Universidad Complutense de Madrid
Máster en Biología Evolutiva
“Relaciones filogenéticas, revisión taxonómica y
filogeografía del complejo de especies Dendropsophus
leucophyllatus (Beireis, 1783) y Dendropsophus
triangulum (Günther, 1869) (Anura: Hylidae)”
- Trabajo Fin de Máster -
Marcel Adrián Caminer Rodríguez
Departamento de Biología Evolutiva y Biodiversidad, Museo Nacional
de Ciencias Naturales (MNCN), Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC)
Noviembre de 2014
Autor: Lic. Marcel Caminer
Fdo.: ________________________
Director: Dr. Borja Milá
Fdo.: ________________________
Departamento de Biología Evolutiva y
Biodiversidad, Museo Nacional de
Ciencias Naturales, CSIC
VºBº Tutor: Dr. Javier Pérez-Tris
Fdo.: ________________________
Departamento de Zoología y Antropología
Física, Universidad Complutense de Madrid
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Resumen
Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum son dos ranas arborícolas con amplia distribución en la cuenca amazónica. Sus patrones de variación morfológica y diferenciación genética sugieren que se trata de un complejo de especies. En el presente trabajo analizo la filogenia y filogeografía de 129 individuos pertenecientes a 56 poblaciones de D. leucophyllatus y D. triangulum para dilucidar sus relaciones evolutivas y definir límites entre especies. Para ello, examino conjuntamente la variación en datos genéticos (secuencias de ADN mitocondrial y nuclear), morfológicos y bioacústicos. Por otro lado, comparo la diversidad genética y la diversidad fenotípica en los principales clados para determinar si ambas están correlacionadas. En base al análisis integrativo realizado en este estudio, reconozco nueve especies candidatas dentro del Grupo Dendropsophus leucophyllatus, de las cuales tres difieren significativamente en sus cantos y su morfología, y por lo tanto las considero como especies confirmadas. Dos de ellas corresponden a Dendropsophus leucophyllatus y Dendropsophus triangulum. Asimismo, encuentro que las poblaciones pertenecientes a dos de los clados con baja diversidad fenotípica (B y H) muestran baja diversidad genética y evidencian una expansión demográfica reciente, por tanto la relativa homogeneidad fenotípica podría ser debida a posibles cuellos de botella genéticos. En contraste, un tercer clado (C) presenta un alto número de fenotipos por haplotipo, patrón posiblemente relacionado con el papel de la selección apostática. Mis análisis identifican además varios clados que sugieren la existencia de linajes adicionales que deberán ser confirmados en base a muestreos y análisis futuros.
Palabras claves: bioacústica; cuenca amazónica; especies candidatas; morfología; ranas arborícolas.
Introducción
El aumento de la destrucción y alteración de los ecosistemas naturales en todo el mundo están precipitando extinciones catastróficas de las especies (Brook et al., 2006). Dado que muchas especies permanecen sin ser descritas, los esfuerzos para catalogar y explicar la biodiversidad requieren ser priorizados.
Para los taxónomos, los caracteres fenotípicos han sido el criterio más común para delimitar e identificar las especies y, aún hoy en día, la mayoría de las especies están descritas en base a su morfología. Sin embargo, durante la última década, la adquisición masiva de datos genéticos ha llevado al desarrollo de varios métodos, entre estos las filogenias moleculares, que en base a caracteres neutros han sido relevantes para la reconstrucción de historias evolutivas y la delimitación de especies (Sites & Marshall, 2004; Wiens, 2007). Los
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árboles de genes proporcionan evidencia vital para entender el proceso de especiación, ya que abarcan la evolución intra e interespecífica, la cual es una conexión que evidencia de mejor manera las relaciones ancestro-descendiente de los alelos dentro de las filogenias y las poblaciones (Hey, 1994; Templeton, 1994). Debido a que el patrón de la coalescente del alelo es estocástico y se puede definir de una manera probabilística (Tajima, 1983; Takahata y Nei, 1985; Hudson, 1991), la tasa por la cual un polimorfismo ancestral se pierde en un determinado linaje proporciona una valiosa información de la divergencia temporal que se produce entre linajes emparentados (Rosenberg, 2002; Hudson & Turelli, 2003). Esta divergencia puede ser evidencia de que no se ha producido un intercambiado de migrantes entre linajes cercanas, y por tal motivo puede servir como base para su delimitación.
El varios estudios se ha utilizado las propiedades biológicas para definir a una especie (definiciones operativas; ver Wiley, 1978), por consiguiente se ha producido un largo debate a través de la historia ya que no es posible determinar de forma inequívoca que las propiedades biológicas son necesarias y suficientes para reconocer a una especie (revisado Mayden, 1997; Wheeler y Meier, 2000). Sin embargo, se han propuesto marcos teóricos alternativos en donde se define a una especie como un linaje de una metapoblación que tiene unidad evolutiva (de Queiroz, 2005 y 2007). La especie, concebida de este modo, se convierte en una categoría de organización biológica en lugar de un rango, y la única propiedad necesaria y suficiente de una especie es que represente un fragmento de evolución por separado de un linaje de la metapoblación. Otras propiedades de las especies como la diagnosticabilidad morfológica, el aislamiento reproductivo y la monofilia son reinterpretados como contingentes, y un linaje pueden o no adquirir dichas propiedades durante el curso de su existencia (de Queiroz, 2005 y 2007). Bajo este concepto, la especie es la única categoría biológica por encima de un organismo, la especiación es el proceso de división de un linaje, y bajo ninguna medida se podría predecir la diferenciación de un carácter. Por lo tanto al nombrar a las nuevas especies, los taxónomos deben presentar diferentes líneas de evidencia para apoyar la hipótesis de que una población está evolucionando de manera independiente (Padial y De la Riva, 2009).
Por otro lado, el comprender la distribución de la diversidad genética en el espacio proporciona información de cómo se iniciaron los eventos de divergencia y especiación, y permite poner a prueba las hipótesis relacionadas con los rangos fronterizos de las especies (Zeisset y Beebee, 2008). El objetivo principal de la filogeografía es explicar los patrones históricos de una determinada población en todo el mundo, teniendo en cuenta las grandes diferencias regionales en la latitud, la topografía y las corrientes oceánicas (Hewitt, 2000). Los análisis filogeográficos se basan en la comparación de la información del genotipo, a menudo derivado de las secuencias de ADN mitocondrial, muestreado de poblaciones con determinado rango de distribución. La filogeografía también ha proporcionado información
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específica sobre los factores que influyen en el flujo genético, como por ejemplo las barreras geográficas (Eriksson et al., 2004; Worley et al., 2004).
La aplicación de métodos moleculares está revolucionando y revitalizando los campos de la taxonomía y la sistemática (Yang y Rannala, 2012). Al combinar los datos genéticos con otros conjuntos de caracteres independientes, una práctica que se ha denominado recientemente como "taxonomía integrativa" (Dayrat 2005; Padial y De la Riva, 2009), los límites de las especies se pueden definir de forma objetiva. De hecho, en base a esta nueva herramienta se ha encontrado que las especies crípticas pueden ser mucho más abundantes en la naturaleza de lo esperado (Bickford et al., 2007; Elmer et al., 2013; Elmer y Cannatella, 2008; Fouquet et al., 2007b; Funk et al., 2012; Jansen et al., 2011), tanto a través de taxones y entre regiones geográficas (Fouquet et al., 2007a; Fouquet et al.,2012; Milá et al., 2012; Pfenninger y Schwenk, 2007).
La morfología se ha utilizado ampliamente para la reconstrucción filogenética durante décadas, y muchos estudios moleculares no han hecho más que confirmar las agrupaciones ya establecidos por los morfólogos. De hecho, gran parte de la teoría moderna de la sistemática se desarrolló casi exclusivamente en base a datos morfológicos (Hennig, 1966; Wiley, 1981). Sin embargo, los datos morfológicos son particularmente propensos a la convergencia adaptativa (Hedges y Sibley, 1994; Givnish y Sytsma, 1997). Por ejemplo, se han encontrado ecotipos similares en las lagartijas anolis que han evolucionado en diferentes islas del Caribe (Losos et al., 2006), también existen convergencias morfológicas asociadas a las adaptaciones a los diferentes hábitats y recursos específicos en peces cíclicos de los lagos de Tanganica (Muschick et al., 2012), y asimismo se ha podido determinar la evolución de rasgos similares en los pájaros cantores que se alimentan de néctar en Australia debido a presiones selectivas comunes (Fleischer et al., 2008). A menudo se invoca la posibilidad de la convergencia en los análisis filogenéticos morfológicos para explicar los conflictos producidos entre los árboles obtenidos de los datos moleculares y los morfológicos (por ejemplo, Wake, 1991; Losos, 2009; Fleagle y McGraw, 1999). La idea de que los datos morfológicos son altamente susceptibles a la convergencia tiene sentido intuitivo, debido a que interactúan con el medio ambiente de manera más directa y con más frecuencia que los caracteres moleculares, los cuales se supone que son esencialmente neutros (Kimura, 1983; Hedges y Sibley, 1994).
En anuros el alto nivel de similitud morfológica, y a menudo la presencia de homoplasías (Emerson, 1986) han oscurecido sustancialmente su sistemática antes del advenimiento de caracteres moleculares (Bossuyt y Milinkovitch, 2000; Frost et al., 2006; Van der Meijden et al., 2005). Sin embargo, en la sistemática a nivel de especies, los caracteres bajo selección sexual pueden ser muy útiles para la designación de especies biológicas. La coloración y los cantos de anuncio de los machos tienen a menudo un
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componente hereditario y por tanto están sujetos a la selección (Endler, 1992; Hoekstra et al., 2004; Hoffman et al., 2006; Kingston et al., 2003; Ryan et al., 1996). Los polimorfismos en el color pueden surgir y ser mantenidos por diferentes procesos evolutivos. Por ejemplo, una reducción en el flujo genético entre poblaciones ecológicamente distintas puede llevar a la divergencia fenotípica (Gray y McKinnon, 2006; Rueffler et al., 2006). Sin embargo, el papel de la coloración en la comunicación intraespecífica en ranas aún no está bien esclarecido (Hödl y Amézquita, 2001). Por el contrario, los cantos de anuncio en las ranas son el principal mecanismo de reconocimiento, y los caracteres bioacústicos son de excelente uso en la taxonomía, aunque la tasa de evolución en los diferentes parámetros del canto pueden variar entre los diferentes grupos (Cocroft y Ryan, 1995; Richards, 2006; Ryan, 1986;) y su valor para la reconstrucción filogenética es poco conocido. Todos estos rasgos tienen una función de señalización parcial (patrones de coloración) o exclusiva (cantos de anuncio) que es importante en la comunicación intraespecífica, de manera que se encuentran potencialmente bajo la selección sexual (Arak, 1983; Forester y Czarnowsky, 1985; Gabor et al., 2000; Ryan, 1999; Ryan y Rand, 1990; Ryan y Wilczynski, 1991).
Una predicción del concepto de linaje evolutivo es que existe una correspondencia entre divergencia genética y divergencia fenotípica, y por tanto una amplia diferenciación morfológica intraespecífica debería estar acompañada de un patrón filogeográfico mucho más marcado que en taxones morfológicamente uniformes. Sin embargo, si la variación morfológica es el resultado de una fuerte selección natural, la divergencia fenotípica podría superar a la de marcadores genéticos neutros. Asimismo, en varios grupos, el alto nivel de diferenciación genética no es correspondido por una diferenciación morfológica sustancial, dando lugar a linajes crípticos (Good, 1989; Good y Wake, 1992; Shaffer et al., 2004; Veith et al., 2004). En este contexto, y a fin de cuantificar la biodiversidad y comprender los procesos que la generan, es importante la comparación de la estructura filogeográfica entre especies estrechamente relacionadas con diversos niveles de variación morfológica intraespecífica.
En el presente estudio comparo los patrones de variación genética y fenotípica en el complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum a fin de esclarecer sus relaciones filogenéticas, patrones filogeográficos, estructura de la población y los rasgos fenotípicos potencialmente implicados en el aislamiento reproductivo. El grupo Dendropsophus leucophyllatus actualmente se encuentra integrado por diez especies distribuidas en las regiones amazónica y andina de America del Sur (de acuerdo a Faivovich et al., 2005; Frost, 2014): Dendropsophus anceps (Lutz, 1929), D. bifurcus (Andersson, 1945), D. ebraccatus (Cope, 1874), D. elegans (Wied-Neuwied, 1824), D. leucophyllatus (Beireis, 1783), D. manonegra (Rivera-Correa y Orrico, 2013), D. rossalleni (Goin, 1957), D.
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salli (Jungfer, Reichle y Piskurek, 2010) D. sarayacuensis (Shreve, 1935) y D. triangulum (Günther, 1869). (Figura 1)La mayoría de los individuos pertenecientes al grupo D. leucophyllatus pueden ser reconocidos morfológicamente con bastante facilidad, sin embargo algunos han demostrado ser difíciles de asignar a una determinada especie, ya que al ser polimórficos en sus patrones de coloración, pueden compartir algunos morfotipos entre diferentes especies. Es así que la especie D. triangulum ha sido descrita como una nueva especie en cuatro ocasiones posteriores a su primera descripción en 1869 (Duellman 1974), debido a que posee diferentes patrones de coloración y se pensaba que cada determinado patrón era una nueva especie. Por ejemplo, Dendropsophus elegans fue considerada un sinónimo de D. leucophyllatus durante más de un siglo (Caramaschi y Jim, 1982), y una rana descrita como Hyla favosa (Cope, 1885) ha resultado ser una variante de color de D. leucophyllatus (Titus et al., 1989).
La sistemática de este grupo fue establecida por primera vez en base a caracteres morfológicos de sus renacuajos (Duellman y Trueb, 1983), y posteriormente se refinaron con análisis moleculares (Check et al., 2001; Faivovich et al., 2005; Fouquet et al., 2007a; Jungfer et al., 2010; Pyron y Wiens, 2011; Rivera-Correa y Orrico, 2013) combinados con datos bioacústicos (Jansen et al., 2011; Lougheed et al., 2006). Chek et al. (2001) proporcionó evidencia molecular de que D. leucophyllatus es un complejo de más de una especie, cuando encontró que algunas poblaciones de D. leucophyllatus estaban más estrechamente relacionadas a D. triangulum que a otras poblaciones de D. leucophyllatus; sin
Figura 1. Distribución geográfica de las especies pertenecientes al grupo Dendropsophus leucophyllatus.
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embargo, no se han encontrado hasta la actualidad caracteres útiles para identificar a estos nuevos linajes evolutivos (ver Lougheed et al., 2006).
Los cuatro objetivos principales de este estudio son: (1) lograr una mejor comprensión de las relaciones filogenéticas dentro de este complejo de especies utilizando marcadores moleculares; (2) proponer una revisión taxonómica del grupo; (3) utilizar una aproximación filogeográfica para estudiar la historia evolutiva y demográfica de los principales clados del grupo; y (4) comparar patrones de diversidad genética con patrones de diversidad fenotípica.
Para el primer objetivo, genero una nueva filogenia molecular utilizando marcadores mitocondriales y nucleares para determinar las relaciones evolutivas entre los diferentes linajes. Para el segundo combino la filogenia con los patrones fenotípicos para evaluar la relevancia en la sistemática de la bioacústica y los caracteres morfológicos para la identificación de las especies y de los principales clados dentro de este grupo de ranas. Para el tercer objetivo realizo árboles y redes de haplotipos derivados del ADN mitocondrial, y superpongo los datos genéticos con la distribución geográfica para inferir la historia evolutiva de la población. Finalmente, comparo patrones filogenéticos con patrones fenotípicos para identificar casos de posible convergencia fenotípica entre linajes o casos de divergencia fenotípica rápida.
Materiales y Métodos
Extracción del ADN, amplificación y secuenciación
Extraje el ADN de tejidos (hígado y músculo) preservados en etanol al 95% de individuos que fueron recolectados en el campo y que se encuentran disponibles en las colecciones del Museo de Zoología (QCAZ) de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador, del Museo de Historia Natural Noel Kempff Mercado de Bolivia (MNKA) y en el Centro de Ornitología y Biodiversidad en Perú (CORBIDI). Utilicé los protocolos estandarizados de extracción con fenol-cloroformo (Sambrook et al., 1989) y con el kit de extracción Qiagen DNeasy (QiagenTM, Valencia, CA). Después de extraer el ADN amplifiqué los segmentos de los genes mitocondriales 12S rRNA, 16S rRNA, NADH Deshidrogenasa I (ND1) y Citocromo Oxidasa I (CO1) y porciones de los genes nucleares de la proopiomelanocortina (POMC), del gen activador de la recombinación 1 (RAG-1) y del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con protocolos estandarizados. Los cebadores y protocolos utilizados se presentan en los Anexos 1 y 2. Los productos amplificados fueron secuenciados en plataformas comerciales (Macrogen Inc., Seoul, Korea, y Secugen, Madrid, España).
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Análisis filogenéticos
Estimé las relaciones filogenéticas entre las especies pertenecientes al grupo Dendropsophus leucophyllatus utilizando secuencias de cuatro genes mitocondriales (12S, 16S, CO1, y ND1) y de tres genes nucleares (POMC, RAG1 y BDNF). Para ampliar el muestreo de las especies, también incluí secuencias del GenBank. Utilicé muestra de Dendropsophus brevifrons, D. carnifex, D. parviceps y D. rhodopeplus como grupo externo (basado en Pyron y Wiens, 2011). Todas las muestras utilizadas aparecen listadas en el Anexo 3.
El alineamiento preliminar de las secuencias lo realicé con el programa Geneious 5.4.4 (GeneMatters Corp.). La matriz fue importada a Mesquite (versión 2.72; Maddison y Maddison, 2009) y las regiones alineadas ambiguas fueron ajustadas manualmente para producir una alineación parsimoniosa. Para los fragmentos de genes que codifican para proteínas, las secuencias de ADN fueron traducidas a aminoácidos con Mesquite para ayudar a la alineación manual. Debido a que el conjunto de datos incluye varios genes, es poco probable que se ajuste a un único modelo de sustitución nucleotídica. Por lo tanto, dividí los datos para analizar cada partición bajo un modelo separado elegido con el programa JModelTest versión 0.1.1 (Posada 2008) y utilizando el Criterio de Información de Akaike. Definí particiones para cada gen, y en el caso de los genes codificantes, utilicé cada posición del codón como particiones separadas.
Los árboles filogenéticos se obtuvieron utilizando inferencia bayesiana y máxima verosimilitud. Para estos análisis se concatenaron los genes mitocondriales y los nucleares por separado. Para el análisis bayesiano se corrieron dos análisis independientes utilizando el método de la cadenas de Markov-Monte Carlo con cuatro cadenas por 10 millones de generaciones. Utilicé el programa TRACER versión 1.5 (Rambaut y Drummond, 2007) para monitorear los valores de verosimilitud y confirmar visualmente la convergencia y la estacionalidad de las corridas. Cada corrida fue muestreada cada 1.000 generaciones y se descartaron los primeros 2.500 (20%) árboles (burn in), el resto se utilizó para estimar el árbol bayesiano, las probabilidades posteriores y otros parámetros del modelo. El análisis filogenético bayesiano lo llevé a cabo con el programa en MrBayes 3.2.1 (Ronquist et al., 2012).
También estimé la filogenia bajo el criterio de máxima verosimilitud utilizando el programa GARLI versión 2.0 (Zwickl, 2006). Se realizaron 10 análisis independientes para asegurar que los valores de verosimilitud fueran consistentes. Además se empleó la técnica de bootstrap no paramétrico para evaluar el soporte de cada nodo, con 100 réplicas. El consenso de los árboles fue obtenido en Mesquite 2.74 (Maddison y Maddison, 2009) utilizando la regla mayoritaria al 50%.
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Índices de diversidad de las secuencias, redes de haplotipos y filogenias del ADN
mitocondrial
Calculé los índices de diversidad haplotípica (h), nucleotídica (!) y de secuencias (k) en el programa DnaSP (Librado y Rozas, 2009) para cada uno de los principales clados obtenidos en el análisis filogenético con el ADN mitocondrial. Para determinar si existió cambios repentinos en el tamaño de la población utilicé la prueba de la neutralidad de Fu (Fu, 1997), la cual detecta desviaciones de la neutralidad en escenarios caracterizados por un exceso de alelos raros y mutaciones recientes en secuencias no recombinantes. El programa Arlequin versión 3.0 (Excoffier et al., 2005) fue utilizado para obtener los valores de Fs de Fu, y los valores grandes negativos y significativos fueron interpretados como un exceso de mutaciones recientes causadas por una expansión de la población (Fu, 1997). La significación de los valores Fs fue evaluada utilizando 1.000 permutaciones aleatorias en el programa Arlequin.
En algunos análisis intraespecíficos un formato de árbol jerárquico puede ser inadecuado para la representación de las relaciones entre los haplotipos, debido a que el período de tiempo durante el cual se han desarrollado las muestras es tan corto que coexisten haplotipos ancestrales y derivados (Posada y Crandall, 2001; Kratysberg et al., 2004). Por tal motivo, para examinar las relaciones filogenéticas entre los haplotipos construí redes de haplotipos para cada uno de los clados principales utilizando el algoritmo “median-joining” en el programa Network 4.6.0 (Fluxus Technologies Inc.). En estas redes, los haplotipos se representan como círculos en los nodos de un árbol en vez de en las puntas, y el tamaño del círculo es proporcional a la frecuencia del haplotipo en la población. También realicé filogenias de los haplotipos para cada uno de los genes mitocondriales utilizando inferencias bayesianas con los mismos parámetros y modelos evolutivos que fueron empleados en la filogenia de los genes mitocondriales concatenados.
Análisis morfológicos y de coloración
Observé patrones de coloración para determinar si la diversidad genética revelada por el ADN mitocondrial es acorde con la diversidad fenotípica. Los patrones de coloración fueron observados en individuos vivos (en base a fotografías) y en preservación, tomando en cuenta solamente los individuos adultos. Se determinó la edad y la condición sexual por medio de una disección o por la observación de los caracteres sexuales secundarios externos. Revisé un total de 440 individuos adultos pertenecientes al complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum depositados en las colecciones de los museos: Museo de Zoología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCAZ), Museo de Zoología de la Universidad de São Paulo (MZUSP), Museo de Historia Natural Noel Kempff Mercado de Bolivia (MNKA),
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Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid (MNCN) y Centro de Ornitología y Biodiversidad de Perú (CORBIDI). Medí la longitud rostro cloacal (LRC) con un calibrador digital con precisión de 0.01mm marca Tresna.
Los caracteres cualitativos utilizados para las diagnosis se basaron principalmente en Duellman (1974 y 1978), Cochran y Goin (1970), Goin (1957), Rodriguez y Duellman (1994) y referencias citadas en estos artículos. Se examinó: (1) coloración del dorso y vientre, (2) presencia o ausencia de una o dos manchas en las pantorrillas y antebrazos, (3) coloración de los flancos y lados de la cabeza (4) forma y número de marcas en el dorso, (5) presencia o ausencia del patrón de coloración reticulado y (5) coloración en vida del iris.
Análisis bioacústicos
La comunicación acústica en anuros puede ser utilizada para atraer a la pareja (por ejemplo, Haddad y Cardoso, 1992; Brenowitz y Rose, 1999) y también puede estar relacionada con la defensa del territorio, incluyendo encuentros entre machos que compiten por los sitios de llamada (por ejemplo, Wells, 1988; Bastos y Haddad, 2002) o sitios de postura de huevos (por ejemplo, Martins et al., 1998). En este estudio se reconocieron dos tipos de cantos emitidos por los machos que forman parte del complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum. Todas las vocalizaciones eran simples y estaban formadas por una o varias notas pulsadas, pero eran distintas en su estructura física y fueron emitidas en diferentes contextos sociales.
Cantos de anuncio.—Este tipo de canto es de gran valor para la determinación de la identidad de la especie y para la resolución de problemas taxonómicos, además permite la identificación de especies crípticas e híbridos (Heyer et al., 1996; Angulo et al., 2003; Gergus et al., 2004). Los machos pertenecientes al complejo Dendropsophus leucophyllatus-triangulum producen este tipo de canto antifonalmente: cantos frecuentes y sincronizados producidos por diferentes machos que interactúan evitando la superposición acústica. La primera nota para este tipo de canto (denominada nota A en este estudio) es pulsada (10–20 pulsos) y tiene un tiempo de duración entre 0,08 y 0,2 segundos; puede estar o no acompañada por una o varias notas secundarias (nota B) que también son pulsadas, pero se diferencian de la primera nota en su duración (0,02–0,04 s) y número de pulsos (2–6 pulsos).
Cantos territoriales.—Es una forma de interacción agonística (comportamiento agresivo) que se produce cuando un individuo intenta adquirir un recurso impugnado, tal como un territorio, a expensas de otro. Los cantos territoriales se emiten al comienzo de la actividad de las llamadas y pueden ser utilizados para delimitar los límites territoriales. También se pueden escuchar cantos territoriales adicionales cuando los machos invaden los territorios de sus congéneres, y generalmente acaban a la salida del intruso (Toledo, 2004). Se observó que los machos pertenecientes al grupo D. leucophyllatus-triangulum emitían este tipo de canto a tasas elevadas cuando existe una alta actividad de llamados conspecíficos y
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también cuando se producen interacciones interespecíficas. El número de notas para este canto puede variar de 3 a 7 (notas B), las cuales pueden incrementarse a medida que las interacciones continúen. A diferencia del canto de anuncio, no se emite la nota A.
Para la grabación de los cantos utilicé una grabadora digital OlympusTM LS10 y un micrófono direccional SennheiserTM ME-67. También incluí cantos publicados en Duellman y Pyles (1983), Lougheed et al. (2006) y Jansen et al. (2011). Los cantos están depositados en el archivo de audio del Museo de Zoología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCAZ), en la Fonoteca Zoológica del Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC) de Madrid y en la Macaulay Library del Laboratorio de Ornitología de la Universidad de Cornell.
Se obtuvieron cantos pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum de las localidades de BOLIVIA: SANTA CRUZ: Puerto Alcamcén; Ñuflo de Chávez; Ichilo; BENI: Yucuma; Estación Biológica de Beni; BRASIL: PARÁ: 200 km al oeste de Redençao; Alter do Chão; Obidos; AMAPÁ: Serra do Navio; ACRE: Río Branco; ECUADOR: SUCUMBÍOS: Santa Cecilia; PASTAZA: Loracachi; NAPO: Misahualli; ORELLANA: 57 km vía Maxus; Tambococha; Chiroisla; PERÚ: MADRE DE DIOS: Puerto Maldonato; GUAYANA FRANCESA: CAYENNE: Kaw; Toponowini.
En total se obtuvieron las grabaciones de los cantos de 50 individuos que representan siete de los ocho clados obtenidos en este estudio. Los oscilogramas, espectrogramas y espectros de poder fueron editados y realizados con el programa Raven Pro versión 1.5 (Charif et al., 2010). El espectrograma fue generado mediante una transformación Fourier directa (DFT) a partir de una muestra de 1024 puntos y una resolución de frecuencia de 43.1 Hz. Se utilizaron varios cantos y notas por individuo para calcular un promedio individual.
Para este trabajo consideré como “canto” a una secuencia estereotipada de notas; una “nota” como la unidad de sonido constituida por uno o más pulsos producidos durante un solo ciclo de flujo de aire (McLister et al., 1995); mientras que un “pulso”, es el resultado pasivo del flujo del aire a través de la laringe (McLister et al., 1995).
Los parámetros analizados fueron: duración del canto (Ddc), número de notas por canto (Nnc), tiempo de subida del canto (Tsc), número de pulsos por canto (Npc), duración de la nota A (DdlA), número de pulsos de la nota A (NpA), duración de la nota B (DdlB), número de pulsos de la nota B (NpB), distancia entre notas (Dtn), promedio de la frecuencia dominante del canto (Fdc), banda de la frecuencia del canto (Bfc) y distancia entre pulso (Dtp). Todas estas características del canto son de uso común para las descripción de cantos y el reconocimiento taxonómico (Cocroft y Ryan, 1995; Bosch y De la Riva, 2004; Lougheed et al., 2006; Márquez et al., 1995; Padial et al., 2008). En el Anexo 4 se provee información más detallada de cada parámetro utilizado y en la Figura 2 se muestra un ejemplo de la forma
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de un onda típica y el espectrograma a partir de la cual se midieron las variables los cantos.
Debido a que las variables del canto pueden estar afectadas principalmente por la temperatura del ambiente (Gerhardt y Huber, 2002), los datos fueron sometidos a una regresión de todas las variables con la temperatura. Los análisis mostraron una falta de correlación entre la temperatura y todas la variables por lo que no se aplicaron correcciones adicionales. La falta de correlación puede ser consecuencia del rango relativamente pequeño de temperaturas registradas durante las grabaciones (23–26 oC).
Realicé un análisis de componentes principales (ACP) con el fin de conocer el grado de diferenciación de los cantos entre clados. Posteriormente realicé una prueba de t pareada para analizar las variables entre clados para los componentes principales encontrados en el ACP. Los análisis se ejecutaron en el programa SPSS ® (2009, version 17.0 para Windows).
Delimitación de las especies
Los linajes encontrados en este estudio serán clasificados en tres categorías según las definiciones realizadas por Vieites et al. (2009). (1) Especies candidatas confirmadas (ECC), son aquellas que difieren claramente por caracteres morfológicos y bioacústica y por lo general muestran alta diferenciación genética. (2) Especies candidatas no confirmadas (ECN), son linajes genealógicos profundos en los que su bioacústica y morfología todavía no han sido estudiadas. (3) Linajes conespecíficos profundos (LCP), son linajes genealógicas divergentes que no presentan diferenciación acústica ni morfológica, o que solamente las presentan en caracteres conocidos que muestran la variabilidad intraespecífica.
Figura 2. Oscilograma (A) y espectrograma (B) de un canto representativo del complejo de
especies D. leucophyllatus-triangulum. En el oscilograma, se muestra la nota primaria denominada en este estudio como Nota A, seguida de una nota secundaria (Nota B).
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Resultados
Análisis filogenéticos
Se obtuvieron secuencias de 163 individuos para los genes mitocondriales 12S (~967 pb), 16S (~1.106 pb), CO1 (~642 pb), ND1 (~1.102 pb) y para los genes nucleares POMC (~632 pb), RAG-1 (~448 pb) y BDNF (~718 pb), incluyendo los grupos externos (Anexo 3). Los modelos evolutivos utilizados para las particiones de los análisis filogenéticos y los valores de sus diferentes parámetros se detallan en el Anexo 5.
Los análisis de inferencia bayesiana y máxima verosimilitud para los genes individuales y para los genes combinados mitocondriales muestran árboles similares, por consiguiente sólo se presenta la topología del árbol con los genes mitocondriales concatenados (Fig. 3). Actualmente, el grupo de especies Dendropsophus leucophyllatus es relativamente bien conocido en cuanto a su composición de especies (ver Duellman 1974; Titus et al., 1989; De la Riva y Duellman, 1997; Chek et al., 2001; Wiens et al., 2005; Faivovich et al., 2005; Jungfer et al., 2010; Rivera-Correa y Orrico, 2013). La única especie que por el momento no posee análisis filogenéticos es D. rossalleni, aunque De la Riva y Duellman (1997) sugieren que pertenece a este grupo debido a que presenta un cierto grado de similitud en su morfología.
A pesar de estas contribuciones, en este estudio hay dos aspectos en la sistemática del grupo de especies Dendropsophus leucophyllatus que requieren una especial atención. En primer lugar, dos especímenes de Perú colectados en la localidad de La Mar (departamento de Ayacucho), presentan una morfología y un patrón de coloración muy parecido a D. salli y D. bifurcus (dorso de color marrón, con manchas de color crema en el hocico, las líneas dorsolaterales, la rabadilla, los antebrazos y las pantorrillas). Estos especímenes pertenecen al Clado I (Fig. 3), se encuentran estrechamente relacionados con la especie D. salli con soportes estadísticos muy altos de probabilidad posterior (0,99) y bootstrap (100%), y presentan una divergencia muy alta en sus secuencias de ADN mitocondrial (distancias p no corregidas varían entre 8,4–9,5% para el gen 16S). Al mismo tiempo, ambas especies comparten un ancestro común con D. elegans y por consiguiente forman un grupo monofilético.
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Figura 3. Filograma consenso resultante del análisis bajo el criterio de inferencia bayesiana de los
genes combinados 12S, 16S, ND1 y CO1 que representa las relaciones dentro del Grupo
Dendropsophus leucophyllatus. Se muestra el número de museo de cada individuo y su localidad.
Los colores representan los diferentes clados obtenidos en este estudio. Los valores de bootstrap y las probabilidades posteriores aparecen en las ramas; los valores faltantes indican valores por debajo de 50 (bootstrap) o 0,5 (probabilidades posteriores). No se muestra el grupo externo. Las abreviaturas son: BO Bolivia, BR Brasil, CO Colombia, EC Ecuador, GF Guayana Francesa, PE Perú, SU Surinam.
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En segundo lugar, la filogenia identificó ocho clados con buenos soportes (>0,89 probabilidades posteriori; >78% bootstrap) dentro de lo que actualmente se reconocen como dos especies Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum. Estos resultados son congruentes con la filogenia presentada por Lougheed et al. (2006), en la cual se identificaron tres de estos clados (B, C y D + F–H ). Las distancias p no corregidas entre los linajes más emparentados para el gen 16S oscilaron entre 3,1 y 8,5%, mientras que dentro de cada linaje las distancias p variaron entre 0,0 y 1,8%. Los ocho clados se encuentran clasificados en dos subclados basales y alopátricos con un soporte estadístico muy alto. El primero está conformado por 3 clados (A, B y C) y el segundo por los clados D, E, F, G y H.
El clado A es hermano del clado B, lo que nos indica que están cercanamente emparentados. El clado A se distribuye en los departamentos de Beni y Santa Cruz en Bolivia; mientras que el clado B se encuentra al noroccidente de Brasil (Estados de Amazonas, Amapá y Pará), en Surinam (Distrito de Para), y gran parte de la Guayana Francesa (Distritos de Cayena y Saint Laurent du Maroni). Finalmente, el clado C se encuentra geográficamente ubicado al norte y suroriente del Ecuador (Provincias de Sucumbíos, Napo, Orellana, Pastaza y Morona Santiago), al noroeste de Brasil (Estado de Amazonas) y en la región amazónica del Perú (Departamento de Loreto) (Fig. 4). El clado C forma un grupo monofilético con los clados A y B, que excluye a los clados D, E, F, G y H.
Figura 4. Mapa de las localidades muestreadas en este estudio para las especies
pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Las estrellas azules corresponden al clado A, los pentágonos marrones al clado B, los triángulos verdes al clado C, los cuadrados rojos al clado D, los círculos naranjas al clado E, el cuadrado redondeado morado al clado F, los círculos celestes al clado G y los círculos amarillos al clado H.
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En el segundo subclado tenemos la presencia del clado D, el cual es el más basal de este grupo y comparte su ancestro común con los clados E, F, G y H. El clado D está distribuido en los estados de Acre y Pará (Brasil) y en los departamentos del Cusco y Madre de Dios (Perú). Debido a que los valores de probabilidad posterior y bootstrap fueron muy bajos, no hubo una buena resolución filogenética entre los clados E, F, G y H. Los clados F y G están presentes en el estado de Pará en Brasil; el clado E se encuentra distribuido en el departamento del Cusco en Perú; mientras que el clado H está geográficamente ubicado en región amazónica del Ecuador (Provincia de Orellana y Sucumbíos), al noroccidente y nororiente de Brasil (Estados de Acre y Pará) y al nororiente del Perú (Departamento de Loreto) (Fig. 4).
Para la filogenia con los genes nucleares combinados bajo el criterio de inferencia bayesiana y máxima verosimilitud (Anexo 6) hay poca resolución, por ende la topología del árbol de los genes nucleares fue incongruente con la de los genes mitocondriales.
Análisis de coloración
Se encontraron variables cualitativas que fueron diferentes entre algunos clados resultantes de los análisis filogenéticos. Los estados de estas variables se repiten en individuos de diferentes localidades y pertenecientes a un mismo clado. Principalmente, se analizaron los patrones de coloración del dorso y vientre, los cuales han sido y siguen siendo de gran utilidad para asignar a los diferentes linajes dentro del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum (ver Boulenger, 1882; Cochran y Goin, 1970; Titus et al., 1989; Duellman, 1974 y 1978; Rodriguez y Duellman, 1994). A continuación describo las variables cualitativas para cada clado:
Clado A.— (Fig. 5A-B) La coloración del dorso es café o marrón obscuro, y presenta machas de color amarillo brillante o blanco cremoso en las líneas dorsolaterales y la rabadilla. Estas manchas con bordes irregulares y pequeños puntos marrones en su interior (Fig. 5A), también se encuentran presentes en los antebrazos y las pantorrillas (2 ó 3 en cada una), y pueden diferenciarse de las manchas encontradas en los clados B, D, E, F, G y H (manchas con bordes lisos y sin puntos). La punta del hocico, lados de la cabeza, la región supra-cloacal, las superficies dorsales de las extremidades superiores e inferiores, y los flancos son de color marrón. Algunos individuos tienen una coloración muy diferente a la descrita previamente, pues consiste de un dorso con una fina red de líneas amarillas o blancas en un fondo café o marrón obscuro (morfo "reticulado"; Fig. 5B). Esta fina red se extiende en las superficies dorsales de la cabeza, el cuerpo y las extremidades. En la noche las manos, los pies, las axilas, las superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies ventrales de los miembros son naranja-amarillento o rosado; de día estas superficies son anaranjadas. El saco vocal es amarillo y el iris es bronce oscuro.
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Clado B.— (Figs. 5C y 6) La coloración del dorso es café o marrón obscuro en el centro, y blanco cremoso o amarillo brillante en las periferias. Las esquinas posterolaterales son confluentes con una amplia franja marrón en los flancos. La mancha blanca que se encuentra presente en la rabadilla es característica para este clado, y puede diferenciarse de las manchas presentes en el resto de clados (A, D, E, F, G y H) debido a su peculiar forma de hoja alargada (Fig. 5C y 6). La punta del hocico, lados de la cabeza, la región supra-cloacal, las superficies dorsales de las extremidades superiores, los flancos y los muslos son de color marrón. En la pantorrilla se encuentra presente una mancha crema o amarilla que puede cubrir la mayor parte la superficie, y en algunos casos puede estar dividida por una banda transversal de color marrón; manchas con similares coloraciones pero de formas redondas pueden encontrarse en los antebrazos (una o dos en cada extremidad). En algunos individuos, también se encuentra presente el morfotipo reticulado. En la noche las manos, los pies, las axilas, las superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies ventrales de los miembros son naranja-amarillento; de día estas superficies son anaranjadas. El saco vocal es amarillo y el iris es de color bronce oscuro.Figura 5. Diferentes patrones de coloración de individuos perteneciese al complejo de
especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. (A y B) Clado A; (C) Clado B; (D–G) clado C; (H) clado D; (I–L) clado H.
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Clado C.— (Figs. 5 D–G y 6) La coloración dorsal en este clado puede variar de blanco cremoso a crema amarillento, amarillo, café o marrón obscuro, con o sin una o más marcas marrones obscuras sobre todo el dorso. Las superficies dorsales de las pantorrillas y algunas veces los antebrazos y los pies son del mismo color que el dorso. Duellman (1974) identificó 7 morfotipos para este clado, para los cuales se basó en el número y la distribución de las marcas encontradas en el dorsal. A continuación describo los mismos morfotipos con algunas variaciones: (1) individuos sin marcas en el dorso; (2) una marca de forma circular o triangular en la región occipital; (3) dos marcas, una ubicada en la región media dorsal y la otra en la región occipital; (4) una marca en forma de triángulo o una banda ancha que va desde la cabeza hasta la región media dorsal; (5) tres marcas redondas, una en la cabeza y dos en la región media dorsal; (6) una fila de marcas redondeadas en la región media dorsal y en las líneas dorsolaterales; y (7) numerosas marcas circulares distribuidas sobre todo el dorso. Para los morfotipos 6 y 7, marcas similares pueden estar presentes en las superficies dorsales de las extremidades superiores e inferiores (Fig. 5E). El patrón en los individuos queFigura 6. Fotografías dorsales de individuos preservados pertenecientes a los Clado B,
C y H del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum.
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presentan varias marcas en el dorso (morfotipo 7) puede ser fácilmente confundido con el morfotipo reticulado encontrado en los clados A, B, E, F, G y H. Los lados de la cabeza, los flancos, las superficies dorsales de las manos, pies, antebrazos y muslos son de color marrón oscuro o de un gris uniforme. Las manos, las axilas, las superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies ventrales de los miembros son de color rosa por la noche y rojo en el día. El saco vocal es amarillo y el iris es bronce oscuro.
Clado D–H.— (Figs. 5 H–L y 6) Después revisar los patrones de coloración de los especímenes preservados y vivos (fotografías), no se encontró ningún carácter diagnóstico que permita diferenciar los clados obtenidos en los análisis moleculares. Los individuos pertenecientes a estos cinco clados presentan una marca dorsal marrón obscura distintiva en forma de reloj de arena con un color de fondo amarillo brillante o cremoso (Fig. 5K); en algunos casos la marca dorsal tiene forma de banda y podría confundirse muy fácilmente con el morfotipo 4 del clado C. Por otra parte, en algunos especímenes una o las dos esquinas posterolaterales son confluentes con una amplia franja marrón en los flancos (Fig. 5 H–J); la mancha que se forma en la rabadilla posee una variedad de formas y tamaños (e.j., círculo, óvalo o rectángulo con bordes redondeados). En estos cincos clados, también se encuentra presente el morfotipo reticulado (fina red amarilla brillante o cremosa que se extiende por toda la superficie dorsal, incluyendo las extremidades; Fig. 5L). La punta del hocico, lados de la cabeza, la región supra-cloacal, los flancos, las superficies dorsales de las extremidades superiores e inferiores son de color marrón. Las superficies dorsales de las pantorrillas poseen de 1 a 3 manchas; mientras que las superficies dorsales de los antebrazos pueden tener o no 1 ó 2 manchas redondeadas. En las localidades pertenecientes al Ecuador se ha encontrado que la mancha en la pantorrilla puede cubrir la mayor parte de la superficie. Las manos, los pies, las axilas, las superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies ventrales de los miembros son de color naranja pálido por la noche y anaranjado brillante en el día. El saco vocal es amarillo y el iris es de color bronce oscuro.
La prueba de t realizada con la variable longitud rostro-cloacal en los machos permitió determinar diferencias en el tamaño corporal entre clados (Anexo 7). La Figura 7 muestra que los individuos del clado C son los más pequeños (el promedio es 24,71 ± 2,53 mm) y se diferencian de los demás clados (P <0,001); los especímenes del clado A son los más grandes (30,60 ± 1,63 mm) y también presenta significación con los clados B, E, y H (P <0,002); mientras que el clado E es diferente a los clados F y G (P = 0,02).
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Análisis bioacústicos
Los resultados obtenidos del análisis de componentes principales muestran tres componentes principales (CP) que explican en conjunto el 75.97% de la variación total (Anexo 8). El CP1 (42,54% de la variación explicada) tiene cargas mayores en la duración (DdlB) y número de pulsos de la nota B (NpB), y el número de notas por canto (Nnc). El CP2 (21,45% de la variación explicada) tiene cargas mayores en la banda de la frecuencia del canto (Bfc) y el número de pulsos por canto (Npc). El CP3 (11,97%) tiene las cargas mayores en la distancia entre notas (Dtn).
La proyección de los individuos sobre el CP1 y el CP2 (Fig. 8) permite separar a los cantos de anuncio de los territoriales, y también diferenciar algunos de los clados dentro de los cantos de anuncio. En el caso del CP1, los cantos de anuncio de los clados A y D se separan de los cantos de anuncio pertenecientes a los clados B, C, F, G y H por tener una menor duración y número de pulsos de la nota B, y también por un menor número de notas en sus cantos de anuncio. De igual manera, los cantos de territorio se separan ligeramente de los cantos de anuncio por tener una mayor medida de estas tres variables. En el caso del CP2, tanto los cantos de territorio como los de anuncio para el clado C tienden a separarse del resto
Figura 7. Diagrama de caja que compara la longitud rostro cloacal (LRC) de los
machos adultos del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Se muestra la media para cada clado (línea central de cada caja), la variación de los datos (rango intercuartil: longitud de la caja), los límites sobre los cuales se ubican los datos atípicos (barras de error) y los datos extremos (puntos negros).
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de clados debido a que poseen una mayor banda de frecuencia y un mayor número de pulsos por canto. Las características de los cantos de anuncio y territorio para cada clado, con excepción del clado E del cual no pude obtener grabaciones, se resumen en el Anexo 9.
La prueba de t permitió determinar qué caracteres, de acuerdo a los componentes principales, son diferentes entre los clados. El primer componente (CP1) para los cantos de anuncio, que está relacionado con las variables obtenidas de la nota B y el número de notas por canto, nos indica que los clados A y D son altamente significativos con respecto a los clados B, C, F, G y H (P <0,001); el clado C es diferente de B, F, G y H (P <0,005); y los clados G y H también presentan significación (P = 0,01). Para el segundo componente (CP2) para los cantos de anuncio, el cual está influenciado por la banda de la frecuencia y el número de pulsos por canto, los resultados muestran que el clado C se diferencia de los demás clados (P <0,01); mientras que los clados A y D son diferentes a B y F (P <0,03).
En cuanto a la comparación de los componentes principales para cada clado con
respecto a los cantos territoriales, el CP1 nos indica que existe significación entre el clado D y los clados B, C, G y H (P <0,008); el clado A es diferente a B, C y H (P <0,01); y los clados B y C presentan significación al igual que G y H (P <0,01). Por otra parte, al comparar el segundo componente principal entre clados, el clado C muestra diferencias con el resto de clados (P <0,02); mientras que los clados B y G son diferentes a los clados A y D (P <0,01). En el Anexo 10 se indica la significación estadística entre las comparaciones de los componentes principales para los cantos de anuncio y de territorio.
Figura 8. Proyección de las variables acústicas sobre los componentes
principales CP1 y CP2 de un análisis de componentes principales pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum.
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Estatus taxonómico de Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum
La examinación del holotipo de D. triangulum (BM 68.11.15.2, Figura 9) que se encuentra depositado en la colección del Museo Británico en Londres, sugiere que pertenece al clado C debido a la combinación de la presencia de una mancha en forma de triángulo en la cabeza y por la localidad tipo “Brasil”, la cual es consistente con el rango de distribución del clado C.
El holotipo de D. leucophyllatus no pudo ser examinado porque está perdido (Böhme, 1981). Sin embargo, la descripción y dibujo del holotipo de D. leucophyllatus en una revisión hecha por Böhme (1981) combinada a la ubicación de la localidad tipo, sugieren que pertenece al clado B. El énfasis de Beireis (1783) en la mancha blanca ovalada ubicada en la superficie dorsal de la rabadilla es consistente con la mancha característica del clado B. Por otra parte, la presencia exclusiva de individuos del clado B con este tipo de patrón de coloración en la región de la Guayana es consistente con la localidad tipo “Surinam”.
Índices de diversidad de las secuencias, redes de haplotipos y filogenias del ADN
mitocondrial
Se tomaron en cuenta sólo los datos moleculares de los clados B, C y H para compararlos, debido a que estos poseían un mayor número de muestras y localidades en relación a los demás clados. La prueba de neutralidad de Fu mostró tanto valores positivos como negativos, no obstante sólo hubo significancia para los valores negativos de los clados B (Fs = -1,72; P = 0,01) y H (Fs = -1,82; P = 0,03) en el fragmento 12S, lo cual indica un exceso de mutaciones recientes y que la población ha sufrido una expansión poblacional (Fu 1997). Por otra parte, el clado C fue el que presentó un mayor número de sitios polimórficos (s = 19–61)
Figura 9. Holotipo de Dendropsophus triangulum (BM 68.11.15.2, LRC
= 27 mm). A la izquierda vista dorsal y a la derecha vista ventral.
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y mayor diversidad nucleotídica (! = 0,005–0,012) en todos los fragmentos de los genes mitocondriales, seguido por el clado H (s = 6–25; ! = 0,001–0,007) y posteriormente por el clado B (s = 2–9; ; ! = 0,0006–0,003); lo cual está muy acorde con el número individuos y sitios muestreados por clado. En cuanto a la diversidad haplotípica, el clado H presentó los valores más altos para los fragmentos de los genes 16S y ND1 (! = 0,85 y 0,90 respectivamente), y el clado C para los fragmentos 12S y CO1 (! = 0,82 y 0,83). Los resultados de la prueba de la neutralidad y los índices de diversidad genética para cada gen mitocondrial y para cada uno de los clados principales obtenidos de la filogenia mitocondrial, se resumen en la Tabla 1.
16S (~503 pb)
Clados sitios No. individuos No. Hap. No. s h ! Fs P
B 14 25 3 2 0,29 ± 0,01 0,0006 ± 0,0002 -1,004 0,16 C 21 46 9 19 0,75 ± 0,04 0,007 ± 0,001 1,15 0,74 H 11 27 10 12 0,85 ± 0,04 0,007 ± 0,0005 -1,13 0,34
12S (~781 pb)
Clados sitios No. individuos No. Hap. No. s h ! Fs P
B 9 14 4 3 0,49 ± 0,15 0,0007 ± 0,0002 -1,72 0,014 C 20 43 9 21 0,82 ± 0,03 0,005 ± 0,001 1,76 0,82 H 7 16 5 6 0,53 ± 0,14 0,001 ± 0,0004 -1,82 0,038
ND1 (~939 pb)
Clados sitios No. individuos No. Hap. No. s h ! Fs P
B 9 16 6 9 0,83 ± 0,56 0,002 ± 0,0005 -0,61 0,35 C 16 35 13 61 0,81 ± 0,05 0,012 ± 0,002 2,61 0,87 H 6 15 9 25 0,90 ± 0,05 0,006 ± 0,001 -0,46 0,42
CO1 (~625 pb)
Clados sitios No. individuos No. Hap. No. s h ! Fs P
B 7 12 4 6 0,56 ± 0,15 0,003 ± 0,0009 0,75 0,69 C 17 42 12 31 0,83 ± 0,03 0,011 ± 0,002 1,19 0,73 H 6 14 5 9 0,70 ± 0,10 0,003 ± 0,001 0,55 0,69
La secuenciación de 73 individuos para el fragmento del gen 12S, 96 para el 16S, 66 para ND1 y 68 para CO1 produjo 18, 10, 28 y 21 haplotipos únicos, respectivamente (Anexo 11). Las filogenias obtenidas en base al análisis bayesiano y las redes de haplotipos construidas para cada uno de los cuatro marcadores de ADN mitocondrial indican que el clado B posee el menor número de haplotipos en los cuatro fragmentos de genes en relación al resto de clados, y su estructura genética no presenta un patrón geográfico definido (Fig. 10).
Tabla 1. Diversidad genética e índices de la historia demográfica de los principales clados
obtenidos en la filogenia molecular del complejo de especies Dendropsophus
leucophyllatus-triangulum. Los clados corresponden a los definidos por la Figura 3. No. Hap. = número de
haplotipos, s = número de sitos polimórficos, h = diversidad haplotípica, ! = diversidad nucleotídica y Fs = valores de la prueba de Fu.
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Figura 10. Red de haplotipos y análisis bayesiano de cuatro fragmentos de ADN mitocondrial para los principales clados obtenidos en este estudio. (A) 12S, (B) 16S,
(C) ND1 y (D) CO1. Los colores representan a los diferentes clados: café para el clado B, verde para el C y amarillo para el H. Se muestran las probabilidades posteriores en las rama del árbol. Los haplotipos están representados por círculos, su tamaño es proporcional a su frecuencia en la población. Cada rama de la red representa un cambio de nucleótido único y las mutaciones adicionales se indican con barras a lo largo de las ramas. Los números en los cuadrados indican los cambios de nucleótidos que separan a las poblaciones más divergentes.
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Para el clado C, se observan dos clados bien definidos con valores de soporte altos en sus ramas (probabilidad posterior >0,92) para todos los árboles filogenéticos, en los cuales se separan a las poblaciones de Requena (ubicada al oriente de Loreto) y Sacado (al sur-occidente del Estado de Amazonas) del resto de poblaciones muestreadas. En las redes de haplotipos creadas con los cuatro diferentes marcadores mitocondriales (Fig. 10A–D), la poblaciones de Requena se diferencian por un rango de 10 a 35 pasos mutacionales y la de Sacado por 7 pasos del resto de poblaciones; mientras que los haplotipos encontrados en una misma localidad del Ecuador tienden a separase por un rango de 2 a 9 pasos. Finalmente en el clado H, las poblaciones de Requena se diferencian por 12 y 4 pasos del resto de poblaciones, pero solamente en los fragmentos ND1 y CO1 respectivamente.
Discusión
Divergencia genética y delimitación de las especies
En este estudio he identificado 9 linajes genealógicos con gran divergencia genética dentro del complejo Dendropsophus leucophyllatus-triangulum, hasta ahora considerado dos únicas especies. Los análisis bioacústicos y morfológicos junto a la filogenia molecular revelan la existencia de varias especies taxonómicas nuevas. En base a la clasificación propuesta por Vieites et al. (2009) pude identificar 3 especies candidatas confirmadas (clados A–C), una especie candidata no confirmada (clado I) y 5 linajes genealógicos profundos. Al igual que en otros estudios sobre los anfibios de la Amazonía (por ejemplo, Elmer et al., 2013; Fouquet et al., 2007; Funk et al., 2011), los resultados de este estudio documentan una gran proporción de la diversidad que se encontraba oculta en el grupo Dendropsophus leucophyllatus dentro de un conjunto de poblaciones que antes eran tratadas como dos especies con amplia distribución.
La baja variabilidad los genes nucleares utilizados en este estudio (POMC, RAG-1 y BDNF) no resolvió las relaciones filogenéticas a nivel de especies. Las inconsistencias entre las árboles filogenéticos mitocondriales y los nucleares puede deberse a sus respectivas tasas de evolución. La elevada tasa de mutación y menor tamaño de población efectiva, hacen que los genes mitocondriales sean más variables que los nucleares (Brown et al., 1996).
Los individuos pertenecientes a los clados A, B y C presentan diferencias en sus secuencias de ADN mitocondrial (distancias p no corregidas >4,8% para el gen 16S), cantos de anuncio, patrones de coloración y tamaño del rostro cloacal, además sus rangos de distribución son alopátricos. Por consiguiente, existen suficientes evidencias para categorizarlas como linajes evolutivos independientes.
Las ranas pertenecientes a los clados D, E, F, G y H se encuentran caracterizadas por una morfología relativamente conservada que puede ocultar una profunda diferenciación
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genética, lo que indica que la tasa molecular está divergiendo más rápidamente que la evolución morfológica (Heyer y Maxson, 1982; Duellman y Tueb, 1994). Los cantos de anuncio entre los clados D, F, G y H que, según los análisis, representaría linajes distintos, en algunos casos han demostrado ser muy similares o incluso idénticos. Sin embargo, se ha demostrado que la hibridación natural a veces se produce entre especies con llamadas bien diferenciadas, lo que indica que las diferencias en los cantos no son necesariamente suficientes para evitar la hibridación interespecífica cuando otros mecanismos de aislamiento se debilitan o se eliminan (Blair, 1958).
En ciertas localidades los análisis revelaron que algunos linajes independientes se encuentran en simpatría o al menos en una proximidad muy cercana (por ejemplo, la localidad de Redençao para los clados D y G; Alter do Chão para B y F; La Convención para D y E; Requena, San Vicente, Chiroisla, Huiririma, Nuevo Rocafuerte y Tabatinga para C y H). Los grupos fenotípicamente o genéticamente diferentes que son capaces de mantener su integridad genética en simpatría pueden interpretarse como especies biológicas (Mallet, 2008). No obstante, los linajes de ADN mitocondrial divergentes en simpatría también podrían ser el producto de contactos secundarios entre poblaciones previamente aisladas y todavía co-específicas (capaces de reproducirse) (Hewitt, 2011). Por tal motivo, interpreto a las entidades simpátricas que no poseen variables fenotípicas únicas para su diferenciación como linajes genealógicos profundos a la espera de nuevas pruebas para su posible designación como especies.
Consideraciones biogeográficas
La biodiversidad se encuentra distribuida de una forma heterogénea dentro del Neotrópico. Los bosques tropicales de América del Sur se pueden dividir en cinco regiones principales (Duellman, 1999): el Chocó en la costa del Pacífico; las empinadas laderas de los Andes; la selva costera del Caribe; la selva atlántica del Brasil y la selva amazónica. Estas regiones se caracterizan por un alto grado de endemismo (Duellman, 1999). Las tierras bajas del Amazonas (<600m) son consideradas como un conjunto de sub-regiones que comprenden la Amazonía occidental (Alto Amazonas), el Escudo Brasileño y el Escudo Guayanés.
La distribución geográfica del clado B restringida al Escudo Guayanés, podría indicar que este linaje es endémico de la región y en consecuencia presentaría una larga historia evolutiva de gran relevancia dentro de la Guayana Francesa. Por otra parte, al interpretar como variación dentro de la misma especie al amplio número de pasos mutacionales de las poblaciones de Requena (Perú) que conectan con los haplotipos de las localidades cercanas o pertenecientes al Ecuador en los clados C y H, se podría inferir que la historia biogeográfica de la Amazonía occidental es independiente para ambas regiones muestreadas. Sin embargo, se necesitarán muestreos adicionales para sustentar esta hipótesis.
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Correlación entre la diversidad genética y la fenotípica
Dentro del complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum encontré tres linajes (clados B, C y H) que presentan diferentes niveles de diversidad fenotípica y genética. El clado C presenta un gran número de fenotipos de coloración diferentes y una alta diversidad haplotípica y nucleotídica, mientras que los clados B y H muestran baja diversidad genética, una relativa homogeneidad fenotípica, y no presentan un patrón geográfico definido. La gran variación de colores y manchas que poseen las ranas pertenecientes al clado C podría ser resultado de la selección apostática contra depredadores visuales, en donde las formas comunes de una especie son mayormente depredadas en comparación a las más raras y esto permite que los morfos raros tengan una ventaja selectiva en la población (Paulson, 1973). También es posible que la combinación de los patrones de coloración con el entorno sea una señal suficiente para disuadir a los posibles predadores (cripsis) (por ejemplo, Osorio y Srinivasan, 1991).
Los resultados de la prueba de la neutralidad de Fu para el gen mitocondrial 12S indican que los clados B y H sufrieron una expansión poblacional reciente (Fu, 1997), lo cual explicaría la menor diversidad genética y fenotípica que poseen estos clados en comparación al clado C. Estas expansiones demográficas recientes fueron probablemente precedidas por cuellos de botella genéticos que pudieron afectar no solamente a las regiones neutras del genoma sino también a las que codifican la variabilidad fenotípica, reduciendo así tanto el número de haplotipos mitocondriales como de fenotipos de coloración. Por otra parte, se ha demostrado que la selección sexual en anuros es a menudo mayor en los cantos que en la coloración (Dreher y Pröhl, 2014), sin embargo no se podría descartar la posibilidad de que la selección sexual estuviese actuando también en los patrones de coloración para estos dos clados, produciendo de esta manera morfos específicos para el reconocimiento de especies.
Conclusiones
Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum, han sido consideradas hasta ahora dos especies de ranas con una gran variabilidad fenotípica y un amplio rango de distribución. Mis análisis demuestran que de hecho nos encontramos ante un complejo conformado por ocho linajes evolutivos independientes, algunos de los cuales difieren en su morfología y sus cantos de anuncio y territorio. Los patrones de coloración y cantos de anuncio en anuros son importantes para el aislamiento reproductivo y la delimitación de las especies, y los resultados de este estudio han demostrado que la selección sexual está afectando de distinta manera a cada uno de estos rasgos en cada linaje independiente. Además, pude determinar que las poblaciones de la Amazonía ecuatoriana difieren en su historia evolutiva de las poblaciones conespecíficas de Requena en Perú. Finalmente, encontré una correlación positiva entre la
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diversidad fenotípica y la diversidad genotípica en los tres linajes principales de este estudio, lo que sugiere que existe una relación entre la historia demográfica de los clados y su diversidad fenotípica y genética que merece ser explorada más a fondo.
Por otro lado, la mayoría del muestreo se limitó a varias localidades del Ecuador, Perú, y Guyana Francesa y pocas localidades del Brasil y Bolivia, así que es probable que existan más linajes independientes de los que se han encontrado en este estudio. Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de llevar a cabo estudios sistemáticos a gran escala de los anfibios amazónicos para lograr una comprensión más realista de su diversidad y evolución.
Agradecimientos
Agradezco a Borja Milá, director de la disertación, y a Santiago Ron por darme la confianza y oportunidad de realizar este trabajo y compartir sus valiosos conocimientos conmigo. También agradezco a Rafael Márquez, Ignacio de la Riva, Mario García-París, Noemí Goicochea y Pau Alexaindre por sus valiosas sugerencias y aporte en la elaboración de este trabajo. A Liliana Jaramillo y Gabriela Castillo del Laboratorio de Biología Molecular del QCAZ por su colaboración. A Martin Jansen, Antoine Fouquet, Jean-Pierre Vacher, Pablo Venegas, Germán Chávez, Andrew Chek, William Duellman, Steffan Reichle y Philippe Gaucher por el préstamo de tejidos, grabaciones de los cantos y fotografías de los especímenes. A mis padres, a Stephany Torres, Hamid Ghanavi, Pilar Ochoa, Guillermo Friis y Diushi K'eri por sus consejos, apoyo y enseñanzas, los cuales han sido de mucha utilidad en la elaboración de este trabajo y en mi vida personal. Finalmente quedo agradecido al Ministerio de Ambiente del Ecuador por los permisos de colección, a la Pontificia Universidad Católica del Ecuador, al Museo Nacional de Ciencias Naturales (MNCN) y especialmente a la Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT) por el financiamiento de mis estudios y de esta investigación.
Bibliografía
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