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Nuestra identidad es la expresión de nuestra cultura, que depende de nuestras creencias. Nuestras creencias enfatizan ideas, ideas que son propuestas en base a la observación del entorno,
identificando así a cada uno de los elementos que lo caracterizan y nos hacen únicos:
¿Quiénes somos si desconocemos nuestros recursos?
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CONTENIDO DEDICATORIA I AGRADECIMIENTOS II I INTRODUCCIÓN……… 1 II ANTECEDENTES……… . 3 2.1. Biología de las especies……….. 3
2.1.1. Clasificación taxonómica de P. sulphuraria y P. mexicana………... 3
2.1.2. Nombres comunes………. 4
2.1.3. Sinónimos………... 5
2.1.4. Estado de conservación……….. 5
2.1.5. Distribución geográfica……….. 5
2.1.6. Hábitats……….…….. 7
2.2. Citotaxonomía y marcadores genéticos………... 8
2.2.1. Cariotipos……….... 8
2.2.2. Citotaxonomía del género Poecilia………... 9
2.2.3. Marcadores moleculares………. 10 2.2.4. Microsatélites………. 11 III JUSTIFICACIÓN... 13 IV OBJETIVOS... 14 V HIPOTESIS... 15 VI LITERATURA CITADA………... 16 VII ARTÍCULO... 27
VIII NORMAS EDITORIALES... 57
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I DEDICATORIA
A los que están aquí en presencia:
María del Socorro Alpuche Sánchez Mariel Azul D´artola Barceló Lucia Barceló Calao Jidé Raquel Cordova Moscoso
A los que están aquí en esencia
Irlanda Elizabeth Barceló Fuentes† América Fuentes Durán†
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II AGRADECIMIENTOS
Este trabajo de investigación fue un esfuerzo, en el que directa e indirectamente, participaron distintivas personas y en diferentes acciones, por eso agradezco a: quienes me enseñaron, quienes leyeron y criticaron, quienes me tuvieron paciencia, quienes me animaron, quienes me apoyaron, quienes estuvieron conmigo en momentos críticos; en fin, a todos aquellos quienes formaron parte de esta significativa etapa de formación, y que con justa razón deben de ser mencionados.
En primer lugar, agradezco a mis asesores: Dr. Lenin Arias Rodriguez y M. en C. Salomón Páramo Delgadillo. Por su constante apoyo en la realización de esta investigación, por sus innumerables consejos, llamados de atención; singularmente, por haberme permitido accesar a sus cubículos y laboratorios las 24 horas del día, y a los cuales pude considerar como mi segundo hogar.
Específicamente, agradezco al Dr. Lenin por la invitación para formar parte de este proyecto de maestría, por la paciencia dirigida a mi persona, por las constantes discusiones enfocadas al presente trabajo. Además, por demostrar que en unos pocos metros cuadrados se pueden realizar esfuerzos dignos de investigación.
A mi co-asesor, el M. en C. Salomón, y siempre considerado; “profe Salo”, quien me asignó el espacio de meditación y pensamiento, donde redacté la mayor parte de este documento: “mi escritorio”. Agradezco los incontables momentos de cuestionamientos y discusión, que me permitieron reflexionar sobre el proceso de planeación en investigaciones.
A la Dra. Luisa Cámara, nuestra jefa de posgrado, por todo el apoyo brindado y su cabal compromiso para con todas las generaciones. Y en la misma área, agradecer infinitamente a nuestra ex-secretaria de posgrado, a la Lic. Julia Aldecoa, por su excelente desempeño y tolerancia para cada uno de nosotros estudiantes, persona quien detrás de un aviso o solicitud siempre tuvo una solución en nuestras situaciones críticas.
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III
Por el magnífico ejercicio docente de mis profesores de posgrado: el Dr. Stefan Louis Arriaga, Dr. Rangel, Dr. Lenin, M. en C. Salomón, Dr. Alfonso y Dr. Wilfrido.
A mis sinodales: Dr. Alfonso, Dr. Wilfrido, Dr. Lenin, M. en C. Gabriel y Dra. Jeane, por el trabajo de revisión que realizaron en este documento.
Por la colaboración de nuestros amigos profesores en el paper resultante de esta investigación: Dr. Michael Tobler, Dr. Martin Plath, Dr. Ingo Schlupp, Dr. Francisco Javier García de León y Dra. Jeane Rimber Indy.
Al CONACYT por su programa de apoyos a estudiantes de posgrado, por el cual me permitió obtener la beca de manutención.
A la coordinación de Investigación y Posgrado, como también a la Dirección de Investigación y Posgrado, por autorizar y apoyar mi estancia de posgrado en el Laboratorio de genética para la Conservación del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, en la ciudad de La Paz, Baja California Sur. De igual manera, agradezco al Dr. Francisco Javier García de León (responsable del laboratorio antes mencionado), por aceptarme en su laboratorio. A mis instructores de laboratorio: M. en C. Sarahí Esquivel y al Dr. Miguel, a los que admiro por sus amplias capacidades laborales como de enseñanza, no tengo duda que formarán excelentes recursos humanos. A todos mis compañeros del mismo laboratorio: Daniel, Fausto, Thania, Carolina, David; como de laboratorios vecinos, Susy. Y singularmente a mi estimado amigo Emiliano Salinas, mi roommate, que con su singular personalidad hizo de mi estancia lo más amena posible.
Tocando el tema de laboratorios, agradezco también, a todos mis compañeros pertenecientes al Laboratorio de Acuicultura Tropical de la DACBiol y quienes me apoyaron, especialmente a Elías Sánchez y Leonardo Serafín.
A la maestra Arlette Franyutti, ex –jefa de Laboratorio de Acuicultura Tropical, quien me permitió trabajar hasta deshoras de la noche.
A las profesoras: Perla del Carmen Rodríguez Manríquez y Gladys del Carmen Medina Morales, ex – jefas de Biblioteca de DACBiol, por permitirme trabajar en el área de hemeroteca.
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IV
A los responsables del Laboratorio de Docencia, Otilia Evia Michel, Silvestre Carreras Martínez, Moisés Castro Cervantes y Sergio Muñoz Mosqueda, por el excelente servicio y trato para el acceso a reactivos y equipos de laboratorio.
A los vigilantes Don Luis Alberto Guzmán Chablé, Don Inés León Antonio y Don Jesús Hernández Suárez, por su ardua labor en la supervisión de seguridad en las instalaciones de la DACBiol y por los momentos de compañía.
Al Ing. Roque Huerta Acosta, por permitirme colaborar y de la manera más cordial con su grupo de trabajo del CBTA No. 199.
Al Dr. Francisco Corella Justavino, por su valiosa amistad y aprecio, por sus consejos y excelente trato.
A Doña Margarita Moscoso por el apoyo brindado durante parte de este trabajo.
A mi madre “Cocó” por el sustento ejercido a mi beneficio por el que contribuyó en gran medida para alcanzar el término de esta etapa.
A mí tía Lucia Barceló, por el apoyo incondicional que siempre ha demostrado.
A mi amada Jide, por su comprensión, tolerancia, dedicación, cuidado y auxilio. Por estar a mi lado día y noche, calmando mis desesperaciones y enojos, por darme tu tiempo y felicidad, te lo agradezco.
En fin, agradezco a cada uno de las personas quienes contribuyeron a la realización de este esfuerzo que significó sacrificios y al mismo tiempo trajo consigo alegrías y nuevas oportunidades, a todos ustedes, muchas gracias.
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1 I. INTRODUCCIÓN
La amplia biodiversidad de las regiones tropicales, ha motivado discusión y preguntas importantes que han de responder su origen y futuro, considerándolas como la cuna de la biodiversidad mundial. Debido a dicho atributo, el “Grupo de Países Megadiversos Afines” formado el 18 de febrero del 2002, mediante la “Declaración de Cancún”, ha clasificado a distintos países como “megadiversos”, dentro de los cuales, México forma parte, y junto con Brasil y Colombia, poseen del 50% al 80% de toda la biodiversidad del planeta (Mittermeier, 1988).
La fauna de vertebrados terrestres de Canadá, los Estados Unidos de Norte América y sus territorios (incluyendo islas en otros continentes), suman un total de 2,187 especies. Mientras que la fauna de vertebrados de México es estimada aproximadamente en 3,032 especies en una superficie comparativamente mucho más pequeña (Flores & Geréz, 1994). Sin embargo, la importancia de México destaca por el número total de especies y por los porcentajes de endemismo (Ramírez-Pulido et al. 1996), en el que la fauna mexicana de
vertebrados endémicos es calculada en el 32% (Toledo, 1988).
La información citada por Espinosa-Pérez & Daza-Zepeda (2005), Flores & Geréz (1994); establece que el 82% de los órdenes de peces registrados en el mundo se encuentran en México, pertenecientes a 206 familias, correspondiendo aproximadamente a 2,628 especies, de las cuales 506 representan la ictiofauna dulceacuícola, 375 marinas continentales y el resto marinas oceánicas. De estos, los números calculados de especies endémicas todavía no es claro, pero se estima entre un rango de 200 a 300 especies, haciendo notar endemismos a lo largo de todo el país (Contreras-Balderas, 1969; Álvarez del Villar, 1970; Hubbs, 2003 y Miller et al. 2005).
Refiriéndose al sureste mexicano, el estado de Tabasco alberga a dos especies endémicas de poecilidos adaptados a ambientes extremos, específicamente, aguas sulfurosas, y son Poecilia sulphuraria y Gambusia eurystoma, únicos representantes de la ictiofauna del arroyo el Azufre en el municipio de Teapa (Álvarez del Villar, 1948; Miller, 1975; Tobler et al. 1998 y Tobler & Plath, 2009). Recientemente fue descubierta una nueva
población de P. sulphuraria en un complejo de manantiales en Chiapas llamado “Ojos del
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Azufre” (Tobler & Plath 2009, Tobler & Plath 2011), por lo que esta especie endémica es compartida entre los estados de Tabasco y Chiapas.
Colindante al arroyo El Azufre, río arriba en dirección al sureste, se encuentra establecido el arroyo Ignacio Allende (arroyo de agua dulce), donde habitan de manera aislada una comunidad más diversa de peces, que incluyen a cíclidos, siluriformes, carácidos y poecílidos (Tobler et al. 2008; D´artola, 2009), y en este último grupo, se deriva Poecilia mexicana como único integrante del género Poecilia en arroyo Ignacio Allende.
De igual manera, P. mexicana también se encuentra en la última sección del río El azufre justamente antes de concurrir con el arroyo El Azufre, por lo que hipotéticamente hablamos de dos poblaciones aisladas tanto de P. mexicana como P. sulphuraria en el sistema fluvial Ignacio Allende-El azufre. Cabe señalar, que el área que comprende este sistema fluvial es de aproximadamente 10 km2, es decir, el 0.039% de la superficie total de
Tabasco y el 0.013% de la superficie de Chiapas, por lo que la distribución puntual de P.
sulphuraria es una de las características que la sujetan como especie en peligro de extinción
de acuerdo a la NOM-059-SEMARNAT-2010.
En dicha condición, los estudios genéticos pueden aportar elementos importantes que describan el estado genético y fundamenten la historia evolutiva de las especies, proporcionando información referente a su relación, variabilidad genética y morfología cromosómica entre otros; mismos que contribuyen a la resolución de problemas con grupos taxonómicamente complejos, al diseño de programas de crianza en cautiverio, a la comprensión de sistemas de reproducción natural, detectando la diversidad genética dentro y entre poblaciones geográficas, manejando el flujo genético y comprendiendo los factores que contribuyen a la adecuación de especies (Vrijenhoek, 1998). Con todos estos conocimientos lograr la conservación de la especie.
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3 II. ANTECEDENTES
2.1. BIOLOGÍA DE LAS ESPECIES 2.1.1. Clasificación taxonómica
La ubicación taxonómica de los poecilidos estudiados siguiendo los criterios de Miller et al. (2005) y Nelson (2006). Reino: Aniimalia Phylum: Chordata Subphylum: Craniata Grado: Pisces Superclase: Gnathostomata Clase: Actinopterygii Subclase: Neopterygii División: Teleostei Subdivisión: Euteleostei Superorden: Acanthopterygii Orden: Cyprinodontiformes Familia: Poeciliidae Género: Poecilia
Especie: Poecilia mexicana
Poecilia sulphuraria
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4 2.1.2. Nombres comunes
La especie P. mexicana es conocida generalmente como topote del Atlántico (Nelson et al. 2004), Atlantic Molly (Robins et al. 1991) y Shortfin Molly (Greenfield y Thomerson, 1997; Bussing, 1998; Nelson et al. 2004). En el caso de P. sulphuraria, se reconoce a la especie comúnmente con los nombres: topote de Teapa (Nelson et al. 2004), Molly del Teapa (IUCN, 1990; Hilton-Taylor, 2000) y Sulphur Molly (Nelson et al. 2004).
Tabla 1. Listado de nombres comunes para P. mexicana y P. sulphuraia (Froese & Pauly 2012) Especie Nombre común País Idioma Tipo de nombre Referencia
P. mexicana Atlantic molly USA Inglés Vernacular Robins et al. 1991
Fo-vai Samoa Samoan Vernacular Wass 1984
Hulemolly Dinamarca Danés Vernacular Carl 2003
Höhlenmolly Alemania Aleman Vernacular Baensch & Riehl 1995
Meksikonmolli Finlandia Finlandés Vernacular Varjo et al. 2004
Mexikansk molly Dinamarca Danés Vernacular Carl 2003
Mexicomolly Alemania Aleman Vernacular Baensch & Riehl 1995
Olomina Costa Rica Español Vernacular Bussing 1998
Orangefin molly USA Inglés Vernacular Robins et al. 1991
Shortfin molly Belize Inglés Vernacular Robins et al. 1991
Shortfin molly Costa Rica Inglés Vernacular Bussing 1998
Shortfin molly Mexico Inglés AFS Nelson et al. 2004
Shortfin molly USA Inglés AFS Nelson et al. 2004
Topote del Atlántico Mexico Español AFS Nelson et al. 2004
短鰭花鮰(短帆鮰) China Main Chino mandadrín Vernacular Wu et al. 1999 短鳍花鮰(短帆鮰) China Main Chino mandadrín Vernacular Chinese Academy of Fishery Sciences 2003.
P. sulphuraria Molly del Teapa México Español Vernacular IUCN 1990
Molly del Teapa Reino Unido Ingles Vernacular Hilton 2000
Rikkimolli Finlandia Finlandés Vernacular Varjo 2004
Sfchwefel-Molly Alemania Aleman Vernacular Baensch & Riehl 1995
Sulphur molly México Inglés AFS Nelson et al. 2004
Svovlmolly Dinamarca Danés Vernacular Carl 2003
Topote del Teapa México Español AFS Nelson et al. 2004
野花鮰 China Main Chino mandadrín Vernacular Wu et al. 1999
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5 2.1.3. Sinónimos
Tabla 2. Listado de nombres sinónimos de P. mexicana y P. sulphuraia (Froese & Pauly 2012)
Especie Sinónimo Autor Valido
Poecilia mexicana Mollienisia sphenops non Valenciennes, 1846 No
P.cuneata Garman, 1895 No
P. limantouri Jordan & Snyder, 1899 No
P. mexicana Steindachner, 1863 Si
P.Mexicana mexicana Steindachner, 1863 No
P. sphenops (non Valenciennes, 1846) No
Poecilia sulphuraria M. sulphuraria Álvarez, 1948 No
P. sulphuraria Álvarez, 1948 Si
Estado de conservación
El Topote del Atlántico P. mexicana es una especie aun no evaluada por la IUCN por lo que aún no presenta un estado de conservación. Sin embargo, esta especie probablemente pueda corresponder a la categoría de “riesgo menor”, debido a su amplía distribución, además de ser considerada como plaga potencial (Courtenay & Hensley 1980).
El Topote de Teapa P. sulphuraria se encuentra considerada como una especie amenazada en peligro crítico de acuerdo a la IUCN. Debido a la escases de información de la especie, es desconocido el impacto ecológico que realiza sobre el ecosistema.
Distribución geográfica
La familia se distribuye desde altitudes bajas del este de Estados Unidos de América hasta el noreste de Argentina y las Antillas; como también en África y Madagascar (Miller
et al. 2005; Nelson, 2006)
De acuerdo a Álvarez del Villar (1974), la familia Poeciliidae en México estaba compuesta por nueve géneros de los cuales Poecilia estaba constituida por siete especies: P.
reticulata, P. latipuncata, P. sulphuraria, P. sphenops, P. velifera, P. latipinna y P.
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6 formosa. Al paso de los años fueron descubiertas nuevas especies como el necesario
reordenamiento de algunas de ellas, actualmente en México se encuentran 14 especies, P.
butleri, P. catemaconis, P. chica, P. formosa, P. latipinna, P. latipuncata, P. maylandi, P. mexicana, P. orri, P. petenensis, P. sphenops, P. sulphuraria, P. velífera (Miller et al.
2005) y P. thermalis (Palacios et al. 2013).
La distribución de P. mexicana abarca desde la parte baja de la cuenca del río Bravo (ríos Álamo y San Juan) hacia el este dentro de Costa Rica; dentro de los estados de Campeche, Chiapas, Hidalgo, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz, Yucatán. En la vertiente del pacifico, en la parte alta de la cuenca del Río Choluteca, Honduras y en la cuenca del río Lerma (Miller et al. 2005).
En contraste, P. sulphuraria es una especie endémica de la cuenca Grijalva-Usumacinta (Espinosa et al. 1993) compartida entre los estados de Tabasco (Espinoza y Daza 2005, SEDESOL 1994), y Chiapas (Velasco 1976, Lozano & Contreras 1987, Rodiles et al. 2005) que habita arroyos provistos de manantiales de azufre que nacen de la falda septentrional del cerro de Iztapangajoya (Rovirosa 1890) y es llamado Arroyo El Azufre. El arroyo se encuentra ubicado dentro del balneario particular llamado “Baños del Azufre” a 12 km al oeste del municipio de Teapa, Tabasco (Álvarez del Villar 1948, Espinosa et al. 1993; Miller et al. 2005) siendo esta, la primera población registrada por Álvarez del Villar en 1948. Las aguas sulfurosas descritas corren a través de los prados artificiales del Azufre en la dirección del N.O.; reciben por ambos lados diversos tributarios de aguas potables y forman un riachuelo, conocido con el nombre de Río Blanquillo, afluente del Ixtacomitán. Desde su nacimiento hasta su confluencia sirve de línea divisoria entre Tabasco y Chiapas (Rovirosa 1890).
Actualmente, es reportada una segunda población de P. sulphuraria en Iztapangajoya, Chiapas al suroeste de Baños del Azufre en un complejo de manantiales llamado “Ojos del Azufre” (Tobler & Plath 2009), estos se encuentran inmersos en un arroyo que concurre con Arroyo EL Azufre a una distancia de más de tres km en dirección al norte. Por lo tanto, ambas poblaciones se encuentran conectadas.
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7 Hábitats
El Topote del Atlántico P. mexicana es una especie encontrada comúnmente en la vertiente del Atlántico. Su amplía plasticidad ambiental la ha llevado a colonizar gran variedad de ecosistemas acuáticos como: lagunas costeras, estuarios, estanques, ríos de tierras bajas, arroyos de tierras altas, en remansos y rápidos someros; parece preferir fondos de roca cubiertos de con una rica capa de algas filamentosas, diatomeas protozoarios y vegetación en descomposición, pero también es común sobre lodo, limo, arena y guijarros; el agua puede ser clara o bien muy turbia o lodosa. Consiguientemente, puede tolerar agua salada (Castro-Aguirre & Mora-Pérez 1984), salobre y dulce (Miller et al. 2009), como también agua sulfurosa (Gordon & Rosen 1962).
El Topote de Teapa P. sulphuraria habita particularmente manantiales de aguas sulfurosas y sus afluentes; estando presentes en aguas claras y lechosas (Miller et al. 2009), tolerando concentraciones de sulfuro de 530 µM (Tobler et al. 2008). Habitualmente es encontrada en corrientes moderadas a casi nulas. En los manantiales con corrientes nulas, se encuentran presentes algas verdes, sin embargo, la vegetación es virtualmente ausente cuando existen corrientes moderadas.
Uno de los componentes florísticos de la vegetación riparia de los arroyos de aguas sulfurosas es el árbol de hule, siendo evidente la mayor abundancia de esta especie en Ojos del Azufre, Iztapangajoya, Chiapas.
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8 CITOTAXONOMÍA Y MARCADORES GENÉTICOS
Cariotipos
La citogenética es el estudio de la estructura, función y evolución de los cromosomas, siendo usado como herramienta de análisis “los cariotipos” para establecer diagnósticos de genéticos de organismos y/o poblaciones.
Un cariotipo es la caracterización del complemento cromosómico, en otras palabras, la descripción de las características físicas de los cromosomas como son la forma, cantidad, tamaño, ubicación de centrómero, presencia de brazos, etc, plasmando a cada uno de ellos en una imagen ordenándolos sistemáticamente de modo decreciente en función de su longitud.
Los estudios citogenéticos dieron la razón y evidencias en la medicina clínica para demostrar que las aberraciones cromosómicas son responsables de distintos síndromes (Smeets 2004, Silva et al. 2008), como demostró la trisomia del cromosoma 21 o mejor conocido como síndrome de Down (lejeune et al 1959), la monosomía del cromosoma X o síndrome de Turner (Ford et al. 1959), la aneuploidía de cromosomas sexuales ne el caso del síndrome de Klinefelter (Jacobs & Strong 1959), la trisomía del cromosoma 13 o síndrome de Patau (Patau et al. 1960), la trisomía del cromosoma 18 o síndrome de Edwards (Edwards et al. 1960).
Los estudios citogenéticos han sido uno de los métodos más utilizados por los genetistas para estudiar los cambios en los cromosomas a través de la evolución de diversos organismos, trayendo como resultado la determinación de relaciones de parentesco y la elaboración de arboles filogenéticos (Lorenzo et al. 2003). El establecimiento de filogenias ha tenido como resultado la comprensión de los procesos evolutivos y sus mecanismos dentro de muchas especies icticas (Birstein et al. 1997, Daniel-Silva et al. 2005)
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9 Citotaxonomía del género Poecilia
Los estudios de citogenética referentes al género Poecilia han demostrado que las características cariotípicas del taxón destacan por presentar el número modal diploide de 2n=46, condición que es expresada por diversas especies como: P. latipinna (Sola et al. 1990, Sola et al. 1993, Donsakul et al. 2011), P. formosa (Drewry 1964, Schultz & Kallman 1968, Prehn & Rasch 1969, Sola et al. 1992, Galetti Jr & Rasch 1993), P. velífera (Nanda et al. 1993), P. reticulata (Nanda et al. 1993, Donsakul et al. 2011), P. sphenops (Nanda et al. 1993), P. mexicana mexicana (Sola et al. 1992b), P. wingei (Donsakul et al. 2011) y siendo común en condición meiótica presentar n=23 (Wickbon 1943, Prehn & Rasch 1969, Post 1965, Schultz 1967, Nanda et al. 1993 ) Sin embargo, se han reporta variaciones en la cantidad de cromosomas meióticos n=24 en algunas especies tales como
P. melanogaster, P. latipinna y P. sphenops (Post 1965). Se ha reportado la presencia de
cromosomas sexuales únicamente en P. reticulata y P. sphenops (Nanda et al. 1993). De igual manera, se han identificado cromosomas supernumerarios al complemento cromosómico común, es decir, cromosomas extras derivados del complementa cromosómico “A” y llamados cromosomas “B” (Jones & Rees 1982), esto para la especie
P. formosa (Sola et al. 1993, Nanda et al. 2007), presentando además expresan diferentes
citotipos, desde 2n=46 (Drewry 1964, Schultz & Kallman 1968, Prehn & Rasch 1969, Sola
et al. 1992, Galetti Jr & Rasch 1993) como también 3n=69 (Prehn & Rasch 1969, Rasch et al. 1970, Galetti Jr & Rasch 1993), 4n=92 (comprobado mediante determinación de flujo
citométrico, Lampert et al. 2008) (Tabla 1).
Sp Número de cromosomas Referencias
n 2n 3n
P. formosa 23 46 69 Galetti & Marie 1993
P. formosa 46+m Lamatsch et al. 2004
P. formosa 46 Sola et al. 1996
P. formosa 46+m Nanda et al. 2007
P. formosa 46 69 Prehn & Rasch 1969
P. velifera 23 Nanda et al. 1993
P. reticulata 23 incluyendo sex Nanda et al. 1993
P. sphenops 23 incluyendo sex Nanda et al. 1993
P. reticulata 46 Donsakul et al. 2011
P. wingei 46 Donsakul et al. 2011
P. latipinna 46 Donsakul et al. 2011
P. sphenops mellanistica
46 Haaf & Schmid 1984
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P. caudofasciata 23 46 142 Wickbon 1943
P. formosa 46 69 146 Prehn & Rasch 1969
P. latipinna 23 46 146 Prehn & Rasch 1969
P. latipinna 24 83, Post 1965
P. latipunctata 23 146 Prehn & Rasch 1969
P. melanogaster 24 83 Post 1965
P. Mexicana 23 46 146 Prehn & Rasch 1969
P. reticulate 23 46 83,148 Post 1965. Schultz
1967.
P. sphenops 23 46 142, 146 Wickbon 1943.
Prehn & Rasch 1969
P. sphenops 24 83 Post 1965
P. velifera 23 46 83, 142, 146
Post 1965. Wickbon 1943. Prehn & Rasch 1969
Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos de la biología como evolución, ecología, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de diversidad. Además se utilizan para localizar y aislar genes de interés. En la actualidad existen varias técnicas moleculares que nos permiten conocer cómo se encuentran las proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, como con los análisis de proteínas, o de manera directa con estudios de ADN.
Las técnicas moleculares permiten estudiar polimorfismos en el ADN, origen de toda la variación genética, y constituyen por tanto una aproximación más fiable para determinar las diferencias entre variedades o especies. Además evitan problemas asociados con influencias medioambientales, factores fisiológicos y expresión específica de tejido y desarrollo.
Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Un marcador molecular debe reunir una serie de características para maximizar su utilidad (Cheng & Crittenden 1994)
a) Buena distribución a lo largo del genoma b) Alto grado de polimorfismo
c) La técnica para analizar el marcador debe ser rápida y práctica d) Debe poder repetirse con fiabilidad en otros laboratorios
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El monitoreo genético es lo ideal en un programa de reproducción cuya finalidad es la conservación genética (ej. repoblamiento). Para esto, los marcadores moleculares son una herramienta realista y útil para la investigación y el monitoreo de la condición genética en poblaciones nativas y en lotes mantenidos en cautiverio (Alam & Islam, 2005).
Los diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples y son de tipo dominante o co-dominante (Simpson, 1997).
Microsatelites
Los marcadores específicos de secuencia requieren un conocimiento previo de las secuencias de ADN que flanquean al segmento de interés para el diseño de los cebadores o primers (Danzmann y Gharbi, 2001). Esta condición supone al mismo tiempo la principal ventaja y desventaja de este tipo de marcadores, puesto que incrementa su especificidad, pero también su coste. Marcadores de este tipo son los ya mencionados SNPs y los microsatélites.
Los microsatélites consisten en múltiples repeticiones dispuestas en tándem de una secuencia simple que puede variar en tamaño desde 1 a 6 pares de bases (pb). Las formas más comunes de estos motivos de repetición son dinucleótidos tales como (CA)n: (GT) n, (GA) n: (CT) n, (CG) n: (GC) n, (AT) n: (TA)n, donde n es el número de repeticiones. En una serie en tándem, este número es variable, pudiendo dar lugar a una gran cantidad de alelos para cada locus microsatélite en una población.
Además de su potencial polimórfico, los microsatélites reúnen una serie de características que los han convertido en marcadores de preferencia para el mapeo génico: i) son numerosos y se distribuyen ampliamente a lo largo de todo el genoma,
particularmente en peces se ha estimado que su frecuencia es de 1 cada 10 kb (Wright, 1993)
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ii) se heredan de modo mendeliano como marcadores codominantes, lo que facilita el seguimiento de su transmisión dentro de las poblaciones de mapeo (O´Connell y Wright, 1997);
iii) son abundantes en todos los genomas eucariotas estudiados hasta la fecha (Hamada et al. 1982; Tautz & Renz, 1984; Echt & Nelson, 1997; Liu & Cordes, 2004);
iv) la mayoría de los loci microsatélite tienen un tamaño relativamente pequeño que facilita su caracterización vía PCR (Liu & Cordes, 2004);
v) son potencialmente transferibles entre linajes y/o especies próximas (Young et al. 1998; Estoup & Angers, 1998), especialmente cuando el locus microsatélite se encuentra dentro de una secuencia génica (Pardo et al. 2005; Nagy et al. 2007). Esta última característica los hace especialmente útiles para estudios de genómica comparada, ya que convierte a los microsatélite en excelentes puntos de anclaje para identificar cromosomas homólogos entre especies próximas (Kondo et al. 1993; Crawford et al. 1995; McConnell et al. 2000; Sakamoto et al. 2000) o respecto a especies modelo bien conocidas a nivel genómico (Stemshorn
et al., 2005; Franch et al. 2006).
Los microsatélites han tomado ventaja sobre otros marcadores genéticos como los AFLPs yRAPDs debido a que: i) tienen el más alto grado de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) se encuentran en grandes cantidades y están uniformemente espaciados a lo largo del genoma y iv) son selectivamente neutros (Eguiarte
et al. 2007).
Los microsatelites han sido utilizados fundamentalmente para:
Estudios de variación genética intra e interespecífica, análisis de linajes y de sistemas reproductivos, definir unidades de manejo, estimar el tamaño poblacional efectivo, determinar el origen de la población o individuos, entre otros (Hedrick 2004; Foerster et al. 2006; Crawford et al. 2008).
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13 III. JUSTIFICACIÓN
La topota del azufre P. sulphuraria está incluida en la lista de especies con alto riesgo por la IUCN y la Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-2001 (Apartado II). La urgente necesidad de protección de la especie antes señaladas está relacionada con la carencia de estudios de biología y genética básica debido primordialmente a que solo existen los estudios taxonómicos desde su descripción original P. sulphuraria y más recientemente el estudio de tolerancia a la toxicidad de aguas sulfurosas realizado por Tobler et al. (2008, 2009). Mientras tanto, el conocimiento del resto de aspectos de biología y genética continúan como una incógnita que es importante discernir con el propósito de establecer criterios, estrategias de manejo y conservación de las topotas del arroyo el azufre en Teapa, Tabasco, México.
Por otro lado, el aislamiento que presentan ambas localidades de P. mexicana marcan a esta misma como una población de interés, donde los resultados de las frecuencias alélicas y características cariotípicas pueden arrojar información valiosa respecto al estado genético de ésta, que comparando con P. sulphuraria puedan demostrar sus posibles orígenes, parentescos y similitudes entre ambas especies, y que además, debido a la influencia antropogénica negativa y a los pocos esfuerzos de preservación hacen propensas a la extinción de la ictiofauna del sistema fluvial en estudio.
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14 OBJETIVOS
Objetivo general:
Establecer el cariotipo típico de P. mexicana y P. sulphuraria y determinar el grado de variación genética para ambas especies.
Objetivos particulares:
1) Determinar el número modal diploide de cromosomas de P. mexicana y P. sulphuraria.
2) Determinar el cariotipo típico de P. mexicana y P. sulphuraria.
3) Establecer la variación genética de los cariotipos de P. mexicana y P. sulphuraria. 4) Realizar una prueba cruzada de PCR empleando los microsatélites desarrollados
para P. formosa.
5) Establecer el grado de variación genética de los microsatélites que amplifiquen.
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15 HIPÓTESIS
P. mexicana posee la plasticidad fenotípica para sobrevivir en ambientes sulfurosos, y tal es
el caso de la población presente en la “Cueva de la Sardina” y los arroyos adyacentes de aguas sulfurosas, como también de aguas dulces y salobres
Ha sido comprobado la ocurrencia de diferencias genéticas y fenotípicas en organismos de
P. mexicana residentes de arroyos dulceacuícolas y sulfurosos colindantes a la Cueva de la
sardina, demostrando que estas mismas diferencias son producidas en organismos de distintas cámaras dentro de la caverna, clasificándolos en poblaciones aisladas, y por lo tanto realizándose eventos de diferenciación genética por aislamiento y flujo genético casi nulo, cumpliendo con una las características que propician la formación de especies endémicas que se especializarán en este caso a un medio sulfuroso. Así, las variaciones que se produzcan en el material genético (ya sean mutaciones puntuales o cromosómicas) durante la división celular y la segregación cromosómica en poblaciones aisladas que interactúan con diferentes factores bióticos y abióticos, posiblemente perpetuarán en nuevas razas cromosómicas, y si la variación o carácter mutante puede ser heredado a todos los descendientes, este se fijará en la especie o población, siempre y cuando favorezcan la sobrevivencia y reproducción de los individuos.
Por lo tanto, es de asumir que P. sulphuraria haya especializado de la población de P.
mexicana establecida en el arroyo Ignacio Allende, por lo que la constitución alélica de P. sulphuraria posiblemente diverja de P. mexicana como ocurre con la población
perteneciente a la Cueva de la Sardina (Plath et al. 2007), mientras que la morfología cromosómica pueda conservarse, sin embargo, el lugar de los loci puede variar entre ambas especies.
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27 Análisis genético en Poecilia sulphuraria y P. mexicana (Cyprinidontiformes: Poecilidae) basado en cariotipos y marcadores microsatelite
Alain Lois D´artola Barceló1, Francisco J. García de León2, Jeane Rimber Indy1††, Michael
Tobler3⁺, Martin Plath4, Salomón Páramo-Delgadillo1†††, Ingo Schlupp3⁺⁺ & Lenin
Arias-Rodriguez1*
1. División Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. (UJAT), C.P. 86150, Tabasco, México.
† [email protected], ††[email protected],
†††[email protected], *[email protected].
2. Laboratorio de Genética para la Conservación. Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.A. Baja California Sur, México. [email protected].
3. Department of Zoology, Oklahoma State University, Still Water, Oklahoma, USA. [email protected].
4. Department of Zoology, Oklahoma University, Oklahoma, USA. [email protected]. 5. Evolutionary Ecology Group, J.W. Goethe University Frankfurt am Main, Frankfurt, Hessen, Germany. [email protected].
* Autor de correspondencia
Abstract: Genetic analysis in Poecilia sulphuraria and P. mexicana (Cyprinidontiformes: Poecilidae) based in karyotypes and microsatellites markers.
We performed a genetic analysis of the endemic poeciliids P. sulphuraria y P.mexicana by
karyotypes and microsatellite markers. Eighty-nine specimens of P. Mexican and 70 of P.
sulphuraria were collected from two locations in the border region between the town of
Teapa south of Tabasco (Site I= Arroyo Ignacio Allende and Site II=Hacienda Los azufres) and from two places of Chiapas (Site III=Rio el azufre and IV=Rancho La Gloria) in
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southeastern Mexico. The karyotypes of both species were characterized by acrocentric elements with fundamental number (NF) of 46 chromosome arms. The average length of the diploid chromosome complement (DCC) from the karyotype of P. sulphuraria was 198±10.4 and 184±18.0 µm to Hacienda los Azufres and Rancho la Gloria respectively. While the DCC for P. mexicana was 167±9.36 and 167±10.19.5 µm which was corresponding to Arroyo Ignacio Allende and Río el Azufre. The comparison of the DCC showed significant differences (P=0.034) only between species and no differences were observed between locations, so the averaged DCC to P. sulphuraria of both locations (191.65 µm) was higher than that shown by the DCC of P. mexicana collects from both sites (167.45 µm). Regarding the five microsatellite markers used, the genotyping procedure let us observe in P. mexicana from one to two and from two to five specific alleles to the locality Arroyo Ignacio Allende and Rio el azufre respectively, common alleles were also observed from two to three. In the particular case of P. sulphuraria from Hacienda Los Azufres and Rancho la Gloria the specific alleles observed were from one to 11 and from one to three alleles respectively, it was observed also from one to five common alleles. The linkage disequilibrium analysis showed combinations of markers having significant values in both species and all studied localities. The results of the study show genetic variability between sites and species, which follow important effects from the genetic drift. Therefore, it is proposed that the study areas must be considered under protection in accordance with existing regulations by laws in Mexico.
Key words: P. sulphuraria, P. mexicana, karyotypes, microsatellites, Tabasco.
Los peces son un conjunto de animales ampliamente representados en México y en particular en el sureste de la república mexicana, de ellos los cíclidos y centropomidos son los grupos más distintivos de la región atendiendo principalmente a su importancia de carácter económico, no siendo ello una particularidad del grupo de peces al que pertenecen los poecilidos ya que son considerados de menor importancia. Sin embargo, en los últimos diez años se ha dado auge a la importancia biológica y potencial biotecnológico de los poecilidos que habitan fundamentalmente en el sur de Tabasco y el norte de Chiapas. Asumiendo su valor e importancia como peces modelo que pueden servir para dar mayor entendimiento a varios procesos evolutivos (Tobler & Plath 2011).
El género Poecilia en Tabasco y Chiapas está representado básicamente por cuatro especies: P. petenensis, P. velífera, P. mexicana y P. sulphuraria (Álvarez del Villar 1948,
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Miller et al. 2009) y últimamente después de su redescubrimiento a P. thermalis (Palacios
et al. 2013). Aunque también en la región se han registrado varias especies del genero Gambusia (Álvarez del Villar 1948, Miller et al. 2009) que han sido poco estudiadas.
La distribución de P. mexicana en México es la más amplia de todas las especies del género, abarcando del Golfo de México sobre la vertiente Atlántica hasta llegar a Costa Rica (Miller et al. 2009). Dada su amplia distribución, la especie ha colonizado múltiples ecosistemas, por ello se le ha ubicado en hábitats de tipo dulceacuícola, salobre (Miller et
al. 2009) y de aguas sulfurosas en varias localidades del sur de Tabasco y del norte de
Chiapas (Gordon & Rosen 1962, Álvarez del Villar 1948, Miller et al. 2009, Tobler & Plath 2009, Tobler & Plath 2011). Otras especies, que se les ha situado cohabitando pequeños oasis de aguas sulfurosas es P. sulphuraria y Gambusia eurystoma en Teapa, al este de Tabasco (Álvarez del Villar 1948, Miller et al. 2009). Recientemente muy cerca del sitio anterior, P. sulphuraria se ubicó en otro hábitat semejante en el rancho la gloria en Ixtapangajoya Chiapas (Tobler & Plath 2009, Tobler & Plath 2011). Los sitios que P.
sulphuraria habita en Chiapas están rodeados por el cerro de Ixtapangajoya que también se
caracteriza por pequeños arroyos dulceacuícolas que separan a manera de barreras biogeoquímicas los sitios de aguas sulfuras y viceversa (Fig. 1). Los arroyos de aguas sulfurosas reflejan escasa riqueza de ictiofauna y otros organismos que incluyen plantas; y animales parásitos (Tobler et al. 2008, Tobler & Plath 2009), mientras que el número de especies incrementa conforme las aguas sulfurosas se van disolviendo (cuando los arroyos de sulfuro se encuentran con un arroyo dulceacuícola o viceversa) hasta que se tornan completamente dulceacuícolas lo que ha posibilitado la presencia de P. mexicana y otras especies en el ecosistema (Tobler et al. 2008).
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En acuerdo con las particularidades que muestran el ecosistema donde P. sulphuraria y P.
mexicana habitan, hacen pensar en una barrera de tipo biogeoquímico o alopátrica que es
mediado por los arroyos de aguas sulfurosas y dulceacuícolas. Los estudios recientes de comportamiento reproductivo, translocación ambiental y genética por marcadores moleculares entre especies/hábitats han permitido hipotetizar que los obstáculos para que ocurra la hibridación están asociados particularmente a las barreras biogeoquímicas que han impedido las posibilidades de entrecruzamiento (Plath et al. 2007, 2010, Tobler et al. 2008). Sin embargo, hasta la fecha no se han realizado en P. sulphuraria y P. mexicana de las localidades señaladas estudios citológicos comparativos encaminados a la descripción de caracteres cariotípicos en número y forma cromosómica que permitan en combinación con marcadores microsatelites una mayor comprensión de la variabilidad genética compartida y especifica que guardan los especímenes de P. sulphuraria y P. mexicana que habitan en los sitios arriba señalados (Fig. 1) y que den bases para su conservación in situ.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de recolecta: Los sitios de recolecta se encuentran en los estados de Tabasco y
Chiapas, México (Fig. 1). Fueron recolectados 89 especímenes de P. mexicana en dos localidades: Sitio I=Arroyo Ignacio Allende, Teapa, Tabasco (46 organismos. 27 hembras y 19 machos). Sitio III=Rio El Azufre, Pichucalco, Chiapas (46 organismos. 36 hembras y 7 machos). También, se recolectaron 70 ejemplares de P. sulphuraria en dos localidades: Sitio II=Hacienda Los Azufres Teapa, Tabasco (40 organismos. 22 hembras y 18 machos). Sitio IV=Rancho La Gloria, Ixtapangajoya, Chiapas (30 organismos. 15 hembras y 15
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machos). La determinación taxonómica y el sexo de los especímenes fue basada en los caracteres taxonómicos señalados por Álvarez del Villar (1974) y Miller et al. (2005).
Análisis de citogenético: De los especímenes recolectados, fueron seleccionados 29 por
especie: P. mexicana (Sitio I= 8 hembras/8 machos. Sitio III= 7 hembras/6 machos) y P.
sulphuraria (Sitio II= 10 hembras/6 machos. Sitio IV= 7 hembras/6 machos). Estos fueron
inmersos en colchicina al 0.1% durante seis horas en recipientes con aireación suficiente e individualizados por sitio de recolecta. Posteriormente, fueron sacrificados por hipotermia y les fue extraído los arcos branquiales. Se prosiguió con el hidratado por 60 minutos de los tejidos después del disgregado cuidadoso en una solución de citrato de sodio al 1.0%. Subsiguientemente, se retiró la solución hidratante para fijar el tejido por 24 horas adicionando metanol a 4 ºC y ácido acético en proporción 3:1. Las muestras fueron centrifugadas y con recambios del fijador, varias veces a 6000 r.p.m. cada 10 min, hasta que presentaron apariencia blanquecina y después fueron mantenidas a 4 °C por un mes. El material fijado fue goteado a 1.70 m sobre una serie de portaobjetos previamente enfriados a 4 °C en alcohol etílico y secados con la flama de un mechero de alcohol; consecutivamente se incubaron por 24 horas a 45 °C. Las preparaciones cromosómicas, fueron teñidas por 60 min con giemsa al 10% que fue preparada con buffer de fosfato a pH=7.0 (Kligerman y Bloom 1977). Se analizaron las mejores dispersiones cromosómicas (campos mitóticos con cromosomas no traslapados) con los objetivos 10X y 40X y fueron fotodigitalizadas a 100X+1.25X del optovar del microscopio AxioScope-A1, con la AxioCam ERc5s y el programa ZEN/2011 (Carl Zeizz® microscopy GmbH, 2011). El número cromosómico modal diploide, se estableció como el número de cromosomas que mostró la mayor frecuencia en condición mitótica. Para armar el cariotipo fueron
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seleccionados cuatro de las mejores metafases de cada especie/localidad (dos hembras y dos machos) y los brazos q (brazo largo) de cada cromosoma fue medido en micrómetros (µm) con el programa ZEN/2011 (Carl Zeizz® microscopy GmbH, 2011). Mientras que los cromosomas individuales, fueron recortados con el programa Photoshop CS 8.0.1 (Adobe®) y estos fueron insertados en base en su longitud para ordenar el cariotipo con las herramientas de dibujo del programa Microsoft Word 2011©.
Se calculó el valor promedio, la desviación estándar y la longitud relativa de cada par de cromosomas [longitud en µm de cada par de cromosomas q/longitud en µm total del complemento cromosómico diploide (100)].). Se estableció el número fundamental (NF) conforme al número de brazos cromosómicos del complemento cromosómico diploide. Los datos de las medidas promedio de cada par cromosómico (en µm) de los cariotipos fueron evaluados por las pruebas de normalidad y homocedasticidad (P<0.05) (Zar 1984). Posteriormente, las diferencias en la proporción de brazos q en los cariotipos de ambas especies (divididas por localidad) se evaluaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANVA) y al haber diferencias significativas (P<0.05) se empleó la comparación múltiple de Tukey, todos los análisis se realizaron con el programa SigmaStat 2.03 ©.
Análisis con marcadores microsatelites: La extracción de ADN se realizó a partir de
musculo (100 µg) acorde al protocolo de extracción Fenol-cloroformo (Sambrook et al. 1989) y usando 60 individuos de P. mexicana, (Sitio I= 19 hembras y 11 machos. Sitio III= 29 hembras y 1 machos) y de P. sulphuraria 70 ejemplares (Sitio II= 22 hembras y 18 machos. Sitio IV= 15 hembras y 15 machos). Se emplearon cinco marcadores microsatelitales desarrollados en P. formosa (Tiedemann et al. 2005) (Pfor_GT-I49, Pfor_GA-IV29A, Pfor_GT-I33, Pfor_GA-IV29B, Pfor_GA-II41) (Cuadro 1). Las
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condiciones de PCR con lo que se llevó a cabo la amplificación de los microsatélites son mencionados en el Cuadro 3 y las reacciones se hicieron en 15μl por reacción consistiendo de 3 µL de buffer de reacción 1X, 0.9 µL de MgCl2 a 1.5 mM, 0.45 µL de dNTP´s a 0.3
mM, 0.6 µL del iniciador F y R a 0.4 µM, 0.03 µL de Taq Polimerasa, 1 µL de ADN a 50 µg y 8.41 µL de agua ultra pura. Para realizar las amplificaciones fue utilizado un termociclador DNA Engine (Bio-Rad) de 96 plazas.
Los productos de PCR fueron separados por geles de acrilamida al 6% en buffer TBE 1X, los cuales fueron corridos a 1700V durante 150 min. Para visualizar los alelos empleamos la tinción con plata (Bassam & Caetano-Anolles 1993). Los geles teñidos fueron fotodigitalizados con Gel Analyzer de Sequentix (http://www.sequentix.de/) para determinaron los tamaños alélicos de cada locus.
Se estimó la heterocigocidad observada (Ho)/esperada (He), el equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) y el desequilibrio de ligamiento (LD) con los parámetros del programa GENEPOP 4.1 (Rousset 2011).
RESULTADOS
Análisis citogenético: Se emplearon 216 preparaciones cromosómicas de origen mitótico,
de ellas para P. sulphuraria se estudió 239 dispersiones metafasicas de buena calidad, correspondiendo 103 metafases para los especímenes de la Hacienda los Azufres (II) y 136 para los del Rancho la Gloria (IV) (Cuadro 1). Para P. mexicana solo se analizaron 182 dispersiones cromosómicas, siendo 76 metafases procedentes del arroyo Ignacio Allende (I) y 106 de del Rio el Azufre (III) (Cuadro 2).
Las dispersiones cromosómicas de los organismos de P. sulphuraria de la localidad Hacienda Los Azufres (II) presentaron la moda diploide de 2n=46 cromosomas que fue
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correspondiente con el 75.73% de células analizadas; también se observaron ligeras variaciones de 44, 48 y 50 en un porcentaje menor (14.6%, Cuadro 2).
En los especímenes del Rancho la Gloria (IV) también se observó la moda diploide de 2n=46 cromosomas que fue correspondiente con el 69.12% del total de células analizadas, se distinguió además la presencia de variaciones de 42, 44, 48, 50 cromosomas; con menor frecuencia al 13.2% (Cuadro 2).
Para P. mexicana del Arroyo Ignacio Allende (I) se observó que el 86.84% de las metafases contabilizadas tuvieron el número modal diploide de 2n=46 y variaciones que oscilaron desde 44 hasta 48 cromosomas con el 8.49%. En el caso de P. mexicana del Rio el Azufre (III), el 75.73% de las metafases cuantificadas resultaron con la moda diploide de 2n=46 cromosomas, y variaciones de 42, 44, 48 y 50 en un 7.89% (Cuadro 2).
La longitud promedio del complemento cromosómico diploide (LCD) total de los
cromosomas mitóticos de P. sulphuraria fue de 198±10.4 y 184±18.0 µm para Hacienda los Azufres y Rancho la Gloria respectivamente. Mientras que en P. mexicana fue de 167±9.36 y 167±10.19.5 µm para el Arroyo Ignacio Allende y Río el Azufre respectivamente. La comparación LCD mostró diferencias significativas (P=0.034) solo
entre especies y no entre localidades para la misma especie (I vs IV, P=0.567; II vs III,
P=1.0), por lo que la LCD promedio de P. sulphuraria (191.65 µm) fue mayor a la
mostrada por P. mexicana (167.45 µm).
La longitud promedio en micrómetros del primer par cromosómico en P. sulphuraria, del sitio I resultó en 6.56±0.85 µm y 2.68±0.45 µm en el par veintitrés, el cariotipo de los especímenes del sitio II mostraron en promedio en el primer par cromosómico 6.54±0.34 µm y 2.34±0.50 µm para el par último veintitrés, lo que demostró que los cromosomas desde el primer par y hasta el último varían gradualmente en tamaño (Cuadro 3).
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En los elementos cromosómicos del cariotipo de P. mexicana del Arroyo Ignacio Allende, la longitud promedio del primer par cromosómico resultó en 6.28±0.59 µm y 2.16±0.28 µm en el último par veintitrés, en el caso de los organismos provenientes de Rio El Azufre, el promedio del primer para cromosómico fue de 6.19±0.86 µm y de 2.15±0.11 µm del último par cromosómico (Cuadro 3).
Las longitudes cromosómicas fueron similares en las comparaciones al interior de cada especie (P<0.05) entre los veintitrés pares cromosómicos contrastados de P. sulphuraria y
P. mexicana (Cuadro 2). Sin embargo, cuando se contrastaron las longitudes en
micrómetros de pares cromosómicos similares pero entre especies diferentes fue de interés identificar que las longitudes en micrómetros de los cromosomas correspondientes a los pares cromosómicos uno al séptimo fueron no significativos entre especies y localidades. No siendo el caso del par cromosómicos octavo al veintiuno que fueron significativos cuando fueron contrastados homólogamente entre especies/localidades (Cuadro 3).
La morfología cromosómica de ambas especies, fue clasificada en todo el complemento diploide como cromosomas monorrámeos de tipo acrocéntrico (A) debido a que en todas las metafases analizadas se observó presencia de pequeños brazos cromosómicos por encima de la región centromérica; pero estos dado su tamaño no fueron medidos (Fig. 2). Aunque, la frecuencia de tales estructuras difirió entre metafases de diferentes organismos como también dentro de cada sexo, por lo que estos atributos no fueron considerados como brazos pequeños (Cuadro 3). No fue posible observar la presencia de algún patrón de polimorfismo cromosómico marcado entre los cariotipos de machos/hembras y entre los sitios de recolecta.
