INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO DIRECCIÓN DE POSGRADO
FORMATO GUÍA PARA REGISTRO DE ASIGNATURAS
I. DATOS DEL PROGRAMA Y LA ASIGNATURA
1.1 NOMBRE DEL PROGRAMA: Maestría en Ciencias en Desarrollo Regional
1.2 COORDINADOR DEL PROGRAMA: Dra. Hortencia Gabriela Mena Violante 1.3 NOMBRE DE LA ASIGNATURA: Biología Molecular Agrícola
1.4 CLAVE: (Para ser llenado por la SIP)
1.5 TIPO DE ASIGNATURA: OBLIGATORIA OPTATIVA X
SEMINARIO ESTANCIA
1.6 NÚMERO DE HORAS: TEORÍA PRACTICA T-P 64
1.7 UNIDADES DE CRÉDITO: 8
1.8 FECHA DE LA ELABORACIÓN DEL PROGRAMA DE LA ASIGNATURA: 26 08 11
d m a
1.9
SESIÓN DEL COLEGIO DE PROFESORES EN QUE SE ACORDÓ LA IMPLANTACIÓN DE LA ASIGNATURA:
SESIÓN No.
126 FECHA:
21 09 11
d m a
1.10 FECHA DE REGISTRO EN SIP: (Para ser llenado por la SIP)
d M a
II. DATOS DEL PERSONAL ACADÉMICO
2.1 COORD. ASIGNATURA: M. Valentina Angoa Pérez CLAVE: 6528-EC-09 2.2 PROFR. PARTICIPANTE:
Hortencia G. Mena Violante
Francisco Covarrubias Villa CLAVE:
5767-EA-08 7708-EC-11
III. DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO DEL PROGRAMA DE LA ASIGNATURA III.1 OBJETIVO GENERAL:
Comprender los fundamentos de la biología molecular y sus aplicaciones en estudios genéticos en diversos modelos biológicas para contar con elementos de juicio que permitan comprender la importancia de la investigación en este campo.
III.2 DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO
TEMAS Y SUBTEMAS TIEMPO
1. INTRODUCCIÓN. 1 sesión
1.1. Presentación de alumnos y profesores 30 minutos
1.2. Programa de Estudios. 30 minutos
1.3. Programación de actividades. 1 hora
2. INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR. 2 sesiones
2.1. Cronología de aspectos básicos para la biología molecular. 1 hora
2.2. Genética clásica. 2 horas
2.3. Tipos de herencia. 1 hora
3. ACIDOS NUCLEICOS 7 sesiones
3.1. La célula y su material genético 1 hora
3.2. Mitosis, meiosis, fisión binaria y conjugación 1 hora
3.3. Estructura de DNA y RNA 2 horas
3.4. Compactación del DNA en la célula 2 horas
3.5 Modelos de replicación de ácidos nucleícos 1 hora
3.6 Replicación de DNA 4 horas
3.7 Mutación, reparación de DNA y recombinación 2 horas
Práctica 1. Extracción y visualización de ácidos nucleicos 1 sesión
Examen parcial 1 sesión
4.TRANSCRIPCIÓN 7 sesiones
4.1 RNA y proteínas 2 horas
4.2 Procesamiento de RNA mensajero 4 horas
4.3 Mecanismos de regulación 4 horas
4.4 Traducción y código genético 2 horas
4.5 Síntesis de proteínas 2 horas
4.6 Transporte de proteínas 1 hora
4.7 Proteómica 1 hora
5. TÉCNICAS BÁSICAS USADAS EN CLONACIÓN DE GENES 5 sesiones
5.1. Endonucleasas de restricción 1 hora
5.2. Vectores de clonación 1 hora
5.3. Producción de DNA recombinante 3 horas
5.4.Amplificación de DNA (PCR) 1 hora
5.5. Construcción de bibliotecas genómicas 1 hora
5.6. Manipulación de secuencias de DNA clonado 2 horas
5.7 Genómica 1 hora
Práctica 2. Amplificación por PCR 1 sesión
6. ANÁLISIS MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS 3 Sesiones
6.1 Análisis de DNA por Southern 40 minutos
6.2 Hibridación in situ 1 hora
6.3 RAPD´s 40 minutos
6.4 AFLP´s 40 minutos
6.5 RFLP´s 40 minutos
6.6 Microarreglos 1 hora
6.7 Análisis de expresión de RNA por Northern blot 40 minutos
6.8 Técnicas para análisis de proteínas (Western) 40 minutos
Práctica 3. Extracción de RNA 1 sesión
Examen parcial 1 sesión
7.GENÉTICA Y SOCIEDAD 3 sesiones
7.1 Ventajas y desventajas del uso de herramientas moleculares en actividades humanas
(clonación, genoma humano, patentes) 1 hora
7.2 Impacto de Transgénicos (uso en la agricultura, alimentos transgénicos) 1 hora 7.3 Legislación para el uso de transgénicos en la investigación 30 minutos
7.4 Bioética y bioseguridad 30 minutos
7.5 Recursos genéticos en agroecosistemas 1 hora
7.6 Sistema alimentario sustentable 1 hora
8. FILIACIÓN EPISTEMOLÓGICA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR 1 sesión
Actividades adicionales
Se realizará semanalmente la discusión de una noticia relacionada con el tema en turno 15 min Los alumnos participarán en un Foro de discusión de las repercusiones de la aplicación de la
biología molecular en la Producción agrícola
Total 64 horas
III.3 BIBLIOGRAFIA UTILIZADA EN LA ASIGNATURA
Audesirk, T.; Audesirk, G. y Byers B.E. 2004. Biología. 6ª edición. Ed. Pearson PrenticeHall. México.
p:138-242
Bohinski, R.C. 1978. Bioquímica. 2ª edición. Ed. Fondo Educativo Interamericano. EUA. p:201-233 David L. Nelson., Cox, M.M. y Cuchillo C.M. (2001) Lehninger Principios de Bioquimica. 3a edición. Ed.
Omega. Barcelona, p:13-17, 21-50, 325-361 y 907-1150
Hicks, G. J.J. 2001. Bioquímica. Ed. Mc Garw-Hill Interamericana. México D.F. cap 1 y cap 29 al 32 Madigan, M.T.; Martinko, J.M. y Parker. 2004. Brock. Biología de los Microorganismos. 10ª edición, Ed.
Mc Garw-Hill, España. Cap 7, 8,10,15 y31
Mader, S. 2001. Biología. 7ª edición, Ed. Mc Garw-Hill Interamericana. México. p:158-279
Solomon, E.P.; Berg. L.R. y Martín, W.D. 2001. Biología. 5ª edición, Ed. Mc Garw-Hill Interamericana.
México, DF. p:199-371
Formato para elaboración de Reportes de prácticas Título
Introducción Objetivo
Materiales y Métodos Resultados y discusión Conclusiones
Referencias bibliográficas
III.4 PROCEDIMIENTOS O INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN A UTILIZAR
a. Exposición 20%
b. Participación oral en las sesiones de clase 35%
c. Reportes de prácticas 25%
d. Exámenes 20%
Total 100%
PRACTICAS DE LABORATORIO Práctica 1.- Extracción y visualización de ácidos nucleicos
Introducción
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
Ahora se sabe que las “instrucciones” moleculares del DNA dirigen la vida de todas las células de un organismo y confieren a cada una sus características especiales. El DNA también permite a los organismos, o a las células de un organismo, transmitir información con precisión de una generación a la siguiente.1
Para la extracción de DNA es necesario conocer su estructura, y ubicación dentro de la célula, lo cual permitirá el desarrollo de u protocolo para su obtención.
Objetivo
Que el estudiante conozca los fundamentos básicos para la extracción de DNA utilizando un método rústico y otro basado en el uso de un Kit comercial
Materiales y métodos
a) Extracción de DNA de tejido vegetal Material
- 1 taza de brócoli - 1 taza de agua - Sal
- Detergente líquido - Ablandador de carnes Procedimiento
1) Moler en la licuadora el brócoli con el agua y agregar a la mezcla una pizca de sal
2) Colar la mezcla y colocarla en tubos de ensaye en un volumen aproximado de 1/3 de cada tubo 3) Agregar 1/6 del volumen del tubo de detergente líquido y mezclar
4) Dejar reposar la mezcla durante 10 min 5) Transferir a tubos con 1/3 del volumen 6) Añadir una pizca del ablandador
7) Agitar por inversión, dejar reposar otros 10 min
8) Añadir un volumen igual al de la mezcla de alcohol del 96º virtiendo por las paredes del tubo 9) Observar qué sucede
Hacer reporte de práctica discutiendo la función que cada uno de los productos usados desempeñó para la obtención del DNA
b) Extracción de DNA de células eucariotas (Kit Illustra tissue and cells GE Healthcare) MINIPREP Material
Tejido vegetal recién colectado o congelado Nitrógeno líquido
Par de guantes
Mortero y pistilo estériles Gradilla
Puntas para micropipeta automática de 10, 200 y 1000 µl estériles
1 Ibíd. p. 139
Micropipetas
Toallas de papel estériles
Tubos epperndorf de 1.5 ml estériles Vortex
Microcentrífuga Termoblock Procedimiento
1.- Moler el tejido con nitrógeno líquido en un mortero 2.- Agregar 50 µl del buffer de lisis (solución 1)
Nota: si hay algunos cristales en esta solución, precalentarla a 56 ºC por 2-3 min para disolverlos 3.- Adicionar 10 µl de proteinasa K y agitar en vortex 15 s
4.- Incubar a 56º C durante 1 h
5.- Durante la incubación coloque varios tubos de microcentrífuga con 200 µl de Buffer de elución (1x TE buffer) y caliente a 70 º C precalentado. Este buffer será usado para el paso de elución final
6.- Después de la incubación centrifugue 10 s a 2000xg para formación de pastilla
7.- Agregar 500 µl de la solución 2 (con una sal caotrópica) agite en el vortex por 15 s e incube a temperatura ambiente 10 min
8.- Coloque el número de columnas deseadas dentro de tubos eppendorf. Vacíe cada muestra en una columna y centrifugue a 11000xg durante 1 min. Descarte el líquido que se filtró
NOTA: no sobre cargue la columna, el volumen máximo que puede colocar son 720 µl
9.- Adicione 500 µl de solución 2 a la columna y centrifugue a 11000xg durante 1 min. Descarte el filtrado
10.- Aplique 500 µl de buffer de lavado y centrifugue a 11000xg durante 3 min. Descarte el filtrado con todo y tubo NOTA: Antes de proceder a eluir el DNA de la columna asegúrese de que ésta (la columna) esté completamente seca, si hay algún rastro de líquido visible removerlo con otro paso de centrifugación de 15-30 s
11.- Transferir la columna a tubo de 1.5 ml nuevo. Adicione 200 µl de buffer de elución (1x TE) precalentado a la columna. Incube a temperatura ambiente 1 min
12.- Centrifugue a 11000xg durante 1 min para colectar el DNA purificado
NOTA: una segunda elución incrementará la producción en un 20-25 % pero reduce la concentración
13.- El DNA está listo para usarse en las aplicaciones que desees. Almacenarlo a -20 ºC. Se recomienda no someter las muestras a frecuentes congelamientos y descongelamientos porque puede degradarse
Bibliografía recomendada
Dellaporta, S. J., J. Wood and J. B. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: versión II. Plant Mol Biol. Rep. 1:19- 21.
Práctica 2 : Amplificación in vitro de DNA por PCR Introducción
La Reacción en cadena de la polimerasa (pcr por sus siglas en inglés), es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de ADN. Consiste en una forma simple y muy rápida de multiplicar el
ADN presente en diferentes muestras biológicas (millones de copias). Fue una técnica ideada por el Dr. Kary Mullis, la cual se le adjudicó el Premio Nobel de Química en 1993.
El Dr. Mullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa para crear la región doble cadena usando los denominados cebadores (primers).
Se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: desnaturalización del ADN, hibridación de los cebadores a la hebra y extensión de la cadena.
Objetivo
Que el estudiante conozca y realice un protocolo de Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa de la región 5.8 ribosomal de hongos a partir del DNA obtenido en la práctica anterior. Visualización del producto de PCR en gel de electroforesis
Materiales y métodos
Protocolo para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1. Buffer para PCR 10X………2.00 µL (10X)
2. dNTPs………2.00 µL (2 mM) 3. MgCl2………..0.80 µL (50 mM) 4. SI………1.00 µL (20 pmol) 5. ASI……… 1.00 µL (20 pmol) 6. Taq Pol………...0.20 µL
7. H2O………12.00 µL
8. DNA………1.0 µL
9. 20 L volumen total por reacción
10. Programa para la reacción en el termociclador
Condición Temperatura Tiempo
1 Desnaturalización 94 5 minutos
2 Desnaturalización 95 11 segundos
3 Alineamiento 55 3 minutos
4 Extensión 72 1 minuto
5 Desnaturalización 94 15 segundos
Repetir 25 veces desde 2
7 Extensión final 72 5 minutos
4 infinito
Visualización de los productos d ela amplificación en gel de electroforesis (agarosa al 1%) Bibliografía recomendada
Snustad, P y M. J. Simmons.2000 . Plinciples of Genetic. 2nd ed.Wiley.USA.
Práctica 3: Extracción de RNA y Análisis Northern Introducción
Las células contienen dos formas de ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonucleico (DNA) el ácido ribonucleico (RNA). Las moléculas de RNA están involucradas en la expresión del material genético (DNA) y son los productos iniciales de la expresión de un gen que va directamente hacia la síntesis de proteínas.
El conocimiento de la estructura, metabolismo y modo de acción del RNA en la síntesis de proteínas es fundamental para entender el control de la expresión genética, división celular, crecimiento y desarrollo de los organismos.
Objetivo
Que el estudiante conozca y realice la extracción de RNA vegetal y lleve a cabo un análisis de expresión de genes tipo Northern
Materiales y Métodos Extracción de RNA vegetal
1.- Seleccionar algunas hojas de plantas y moler en mortero con nitrógeno líquido 2.- Colocar la muestra en tubos Eppendorf de 1.5 mL
3.- Adicionar 0.5 mL del reactivo de extracción (RNA Reagent INVITROGEN) y mezclar con vortex hasta suspender
4.- Incubar en posición horizontal a temperatura ambiente por 5 min.
5.- Centrifugar a 10,000 rpm durante 2 min
6.- Transferir el sobrenadante a otro tubo Eppendorf y adicionar 0.1 mL de NaCl 5 M. Mezclar con vortex 7.- Adicionar 0.3 mL de cloroformo y mezclar por inversión
8.- Centrifugar a 12,000 rpm por 15min.
9.- Transferir la fase acuosa a otro tubo Eppendorf y adicionar isopropanol al mismo volumen de la fase acuosa, mezclar por inversión
10.- Incubaron a temperatura ambiente por 30 min
11.- Centrifugar a 12,000 rpm por 10min y decantar el sobrenadante 12.- Adicionar 1 mL de etanol al 75% y centrifugar a 12,000 rpm por 5min 13.- Decantar el sobrenadante y secar la pastilla a temperatura ambiente 14.- Resuspender la pastilla en 30 µL de H2O-DEPC.
Electroforesis en gel
1.- Preparar gel de agarosa al 1% en TAE 1X
2.- Vaciar la agarosa con bromuro de etidio en la cámara de electroforesis 3.- Llenar la cámara con TAE 1X (Buffer de corrida) para cubrir la placa 4.- Colocar muestra en los pozos
5.- Correr el gel a 60 voltz 6.- Visualizar en transiluminador Extracción de RNA vegetal
1.- Seleccionar algunas hojas de plantas y moler en mortero con nitrógeno líquido 2.- Colocar la muestra en tubos Eppendorf de 1.5 mL
3.- Adicionar 0.5 mL del reactivo de extracción (RNA Reagent INVITROGEN) y mezclar con vortex hasta suspender
4.- Incubar en posición horizontal a temperatura ambiente por 5 min.
5.- Centrifugar a 10,000 rpm durante 2 min
6.- Transferir el sobrenadante a otro tubo Eppendorf y adicionar 0.1 mL de NaCl 5 M. Mezclar con vortex
Hoja 9 de 10 7.- Adicionar 0.3 mL de cloroformo y mezclar por inversión
8.- Centrifugar a 12,000 rpm por 15min.
9.- Transferir la fase acuosa a otro tubo Eppendorf y adicionar isopropanol al mismo volumen de la fase acuosa, mezclar por inversión
10.- Incubaron a temperatura ambiente por 30 min
11.- Centrifugar a 12,000 rpm por 10min y decantar el sobrenadante 12.- Adicionar 1 mL de etanol al 75% y centrifugar a 12,000 rpm por 5min 13.- Decantar el sobrenadante y secar la pastilla a temperatrura ambiente 14.- Resuspender la pastilla en 30 µL de H2O-DEPC.
Gel desnaturalizante (agarosa 1%)
1. Pesar 1.6 g de agarosa en matraz Erlenmeyer (250 ml).
2. Adicionar 43.6 mL de H2O-DEPC.
3. Adicionar 6 mL MOPS-DEPC 10X.
4. Adicionar 10.7 mL de 12.3M (37%) formaldehído.
5. Fundir agarosa (horno de microondas o baño maría).
6. Vaciar en la cámara y colocar el peine.
Preparación de la muestra
1. Transferir muestras de RNA (10 a 20 g) a microtubos esterilizados.
2. Adicionar 2 L de MOPS 10X.
3. Adicionar 3.5 L de formaldehido 12.3M.
4. Adicionar 10 L de formamida.
5. Adicionar 1 L de buffer de carga.
6. Adicionar 1 L de bromuro de etidio.
7. Incubar en baño maría por 5 min a 65 °C.
8. Enfriar en hielo.
9. Cargar muestras evitando los pozos de los extremos.
Electroforesis (gel desnaturalizante)
1. Correr el gel a 100 V por i h o hasta que el frente de corrida alcance 2/3 partes de la longitud del mismo.
2. Permitir que el gel se enfríe antes de retirarlo cuidadosamente.
Transferencia
1. Enjuagar el gel con H2O-DEPC.
2. Colocar el sistema de transferencia como se muestra en la figura. Colocar el gel sobre una hoja de polietileno y cortar el extremo izquierdo superior del mismo (a manera de señal).
3. Humedecer la mecha de papel filtro con SSC 10X.
4. Colocar la mecha sobre el vidrio puesto a su vez sobre un soporte (e.g. rack de puntas vacío, charola de cámara de electroforesis).
5. Invertir el gel y colocarlo sobre la mecha de papel filtro (exactamente en el centro).
6. Enmarcar el gel con tiras de parafilm.
7. Cortar un extremo de la membrana (hybond N+ nylon para hacerlo coincidir con el corte del gel (que ahora está en el extremo derecho).
8. Colocar la membrana cuidadosamente sobre el gel haciendo coincidir las aristas.
9. Humedecer tres piezas de papel filtro (cortadas del mismo tamaño del gel) y colocarlas sobre la membrana.
10. Colocar el papel absorbente (altura 3-4 cm) sobre el papel filtro.
11. Colocar el vidrio sobre el papel absorbente.
12. Colocar el peso sobre el vidrio cuidando que quede perfectamente centrado y el sistema en total equilibrio.
13. Transferir de 16 a 24 h.
14. Desensamblar cuidadosamente el sistema de transferencia.
15. Colocar la membrana entre dos hojas de papel filtro y envolverla con papel aluminio.
16. Incubar a 80 °C
17. Enjuagar el equipo con H2O-DEPC.
Bibliografía recomendada
Snustad, P y M. J. Simmons.2000 . Plinciples of Genetic. 2nd ed.Wiley.USA.
Barrera–Pacheco A, Joaquín–Ramos AJ, Torres–Pacheco I, González–Chavira MM, Pérez–Pérez MC, Guevara–
Olvera L, Guevara–González RJ (2008) Análisis de la expresión transcripcional inducida bajo condiciones de estrés biótico y abiótico en Capsicum chinense BG–3821. Agrociencia 42:95-106.
