de conferir resistencia frente a las quinolonas. Estos factores contribuyen al aumento de la resistencia frente a los agentes usados como desinfectantes (24); sin embargo específicamente para E. coli BLEES se observó que el producto E tuvo una muy buena acción al lograr una disminución muy notable en la carga microbiana, lo cual indica que dicho producto puede combatir frente a la resistencia de dicha bacteria.
Para E. coli BLEES llama la atención los menores cambios en la susceptibilidad en los periodos de estudio en comparación a SAMR, esto es explicable por el poco tiempo de seguimiento de mi estudio, otros autores han encontrado una disminución notable de la resistencia de bacterias Gran negativas y positivas, pero con seguimientos de 9 meses hasta 5 años (22, 23). Sin embargo podemos decir que la tendencia observada gracias a los resultados obtenidos coincide con la literatura investigada principalmente.
En cuanto a los productos a base de Clorhexidina podemos decir que los resultados obtenidos son muy congruentes con la bibliografía revisada, ya que el gluconato de Clorhexidina se emplea ampliamente y tiene un buen perfil de actividad contra el estafilococo. Algunas cepas de SAMR son menos sensibles a la Clorhexidina que las cepas de S aureus sensibles a la meticilina (25).
En comparación con el estudio realizado por Koljalg, et al. se evidencia que se encuentra una mayor resistencia frente a la Clorhexidina por parte de bacterias Gram negativas. Lo que se relaciona con la mayor prevalencia en la identificación microbiana de muestras provenientes de infecciones nosocomiales (26). Adicionalmente se establece que el carácter multiresistente no se relaciona directamente con la resistencia frente a éste antiséptico, que aunque son molecularmente diferentes, actúan en la pared celular interfiriendo en la permeabilidad de la membrana como los β lactámicos como cefalosporinas o aminoglucósidos. Dichos mecanismos de resistencia se deben principalmente por el contenido de bombas de expulsión, secreción de enzimas capaces de degradar el desinfectante o por el cambio en los componentes de la membrana en bacterias Gram negativas de fosfolípidos por ácidos grasos o lípidos neutros (27).
Por ende de acuerdo a los resultados obtenidos y en conjunto a la bibliografía revisada se puede decir que la resistencia de algunas bacterias se puede superar con el empleo de antisépticos que contengan alcohol y Clorhexidina.
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos en la evaluación realizada a las cepas multiresistentes frente a diversos agentes antisépticos desinfectantes, se puede concluir que las dos cepas, tanto S. aureus SAMR y E. coli BLEES presentan una disminución en la resistencia frente al alcohol glicerinado y a productos que contengan gluconato de Clorhexidina en su gran mayoría (productos A, B y E). Sin embargo al no observar una disminución total en la carga microbiana de las bacterias al ponerlas en contacto con el producto G, se puede decir que la disminución en la resistencia no es igual a la ejercida con los otros productos, lo que puede llevar a una mejora en la fórmula del antiséptico, mas no a un aumento en el tiempo de contacto para asegurar la inhibición bacteriana; esto basados en que intrahospitalariamente lo que conviene son antisépticos que actúen en cortos tiempos de contacto.
La resistencia adquirida por las bacterias Gram negativas frente a los antibióticos ampliamente usados a nivel clínico en este caso no se relaciona directamente con la resistencia presentada frente a los agentes antisépticos más usados. Es de entenderse que el mal uso de los antibióticos y las mutaciones genéticas entre las bacterias aumenta la ineficiencia de los antimicrobianos y la presencia de bacterias multiresistentes en las instalaciones médicas. Así pues, los desinfectantes y antisépticos, sin la valoración de resistencia contribuyen al aumento y a la ineficaz erradicación de las cepas bacterianas.
Se observa un mejoramiento en la susceptibilidad a las bacterias Gram positivas y Gram negativas, probablemente asociado con el tipo de mecanismo de resistencia.
RECOMENDACIONES
Se espera que con la implementación de un adecuado sistema de limpieza e higienización intrahospitalaria con productos como alcohol glicerinado y Clorhexidina a diferentes concentraciones y en conjunto con un programa de uso y manejo adecuado de antibióticos, lograr una disminución significativa de la resistencia en la gran mayoría de la flora microbiana presente en los hospitales y causante de infecciones intrahospitalarias.
Con el fin de poder establecer cuáles son los productos que mejor arrojarían resultados al ser utilizados como antisépticos intrahospitalarios, se recomienda usar la misma metodología con otras cepas de interés clínico que sean multiresistentes a antibióticos tales como
Klebsiella pneumonie KPC, Acinetobacter baumannii MDR y Pseudomonas aeruginosa, ya
que éstas aparentan ser más comunes en los aislamientos de pacientes cateterizados con estancia en la unidad de cuidados intensivos.
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ANEXO 1
METODOLOGIA CURVAS DE CRECIMIENTO
CEPA PRIMER PASE SIEMBRA EN A. TSA (24h/37°C) SEGUNDO PASE SIEMBRA EN A. TSA (24h/37°C) TERCER PASE SIEMBRA EN A. TSA (24h/37°C) PREPARACION SUSPENSION DE TRABAJO SUSPENSION TUBO No. 1 PATRON MF EN SS REALIZAR CURVAS DE CRECIMIENTO REALIZAR LECTURAS DE ABS A 540nm GRAFICAR CELLS/mL Vs. TIEMPO BLANCO: CALDO TSA
ANEXO 2
METODOLOGIA VALORACIÓN DE ANTISEPTCOS
ADICIONAR NEUTRALIZANTE 0,5mL REALIZAR LECTURAS DE ABS A 540nm BLANCO: SS + ANTISEPTICO + NETURALIZANTE GRAFICAR CELLS/mL Vs. TIEMPO REALIZAR ANALISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS PREPARAR SUSPENSION ENSAYO TUBO No. 1 MF PREPARAR MEZCLA ANTISEPTICO E INOCULO EN TUBO MEZCLAR 8mL ANTISEPTICO + 2mL INOCULO DEJARLOS EL TIEMPO DE CONTACTO ESTABLECIDO (7 TIEMPOS) POR TRIPLICADO
