UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
GUÍA DE PRÁCTICA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA – PERÚ 2014
PROLOGO
El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la elaboración de infinidad de productos útiles al hombre, en la generación de procesos productivos con menor contaminación del medio ambiente y con consumos de energía muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones genéticas para que puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos bioprocesos.
El conocimiento de la microbiología se hace imperiosa para su aplicación a diversas disciplinas del saber humano. La presente Guía de Práctica se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las técnicas básicas del manejo de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de Ingeniería Química.
ÍNDICE
PROLOGO ÍNDICE
Paginas.
RECOMENDACIONES GENERALES… ... 4
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ... 5
PRÁCTICA 2 : MICROSCOPIA; OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS IN VIVO, COLORACION VITAL ... 12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL ... PRÁCTICA 4 : COLORACIONES ESPECIALES: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS ... 27
PRÁCTICA 5 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN ... PRÁCTICA 6 : PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ... 43
PRÁCTICA 7 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ... 50
PRÁCTICA 8 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE COLONIAS…… ... 84
PRÁCTICA 9 : CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO ... 91
PRÁCTICA 10 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS ... 98
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Recomendaciones Generales
1. La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia, después de este tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio
2. Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste.
3. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca.
5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
6. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.
8. Hablar sólo lo necesario con los compañeros.
9. Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor.
10. Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo.
11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su uso.
12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor. 14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el
sitio indicado por el profesor.
15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
16. Después de la incubación es necesario la esterilización del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud. 17. Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio. 18. Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su función y el cuidado de cada uno de ellas.
Dominar el mecanismo de iluminación, la observación de una muestra con todos los objetivos.
II. MARCO TEORICO 2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.
2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD
Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se está dentro del laboratorio
Precauciones estándar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminación de una persona, evitando la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras por ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente
6 2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR
- Barreras de protección - Lavado de manos
- Desinfección y esterilización.
- Manejo de objetos punzo cortantes. - Manejo y eliminación de desechos - Ventilación e iluminación adecuadas - Limpieza y desinfección de ambientes 2.1.3 VÍAS DE CONTAMINACIÓN
1. La boca
• Comer, beber y fumar en el laboratorio.
• Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección. 2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.).
3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados. 4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles). 2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION
- Lavado de manos (antes y después) - Guantes
- Mascarilla o barbijo - Mandil
- Gorro
2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD
• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.
• Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente cerrado.
• Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.
• Lavar las manos con agua y jabón:
– antes de realizar las actividades programadas – antes de salir del laboratorio
– después de usar materiales contaminantes. • Recoger el cabello largo.
• Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable.
• No comer, beber, fumar.
• Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor. • Usar mascarillas para casos indicados
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda de la luz usada.
2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo) - Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido - Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo
2. Parte óptica del Microscopio:
- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador - Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características: o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma 2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de aumento. 5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver hasta
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6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste. 12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y
cambie de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.
2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X 40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se usa.
Diámetro del campo microscópico
Ocular Objetivo Diámetro del
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150
Ejemplo:
Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo microscópico, concluiremos que la célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de 1500.
2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.
10 III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X. Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.
IV. CUESTIONARIO
1. ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
2. ¿A qué se denomina campo óptico?
Se denomina campo óptico al círculo visible que se observa a través del microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través del microscopio.
Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el siguiente punto.
3. ¿Por qué decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal?
Se dice que es un microscopio parafocal porque es aquel en el cual la distancia de los objetivos a la laminilla ya esta calculada de modo que si necesitas cambiar al objetivo a una lente más potente este no chocará con la laminilla; si no es parafocal entonces es necesario subir el revólver.
4. ¿Qué es el poder de resolución?
Poder de Resolución. Es la posibilidad de distinguir separados dos puntos muy cercanos entre sí. Cuanto mmayor sea el poder de resolución, menor será la distancia entre dos puntos a la cual pueden distinguirse como tales. La distancia límite en la cual dos puntos pueden ser todavía distinguibles se denomina Límite de Resolución. El poder de
resolución de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda de la fuente luminosa y de la apertura numérica (propiedad óptica de la lente).
Es cuando se tiene como objetivo proteger la salud y la seguridad del personal y de la comunidad frente a diferentes riesgos producidos por agentes biológicos, químicos.
6. Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
Situaciones de peligro:
Colocar nuestras cosas en las mesas sin haberlas desinfectado. Manipular microorganismos o ácidos sin colocarse el mandil. Trabajar con el cabello suelto en el laboratorio.
Situaciones de riesgos
Que el laboratorio tenga instalaciones defectuosas. Intoxicación por inhalar reactivos toxicos.
Inhalar microorganismos por haber abierto una placa lejos del fuego.
7. ¿qué barreras de protección debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar?
Colocarse el mandil antes de ingresar al laboratorio.
Sujetarse el cabello en una cola o un moño de preferencia.
Utilizar guantes si se va a trabajar con sustancias que pueden ser absorbidas por la piel.
Utilizar mascarilla para evitar inhalar los microorganismos
Utilizar gafas de protección para evitar el contacto de los ojos con el medio contaminado.
8. Cómo promovería la cultura de bioseguridad.
Colocando a una persona en la entrada del laboratorio encargada de revisar que nuestros compañeros tengan los implementos necesarios antes de ingresar al laboratorio.
Colocando afiches con las normas necesarias en el laboratorio para recordarles siempre que precauciones deben tomar.
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PRÁCTICA
MICROSCOPIA: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfología de organismos unicelulares.
2) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.
II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición horizontal. 2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes. Grafique la Observación y Resultados
Se realizo la observación de la levadura con colorante vital rojo neutro.
Se observan la levaduras redondeadas, transparentes con algunas que están separadas y otras en mancha unidas
III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS 1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Hay 2 tipos de técnicas:
a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.
2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000).
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Su objetivo es facilitar la observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos. EXAMEN EN FRESCO Material - Microscopio - Láminas cubreobjetos - Láminas portaobjetos - Agua destilada - Asas de Kolle - Gérmenes varios - Muestras fermentadas - Cultivo de microorganismos Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X. Grafique la Observación y Resultados
Observamos en el microscopio la alga a nivel___ celular logrando vislumbrar el nucleo de cada__ célula.___________ _____________________
COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teñidas.
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
Grafique la Observación y Resultados
__Protozoo_____________________________ __Protozoa_____________________________ __Foraminífera __________________________ __Observamos de diferentes tamaños al_____ __protozoo que se encontraba enrrollado____ _______________________________________ _______________________________________
V. CUESTIONARIO
¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?
Ventajas:
Los microorganismos se pueden observar muy bien, incluso si estos se mueven. Se observa también, la división celular, la formación de nuevas especies, etc. La preparación es rápida y simple.
Desventajas:
Hay muchos microorganismos que no se pueden visualizar. No se pueden observar claramente los contrastes.
¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
La ventaja de una preparación gota pendiente es que la muestra no se secará y podrá ser observada por un periodo de tiempo más largo.
¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
I. OBJETIVOS .
Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
II. MARCO TEORICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas. Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las células de cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptídicos.
Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.
GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u
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ondulante, que contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075 m.
2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos. Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son: a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos.
Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. puede prepararse una suspensión del material en una gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa de platino.
b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación son: por el calor y alcohol en frío.
d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos. e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.
f. Secado. Se secará la preparación al aire. CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES
La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los cromóforos presentes.
a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica.
Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej: Sudán III.
CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente.
c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos metacromáticos
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Preparación del Frotis
- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posición plana en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de éste (el portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.
Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción. -
3.2. TINCIONES SIMPLES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol
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Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
-
Grafique la Observación y Resultados
____________________________ ___ _ _ Estroptococos teñidos con azul de metileno
Formando agrupaciones s __ ___
TINCIÓN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo. Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
Grafique la Observación y Resultados
cocos teñidos con safranina _ formando pequeñas agrupaciones de cada microorganismo_____________ _____
3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)
22 Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño. - Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
Grafique la Observación y Resultados
___gramnegativas______ __________ ___bacilos ______________________________ __al ser gram negativos estos bacilos se han ___teñido con la safranina____ _ ___ __
__grampositivas _______________________ __cocos y estafilococos ___________________ __al ser grampositivos los estreptococos y los __cocos se han teñido con el azul de metileno_ _
__gram positivas y gram negativas____________ __estafilococos y bacilos _____________ ______ _____________________________________ __ __de esta imagen podemos deducir que los ___
__estafilococos son gram positivos y los bacilos ___son gram negativos _____________________
IV. CUESTIONARIO
1 ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades?
Un colorante es una sustancia orgánica con afinidad a los tejidos celulares. Estos pueden ser positivos (el azul de metileno, el cristal violeta, la safranina) o negativos (eosina, la fucsinaacida y el rojo Congo).
Propiedades:
Absorben longitudes de onda. Cambian de color con el pH. Cambian de color con la luz.
2 ¿Por qué se le llama a un colorante ácido o básico?
Colorante ácido, son los colorantes negativos, como el rojo Congo, que reaccionan en medios ácidos positivos.
Colorante básico, son los colorantes positivos, como el azul de metileno, que reaccionan en medios básicos negativos.
3 ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
La afinidad entre un colorante y una bacteria se da por un compuesto mordiente que se une a los puentes hidrógeno de a la pared celular bacteriana.
4 ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
El pH influye en la coloración porque determina la carga de la pared celular de los microorganismos; logrando una tinción negativa o positiva.
5 ¿Por qué es necesario utilizar métodos de tinción para visualizar a las bacterias?
Porque las bacterias no pueden ser observadas en microscopios ópticos comunes sin una tinción especifica; es por eso que se utilizan los métodos de tinción
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7 Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos Bacilo de Eberth: S. typhi
Bacilo de Nicolaier: Tetano Bacilo de Hansen: M. leprae
Bacilo de Klebs-Löffler: C. diphtheriae
8 Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales Treponema pallidum
Helicobacterpilori Borreliarecurrentis Borreliaburgdorferi
9 Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
Azul de metileno
10 Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
11 Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.
La tinción de Gram es uno de los métodos más importantes en el laboratorio bacteriológico. Se realiza de la siguiente manera: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava nuevamente con agua, decoloramos con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrimos y cubrimos con Safranina (color de contraste) durante 20 segundos; lavamos, secamos y ya está listo para ser observado en el microscopio.
26
Los mordientes son compuestos que sirven para fijar colores, intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Ejemplos:
Lugol
Ácido tánico Oxido de cromo
13 Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo.
Por un contacto corto entre la muestra y el tinte. Por no colocar la cantidad de mordiente necesario.
Por la mala manipulación de la muestra al momento del flameo dejándola aún húmeda.
14 Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
15 Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.
Gram positivos Gram negativos
cocos Pediococus Stomatococus Lactococus Neisseriagonorrhoeae. Neisseriameningitidis. Moraxellacatarrhalis bacilos Bacilluscereus Bacillusanthraco Clostridium Campylobacterjejuri Shigella Campylobactercoli
PRÁCTICA
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS
I.
OBJETIVOS- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
II.
MARCO TEÓRICO 1. ASPERGILLUSA. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:
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Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive como saprofitos en el suelo, vegetales en descomposición, cualquier tipo de materia orgánica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropa vieja, recipientes con agua sin usar, reactivos químicos, paredes de refrigeradores, sistemas de ventilación, cuartos de hospital, lentes de contacto blancos, en las capas altas de la atmosfera.
Las especies que actúan como patógenos son termotolerantes. Tras la exposición a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalación o se instalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquier origen, como cavernas por TBC.
C. APLICACIONES INDUSTRIALES
En la producción de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera: ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fúngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del páncreas. En la producción de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados. INVERTASA O SACARASA.
Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
La aplicación de enzimas en los detergentes
Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y períodos más cortos de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actúan sobre los materiales que constituyen las manchas, facilitando la remoción de estos materiales y de forma más efectiva que los detergentes convencionales.
• Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logró producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extracción de aceite.
El uso de algunos preparados celulolíticos en el proceso de extracción ha tenido un efecto positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado
enzimático producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extracción del aceite de soya. En condiciones óptimas, el contenido de aceite de soya extraíble (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperación del aceite de soya (99 %).
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite de cacahuate y de 55.3 a 57.1 % Extracción de colorantes. La extracción de colorantes es otra aplicación atribuida a algunos preparados enzimáticos.
Extracción de antioxidantes con preparados enzimáticos con actividades mixtasmixtas El preparado enzimático comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente pectinasa, pero ambién celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no sólo fue efectivo al aumentar la extracción de los fenoles debido a la degradación de los polisacáridos (celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que mejoró también la actividad antioxidante de los extractos fenólicos
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras del espora-cojinete.
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación
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estacional. Las máximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas que en las rurales).
APLICACIONES DEL PENICILLLIUM
Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son absolutamente seguros de comer.
La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming producía 2 mg de penicilina por cada litro de cultivo, posteriormente se encontró que otros Penicillium eran mejores productores de penicilina y se eligió a Penicillium chrysogenum como cepa súper productora de este antibiótico. Finalmente, la selección de sucesivos mutantes súper productores y la mejora en las técnicas de fermentación realizadas por la industria biotecnológica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea en la producción de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.
Incluye las siguientes especies: Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie. > Penicillium candida, ídem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola.
> Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistémica emergente que afecta a roedores y humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina. > Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y recientemente también gorgonzola
III.
PROCEDIMENTO A. MATERIAL • Asa de kolle • KOH al O% • Mechero • Azul de lactofenol • Láminas portaobjetos • Láminas cubreobjetos • MicroscopioB. MATERIAL BIOLOGICO • Cultivo de Aspergillus flavus • Cultivo de Aspergillus niger
• Cultivo de Aspergillus fumigatus • Cultivo de Penicillium C. REACTIVOS C.l. Hidróxido de potasio al 10% KOH 10 g Agua destilada 100 ml C.2. Azul de lactofenol. Fenol 20 g Ácido láctico 20 g Glicerol 40 ml Agua destilada 20 ml
Disolver los componentes antes mencionados y después se agrega el colorante. Se puede emplear cualquiera de los siguientes:
Azul de algodón 0.05g Azul de metileno 0.05 g Azul de cotton de Perrier 0.05 g 1. EXAMEN DIRECTO CON KOH 10%
Se realiza a partir del esputo, membranas expectoradas o fragmentos de tejido que se obtienen por broncospia.
Se encuentran filamentos hialinos, largos, sinuosos y ramificados de 3 a 4 de diámetro. En los aspergilomas puede observarse masas de filamentos con sus cabezas aspergilares. Se puede trabajar a partir del cultivo, con la finalidad de observar sus estructuras que permitan identificar el género.
• Colocar una gota de KOH al 10% en un portaobjeto y mezclar con una pequeña cantidad del material a examinar (micelio aéreo proveniente del cultivo).
• Colocar un cubre objeto (18 x 18 mm) sobre la gota.
• El hidróxido de potasio actúa disolviendo la queratina e intensificando el contraste de las estructuras fúngicas con otros materiales presentes en este preparado microscópico. • Examinar microscópicamente en busca de hifas u otras estructuras nicóticas.
2. CULTIVOS
Se realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Las colonias crecen con rapidez, son de color blanco y por la producción de esporas se tornan de diferentes colores. La superficie es aterciopelada o pulvurulenta. Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentación de la colonia.
2.1. AGAR SABOURAUD FUNDAMENTO
32
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatológicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
IV.
RESULTADOS B. ASPEGILLUS NIGERB. ASPERGILLUS FUMIGATUS
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos Micelio aterciopelado o pulverulento y
de color blanquecino que va cambiando a grisáceo o verde oscuro.
Reverso blanco o marrón rojizo.
Algunas cepas presentan micelio blanco puro y se mantienen con este aspecto incluso cuando el hongo madura.
Conidiófora Vesícula globosa
Conidios globosos y rugosos Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos
Color: verde, pardo, amarillo, blanco, gris y negro.
Cuatro forma: globosa, radiada, columnar o claviforme.
Tamaño y dimensiones. Textura de las esporas
Conidióforos hialinos.
34 C. ASPEGILLUS FLAVUS
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos
Coloracion azul Conidiófora hialina
Vesícula globosa Conidios globosos D. PENICILLIUM
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos Tamaño grande y mediano
Consistencia viscosa
Superficie brillante, lisa, granular, rugosa, aterciopelada, terrosa, algodonosa.
Estructuras unicelulares Multiples filamentos o hifas
3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su padre, los zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.
EL GÉNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente los medios de cultivo.
EL GÉNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios de cultivo. En este Género los esporangióforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico, succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se desarrolle. Una forma típica o filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de mostos azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas (amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente fermenta los azúcares formados en la hidrólisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es en síntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica se emplea para la fabricación de amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar el almidón y producir etanol, pero en menor proporción que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentación alcohólica, en cambio, en los últimos años se
36
Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente. Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rápido crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa petri.
• Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrón o negro con la madurez a medida que se forman esporas.
B. OBSERVAR a. RHYZOPUS
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos Color pardo oscuro
Esporangios esféricos negros Esporangios poras negras Colonias algodonosas
esporangióforos sin ramificar rizoides bien desarrollados
Abundantes rizoides y zigosporas esféricas de pared
Clamidosporas ausentes.
b. MUCOR
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos Presenta colonias
Apariencia algodonosa Presenta una altura de varios
centímetros
Color castaño grisáceo
Presenta columella elipsoidal y globosa en esporangios de color café grisáceo.
Esporangios sin ramificar Tallos cortos ramificados
Las esporangiosporas de pared lisa y elipsoidales
c. ABSIDIA
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos Hifas de color verde
Presentan esporangioforospiriformes Presentan hifas(estructuras cilíndricas). Las hifas estan en sus ápices
V.
CUESTIONARIO1. ¿Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el género Aspergillus
El Aspergillus es un hongo oportunista y uno de los que toma ventaja de personas inmunocomprometidas. Entre las patologías más frecuentes se encuentran:
Aspergilosis pulmonar invasiva: especialmente importante en inmunosuprimidos. Onicomicosis: enfermedad de las uñas.
Otomicosis: enfermedad principalmente del oído externo. Sinusitis alérgica.
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscópicas y microscópicas) Dibuje.
38 ASPERGILLUS NIGER
Macroscópicas: Lanoso
Color negro
Blanco amarillento el reverso
Microscópicos:
FialidesBiseriadas que cubren completamente la vesícula Conidióforo largo y liso ASPERGILLUS FUMIGATUS
Macroscópicas:
Aterciopelado o aspecto de polvo Color blanquecino, cambia a verde
oscuro o gris
Blanco o marrón rojizo el reverso
Microscópicos:
Conidióforo cortó menor a 300 micras Fialidesuniseriadas sobre el tercio
superior de la vesicula, paralelos al eje del conidioforo
ASPERGILLUS FLAVUS Macroscopicas:
Aterciopelado
Color amarillo verdoso o marrón el micelio
Reverso blanco a marrón rojizo
Microscópicas
Conidióforo de longitud variable y rugoso.
Fialidesuniseriadas o biseriadas que cubren completamente la vesicula
4. ¿Cómo diferencia el género Aspergillus del Penicilium?
5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus Producción ácido cítrico.
Producción de enzimas con el A. niger Producción de ácidoglucónico
Fermentación del te
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium
Penicilliumcamemberti, maduración del queso Camembert Penicilliumnotatum, producción de penicilina
Penicilliumroqueforte, maduración del queso Roquefort
Penicilliumpurpurogenum,producción ácidos cítrico y glucónico.
7. ¿Qué es una enzima?
Una enzima es una proteína que cataliza reacciones químicas cuando estas son termodinámicamente posibles; es decir, hacen que las reacciones que tienen una velocidad de reacción lenta se den con mayor rapidez para obtener los mismos resultados en menos tiempo.
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9. Mencione Ud. Cuáles son las características macroscópicas del Penicillium
Es blanco y contiene vellos. Algunos no son ramificados.
Contiene esporas de color verde, azul verdosa, amarillas. Los conidióforos son simples o ramificados.
La superficie de la colonia es algodonosa aterciopelada o pulverulenta. 10. ¿Cuál es la estructura básica de la Penicilina?
11. ¿Cuáles son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes? Los hongos que pertenecen a los Zygomycetes son:
Cunninghamella Mucor Mortierella Rhizopus Absidia Zygorhynchus
12. ¿Cómo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de cultivo se trata de un Zygomycete?
Porque la placa petri presenta coloración verde con borde blanco, y porque al observar al microscopio se ve un talo constituido por un micelio desarrollado de hifas cenocíticas, la mayoría con un micelio reducido y en algunos casos con septos.
13. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes
14. Indique Ud. ¿Cuáles son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una Absidia?
Rhizopus se diferencia porque el reservo de su colonia es blanco grisáceo y sus hifas son aceptadas. Mientras que en el género Mucorhay presencia de estolones y rizoides, asi como esporangioforos no ramificados. Y en el géneroAbsidia porque en este los esporangioforos nacen en los entrenudos de los estolones, sobre la parte arqueada de los mismos y no sobre los rizoides.
15. ¿Qué enfermedades producen estos hongos?
Mucormicosisrinocerebral: diabetes mellitus mal controlada, estos pacientes presentan desnutrición, fallos renales, alteraciones nerviosas y visuales además de deshidratación e hipertermia.
Mucormicosis pulmonar: leucemia, los macrófagos alveolares no eliminan las esporangiosporas que llegan hasta vías respiratorias inferiores. Los pacientes presentan tos productiva y en algunos casos hemoptisis,
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hipertermia, dolor pleural intenso, disnea.
Mucormicosis digestiva: Se presenta en pacientes con desnutrición de II o III grado. Los pacientes con estos grados de desnutrición presentan con gran frecuencia parasitosis intestinales asociadas que pueden favorecer la invasión del hongo en el tejido del tubo digestivo.
Mucormicosis cutánea:se presenta en quemaduras o abrasiones extensas de la piel. Los mucorales presentes en el ambiente pueden desarrollarse en la superficie de la lesión formando colonias superficiales.
16. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos
Para la fabricación de ácido fumárico,el Rhizopusstolonifer(el moho negro del pan).
Durante un proceso intermedio, en la fabricación de la cortisona; Rhizopusstolonifer(el moho negro del pan).
Para producir grandes cantidades de alcohol, Rhizopusoryzae.
Producen una amilasa que se usa en la fermentación alcohólica cuando crecen sobre salvado caliente de trigo o de arroz, especies fúngicas. Para fabricación de pegamento líquido, proteasas que se obtienen de
PRÁCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN
I. OBJETIVOS1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico.
3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los alimentos.
II. MARCO TEÓRICO
El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas. 2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo.
