Estudio de la función de PD-L1 y su interacción con PD-1 en la biología endotelial

- iSanidad (2017).http://isanidad.com/164881/corticosteroides-tocilizumab-reducen- hasta-50-por-ciento-muertes-covid-19-segun-resultados-preliminares-sefh/.

- QuadroFlow (2019). https://free3d.com/es/modelo-3d/tumor-1230.html.

Universidad Autónoma de Madrid Departamento de Bioquímica

Estudio de la función de PD

PD-1 en la biología endotelial

Universidad Autónoma de Madrid

Universidad Autónoma de Madrid Departamento de Bioquímica

Estudio de la función de PD-L1 y su interacción con 1 en la biología endotelial

Tesis Doctoral

Giulia Setti Jerez

Madrid 2020

Departamento de Bioquímica Facultad de Medicina

Universidad Autónoma de Madrid

L1 y su interacción con

Estudio de la función de PD

PD-1 en la biología endotelial

Memoria presentada por la graduada en Biolo

para optar al título de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid

Este trabajo se realizó en el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario de

Estudio de la función de PD-L1 y su interacción con 1 en la biología endotelial

Memoria presentada por la graduada en Biología:

Giulia Setti Jerez

para optar al título de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid

Directora de la Tesis:

Arantzazu Alfranca González

Este trabajo se realizó en el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario de la Princesa.

Madrid, 2020

L1 y su interacción con

para optar al título de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid

Este trabajo se realizó en el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario de

“Non temere i momenti difficili, Il meglio viene da lì”

Rita Levi-Montalcini

Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS Parece que fue ayer cuando empecé esta aventura, y hoy, tres años después, me siento a escribir estas líneas de agradecimiento. Agradecimiento, porque esta tesis, no supone solo un trabajo científico, supone un crecimiento personal, que no hubiera sido posible sin muchas personas.

Santi, mi querido amigo fiel, compañero de risas, compañero de sustos, compañero de sushi y tardes infinitas, compañero de corazón inmenso… Cuanto bien me has hecho. Has sido una pieza clave en mí día a día, ojalá seas para siempre. “Chachas”, mis queridas pili y mili, Montse y Tathy. Gracias por vuestro apoyo, no solo en los experimentos de laboratorio, si no en alegrar cada uno de mis días. Sois maravillosas. Por supuesto, a la que debo un enorme agradecimiento es a la persona que ha hecho posible este trabajo, Arantza. Ha sido una suerte poder aprender de ti, y un placer haber podido formar parte de este pequeño y gran grupo de investigación. Gracias por todo.

Por supuesto, no solo mi grupo ha sido un apoyo, también lo han sido todas las personas que forman parte del Servicio de Inmunología. Un gran equipo en el que hemos aprendido unos de otros. Equipo que no te deja nunca solo, ni siquiera para una cerveza improvisada. Equipo que dedica su tiempo en ayudarte, aunque no lo tenga. Equipo de los cafés infinitos en la salita, teatros y grandes fiestas. Gracias por tanto, os llevo en mi corazón. Corazón que lleva grabado a fuego a dos personas muy importantes para mí, y que forman parte del equipo. Mis chicas, Yaiza y Ana, amigas de desayunos fugitivos y miradas cómplices. Una mirada basta para saber que en 5 minutos hay reunión del consejo en cultivos. Gracias por vuestro hombro y por todos los grandes momentos que he vivido con vosotras, fuera y dentro del hospital. Sois un tesoro. Estoy segura de que esto ha sido solo el comienzo de una bonita y duradera amistad. Os quiero mucho.

Ha sido clave también el apoyo de otras personas que llevan formando parte de mi vida más tiempo, y que han estado ahí empujando cuando la fuerza flojeaba, amigas que no me han dejado tirar la toalla nunca. Gracias Sandra, Ana y Anita, vosotras que empezasteis siendo un grupo de trabajo en la universidad y ahora sois imprescindibles en mi vida. Gracias Esther, que lloras y ríes conmigo, que entiendes lo que se me pasa por la cabeza sin necesidad de decirlo, y que te has leído la tesis mil veces sin entender nada, solo por revisarla una décima vez.

dedicar estos agradecimientos también, por su infinita paciencia y por hacer posible una portada tan preciosa para esta tesis.

No puedo dejar de dedicarle unas líneas también a MA, Javi y Álvaro, que me ayudaron en el último empujón y se aseguraron de que empezara todos los días con una sonrisa. Gracias.

Necesitaría escribir un libro para expresar mi gratitud a todos, y en especial a mi familia. A mis tíos, que desde la distancia siempre están presentes, mi hermano, papá y mamá. Gracias por creer en mí.

Dani, que ahora eres familia, llegaste cuando menos lo esperaba, y más lo necesitaba. Llegaste para dar luz a mi vida y enseñarme el camino cuando yo no lo veía. Gracias por tu amor desinteresado. Gracias por quedarte.

Hoy cierro un capitulo de mi vida, y abro uno nuevo. No sé lo que me deparará la vida, pero de una cosa estoy segura. Cuando mire hacia atrás y recuerde esta tesis, no recordaré si las graficas tenían estrellitas o no, recordaré a todas las personas que me acompañaron en esta experiencia y que hicieron de mi lo que soy hoy.

Gracias, de corazón.

Resumen

Resumen

La inmunoterapia con anticuerpos monoclonales bloqueantes del eje PD-1/PD-L1 es un logro en la terapia actual del cáncer. La Administración de Alimentos y Medicamentos de EEUU (FDA) y la Agencia Europea del Medicamento (EMA) han aprobado recientemente anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer. Sin embargo, estos tratamientos no benefician a la totalidad de los pacientes, que desarrollan resistencia a los mismos.

La función intrínseca de PD-L1 ha sido bien estudiada en células tumorales, y se ha asociado con una mayor supervivencia y progresión tumoral. Sin embargo, esta proteína ha sido poco estudiada en otros tipos celulares. Así, PD-L1 se expresa también en células endoteliales in vitro e in vivo, asociándose con una función reguladora del sistema inmune y con la expresión de VEGFR in vivo. Aun así, el papel de PD-L1 tanto intrínsecamente como a través de su interacción con PD-1, no se ha analizado en detalle en este tipo celular.

La asociación de varias terapias para combatir la resistencia al tratamiento anti PD-1/PD-L1, como en el caso de la terapia combinada con inhibidores de esta interacción y fármacos anti angiogénicos, ha resultado ser positiva. De hecho, esta combinación da lugar a la formación de vénulas especializadas en el tumor que favorecen la infiltración linfocitaria y finalmente una mejor respuesta inmune antitumoral.

Nuestra hipótesis es que la unión del PD-L1 endotelial con PD-1, así como su función intrínseca en estas células, podría modular la vascularización tumoral.

Nuestros experimentos in vitro en células endoteliales muestran una regulación de la expresión de PD-L1 dependiente de citoquinas proinflamatorias así como del estado de confluencia del cultivo celular. Además, estudios funcionales en estas células confirman la implicación de PD-L1 y de la interacción de PD-L1 con PD-1 en la supervivencia y proliferación celular, esenciales en el proceso de angiogénesis.

En suma, nuestros datos indican que PD-L1 está implicado en la funcionalidad endotelial, lo que sugiere que el bloqueo del eje PD-1/PD-L1 podría afectar a la angiogénesis tumoral y por tanto modular el pronóstico de los pacientes y su

Summary

Summary

Immunotherapy with monoclonal antibodies against PD-1/PD-L1 axis represents a milestone in current cancer therapy. The FDA and the EMA have recently approved anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies for the treatment of several cancer types.

However, this treatment does not benefit all cancer patients, who frequently develop resistance to the therapy.

PD-L1 intrinsic function has been associated with survival of cancer cells and tumor progression, but it has been poorly studied in other cell types. Thus, PD-L1 is expressed in endothelial cells in vivo and in vitro. Endothelial PD-L1 has been associated with immune regulatory function and VEGFR-2 expression in vivo.

However, a detailed study of functional role of endothelial PD-L1 either intrinsically or through its interaction with PD-1 has not been performed so far.

Combined therapies employed to overcome the resistance developed to the PD- 1/PD-L1 therapy, as in the case of PD-1/PD-L1 inhibitors and anti-angiogenic drugs, has turned out to yield positive results. Indeed, this combination leads to new specialized vessel formation inside the tumor, which favors lymphocyte infiltration and improves antitumoral immune response.

Our hypothesis is that endothelial PD-L1 binding to PD-1, as well as PD-L1 intrinsic function in endothelial cells, may modulate tumor neovascularization.

Consequently, blocking PD-1/PD-L1interaction with checkpoint inhibitors could interfere with endothelial functionality and modify actual effectiveness of these therapies.

Our in vitro experiments show that pro-inflammatory cytokines as well as culture confluence conditions modulate PD-L1 expression. Furthermore, functional studies confirm the implication of PD-L1 and PD-L1/PD-1 interaction in endothelial survival and proliferation, which are essential processes in angiogenesis.

Altogether, our data indicate that PD-L1 is involved in endothelial functions, suggesting that blocking PD-1/PD-L1 axis could affect tumor angiogenesis, thus modifying patient outcome and the response to combined therapies.

Índice

Resumen Summary

Índice:

Abreviaturas ... 1

1. Introducción ... 5

1.1. Cáncer: un reto para la medicina actual ... 5

1.2. Sistema inmunitario y su respuesta antitumoral ... 6

1.3. Inmunoterapia como tratamiento antitumoral ... 8

1.4. PD-L1 en las células tumorales ... 9

1.5. PD-L1 en el endotelio ... 12

1.6. Modulación de la angiogénesis como estrategia combinada con la reactivación de la respuesta inmune ... 13

2. Hipótesis y Objetivos ... 19

3. Materiales y Métodos ... 23

3.1. Reactivos y anticuerpos ... 23

3.2. Clonajes y plásmidos ... 24

3.2.1. Silenciamiento de PD-L1 ... 24

3.2.2. Sobreexpresión de PD-L1 ... 24

3.2.3. Producción de PD-1 recombinante ... 26

3.2.4. Clonaje para ensayos de proximidad a proteína ... 27

3.3. Cultivo celular ... 28

3.4. Producción de virus y transducción ... 29

3.5. Técnicas de extracción de RNA y PCR ... 30

3.6. Análisis de citometría de flujo ... 30

3.7. Inmunofluorescencia ... 31

3.8. Inmunohistoquímica y cuantificación de la angiogénesis tumoral ... 31

3.9. Ensayo de migración in vitro ... 32

3.9.1. Ensayos de migración en Transwell ... 32

3.10. Producción de PD-1 recombinante ... 34

3.11. Estadística ... 36

4. Resultados ... 41

4.1. Caracterización de la expresión de PD-L1 en EC in vitro ... 41

4.1.1. Expresión basal de PD-L1 en HUVEC y su regulación por citoquinas

proinfamatorias ... 41

4.1.2. Regulación de la expresión de PD-L1 por el estado de confluencia del cultivo celular ... 42

4.2. Estudio del efecto del bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 en la biología endotelial ... 44

4.2.1. Producción de PD-1 recombinante ... 44

4.2.2. Análisis del efecto de la interacción PD-1/PD-L1 en la supervivencia celular endotelial ... 47

4.2.3. Análisis del efecto de la interacción PD-1/PD-L1 en la proliferación endotelial 49 4.2.4. Análisis del efecto del bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 en la migración endotelial ... 50

4.3. Estudio de la señalización intrínseca de PD-L1 en células endoteliales ... 52

4.3.1. Análisis del efecto del silenciamiento de PD-L1 en la supervivencia celular endotelial ... 52

4.3.2. Análisis del efecto de la sobreexpresión de PD-L1 en la supervivencia celular endotelial ... 55

4.3.3. Análisis del efecto de la sobreexpresión de PD-L1 en la proliferación endotelial ... 58

4.3.4. Análisis del efecto de la sobreexpresión de PD-L1 en la migración endotelial .. 59

4.4. Caracterización molecular de las rutas de señalización implicadas en la función intrínseca de PD-L1. ... 61

4.4.1. Estudio del efecto del silenciamiento y sobreexpresión de PD-L1 en la expresión de mediadores angiogénicos mediante microarray. ... 61

4.4.2. Análisis de la asociación de proteínas al dominio citoplásmico de PD-L1 ... 63

4.5. Estudio del efecto de una terapia anti-PD-1 en la angiogénesis tumoral en un modelo de carcinoma epidermoide de pulmón KLN205 de ratón ... 65

5. Discusión ... 69

6. Conclusiones ... 83

7. Bibliografía ... 87

Clave de abreviaturas

ABREVIATURAS

1

Abreviaturas

A/IP: Anexina/Ioduro de propidio APC: Célula presentadora de antígeno APEX:Enzimaascorbatoperoxidasa CDK-4: Quinasa dependiente de ciclina 4 EMA: Agencia europea del medicamento EMT: Transición epitelio-mesénquima Endo-MT: Transición endotelio-mesénquima FBS: Suero fetal bovino

FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos GFP: Proteína fluorescente verde

GSK3: Glicógeno sintasa quinasa 2

HIF-1α: Subunidad alfa del factor 1 inducible por hipoxia HUVEC: Células endoteliales de cordón umbilical humanas IFN: Interferón-γ

IGF-1: Factor de crecimiento insulínico tipo 1 IL-8: Interleuquina 8

ITGAV: Gen de la integrina αV

KDR: Gen del receptor de VEGF tipo 2

MHC: Molécula del complejo principal de histocompatibilidad MMP-9: Metalopeptidasa 9 de matriz

MOI: Multiplicidad de infección mRNA: ARN mensajero

NF-kB: Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas PD-1: Receptor de muerte programada 1

PD-L1: Ligando del receptor de muerte programada 1 TCR: Receptor de célula T

VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular

VEGFR-2: Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2

Introducción

INTRODUCCIÓN

5

1. Introducción

1.1. Cáncer: un reto para la medicina actual

El cáncer es la principal causa de muerte en el mundo, y combatirlo supone uno de los mayores retos de la medicina actual. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), en 2015 ocasionó 8,8 millones de defunciones. Así pues, su prevalencia es muy alta, siendo una de cada seis defunciones en el mundo debidas a esta enfermedad. La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son los tratamientos convencionales más utilizados a día de hoy, aunque en muchos de los casos no son efectivos o suficientes para la eliminación total y definitiva del tumor, además de presentar numerosos efectos secundarios. Por ello, en las últimas décadas los esfuerzos investigadores se centran en la búsqueda de terapias dirigidas complementarias a las existentes o alternativas a éstas, con el fin de mejorar la eficacia de los tratamientos y la seguridad de los mismos.

El término “cáncer” hace referencia a un grupo de enfermedades que se caracterizan por el desarrollo de células anormales, las cuales se dividen indefinidamente y pueden incluso extenderse más allá de sus límites habituales, invadiendo partes adyacentes del cuerpo u otros órganos. Este proceso invasivo se denomina metástasis y constituye la principal causa de muerte por cáncer. La metástasis se une a otras cinco características principales de una célula tumoral descritas por Hanahan y Weinberg en el año 2000(1). Tras un amplio análisis bibliográfico, estos autores describieron 6 principales características que comparten las células tumorales, como son un potencial replicativo ilimitado, evasión de la apoptosis o una formación mantenida de vasos sanguíneos al tumor, proceso conocido como angiogénesis. Recientemente, se han descrito otras características adquiridas en un tumor que favorecen su progresión, como son la evasión de la respuesta inmune antitumoral y el proceso inflamatorio existente en el microambiente tumoral (2). Todas estas características, junto con otras descritas por los mismos autores, permiten que el tumor progrese de forma autónoma y descontrolada (Figura I1).

Figura I1. Características principales de una célula tumoral. Representación gráfica de las principales características de un tumor descritas por Hanahan y Weinberg. Esta imagen ha sido modificada a partir de la original publicada por estos autores (2).

1.2. Sistema inmunitario y su respuesta antitumoral

El sistema inmunitario es el conjunto de células y moléculas que, a través de una respuesta conjunta y coordinada, protege al organismo de cualquier agente extraño, bien externo al cuerpo, bien del propio organismo, pero cuyas características han sido alteradas. Estos agentes extraños pueden ser desde microbios infecciosos hasta células aberrantes, como son las células tumorales.

Esta respuesta inmunitaria se divide en inmunidad innata, que se caracteriza por ser la primera línea de defensa frente a microbios, e inmunidad adaptativa, que surge a partir de la infección y se adapta a ella, siendo por tanto más específica que la anterior. Los linfocitos son las células más características de la inmunidad adaptativa, siendo los linfocitos T los mediadores de la inmunidad adaptativa celular y las principales células anti cancerígenas del sistema inmunitario(3).

Como se puede observar en la Figura I2, la activación de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento de antígenos específicos tumorales acoplados a

Inestabilidad genómica y mutaciones Resistencia

muerte celular Desregulación

de la energía celular

Activación sostenida de rutas

proliferativas

Evasión de inhibidores de

crecimiento

Evasión de la respuesta

inmune

Inmortalidad replicativa

Promoción de procesos inflamatorios

Invasión y metástasis Inducción de la

angiogénesis

INTRODUCCIÓN

7

moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), presentados por células presentadoras de antígeno (APC).

Figura I2. Representación gráfica de la activación de un linfocito T y su inhibición a través del eje PD-1/PD-L1. El linfocito T reconoce el antígeno tumoral presentado por la célula presentadora de antígeno (APC) a través de su receptor TCR, lo que permite la inducción de rutas de señalización (PI3K/Akt y RAS/ERK) que dan lugar a su activación.

Esta activación es controlada posteriormente por la unión del receptor PD-1, cuya expresión se induce tras la activación, a su ligando PD-L1 presente en la APC, que desencadena una señal inhibidora a través de la tirosina fosfatasaShp-2. De igual forma ocurre al unirse al PD-L1 tumoral, lo que resulta en una inactivación de la respuesta inmune antitumoral. La reversión de esta inhibición y por tanto la reactivación de estos linfocitos, se consigue con la acción de un anticuerpo anti-PD-L1, bloqueante de la interacción PD-1/PD-L1.

Esto desencadena señales activadoras de rutas de señalización como PI3K/Akt y RAS/ERK, a través de su receptor TCR y moléculas coestimuladoras, CD28 y CD80.

Esta señalización activadora desemboca en la proliferación de los linfocitos T y producción de citoquinas que permiten la eliminación del agente extraño, en este caso el tumor (3, 4).

Con el fin de evitar una activación de la respuesta inmunitaria exacerbada, existen puntos de control del sistema inmune que inhiben de forma natural esta respuesta citotóxica. El receptor de muerte programada o PD-1, es una molécula inhibidora que conforma uno de los principales puntos de control de la respuesta inmune. PD- 1 es una proteína transmembrana de tipo I que se expresa en la membrana de los linfocitos T tras activarse. Al unirse este receptor a su ligando PD-L1, presente en la célula presentadora de antígeno, el dominio citoplásmico se fosforila, dando lugar a la unión de la tirosina fosfatasa Shp-2, responsable de la desactivación de las rutas previamente activadas por el TCR. Esta desactivación, resulta finalmente en la inhibición de la respuesta de los linfocitos T(5, 6).

1.3. Inmunoterapia como tratamiento antitumoral

Uno de los mecanismos de evasión de la respuesta inmune que han desarrollado las células tumorales es la activación de los puntos de control inhibidores de la respuesta de los linfocitos T. Así pues, las células tumorales expresan en su superficie el ligando PD-L1 que al unirse a su receptor PD-1 en los linfocitos T, desactiva su respuesta antitumoral. Por esta razón, el bloqueo de estos puntos de control es uno de los métodos actuales más prometedores para potenciar de forma eficaz la eliminación de tumores a través de la reactivación de la respuesta inmunitaria frente a estos (Figura I2). Este tratamiento enfocado a la modulación del sistema inmune es una de las formas de inmunoterapia antitumoral, y constituye uno de los enfoques principales de la investigación oncológica actual.

Concretamente, el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos al bloqueo de estos puntos de control con el fin de eliminar el freno inmunológico ejercido por las células tumorales, ha sido particularmente exitoso (7, 8).

INTRODUCCIÓN

9

Tanto es así, que han sido aprobados por la FDA y la EMA algunos anticuerpos bloqueantes del ejePD-1/PD-L1, como son el anticuerpo anti-PD-1 Nivolumab y el anticuerpo anti-PD-L1 Atezolizumab. El uso de estos anticuerpos para el tratamiento de algunos tipos de cáncer, como es el melanoma, cáncer renal y cáncer de pulmón no microcítico, ha resultado ser muy beneficioso(4, 9, 10). Sin embargo, a pesar de los resultados prometedores de esta inmunoterapia, existe un porcentaje elevado de pacientes que presentan cierta resistencia intrínseca al tratamiento o que responden a éste, pero recaen tras un periodo de tiempo (4).

1.4. PD-L1 en las células tumorales

Debido a su relevancia clínica, PD-L1 ha sido ampliamente estudiado en células tumorales en las últimas décadas. PD-L1 no solo funciona como un ligando inerte para la señalización del receptor PD-1, sino que también presenta una señalización intrínseca en la célula tumoral que lo expresa, lo que podría explicar en parte las resistencias a la inmunoterapia actual.

PD-L1 se expresa en multitud de tipos de cáncer y su expresión se relaciona frecuentemente con un peor pronóstico de los pacientes (11-13). Esta expresión se ha relacionado también con una mejor respuesta a tratamientos inmunoterápicos enfocados al eje PD-1/PD-L1, sirviendo por tanto como un biomarcador pronóstico y de respuesta a tratamiento en muchos casos (14, 15).

PD-L1 es una proteína transmembrana de tipo 1 de la familia de las proteínas B7, con un dominio extracelular tipo inmunoglobulina y un dominio citoplasmático corto, carente de dominios reguladores de señalización conocidos (16).

Recientemente, se han descrito tres secuencias cortas implicadas en la protección frente a la muerte inducida por IFNγ en células tumorales (17). PD-L1 se expresa de forma constitutiva e inducible en células hematopoyéticas como son células B, T, células dendríticas y macrófagos (18). Además, se expresa en células tumorales (19)y en otras células no hematopoyéticas como las células endoteliales (20).

La expresión de PD-L1 se regula por rutas de señalización típicamente oncogénicas como son la ruta PI3K/Akt/mTOR o la ruta RAS/ERK, tanto a nivel transcripcional

como post-transcripcional. La regulación de PD-L1 también puede darse a través de miRNAs, los cuales pueden actuar de forma directa uniéndose al ARN mensajero (mRNA) de PD-L1, o de forma indirecta modificando la expresión de otros reguladores (21, 22).

Algunos de los factores que inducen la expresión de PD-L1 a nivel transcripcional son HIF-1α, inducido por hipoxia (23) y STAT-3, intermediario de la ruta oncogénica JAK/STAT que interviene en procesos de proliferación y supervivencia tumoral (24). Algunas citoquinas inflamatorias como el IFNγ son secretadas en el microambiente tumoral principalmente por células T activadas. El IFN activa la ruta JAK/STAT, desencadenando finalmente una inducción de la expresión de PD- L1 (25, 26). Otros factores de transcripción implicados en la regulación de PD-L1 son NF-kB, clave en la inflamación y la inhibición de apoptosis en el tumor (27), o el oncogén MYC, importante también para el control de la supervivencia y proliferación tumoral (28).

PD-L1 se regula además a nivel de proteína, cuya estabilidad está modulada por su interacción con la proteína transmembrana CMTM6, que evita su ubiquitinización y degradación por proteasoma (29). Otra proteína que estabiliza de manera indirecta PD-L1 es la CSN5, inducida por la ruta NF-kB (30). CSN5 puede activarse también a través de la enzima USP22, la cual puede desubiquitinizar directamente a PD-L1 (31). La ciclina D-CDK4, sin embargo, regula negativamente la expresión de PD-L1 activando de manera indirecta la ubiquitinización de éste y por tanto su degradación (32). Existen otras modificaciones posttranscripcionales que regulan la estabilidad de PD-L1 y su degradación, como son la N-glicosilación que favorece su estabilidad, y la fosforilación mediada por enzimas como la GSK3B, que da paso a la ubiquitinización y posterior degradación de proteínas PD-L1 no glicosiladas (33).

En los últimos años, es cada vez más evidente la función de PD-L1 en las células tumorales más allá de su implicación en la supresión de la respuesta inmune antitumoral. PD-L1 ha sido relacionado en muchos estudios con un efecto anti- apoptótico, a través de la activación de rutas que promueven la supervivencia celular en células tumorales como PI3K/Akt y MAPK/ERK. La expresión de PD-L1

INTRODUCCIÓN

11

se traduce en un incremento de la fosforilación de Akt en carcinoma renal y de Akt y ERK en células de cáncer de mama (34, 35). Además, PD-L1 se ha relacionado con el aumento de expresión de intermediarios anti-apoptóticos como Bcl-2 y Bcl-xl en cáncer renal, además de interferir en la señalización inductora de muerte celular mediada por Fas-ligando(19, 36). Un estudio reciente ha descrito también la implicación de PD-L1 en la protección de células tumorales frente a la muerte inducida por IFN, a través de la inhibición de la ruta JAK1/STAT3/caspasa7 activada por éste (17).

Figura I3. Regulación de la expresión de PD-L1 y su función en la célula tumoral. El PD-L1 tumoral se regula a nivel transcripcional y mediante estabilización de proteína. Esta regulación ocurre también por rutas de señalización asociadas con PD-L1, como son la ruta PI3K/Akt y MAPK/ERK (Flechas discontinuas). La expresión de PD-L1 está estrechamente relacionada con supervivencia, transición epitelio-mesénquima (EMT) y proliferación tumoral.

PD-L1 participa, además, en el crecimiento tumoral, habiéndose implicado en procesos de proliferación (37) e invasión. Un estudio muy reciente en cáncer de

PD-L1

PROTEÍNA mRNA

JAK/STAT

NFkB

IFNγ

ZEB1/mir200 c-Myc

HIF1α CMTM6

CSN5 CDK4/6

PI3K/Akt MAPK/ERK NFkB β- catenina

Supervivencia EMT Proliferación

Reguladores de la expresión

Señalización activada

pulmón ha descrito la estabilización de la proteína β-catenina, a través de la acción de PD-L1 en la inactivación de la proteína GSK3β. Esto a su vez, favorece la unión de β-catenina al promotor de la proteína WIP, de la cual se conoce su relación con la progresión tumoral y metástasis. Además, la sobreexpresión de PD-L1 se relaciona con un incremento de marcadores típicos de la transición epitelio- mésenquima (EMT) clave en la metástasis tumoral, como son MMP-9, la Vimentina y la N-cadherina (38). La relación de PD-L1 con marcadores de EMT y el eje β- catenina/ZEB1, se ha encontrado también en otros estudios en cáncer de pulmón y cáncer esofágico (39, 40).

1.5. PD-L1 en el endotelio

A pesar de que el estudio de PD-L1 se ha centrado en el contexto tumoral, PD-L1 se ha analizado también en otros tipos celulares, como en células endoteliales.

Aunque los estudios son escasos, se sabe que las células endoteliales expresan PD- L1 de manera constitutiva e inducible por moléculas inflamatorias como son IFNγ y TNFα (20, 41, 42). Esta expresión endotelial se ha encontrado tanto en estudios con células humanas y de ratón in vitro como en modelos inflamatorios in vivo (42, 43).

El PD-L1 endotelial parece regular la función de los linfocitos T, inhibiendo la secreción de citoquinas y su actividad citotóxica (42, 44). Por otra parte, esta molécula se ha relacionado con la regulación de la angiogénesis en un estudio con células endoteliales de córnea de ratón, en el que se observa que la inhibición de su expresión en estas células coincide con un aumento en la expresión del receptor del factor de crecimiento endotelial VEGFR-2 (45).

Esta correlación entre el receptor VEGFR-2 y la expresión de PD-L1, se ha observado también en un estudio con células endoteliales hepáticas de ratón. En este estudio utilizan un modelo de sepsis en ratón, en el cual encuentran una disminución del receptor VEGFR-2. Estos cambios se recuperan tras la eliminación de la expresión de PD-L1 en estos ratones, si bien el estudio no demuestra la implicación directa del PD-L1 endotelial (46).

INTRODUCCIÓN

13

Otros autores coinciden con el efecto negativo de PD-L1 sobre la división celular del endotelio inflamado en células endoteliales linfáticas in vivo. Sin embargo, en este estudio observan un efecto adicional de PD-L1 como protector de muerte celular, siendo su expresión inversa a la de caspasa3/7 en estas células (47).

La implicación de PD-L1 en patologías inflamatorias vasculares se ha observado también en otro estudio con un modelo murino de distrés respiratorio, en el que encuentran que la eliminación de PD-L1 aumenta la supervivencia de éstos, y regula la permeabilidad y la integridad del endotelio pulmonar (48).

En suma, el PD-L1 endotelial se ha relacionado no solo con una función reguladora de la respuesta inmune, sino también con una función reguladora de la vasculatura, aunque no existen estudios en los que se haya ahondado en el conocimiento de los mecanismos implicados, así como en la posible función específica de PD-L1 endotelial en un entorno tumoral.

1.6. Modulación de la angiogénesis como estrategia combinada con la reactivación de la respuesta inmune

La efectividad de la respuesta inmune antitumoral depende no solo de la correcta activación de los linfocitos T, sino también de una correcta extravasación linfocitaria al tumor superando las condiciones adversas del microambiente tumoral. Existen, por tanto, multitud de factores que interfieren en una respuesta inmunitaria adecuada, lo que genera una necesidad de conocimiento de estos mecanismos subyacentes para mejorar la respuesta de los pacientes a la inmunoterapia y disminuir las resistencias observadas actualmente (49).

Un componente principal del microambiente tumoral es la red de vasos sanguíneos que sostienen el crecimiento tumoral. La formación de esta vasculatura tumoral se origina por el proceso conocido como angiogénesis. El término angiogénesis hace referencia a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos preexistente. Esta vascularización permite la llegada de nutrientes y oxígeno a los tejidos, en este caso al tumor, siendo por tanto vital para el crecimiento tumoral y

la diseminación de este, es decir, la metástasis (50, 51). Este proceso se encuentra fisiológicamente regulado por un equilibrio entre moléculas pro-angiogénicas, como el factor de crecimiento endotelial (VEGF), y moléculas anti-angiogénicas (52). La angiogénesis tumoral se desencadena cuando este equilibrio se rompe (Figura I4), siendo el microambiente tumoral y las propias células tumorales responsables de la descompensación de este equilibrio, y por tanto de un crecimiento sostenido de los vasos sanguíneos hacia el tumor (53, 54).

La constante inducción de factores pro-angiogénicos en un tumor, da lugar a unos vasos sanguíneos inestables e inmaduros. Así pues, la vasculatura tumoral se caracteriza por una morfología tortuosa y desorganizada, además de ser altamente permeable, lo que resulta en un aumento de la presión intersticial en el interior del tumor, debido a un paso de fluidos excesivo. Esto dificulta la extravasación linfocitaria al tumor, dando lugar a una respuesta antitumoral pobre (55). Es bien conocido que el tratamiento con anti-angiogénicos, permiten la normalización de esta vasculatura, facilitando, por tanto, una correcta extravasación linfocitaria al tumor (56).

Figura I4.Homeostasis angiogénica. El desbalance del equilibrio entre moléculas activadoras e inhibidoras del proceso angiogénico, desencadena la activación de la formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de una red de vasos existente.

INTRODUCCIÓN

15

Existen diferentes anti-angiogénicos aprobados para la práctica clínica, como es el Bevacizumab, un anticuerpo bloqueante del factor de crecimiento endotelial VEGF, que ha resultado ser beneficioso para el tratamiento de varios tipos de cáncer, como son cáncer renal, de ovario, de mama y colorrectal metastásicos y cáncer de pulmón de células no pequeñas (57). Sin embargo, así como ocurre con la inmunoterapia enfocada al eje PD-1/PD-L1, muchos pacientes tratados con estos anti-angiogénicos presentan respuestas incompletas o inexistentes al tratamiento (58, 59). Con el fin de mejorar la eficacia de estos y la supervivencia de los pacientes, ha surgido en los últimos años como nueva estrategia la combinación de diferentes terapias. En concreto, la combinación de anti-angiogénicos y anticuerpos bloqueantes anti-PD-L1 o anti-PD-1, parece tener un efecto sinérgico en la eliminación de algunos tipos de cáncer (60, 61).

Estudios con varios modelos de cáncer murinos, han descrito una mejora en la infiltración y activación linfocitaria en el tumor cuando se combina el tratamiento con anti-PD-L1 y bloqueantes de VEGFR-2 o de VEGF y Angiopoietina 2 (62-64).

Esta mejora en el control de la progresión tumoral, puede deberse también a la inducción de la formación de vénulas de endotelio alto en el tumor. En concreto, la combinación de un anticuerpo bloqueante de VEGFR y un anticuerpo anti-PD-L1 se han relacionado con la formación de estos vasos en dos modelos de tumor en ratón (65). La presencia de estas vénulas especializadas en la extravasación linfocitaria en el tumor se ha relacionado con una mejor respuesta a la inmunoterapia en varios tipos de cáncer (66).

Actualmente existen ensayos clínicos en humanos combinando anti-VEGFR o anti- VEGF con anticuerpos anti-PD-L1 para el tratamiento de carcinoma renal, en el que se ha observado una mejor supervivencia de los pacientes tratados con esta combinación (62, 67).

Así pues, PD-L1 es comúnmente conocido como el ligando del receptor PD-1, implicado en la regulación negativa de la activación de los linfocitos T. Esta proteína se expresa también en células tumorales, lo que permite al tumor evadir la respuesta inmune antitumoral. PD-L1 presenta además una función intrínseca en la propia célula que lo expresa. Es conocida cada vez más su implicación en la

progresión tumoral, pero aún es escasa la información que se tiene sobre esta molécula en otros contextos celulares, como es el sistema vascular. PD-L1 se ha relacionado en células endoteliales con una función reguladora de la vasculatura en contados estudios. A su vez, estudios de combinación de terapia angiogénica con inmunoterapia, muestran un efecto sinérgico positivo en la eficacia antitumoral de las mismas.

Hipótesis y objetivos

2. Hipótesis y Objetivos

PD-L1 se ha asociado con procesos de supervivencia y progresión tumoral, pero el conocimiento de su implicación en otros contextos celulares, como es el sistema vascular, es escaso.

Nuestra hipótesis es que PD-L1 podría tener una función reguladora de la biología endotelial, en concreto en la vasculatura tumoral, y por tanto interferir en la eficacia de las inmunoterapias antitumorales enfocadas al eje PD-1/PD-L1.

Con el fin de validar nuestra hipótesis, establecimos los siguientes objetivos principales:

1. Estudiar la expresión de PD-L1 y su regulación en células endoteliales in vitro.

2. Analizar el efecto de la interacción PD-1/PD-L1 en la supervivencia, proliferación y migración de células endoteliales in vitro.

3. Analizar la función intrínseca de PD-L1 en la supervivencia, proliferación y migración las células endoteliales in vitro.

4. Estudiar la señalización del PD-L1 endotelial a nivel molecular.

5. Analizar el efecto de un anticuerpo bloqueante de la interacción PD-1/PD- L1 en la angiogénesis de tumores in vivo.

Materiales y Métodos

3. Materiales y Métodos

3.1. Reactivos y anticuerpos Reactivos:

Para realizar los ensayos de interacción PD-1/PD-L1 in vitro se utilizaron las proteínas PD-1His-tag recombinante humano (RyD Systems, USA) y Drosophila Notch EGFF20 recombinante (RyD Systems, USA) como proteína control. Para el bloqueo in vitro de esta interacción se utilizó el anti PD-L1 Atezolizumab (Tecentriq, Roche, USA), así como un anticuerpo control de isotipo IgG humano como control negativo (Thermo Fisher, USA). Los anticuerpos empleados en los ensayos de inmunoflourescencia, inmunohistoquímica, citometría de flujo y Western blot se detallan en las tablas 1 y 2.

Las enzimas utilizadas para los clonajes descritos en este trabajo fueron: Enzima de restricción AscI (Promega, USA), Enzima de restricción Esp3I (Thermo Fisher, USA), Enzima de restricción NotI (Promega, USA), Enzima de restricción ApaI (Promega, USA) y Enzima de restricción XmaI (Promega, USA).

Anticuerpos primarios:

Anticuerpo Especificidad Casa comercial Aplicación

Anti-PD-L1 Humano Abcam IF

PE Anti-PD-L1 Humano eBioscience CF

PE Anti-Ki67 Humano Thermo Fisher IF

Anti-Caspasa-3 activa Humano Thermo Fisher IF

Anti-PD-L1 Humano Abcam WB

Anti-Flag Tag Thermo Fisher WB

PE Anti-CD202b Humano Biolegend CF

Anti-CD31 Ratón Abcam IHQ

Anti-PD-L1 Ratón R&D Systems IHQ

Tabla M1. Anticuerpos primarios. PE: Ficoeritrina, IF: Inmunofluorescencia, CF:

MATERIALES Y MÉTODOS

24 Anticuerpos secundarios:

Anticuerpo Especificidad Casa comercial Aplicación

Anti-Conejo- Alexa 594 Conejo Thermo Fisher IF

Anti-Rata- Alexa 568 Rata Thermo Fisher IF

Anti-Ratón-HRP Ratón Thermo Fisher WB

Anti-Cabra-Biotina Cabra Thermo Fisher IHC

Anti-Conejo-Biotina Conejo Thermo Fisher IHC

Tabla M2. Anticuerpos secundarios. IF: Inmunofluorescencia; WB: Western blot; HRP:

Peroxidasa; IHC: Inmunohistoquimica.

3.2. Clonajes y plásmidos

3.2.1. Silenciamiento de PD-L1

Para silenciar PD-L1 en células endoteliales de cordón umbilical humanas (HUVEC), utilizamos cuatro vectores de expresión viral con diferentes construcciones silenciadoras shRNA para PD-L1 seguidas del ADN complementario (cDNA) de GFP, incluidos en un kit comercial de expresión lentiviral (Origene, USA). Como control de infección, se utilizó el mismo vector que los anteriores con una secuencia scrambled (no silenciadora), incluido en el mismo kit. Estos plásmidos fueron utilizados para la producción de lentivirus (descrito en el apartado 3.4.). La infección de células HUVEC con una mezcla de estos virus permitió el silenciamiento de PD-L1 en estas células.

3.2.2. Sobreexpresión de PD-L1

Para la sobreexpresión de PD-L1 en HUVEC in vitro, clonamos la secuencia del cDNA de éste en un vector de expresión viral, para la posterior producción de lentivirus con esta construcción.

En primer lugar, amplificamos la secuencia del cDNA mediante PCR a partir del vector comercial Human cDNA clone PD-L1/CD274 (Origene, USA) con los oligonucleótidos (oligos) PD-L1 Fw y PD-L1 Rv que se muestran en la Tabla M3. El primer FW fue diseñado añadiendo la diana de la enzima de restricción Asc1, lo cual nos sirvió para generar extremos cohesivos que nos permitieron clonar la secuencia en el vector de expresión viral de interés PHRSIN-CS-Luc-IRES-emGFP- WdINotI.str. Antes de clonarlo en este último vector, insertamos la secuencia en un vector pGEMT-Easy (Promega, USA). Este vector se digirió con las enzimas AscI y NotI para extraer el inserto PD-L1 previamente clonado en él e insertarlo a continuación del promotor SFFV en el vector final PHRSIN-CS-Luc-IRES-emGFP- WdlNotI.str digerido con las mismas enzimas (Figura M1). El resultado fue un plásmido PHRSIN-SFFV-PD-L1. El vector vacío se utilizó como control en todos los ensayos de sobreexpresión de PD-L1.

Figura M1. Estrategia de clonaje para la sobreexpresión de PD-L1 en HUVEC.

PD-L1 cDNA AscI

5`- -3`

NotI

NotI AscI

AscI NotI

Pgemt-Easy Vector

PHRSIN-CS-Luc-IRES-emGFP-WdINotI.str

SFFV-PD-L1

MATERIALES Y MÉTODOS

26 3.2.3. Producción de PD-1 recombinante

Para la producción de la proteína PD-1 recombinante se utilizó un sistema de producción de baculovirus en células de insecto (descrito en el Apartado 3.9.).

Como se muestra en la Figura M2., se amplificó la secuencia del dominio extracelular de la proteína PD-1 (de la posición 25 a la 535) del vector de expresión Human PD1/PDCD1 natural ORF mammalian expression plasmid (SinoBiological, USA), con el fin de clonarla finalmente en un vector de expresión viral pSLG-IBA63. La secuencia de los oligos utilizados para ello, PD-1 Fw y PD-1 Rv, se muestra en la Tabla M3. Estos oligos contienen secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción Esp3I, para permitir el clonaje del producto de PCR en el vector final de expresión viral pSLG-IBA63 (IBA Lifescience, Alemania). Antes de clonarlo en este último vector, se insertó en el vector pGEMT- Easy en el cual se realizó una mutagénesis dirigida siguiendo el protocolo del kit QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesiss Kit (Agilent, USA) utilizando unos oligos que incluían la mutación deseada (PD-1 Mut Fw y PD-1 Mut Rv). Esta mutación consiste en una sustitución de cisteína 63 por serina, realizada con el fin de aumentar la estabilidad de la proteína (68).

Figura M2. Estrategia de clonaje para la producción de PD-1 recombinante.

Fragmento externo PD-1 5`-

Pgemt-Easy Vector -3`

Esp3I Esp3I

pSLG-IBA63

Esp3I Esp3I

pSLG-IBA63-PD-1

Finalmente, se digirió el fragmento clonado con la enzima de restricción Esp3I y se clonó en el vector viral final pSLG-IBA63 digerido con la misma enzima siguiendo el protocolo StartGateDirect Transfer Cloning (IBA Lifescience, Alemania). La construcción resultante utilizada para la producción de baculovirus fue pSLG- IBA63-PD-1 (Figura M2).

3.2.4. Clonaje para ensayos de proximidad a proteína

La enzima ascorbato peroxidasa (APEX), se ha utilizado con éxito para los estudios de interacción proteica (69). Por ello, diseñamos un clonaje para generar un vector de expresión lentiviral que diera lugar a la expresión de la proteína PD-L1 fusionada con APEX en su extremo citoplásmico. Así pues, amplificamos mediante PCR en primer lugar la secuencia total del cDNA de PD-L1 a partir del vector comercial Human cDNA clone PD-L1/CD274 (Origene, USA) con un oligoPD-L1- APEXFw,que contiene la secuencia de corte de la enzima XmaI (Promega, USA), y un oligoPD-L1-APEXRv, en el que se eliminaron los pares de bases correspondientes al codón de parada (TAA). La secuencia insertada se clonó en el vector pGEMT-Easy (Promega, USA), como paso intermedio antes de clonarlo en el vector que incluía APEX2 unido a un tagFlag. Tanto el vector pGEMT-Easy como el vector PcDNA3-APEX2-NES (Addgene, USA) se cortaron con la enzima de restricción NotI, para ligar posteriormente la secuencia PD-L1 en una posición 5’

con respecto a la secuencia APEX2 en el vector pcDNA3-APEX2-NES. Se comprobó la correcta orientación de PD-L1 mediante la digestión del plásmido con ApaI (Promega, USA), la cual al cortar en diferentes puntos de la secuencia, dio lugar a fragmentos de tamaño diferente dependiendo de la orientación de ésta.

Finalmente se digirieron tanto este vector como el vector de expresión lentiviral final PHRSINCSGWdlNotICAG.str con las enzimas XmaI y XhoI (Promega, USA).

Esto permitió introducir la secuencia PD-L1-APEX2-Flag en el vector de expresión, resultando un plásmido final CAG-PD-L1-APEX2 (Figura M3).

MATERIALES Y MÉTODOS

28

Figura M3. Estrategia de clonaje para análisis de proximidad proteica.

3.3. Cultivo celular

HUVEC: Se utilizaron como modelo experimental de este trabajo células endoteliales humanas de cordón umbilical (HUVEC) adquiridas a Lonza (Suiza).

Estas células se cultivaron en placas de cultivo previamente cubiertas con gelatina al 0.2% y utilizando medio M199 (Lonza, Suiza) suplementado con 20% de suero fetal bovino (FBS, Thermo Fisher Scientifics, USA), 10% de Hepes 1M (Lonza, Suiza), 1% de Penicilina/Estreptomicina 100X (P/S, Biowest, Francia) y 0.4% de un suplemento de crecimiento endotelial con 22.5 mg/ml de heparina (Promocell, Alemania). Se cultivaron en incubadores con 5% de CO2 y humedad controlada a 37°C. Para la realización de experimentos se utilizaron células en pases 3-7. Las fotos del cultivo celular fueron tomadas con un objetivo 10X con un microscopio óptico Nikon Eclipse TS100 con cámara DS-Fi1 acoplada (Nikon, Japón).

SF9: Estas células de insecto (ATCC, USA) se cultivaron en Grace´s Insect Medium (Thermo Fisher, USA) suplementado con 20% de FBS y 1% de Penicilina/Estreptomicina. Se incubaron sin CO2 y a 27°C. Para el mantenimiento normal del cultivo y producción de virus a pequeña escala se cultivaron en

PD-L1 cDNA XmaI

5`- -3`

NotI

NotI XmaI

Pgemt-Easy Vector

NotI

PcDNA3-APEX2-NES

NotI

PD-L1-APEX2-NES

XmaI

XhoI

XhoI

PHRSINCSGWdINotICAG.str

XmaI XhoI

CAG-PD-L1-APEX2

monocapa, mientras que para la producción de baculovirus a gran escala se cultivaron en suspensión en continua agitación a 50-100 rpm.

HEK-293: Esta línea celular (ATCC, USA) fue utilizada para la producción de lentivirus. El mantenimiento del cultivo se hizo en incubadores libres de micoplasma con 5% de CO2 y humedad controlada a 37°C. Se cultivaron con medio DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S.

3.4. Producción de virus y transducción

Los lentivirus para la posterior transducción de las HUVEC in vitro, se produjeron mediante la transfección de células HEK-293T libres de micoplasma con fosfato cálcico. Para la transfección se usaron el vector de expresión viral de interés y dos plásmidos de empaquetamiento viral (PsPaX y VsVg). La adición de fosfato cálcico a la mezcla de los plásmidos anteriores y el plásmido vector de la secuencia de interés, permite un agregado que protege el DNA y es fagocitado por las células.

Tras la incubación durante 16 horas de las células con esta mezcla de transfección, compuesta por el vector de interés, los plásmidos PsPaX y VsVg y el fosfato cálcico, se cambió el medio y se dejaron 48 horas con medio DMEM completo para la producción de los lentivirus. Los sobrenadantes de los cultivos transfectados, que contenían los correspondientes lentivirus, fueron filtrados con Steriflip 0.45 µm (Merck, Alemania) y se ultracentrifugaron a 23000 revoluciones por minuto (rpm) durante 2 horas a 4°C. Los virus se resuspendieron finalmente en PBS 1X frío y se congelaron a -80°C.

Los lentivirus recogidos se titularon transduciendo células HEK293 con diferentes diluciones del virus (3 µl, 0,3 µl y 0,003 µl) y analizando la expresión de GFP por citometría de flujo a las 24 horas. Debido a que la construcción final PHRSIN-SFFV- PDL1 para la sobreexpresión de PD-L1 carece de GFP (Apartado 3.2.2.), se estimó el título de estos lentivirus utilizando como control los virus generados en paralelo en las mismas condiciones a partir del plásmido PHRSIN-CS-Luc-IRES-emGFP- WdlNotI.str.

MATERIALES Y MÉTODOS

30

La transducción de las células HUVEC se realizó en pases tempranos (3 ó 4) a una MOI de 5 durante 16 horas.

3.5. Técnicas de extracción de RNA y PCR

El RNA total se extrajo de las células usando TRI Reagent (MRC, USA) y se precipitó mediante una solución de isopropanol frío. Una vez extraído, se lavó con etanol al 70% y se solubilizó en agua destilada RNAsa free. El cDNA se obtuvo a partir de este RNA mediante el kit GoScript Reverse Transcriptase kit (Promega, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, la expresión génica se analizó mediante RT-PCR con un sistema CFX384 (Biorad, USA) usando el Power SYBR Green PCR master mix (ApplyBiosystem, USA). El microarray utilizado en este trabajo fue el kit de Angiogénesis Humano RT² Profiler PCR Array (Quiagen, USA). Los oligos utilizados para RT-PCR se muestran en la Tabla M3.

3.6. Análisis de citometría de flujo

La expresión de PD-L1 se analizó por citometría de flujo, incubando las células con un anticuerpo anti-PD-L1 humano marcado con PE (eBioscience, USA) a una concentración de 0.2 µg/µl durante 30 minutos a 4°C. El mismo protocolo de marcaje se utilizó para la tinción con anti- CD202b marcado con PE para los ensayos de interacción de proteína con PD-1 recombinante.

Para el análisis de supervivencia se marcaron las células con un kit Anexinay Ioduro de propidio (A/IP) siguiendo el protocolo del fabricante (Immunostep, España).

Todas las células marcadas se analizaron con un FACS Canto II (BD Biosciences, USA) y los datos recogidos fueron posteriormente analizados y representados utilizando el FlowJo software (BD Biosciences, USA).

3.7. Inmunofluorescencia

Las células previamente despegadas de la placa de cultivo con 0.05% Tripsina- EDTA 1X (Gibco, ThermoFisher, USA), se sembraron sobre cristales de vidrio recubiertos con gelatina al 1% previamente esterilizados. Las células se fijaron con paraformaldehido al 4% durante 10 minutos y después se permeabilizaron con 0.1% de Tritón X-100 en PBS durante 30 minutos, todo ello a temperatura ambiente. Antes de la incubación con los anticuerpos, se bloquearon con 3% de BSA en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos primarios se incubaron 16 horas en cámara húmeda a 4°C y los anticuerpos secundarios 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios usados (Tabla M1) fueron anti PD-L1 humano de conejo (Abcam, USA), anti-Ki-67 humano de rata (Thermo Fisher, USA) y anti-Cleaved Caspase 3 (Caspasa 3 activa) humano de conejo (Thermo Fisher, USA). Se utilizaron los correspondientes secundarios marcados con Alexa 594/568 (ThermoFisher, USA). La tinción del núcleo celular se realizó con DAPI (Invitrogen, USA) y los cristales se montaron con medio Mowiol (Merck, Alemania). La tinción se analizó mediante un microscopio confocal Leica TCS SP5 (Alemania) y las imágenes tomadas fueron posteriormente analizadas con el software ImageJ. Para el análisis de la intensidad media de fluorescencia (MFI) se seleccionó el área fluorescente y se midió la fluorescencia en pixeles con respecto al total de la imagen capturada. Para ello todas las imágenes fueron tomadas previamente con el mismo aumento (40X).

3.8. Inmunohistoquímica y cuantificación de la angiogénesis tumoral

Se analizaron los tumores de ratones con un modelo de cáncer epidermoide de pulmón KLN205, tratados con anticuerpo anti-PD-1 o anticuerpo control de isotipo. Se utilizaron cortes transversales de 3 micras de los tumores previamente fijados con paraformaldehido al 4% y embebidos en parafina. Se incubaron estos cortes con anticuerpos primarios Anti-PD-L1 (RyD Systems, USA) y Anti-CD31 (Abcam, USA) de ratón a una concentración 5 ug/ml y 1:1000 respectivamente.

Estos se incubaron durante 16 horas a 4°C en cámara húmeda. Se utilizaron los

MATERIALES Y MÉTODOS

32

correspondientes secundarios Anti-Conejo-Biotina y Anti-Cabra-Biotina a una concentración 1:500 y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. Los cortes fueron posteriormente incubados con ABC-HRP kit (Vector Laboratories, USA) y revelados con DAB (Diaminobencidina) de Vector Laboratories (USA).

Para la cuantificación de la angiogénesis se tomaron fotos desde la parte más externa del corte hacia la más interna a un aumento de 10 X en microscopio óptico Nikon Eclipse Ci (Nikon, Japón). El número de fotos tomadas por muestra depende del tamaño del tumor. Debido a que se tomaron las fotos mediante un barrido de la muestra, de fuera hacia dentro del tumor, se consideraron 3 zonas del tumor (zona periférica, zona intermedia, zona central o core), dividiendo el total de fotos tomadas de la muestra en tres partes. Estas fotos se cuantificaron mediante el conteo de los vasos sanguíneos teñidos con Anti-CD31, que se normalizó posteriormente con el número total de imágenes analizadas.

3.9. Ensayo de migración in vitro

3.9.1. Ensayos de migración en Transwell

Para analizar la migración de las HUVEC se utilizaron Transwell con un poro de 8 µm (Corning, USA). Se utilizaron placas p24 en cuyos pocillos se puso Medio M199 completo con 0.5% de FBS como estímulo para la migración. Las células se sembraron sobre las membranas Transwell con medio M199 suplementado con 10% de BSA sin FBS. Se incubaron a 37°C durante 6 horas. Tras las 6 horas de migración, se eliminaron las células que permanecían en la parte superior de la membrana y que por tanto no habían migrado. Tras ello, se cortaron las membranas, las cuales incluían únicamente las células que habían migrado, se fijaron con PFA 1X 10 minutos a temperatura ambiente (5) y se marcaron los núcleos con DAPI. Se contaron las células de 10 campos 20X de cada membrana con un microscopio de fluorescencia (Eclipse Ci, Nikon, Japón).

Figura M4. Migración de HUVEC en Transwell.

3.9.2. Ensayos de migración en Matrigel

Se utilizó Matrigel (Corning, USA) diluido en frío 1:2 en medio DMEM sin FBS, que fue repartido en una placa de 96 pocillos, 100 µl por pocillo. Se dejó que solidificara 1 hora a 37°C, y se sembraron 1,5x10⁴ HUVEC por pocillo. Este ensayo se realizó por separado, con células con sobreexpresión de PD-L1 y su respectivo control tras 96 horas de transducción, y con células incubadas con PD-1 recombinante y proteína control. La placa con el Matrigel y las células se incubó durante 16 horas a 37°C, tras lo que se tomaron fotos de los pocillos triplicados con un objetivo 10X de un microscopio óptico Nikon Eclipse TS100 con cámara DS- Fi1 acoplada (Nikon, Japón).

La cuantificación de la formación de tubos de células endoteliales en el Matrigel (Figura M5), se realizó mediante el conteo de tubos que conectan las redes formadas (A), sin tener en cuenta las prolongaciones que no llegan a cerrar un área (B), y de las áreas cerradas que quedan en la red de tubos (C).

MATERIALES Y MÉTODOS

34

Figura M5.Cuantificación de la formación de tubos de células endoteliales en Matrigel. A) Tubo que conecta una red formada. B) Tubo incompleto, no considerado para la cuantificación. C) Área completa de la red de tubos formada.

3.10. Producción de PD-1 recombinante

Debido a que la optimización de la producción de PD-1 tardó en completarse, todos los ensayos in vitro realizados en este trabajo se llevaron a cabo utilizando una proteína PD-1 recombinante comercial (R&D Systems, USA) y una proteína Notch recombinante de Drosophila comercial (R&D Systems, USA) como control negativo.

Producción de Baculovirus y transducción: Para la producción de la proteína PD-1 recombinante se utilizó un sistema de producción de baculovirus en células de insecto mediante el kit BacPak Baculovirus expression system (TakaraBio, USA).

Una vez obtenido el vector de expresión viral con la secuencia de PD-1 clonada, el cual incluye además un tag-Flag para su detección (se muestra en Apartado 3.2.3.), se transfectaron las células de insecto SF9 siguiendo el protocolo indicado en el kit anteriormente mencionado. La presencia de baculovirus en el sobrenadante, tras una correcta transfección de las células, se comprobó con la transducción de éstas con sobrenadantes recogidos de repetidas transducciones (con el fin de amplificar la producción de los baculovirus) y realizando una PCR del material genómico de las células. El material genómico se extrajo mediante el kit QIAamp UCP DNA Micro Kit (Qiagen, USA). Los oligos utilizados se muestran en la Tabla M3.

De esta manera se obtuvieron baculovirus que, tras la transducción de las células SF9, permitieron la expresión del fragmento extracelular de PD-1 para su posterior purificación. La comprobación de la expresión de la proteína PD-1 en las células transducidas, se realizó mediante la técnica de Western Blot detectando el tag Flag de la proteína con un mouse anti-Flag (1:1.000) y su correspondiente anticuerpo secundario anti-mouse-HRP (1:10.000). Para poner a punto la producción de PD-1 a gran escala, se midió primero el título de los baculovirus a través de un ensayo de placas de lisis, tal y como se encuentra descrito en el protocolo BackPak Baculovirus expression system (TakaraBio, USA). Tras ello, se seleccionó el tiempo y la MOI más eficientes para una máxima producción de PD-1. Para ello se infectaron las SF9 con diferentes MOI (0.5, 1, 3, 5, 8, 10) y se lisaron las células a dos tiempos, 72 y 96 horas. La expresión de PD-1 se comprobó de nuevo mediante la técnica de Western blot.

Purificación de la proteína: Una vez comprobada la expresión de la proteína PD-1 en las células SF9, se lisaron las células en Buffer de lisis (50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mM, NaCl, 1 mM EDTA, Y 1% TRITON X-100) suplementado con inhibidores de proteasa (Roche, Francia) 30 minutos a RT. Tras centrifugar el lisado, los sobrenadantes se pasaron por columnas de afinidad de agarosa unida covalentemente a un anti-Flag (Merck, Alemania). Se realizaron lavados de la columna con TBS 1X y se eluyó la proteína con un péptido con una alta afinidad por el anticuerpo anti-Flag (3X FLAG Peptide, Merck, Alemania). La cantidad relativa de la proteína PD-1 en el eluido se estimó mediante su visualización en geles de poliacrilamida teñidos con azul Coomasie. La cuantificación de los eluidos de proteína se realizó con Pierce BCA ProteinAssay Kit (ThermoFisher, USA).

Ensayos de unión al ligando: Para comprobar la correcta unión de la proteína PD-1 recombinante con su ligando PD-L1 en células HUVEC, se realizó un ensayo de competición por el ligando con un PE mouse anti-PD-L1. Primero se seleccionó una concentración de anticuerpo limitante para evitar una saturación del marcaje.

MATERIALES Y MÉTODOS

36

Para ello se incubaron las HUVEC con diferentes concentraciones de PE mouse anti-PD-L1 (2, 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05 µl a partir de una concentración de 0.1 µg/µl).

Seleccionamos 1 µl para el ensayo de competición. Así pues, se incubaron previamente las HUVEC con las proteínas PD-1 purificado, PD-1 recombinante comercial como control positivo y Notch recombinante comercial como control negativo, durante 10 minutos a 4°C. Cada pool de células con la proteína correspondiente, se incubó con PE mouse anti-PD-L1 y PE mouse anti-CD202b (1:100), como control de especificidad, durante 30 minutos a 4°C. El marcaje resultante se analizó por citometría de flujo.

3.11. Estadística

Todos los experimentos in vitro se realizaron por triplicado y al menos dos veces.

La significación de las diferencias encontradas entre dos grupos se analizó mediante el test estadístico t de Student. En experimentos con más de dos grupos se analizó mediante un test Anova y la comparación entre ellos con el post-test Bonferroni. Las diferencias se consideraron positivas con valores p<0.05 (*p<0.05,

**p<0.01, ***p<0.001). El análisis de los datos y su representación gráfica se realizaron mediante el software GraphPadPrism 6.

Tabla M3.Secuencias de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo.

OLIGONUCLEÓTIDOS

PD-1 Fw 5’-AGCGCGTCTCCAATGCAGATCCCACAGGCGCC-3’

PD-1 Rv 5’-AGCGCGTCTCCTCCCTTGGAACTGGCCGGCTG-3’

PD-1 Mut Fw 5’-CCGGCCAGGACTCCCGCTTCCGTGTC-3’

PD-1 Mut Rv 5’-GACACGGAAGCGGGAGTCCTGGCCGG-3’

IBA63 Fw 5’-CAACGCACAGAATCTAGCGC-3’

IBA63 Rv 5’-TAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’

PD-1 Rv 5’- CCTCCCTTGGAACTGGCCGGCTG-3´

PD-L1 Fw 5´- GGCGCGCCAGATGAGGATATTTG-3´

PD-L1 Rv 5’-GATTACGTCTCCTCCAAATGTCAGATCT-3´

KDR Fw 5’-CCAAGCCAGGAGGGCCACTC-3´

KDR Fw 5’-GAATCGTGCCCCTTTGGTCTTGTAGG-3´

ITGAV Fw 5’-GGCTGGAACTCAACTCTTAGCTGGTC-3´

ITGAV Rv 5’-CTCGAGACTCCTCTTATCTCAACTGC-3´

IGF-1 Fw 5’-GCACACCATGTCCTCCTCGCATC-3´

IGF-1 Rv 5’-GAGCCATACCCTGTGGGCTTGTTG-3´

IL-8 Fw 5’-CTGCAGCTCTGTGTGAAGGTGCAG-3´

IL-8 Rv 5’-CAATAATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG-3´

Resultados

4. Resultados

4.1. Caracterización de la expresión de PD-L1 en EC in vitro

4.1.1. Expresión basal de PD-L1 en HUVEC y su regulación por citoquinas proinfamatorias

Como han descrito algunos autores previamente (42, 43), las células endoteliales expresan PD-L1 basalmente, si bien la expresión de esta molécula puede ser modulada por citoquinas proinflamatorias como IFNγ y TNFα. Para confirmar estos hallazgos en nuestro modelo de estudio, se trataron células endoteliales humanas de vena de cordón umbilical (HUVEC) in vitro con IFNγ (100 ng/ml) y TNFα (20 ng/ml), de manera independiente o combinada, durante 24 h.

Figura R1. Regulación por citoquinas proinflamatorias de la expresión de PD-L1 en membrana. Análisis representativo de citometría de flujo de la expresión de PD-L1 en HUVEC sin permeabilizar, en condiciones basales y tras 24 h de tratamiento con IFNγ (100 ng/ml) y TNFα (20 ng/ml), de manera independiente o combinada. Se muestra la

MFI: 3362

%: 79,6 MFI: 9457

%: 99.9

MFI: 4753

%: 93.9 MFI: 25297

%: 99.9

RESULTADOS

42

intensidad media de fluorescencia (MFI) de PD-L1 y el porcentaje de células positivas para este marcador en cada caso.

Como se observa en la Figura R1., PD-L1 se expresa basalmente en un 70-80% del total de células analizadas, y se induce a las 24 horas de tratamiento tanto con IFNγ como con TNFα. Además, dichas citoquinas presentan un efecto aditivo en la expresión de PD-L1 endógeno cuando las células son tratadas con ambas simultáneamente.

4.1.2. Regulación de la expresión de PD-L1 por el estado de confluencia del cultivo celular

Algunos autores asocian PD-L1 con el ciclo celular en células tumorales; así, en un estudio observan que los niveles de PD-L1 fluctúan entre las distintas fases del ciclo celular en varios tipos tumorales, siendo elevados en la fase M y fase inicial G1 (32). Además, en otro estudio se observan variaciones en la localización subcelular de PD-L1 en células de cáncer de colon aisladas(70). Por ello, quisimos evaluar en nuestro sistema endotelial si la expresión de PD-L1 se ve afectada por los cambios de densidad celular. Para ello, sembramos las HUVEC al 30% o 100%

de confluencia y analizamos la expresión de PD-L1 en superficie por citometría de flujo a diferentes tiempos (6,16 y 24 horas).

Como se puede observar en la Figura R2.A., la expresión de PD-L1 tras 6 h no difiere entre estados de confluencia, encontrándose un 80% de células positivas para este marcador. A las 16 horas, la expresión de PD-L1 se mantiene en el cultivo subconfluente, disminuyendo, sin embargo, en el cultivo confluente, encontrándose en este un porcentaje de expresión de alrededor de un 70%. Estos cambios se acentúan a las 24 horas, donde el cultivo subconfluente alcanza un 90%

de expresión de PD-L1 en membrana, mientras que en el cultivo confluente PD-L1 disminuye de manera progresiva alcanzando un porcentaje del 50%. Por tanto, la expresión de PD-L1 en membrana se modifica según el estado de confluencia del cultivo celular. Para confirmar este resultado y analizar posibles cambios en la distribución de PD-L1, realizamos ensayos de inmunofluorescencia en HUVEC en