I N V E S T I G A C I Ó N
RESUMEN
L
a sangre del cordón umbilical (SCU) ha pasado de ser un desecho biológico a fuente potencial de células Stem hematopoyéticas (CSH) con capa-cidad regenerativa, por lo cual el procesamiento y crio-preservación después de su obtención en condiciones que garanticen su utilización es clave en un transplante exitoso.El almacenamiento de CSH de SCU es realiza-do tanto en bancos de carácter público (realiza-donación de SCU) como privado (SCU para uso autólogo). Nuestro objetivo fue realizar un análisis de la experiencia de un Banco de SCU en Colombia en el cual se caracterizaron los procesos de obtención, transporte, procesamiento y criopreservación.
Se diseñó un estudio de serie de casos; en el que se analizaron 1080 registros de la base de datos del Banco de Células Stem de Colombia S.A. Este análisis eviden-ció que el tiempo transcurrido antes del procesamiento de las muestras fue menor de 12.7±10.3 horas; el vo-lumen promedio fue 68,2±27,6ml; el recuento inicial de células nucleadas tenía promedio de 1,03 x 109cm/ mm3, con un promedio absoluto de CD34+ criopre-servadas de 161,7±199,7cel/µl, el porcentaje de células CD34+ de las muestras fue de 0,228%, el 88,6% de las muestras estudiadas tenían un porcentaje de viabilidad superior al 95%, 21 muestras que corresponden al 1,9% presentaron hemocultivo positivo y el 100% de las prue-bas serológicas para enfermedades infectocontagiosas fue negativas.
Palabras clave: Células Stem, cordón umbilical,
bancos de sangre de cordón umbilical, NEtCORD.
ABSTRACT
Key words: Stem Cells, umbilical blood, banks of umbilical cord blood, NEtCORD.
CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCESOS
DE OBTENCIÓN, TRANSPORTE,
PROCESAMIENTO Y CRIOPRESERVACIÓN
DE LAS MUESTRAS DE SANGRE
DE CORDÓN UMBILICAL, OBTENIDAS DE
ENERO DE 2006 A FEBRERO DE 2008
EN EL BANCO DE CÉLULAS STEM
DE COLOMBIA
Ávila Portillo L.M.1, Ávila J.P.1, Martínez C.2, Rosas S.3,
Jaimes J.E.4, Becerra A.1, Gómez C.1, Madero J.I.1
1 Banco de Células Stem de Colombia.
2 Estudiante Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 3 Asesora metodológica Universidad Colegio Mayor de
INTRODUCCIÓN
Las células Stem Hematopoyéticas (CSH) prove-nientes de sangre de cordón umbilical (SCU) se han convertido en una alternativa en muchas enfermeda-des, tales como Leucemia mieloide aguda (AML)i, en-fermedad de Krabbeii y síndrome de Wiskott Aldrichiii entre otras, por lo cual los Bancos de Sangre de Cordón Umbilical (BSCU) desde sus inicios en el año de 1993 en Nueva York son cada vez más frecuentesiv-v. En Co-lombia existen tres bancos de criopreservación de SCU. Sin embargo, a pesar de la existencia de estos no hay hasta el momento una ley o norma que los rija en cri-terios como el transporte, recolección, procesamiento y criopreservación. En cada Banco de SCU estos criterios, se han definido de acuerdo a su modelo de aprendizaje, el cual cambia dependiendo del sitio de entrenamien-to de su personal técnico, algunos se han entrenado en bancos de cordón públicos acreditados por NEtCORDvi y otros en Bancos de Unidades de Fertilidad.
Por lo cual se realizó el análisis de la base de da-tos del Banco de Células Stem de Colombia, el cual es un banco privado con certificación ISO-9001 dirigido por profesionales entrenados en el Banco público acre-ditado por NEtCORD, se realizó la caracterización de los procesos de calidad que allí se manejan en relación a la recolección, procesamiento y criopreservación de muestras de SCU obtenidas entre los meses de Enero del 2006 a Febrero del 2008.
MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de datos
Se realizó un estudio de Serie de casos, descriptivo y retrospectivo de las muestras de sangre de cordón um-bilical. Para la realización de este proyecto se analizaron 1080 registros de la base de datos del Banco de Células Stem de Colombia del periodo comprendido entre Ene-ro del 2006 a FebreEne-ro del 2008, estas muestras fueEne-ron remitidas de ciudades dentro y fuera de Colombia. Solo se tuvieron en cuenta las muestras de SCU que poseían como mínimo los datos de: volumen de SCU, recuento celular inicial y final, tiempo de procesamiento, CD34, % de CD34, viabilidad, hemocultivos y pruebas de enfermedades infecciosas. La obtención y revisión de la base de datos fué obtenida previa autorización del Banco de Células Stem de Colombia.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para efectos del análisis estadístico se elaboró una base de datos la cual fue procesada con el paquete esta-dístico S.P.S.S.® versión 11.05 para Windows®39. reali-zándose un análisis descriptivo univariado construyendo tablas y gráficas, elaboradas con los estadígrafos según el
nivel de medición de las variables, de manera que para las variables cualitativas se obtuvo la distribución por-centual de frecuencias mientras que para las variables cuantitativas se calcularon medidas de tendencia cen-tral. Posteriormente, se realizó un análisis mediante la prueba de Chi2 (c2) para valorar la fuerza de asociación. Es importante recalcar que para eliminar los efectos del control de sesgos y expectativas de los investigadores (validez), el procesamiento estadístico fue desarrollado por personal Bioestadística, independiente, del grupo clínico de investigación. Finalmente los datos obtenidos fueron comparados con los requisitos expuestos en la literatura mundial.
CONSIDERACIONES BIOÉTICAS
En el desarrollo de esta investigación se respetaron las normas de bioética y normas legales de la investiga-ción clínica aplicada en salud según la legislainvestiga-ción nacio-nal e internacionacio-nal, particularmente la Resolución 8430 de 1993 del Ministerio de Salud.
RESULTADOS
Las muestras analizadas fueron tomadas un 73.3% por cesárea y solo en el 26,7% de los casos correspon-dió a parto natural. Al realizar el análisis sobre el origen de las muestras procesadas, se pudo determinar que el 60.8% de las muestras pertenecían a Bogotá siendo un 39.2% de las muestras provenientes de fuera de la ciu-dad. Por lo cual se realizó un análisis sobre el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el inicio del procesamiento en el Banco de Células Stem de Colom-bia, encontrándose una media de 12.7±10.3 horas, observándose una distribución multimodal asimétrica positiva con respecto a la media; indicando que en la mayoría de las muestras, el tiempo de transporte fue menor de 12.7±10.3 horas. (Gráfica 1).
Gráfica 1. Comportamiento del tiempo antes del procesamiento. 220,0 200,0 180,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 40,0 20,0 0,0 60,0 Fr ecuencia Desv. tip. = 10,32 Media = 12,7 N = 1079,00
tIEMPO ANtES DEL PROCESAMIENtO
CARACTERIZACIÓN DEL PROCESAMIENTO
Al analizar las muestras recibidas se realizó una ca-racterización del procesamiento y obtención de células. La variable volumen de muestra en general presentaba un promedio de 68,2±27,6ml con un volumen máximo encontrado de 240ml, que para una mejor evaluación se categorizaron en los niveles A: <40 ml, B: 40-60 ml, C: 60-80 ml y D: >80 ml donde se puede observar, que solo un 13.2% se encuentran en la categoría A te-niendo un volumen bajo que compromete su utilidad al presentar un volumen menor a 40ml. Por otra parte el 29.5% de las muestras recibidas fueron de un volumen superior a 80 ml (categoría D) consideradas desde éste aspecto como muestras optimas, además se hace no-tar que el 56.4% superaban en volumen el criterio de 60 ml considerado deseable para su posterior utilidad (Gráfica 2).
Es importante señalar que de las 1080 muestras re-cibidas durante el periodo de observación fue necesario descartar 65 que corresponde al 6,0% de los cálculos relacionados con el número de células. Referente al re-cuento inicial de células nucleadas se encontró un pro-medio 103.0 X 107 células totales iníciales, con un
míni-mo de 117.0 X106 y un máximo de 453.0 X107 antes de la reducción del volumen siendo éste el total de células contenidas en la muestra antes del procedimiento. Por otra parte, se encontró que las células totales finales fue-ron de 581 x 106 en promedio.
A partir de lo anterior se pudo analizar que en el procedimiento de reducción de volumen se perdieron en promedio 455.0X106 células mononucleares (cmn) oscilando entre un mínimo de 246X104 y un máximo de 356X 107, con una pérdida en general del 30%.
CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYETICAS (CD34+)
Los resultados referentes al número de células CD34 positivas se puede observar en la Tabla 1, donde se muestra un promedio absoluto de 161,7 ±199,7cel/µl con un porcentaje promedio de 0,228% aún cuando os-ciló entre un mínimo 0,06% y un máximo de 4,79%.
Con base en esto se procedió a categorizar el
por-centaje de CD34+ obtenido utilizando los criterios re-comendados por la literatura5-6 con lo cual se construyó la Gráfica 3, donde se puede observar como el 70.7% de las muestras tiene un porcentaje superior al 0.1% de CD34+.
Gráfica 2. Categorización del volumen de la muestra.
Tabla 1. Células CD34+.
Gráfica 3. Distribución por categorías del porcentaje
de CD34+ de la muestra.
N
Válidos Media Mediana Desv. típ. Mínimo Máximo CD34 ABSOLUTO 1080 161.7043 78,7600 199,65971 4,09 1351,00 TOTAL CD34 1080 3234086,11 1575200,00 3993194,165 81800 27020000 % CD34 1079 ,22752 ,15000 ,292409 ,006 4,790 VIABILIDAD 1079 98,129 99,360 3,0244 80,6 100,0 VOLUMEN DE LA MUEStRA < 40 ml A D C B >=-80 ml 60-80 ml 40-60 ml 13,2% 29,5% 27,9% 29,4% % CD34 18,1% <0.1% 0.1-0.3% >0.3% 29,3% 52,6%
Respecto a la viabilidad, se puede afirmar que en el 88,6% de las muestras estudiadas se obtuvo un porcen-taje de viabilidad superior a 95%.
Finalmente, se analizaron los resultados de pruebas infecciosas (VIH1-2, VHB, VHC, VDRL) y de contami-nación (Hemocultivo), donde se encontró que 21 mues-tras que corresponden al 1,9% presentaron hemocultivo positivo todas ellas tomadas en parto natural y que fue-ron informadas y descartadas inmediatamente. Respec-to a las pruebas infecciosas el 100% de los casos fue negativo.
ANÁLISIS DE ASOCIACIONES
Con base en la descripción anterior se practicaron los cruces de variables dirigidos a dar respuesta a las rela-ciones sugeridas. Al evaluar la relación entre el volumen de la muestra y el recuento de células totales iniciales se encontró asociación significativa con base en la prueba de Chi cuadrado con p<0.05 como se puede ver en la
Gráfica 4.
Se puede ver que la proporción de células iniciales < 4x108 disminuye a medida que se incrementa el vo-lumen de las muestras, generando una mejor calidad de las muestras almacenadas. Finalmente como se puede apreciar en la Gráfica 5 en lo referente al porcenta-je de CD34+ se encontró asociación significativa con
p<0.001; pudiéndose afirmar que la probabilidad de
obtención de células CD 34+ es directamente propor-cional al volumen de la muestra.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Las muestras del Banco de Células Stem de Colom-bia obtenidas inmediatamente después del nacimiento con la placenta in útero por personal previamente capa-citado, fueron procesadas manualmente en un sistema cerrado de bolsa estéril, utilizando como criopreservante el DMSO/DEXtRAN; la criopreservación fue realizada mediante una curva de congelación controlada y las cuales posteriormente almacenadas en nitrógeno liqui-do a -196°Cvii. El conteo de CD34 y la viabilidad fueron realizados por técnica de citometría de flujo.
En el análisis realizado se determinó un tiempo trans-currido antes del procesamiento, fue de 12.7 +_10.3 horas, que está dentro del parámetro de 48 horas suge-rido por la norma NEtCORD FACtviii, lo cual se corro-boró en un estudio reportado por el Banco de Células Stem de Colombia, en el cual la viabilidad disminuye un 30% después de las 48 horas de tomada la muestra. En la reducción de volumen manual utilizando una bolsa tansfer freezing bag® con sistema cerrado, dismi-nuye un 30% la recuperación de la muestra, datos simi-lares fueron reportados en comunicación personal con instituciones que procesan manualmente. El CordMx quien procesa bajo un sistema de separación y concen-tración celular automatizado (Sepax-Biosafe), reportó en el año 2005 un porcentaje de recuperación de 80%ix, disminuyendo la pérdida celular por lo cual este sistema es el recomendado por la red internacional NEtCORD FACtx.
Gráfica 5. Porcentaje de CD34 en relación al volumen de la muestra. Se puede observar como a mayor volumen de la muestra
el porcentaje de CD34+ aumenta. 17 100 Recuento >8.0 xE8.0 VOLUMEN DE LA MUEStRA <40 ml 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 40-60 ml 4.0x8.0 - 8.0xE8.0 <4.0 E.80 60-80 ml >=-80 ml 69 33 14 25 64 93 74 7 CÉL.tOt.IN. 43 100 Recuento VOLUMEN DE LA MUEStRA <40 ml >0.3% % CD34 0.1-0.3% <0.1% 19 30 33 8 49 17 50 51 19 22 59 >=-80 ml 60-80 ml 40-60 ml 40 50 60 70 80 90 10 0 20 30
Los criterios de aceptación utilizados en el Banco de Células Stem de Colombia, entre los que se encuentra un volumen mínimo de 40ml también fueron analiza-dos, encontrándose un volumen de muestra promedio de 68,2±27,6 ml con un máximo de 240 ml. Al realizar una clasificación de las muestras se pudo determinar que un 13.2% se encuentran con un volumen bajo y un 29.5% de las muestras recibidas tenían un volumen superior o igual a 80 ml, consideradas desde este aspec-to como muestras óptimas; cabe anotar que el 56.4% superaban en volumen el criterio de 60 ml considerado deseable para su posterior utilidad; CordMx maneja un volumen mínimo para procesamiento de 80 ml (10), el contraste de volumen se da por que en los bancos pú-blicos, la muestra es de donación y la decisión de crio-preservarla o no es exclusiva de los criterios de inclusión del Banco, en el caso de las muestras criopreservadas en bancos privados la decisión se da por los dueños de la muestra que previa información de las probabilidades de utilización firman un consentimiento informado. El segundo criterio de aceptación utilizado es el re-cuento inicial de células nucleadas siendo éste de 400 millones. Se encontró un promedio de 103.0 x 107 cmn/ mm3 teniendo como valores mínimos y máximos 117.0 x106 y 453.0 x107 respectivamente, siendo éste el to-tal de células contenidas en la muestra antes del pro-cesamiento; por otra parte, se encontró que al analizar el recuento final de células nucleadas el promedio fué de 29.058,6±13.207,6 cmn /mm3 con lo que se llegó a calcular que las células totales finales fueron de 581 x106 en promedio; en el procedimiento de reducción de volumen se perdieron en promedio 455.0x106 cmn os-cilando entre un mínimo de 246 x104 y un máximo de 356 x107, con una pérdida en general del 30%, de for-ma importante el número de CD34+ criopreservadas en el Banco de Células Stem de Colombia (cuyo análisis se realiza en la plataforma de citometría de flujo estan-darizada por la Sociedad Internacional de Ingeniería de tejidos Hematopoyéticos ISHAGExi) arrojando un pro-medio de 3.23 x 10 similar a los reportados por CordMx de 2.68 x10 (10).
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