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LIGHT DIAGNOSTICS™
KIT IFA PARA CONFIRMACION DEL VIRUS RESPIRATORIOS
Identificación cualitativa de Adenovirus, Influenza A & B, Parainfluenza de Tipo 1, 2, 3, y
Virus Respiratorio Sincitial
Suplemento Español De la Lengua
3108 250
Uso previsto
El Kit IFA para Confirmación del Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ está indicado para el uso diagnóstico in vitro en la confirmación cualitativa de adenovirus, virus de la influenza A y B, virus de la parainfluenza 1, 2 y 3, y virus respiratorio sincitial (VRS) en cultivos celulares inoculados.
Resumen y explicación
En el hombre, los virus respiratorios son responsables de una proporción significativa de enfermedades. Algunos virus (por ej., el virus de la influenza) son estacionales en tanto que otros (por ej. los adenovirus) afectan predominantemente a distintos grupos de edad. En una población dada, los virus respiratorios pueden ser responsables de una considerable morbilidad. El advenimiento de tratamientos antivíricos apropiados contra algunos virus respiratorios hace imperativa la investigación rápida para la identificación de estos microorganismos, lo que permitirá la institución precoz del tratamiento.
Los dos agentes antivíricos más ampliamente usados en la actualidad son la amantadina/rimantadina para la influenza A y la ribavirina para la bronquiolitis producida por el virus respiratorio sincitial. Ambos agentes tienen mecanismos de acción distintos aunque la mayoría afectan a los estadios precoces de la infección, tales como la penetración o la descapsulación40,62. En las concentraciones fisiológicas alcanzables, la amantadina y la rimantadina inhiben específicamente la replicación del virus de la influenza A12. La ribavirina tiene una actividad de amplio espectro in vitro contra múltiples virus tales como el virus respiratorio sincitial, sarampión, influenza A y B, y parainfluenza 45,47,23.
Los tres métodos habitualmente usados para identificar los virus son: el aislamiento en cultivo / confirmación, la detección directa y la serología. Entre ellos, el aislamiento en cultivo / confirmación es el método estándar para la mayor parte de los laboratorios. Hasta la fecha es el método con mayor sensibilidad disponible para la detección de los virus respiratorios y en ocasiones, se utiliza para confirmar las detecciones directas. El Kit IFA para Confirmación del Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ utiliza anticuerpos monoclonales para la confirmación del cultivo, que proporciona resultados claros y fáciles de interpretar en sólo 60 minutos.
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Los adenovirus son responsables de un número significativo de enfermedades respiratorias clínicas. Las enfermedades de las vías respiratorias altas causadas por los adenovirus comprenden: resfriados, faringitis y amigdalitis, y ocurren sobre todo en los lactantes y niños pequeños. Probablemente alrededor del 10%
de las neumonías infantiles están causadas por adenovirus44. Otras enfermedades de las vías respiratorias bajas relacionadas con el adenovirus son:
la bronquitis y la bronquiolitis31. En los niños menores de 5 años de edad, los adenovirus son responsables de aproximadamente el 5% de los casos de enfermedades respiratorias agudas (ERA). Las ERA se pueden manifestar por congestión nasal, rinitis, tos y, ocasionalmente, amigdalitis, fiebre y mialgias.
La asociación de conjuntivitis y ERA constituye la fiebre faringoconjuntival2.
Los adenovirus se han asociado frecuentemente con un síndrome tosferinoide, pero los estudios recientes sugieren que la presencia de adenovirus en estos casos puede deberse a una reactivación del virus latente del tejido amigdalino durante las infecciones por Bordetella pertussis53.
Las enfermedades oculares que resultan de la infección por adenovirus comprenden la queratoconjuntivitis epidémica (QCE), la conjuntivitis hemorrágica aguda y la conjuntivitis folicular aguda.
El adenovirus está relacionado con diversas afecciones gastrointestinales y probablemente está presente en el 7-17% de todas las gastroenteritis infantiles.
Los tipos 40 y 41 se han asociado con diarrea y gastroenteritis aguda13,22,68.
El virus también se ha relacionado con invaginación intestinal3, cistitis hemorrágica aguda54 y meningoencefalitis.
Las investigaciones indican que la incidencia de las infecciones por adenovirus en pacientes inmunodeprimidos probablemente no sea superior a la de los individuos normales; sin embargo, la gravedad y la probabilidad de muerte pueden ser superiores31.
Los adenovirus humanos pertenecen a la familia Adenoviridae, género Mastadenovirus. No poseen cápsula, tienen un genoma de ADN bicatenario, forma icosaédrica y un diámetro entre 70 y 90 nm30. Tienen una capa proteica de capsómeros, 240 hexones y 12 pentones.
Los adenovirus pueden cultivarse y aislarse en diversas estirpes celulares, e identificarse mediante varios métodos. Las estirpes celulares apropiadas son:
HEp-2, HeLa, KB y HEK. Para la propagación de los tipos 40 y 41 pueden utilizarse las células Graham 293. La confirmación de la infección generalmente se realiza mediante inmunofluorescencia o enzimoimmunoanálisis (EIA), pero también se puede realizar mediante los métodos de fijación del complemento, inhibición de la hemaglutinación y neutralización34.
Los virus de la influenza causan una enfermedad respiratoria altamente contagiosa que da lugar, típicamente, a epidemias28. Hay tres tipos, A, B y C, en los cuales la especificidad es conferida por los antígenos de la nucleoproteína interna y de la proteína de la matriz52.
La infección del adulto por el virus de la influenza característicamente da lugar a traqueobronquitis y afectación leve de las vías respiratorias42,65 con desarrollo posible de rinitis y/o faringitis. Sin embargo, la infección puede presentarse con manifestaciones clínicas que varían entre la ausencia de síntomas y la neumonía fatal52. En los niños se puede dar el mismo espectro de respuesta clínica con algunas diferencias concretas. La fiebre puede ser más alta en los niños, y acompañarse de convulsiones febriles24,26,60,70,71. Los virus de la influenza son responsables del 14% de las fiebres infantiles con síntomas respiratorios lo bastante graves para requerir la atención de un médico24,71. Los niños experimentan más afectación gastrointestinal que los adultos14 y desarrollan miositis, otitis media y crup con más frecuencia29,38. La infección neonatal puede dar lugar a fiebre inexplicable48 y es potencialmente fatal1,18,48,57. La enfermedad de las vías respiratorias bajas de los niños y adultos asociada a la infección por el virus de la influenza se manifiesta como tres formas de neumonía: neumonía vírica primaria, neumonía vírica-bacteriana combinada e infección por el virus de la influenza seguida de neumonía bacteriana52. Las respuestas clínicas no pulmonares a la infección por el virus de la influenza incluyen: viremia, afectación cardiaca y del SNC, síndrome de Reyes y choque tóxico52.
Los virus de la influenza tipos A y B causan, esencialmente, el mismo espectro de enfermedades. No obstante, la infección por el virus A requiere hospitalización con una frecuencia aproximadamente cuatro veces mayor que la del tipo B38, y el tipo B produce más frecuentemente miositis y afectación gastrointestinal11,15,36,41.
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El tipo C del virus de la influenza produce enfermedad de las vías respiratorias bajas con poca frecuencia pero produce esporádicamente enfermedad de las vías respiratorias altas38,19,50. En la edad adulta, casi todos los individuos tienen anticuerpos frente al tipo C55.
Los virus de la influenza son miembros de la familia Orthomyxoviridae. Son pleomórficos, encapsulados y contienen un genoma de ARN monocatenario segmentado de sentido negativo. Su diámetro oscila entre 80 y120 nm39.
La adición de tripsina permite cultivar los virus de la influenza en una variedad de estirpes celulares como las células de riñón canino de Madin-Darby (MDCK), de carcinoma pulmonar A549 y las células primarias de riñón de mono (PMK)20,64 así como en los huevos de gallina embrionados o sistema de la "allantoin-on-shell"17. El virus de la influenza puede ser detectado con técnicas de inmunofluorescencia, hemadsorción o hemaglutinación, usando hematíes de pollo o cobaya. El aislamiento en cultivo y confirmación es una técnica fácil, sensible y relativamente rápida para la identificación de las infecciones por los virus de la influenza. El efecto citopático es evidente de 3 a 7 días después de la inoculación, en forma de vacuolización y degeneración celular.
Los virus de la parainfluenza, combinados con el virus respiratorio sincitial, representan los patógenos respiratorios más significativos de las vías respiratorias altas en los lactantes y niños pequeños4,6,7,37. Se han identificado cuatro tipos de virus de la parainfluenza en niños y adultos. Los tipos 1 y 2 son causas importantes de laringotraqueobronquitis (crup). La gravedad de la enfermedad es mayor en los niños de 2 a 4 años66. La infección por el virus de la parainfluenza del tipo 3 puede dar lugar a crup, pero lo más notable es que el tipo 3 ocupa el segundo lugar, tras el virus respiratorio sincitial, como causa de bronquiolitis y neumonía en el lactante8,9,25,58,59. La enfermedad causada por la infección por el tipo 3 es más grave en los lactantes de menos de 1 año66.
En los niños de más edad y en adultos, la enfermedad puede ser asintomática o similar a un resfriado67. La laringotraqueobronquitis grave durante la lactancia o en la primera infancia puede dar lugar a hiperactividad bronquial después del ejercicio en los niños mayores o adolescentes. Sin embargo, sigue sin determinarse si la hiperactividad bronquial era una afección preexistente que
desempeñó un papel en la patogenia del crup, o si se desarrolla como una complicación de la laringotraqueobronquitis grave27,43.
El tipo 4 del virus de la parainfluenza se ha asociado solamente a enfermedad leve de las vías respiratorias altas en los adultos y los niños, y es difícil de identificar en cultivos celulares66.
Los virus de la parainfluenza pertenecen al género Paramyxovirus de la familia Paramyxoviridae. Son virus encapsulados con un genoma de ARN monocatenario de polaridad negativa cuyo diámetro oscila entre 150 y 200 nm10.
Los virus de la parainfluenza crecen bien en las estirpes primarias de células de riñón de simio o humano y en la estirpe LLC-MK2, una estirpe de células heteroploides de riñón de mono rhesus66. Para la recuperación de los tipos 1 y 2, pero no para el tipo 3, es necesaria la presencia de tripsina en el medio. La infección del cultivo tisular por el virus se puede identificar mediante hemadsorción con hematíes de cobaya. Los tipos 2 y 3 se pueden reconocer por la formación de sincitios.
A la edad de 2 años, la mayoría de los niños han sufrido infecciones por el Virus Respiratorio Sincitial (VRS), lo que significa que representa la etiología vírica más frecuente de las enfermedades de las vías respiratorias bajas en la niñez63. La infección por VRS suele dar lugar a resfriados con rinorrea profusa, pero en las primoinfecciones de los lactantes de 6 semanas a 6 meses, el 25-40%
desarrollarán una enfermedad de las vías respiratorias bajas63. En la mayoría de las áreas investigadas, el VRS era responsable de más neumonías y bronquiolitis que el resto de los patógenos microbianos46. Hay estudios que sugieren que las neumonías y bronquiolitis infantiles causadas por el VRS pueden dar lugar a alteraciones respiratorias a largo plazo, tales como función pulmonar anormal, asma, tos y bronquitis recurrentes51.
El VRS también se ha implicado en el síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL), aunque no se ha determinado la naturaleza de dicha asociación16,46,56,61,69.
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El virus respiratorio sincitial pertenece a la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus. Es un virus pleomórfico, encapsulado, de 150 a 300 nm de diámetro5,33,56 y con ARN monocatenario63.
El VRS se puede detectar mediante inmunofluorescencia, EIA, fijación del complemento, neutralización o aislamiento en cultivo y confirmación21,32,46,49. Existen diversas estirpes celulares para el cultivo del VRS. Para el aislamiento primario, son aceptables las estirpes HEp-2 o HeLa63, aunque también se han utilizado otras estirpes, como Vero, LLCMK-2, o CV-l . El virus produce los efectos citopáticos característicos de formación de sincitios y destrucción celular63.
Principio de la prueba
El Kit IFA para Confirmación del Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta para la identificación del virus en los cultivos tisulares infectados. Los anticuerpos monoclonales de ratón proporcionados se unirán al antígeno vírico apropiado en la muestra del portaobjetos. El anticuerpo no unido se lava del portaobjetos con PBS (phosphate buffered saline, solución salina tamponada con fosfato). Esto se sigue de la adición de IgG de cabra anti-ratón marcada con FITC (fluorescein isothiocyanate, isocianato de fluoresceína), que se une al complejo antígeno- anticuerpo. El anticuerpo marcado no unido se lava del portaobjetos con PBS.
Al someterse a luz ultravioleta, el FITC muestra una fluorescencia de color verde manzana que permite la visualización del complejo mediante microscopía.
La fluorescencia de las células indica que la muestra es positiva. Las células no infectadas se tiñen de color rojo pálido debido a la presencia de Evans Blue en el anticuerpo secundario marcado con FITC. El reactivo Respiratory Viral Screen se utiliza para confirmar la presencia indiscriminada de virus respiratorios (adenovirus, virus respiratorio sincitial, tipos 1, 2 y 3 de la parainfluenza e influenza A y B. La calidad de los resultados depende de diversos factores tales como la condición de las células para confirmación del cultivo, el fijador utilizado, y la experiencia del técnico que realiza el análisis.
Componentes del Kit
1.) Respiratory Viral Screen; 5007: Un (1) frasco cuentagotas de 10 ml con los anticuerpos monoclonales contra: adenovirus, influenza A, influenza B, parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3 y virus respiratorio sincitial en PBS con estabilizador de proteínas, y azida sódica al 0,1% (conservante).
La cantidad suministrada es suficiente para 250 pruebas. Estimación se basa en las pruebas de caída de 40μL; el número real de las pruebas pueden variar.
2.) Normal Mouse Antibody 5014: Un (1) frasco cuentagotas de 10 ml que contiene anticuerpo de ratón normal que se utilizará como control negativo en PBS con estabilizador de proteínas, y azida sódica al 0,1%
(conservante).
3.) Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate; 5008: Un (1) frasco cuentagotas de 10 ml con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcado con FITC en PBS con el Evans Blue al 0,02% como tinción de contraste, BSA al 0,2% y azida sódica al 0,1% como conservante.
4.) Phosphate - Buffered Saline (PBS); 5087: Un (1) envase de las sales para preparar 1 litro de solución salina tamponada con fosfato tras su disolución en agua destilada. Guarde en un envase cerrado y limpio, a temperatura ambiente.
5.) Tween® 20 / Sodium Azide Solution (100X); 5037: Un (1) frasco de 10 ml que contiene monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween 20) y azida sódica (NaN3) concentrada, para diluir 1:100 en PBS.
6.) Mounting Fluid 5013: Un (1) frasco cuentagotas de 10 ml que contiene tampón Tris, glicerina, amplificador de la fluorescencia y azida sódica como conservante. Guarde a temperatura entre 2° y 25ºC.
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Materiales necesarios no suministrados
1. Cultivo celular para el aislamiento de los virus respiratorios: Todos los laboratorios deben mantener reservas de células viables en el paso o estado apropiado para realizar de forma eficiente la replicación de los virus respiratorios de las muestras procesadas de los pacientes. Estas células deben ser comprobadas periódicamente para conocer su capacidad para servir de soporte al crecimiento de los virus respiratorios. Se pueden obtener estirpes celulares apropiadas de la ATCC® (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA.
2. Para el aislamiento de los virus se utiliza un medio de transporte que no inhiba los virus respiratorios ni las células usadas para el aislamiento de los virus en cultivo: Un medio apropiado es la solución salina equilibrada de Hank con antibióticos y un estabilizador proteico. Evite el uso de sueros animales (excepto el suero bovino fetal precalostral) como estabilizador proteico para prevenir las interferencias de los anticuerpos inherentes.
3. Medios de cultivo como RPMI o medio esencial mínimo de Eagle con la cantidad apropiada de suero fetal bovino precalostral.
4. Tubos de cultivo, “dram vials” o placas multipocillos estériles.
5. Acetona, 99,5%.
Nota: La acetona es higroscópica y se debe guardar en envases cerrados herméticamente. La presencia de humedad en la acetona puede dar lugar a un aspecto brumoso del sustrato durante la microscopía de fluorescencia.
6. Portaobjetos de vidrio limpiados con acetona.
7. Pipetas estériles.
8. Cámara húmeda.
9. Solución de hipoclorito sódico (0,05%).
10. Cubreobjetos del nº 1.
11. Estufa de incubación con reóstato para regulación de la temperatura.
12. Torundas estériles.
13. Pinzas.
14. Frascos para la obtención y transporte de las muestras.
15. Microscopio de fluorescencia con la combinación apropiada de filtros para FITC (pico de excitación: 490 nm, pico de emisión: 520 nm).
16. Perlas estériles de vidrio (diámetro de 1 a 3 mm).
17. Centrífuga.
18. Vórtex o agitador por ultrasonidos.
19. Agua destilada.
Estabilidad y almacenamiento
Si se almacena entre 2º y 8ºC, el Kit IFA para Confirmación del Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ es estable hasta la fecha de caducidad que está impresa en la etiqueta. No congele ni exponga a temperaturas elevadas.
Deseche los restos de reactivos después de la fecha de caducidad del kit.
Durante la incubación, los portaobjetos se deben proteger de la luz y conservarse en una cámara húmeda a la temperatura recomendada.
Una disminución marcada de la fluorescencia puede indicar deterioro del conjugado o del anticuerpo. Con cada muestra, se debe analizar un control positivo para asegurar el funcionamiento adecuado de estos reactivos y el procedimiento de tinción correcto. Si hay una disminución de la intensidad de la tinción después del análisis apropiado, deje de usar los reactivos.
Advertencias y precauciones
• La azida sódica (presente en el conjugado, el Respiratory Viral Screen, la solución de PBS/Tween 20 y el líquido de preparación) puede formar azidas metálicas potencialmente explosivas con las tuberías. Al desechar estos materiales, enjuague con abundante agua para evitar la acumulación de azida.
• La dilución o las mezclas de los conjugados o del anticuerpo del Respiratory Viral Screen 5007 pueden causar resultados erróneos.
• No use los reactivos después de la fecha de caducidad.
• Evite dejar los reactivos por encima de 2º y 8ºC durante períodos prolongados.
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• No permita que se sequen los portaobjetos en ningún momento durante el proceso de tinción.
• Manipule todas las muestras y los materiales como potencialmente infecciosos. Descontamine con hipoclorito sódico al 0,05% (una dilución 1:100 de lejía doméstica).
• No exponga los reactivos a luz intensa durante el almacenamiento o la incubación.
• Evite el contacto con el Evans Blue (presente en el Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate 5008) ya que es un carcinógeno potencial. Si entrara en contacto con la piel, enjuague con agua abundante.
• La acetona es sumamente inflamable y su ingestión o inhalación es nociva para la salud. Conserve este producto alejado del calor, chispas o llamas.
Evite la inhalación de los vapores. Utilice una ventilación apropiada.
• No pipetee los reactivos con la boca.
• No sustituya los reactivos de otros fabricantes.
• La modificación del protocolo proporcionado puede causar resultados erróneos.
• Al teñir múltiples muestras en un portaobjetos, evite la contaminación cruzada entre las mismas.
• El anticuerpo de ratón normal se debe comprobar con cada aislado del cultivo celular. La fluorescencia indica una reacción no específica y la prueba se considera no válida.
• El Mounting Fluid 5013 contiene un amplificador de fluorescencia que puede resultar destructivo para las mucosas. Evite el contacto directo con la piel o las mucosas. Si ocurriera el contacto, enjuague con agua abundante.
Obtención de muestras
Los procedimientos apropiados de extracción, transporte, procesamiento y almacenamiento de las muestras tienen una importancia fundamental para el aislamiento y confirmación del virus infectante. La selección de la técnica de obtención apropiada requiere el conocimiento de la patogenia de la enfermedad.
Una regla sencilla es que cuando una enfermedad está en una superficie (piel o membrana mucosa), hay que cultivar material de dicha superficie. En las enfermedades profundas o generalizadas (erupciones no vesiculosas, meningitis, encefalitis, fiebre de origen desconocido o infecciones congénitas), es recomendable tomar muestras de múltiples sitios.
El tipo de muestra obtenida y su procesamiento posterior dependen de la enfermedad y del virus que hay que detectar. Se puede encontrar información detallada sobre los síntomas y las técnicas de obtención de muestras en Balows, A. et al., (eds.) 5th ed. (1991) The Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
Adenovirus, Ch. 86; Respiratory Syncytial Virus, Ch. 83; Influenza Viruses, Ch.
81; Parainfluenza Viruses, Ch. 82; Animal and Animal Cell Culture Systems, Ch. 19.
El transporte adecuado de las muestras debe cumplir con todas las leyes y reglamentaciones aplicables relativas al transporte de muestras biológicas.
Procesamiento de muestras
Antes de procesar las muestras, compruebe que se han recogido y transportado correctamente. La manipulación incorrecta de las muestras puede causar resultados erróneos.
Cuando se usen aspirados, lavar la muestra mezclando aproximadamente 0,2 a 0,4 ml de la secreción sin diluir con unos 2,0 ml de PBS fría. Agitar la muestra en un vórtex para separar las células del moco. Llevar el volumen hasta 10 ml y centrifugar a 200-500 g durante 7-10 minutos. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado hasta que desaparezca el moco de la muestra. Resuspender de nuevo en el medio apropiado y agitar en el vórtex, o sonicar, para disgregar las células.
Centrifugar y utilizar el sobrenadante como material de inoculación.
Para los exudados nasofaríngeos o faríngeos, agitar el envase con la muestra para separar las células. Para una mayor recuperación celular, agregar algunas perlas de vidrio estériles a la muestra y agitar en el vórtex durante un minuto, o sonicar a 8 a 12 Kc/s, durante un minuto. Deseche la torunda en una solución de
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hipoclorito de sodio. Centrifugue la muestra a 200-500 g durante 7-10 minutos.
Utilice el sobrenadante como material de inoculación.
Examine los cultivos celulares justo antes de sembrar la muestra para verificar que la morfología sea la adecuada. Lavar la monocapa con medio fresco y aspirarlo. Agregue 0,2 - 0,5 ml del inóculo a cada uno de los frascos de cultivo.
Inocular las muestras por duplicado. Dejar a 37 °C durante 30 a 60 minutos o, después de la inoculación, centrifugar los frascos de cultivo durante 30 minutos entre 500 y 700 g y dejarlos a 37 °C durante 30 minutos (se deben realizar los controles apropiados para asegurar que no haya ningún efecto perjudicial de la centrifugación sobre las estirpes celulares utilizadas). Después del período de incubación, cubrir los cultivos con medio de mantenimiento fresco e incubar a 35-37 °C. Renovar el medio de cultivo celular cada 3 ó 4 días.
Examine diariamente en busca del CPE (cytopathic effect, efecto citopático).
Las cultivos celulares sometidos a adsorción o centrifugación, según lo descrito previamente, pueden mostrar CPE tan precozmente como a las 48 horas.
Se debe inocular una muestra de cada lote de las estirpes celulares empleadas para el cultivo celular con una cepa representativa de los virus respiratorios para asegurar la susceptibilidad a la infección y el CPE adecuado. Los cultivos celulares no inoculados también deben crecerse y examinarse diariamente en busca de virus y micoplasma. Estos funcionarán como control de la morfología celular normal y pueden resultar útiles para detectar un CPE temprano. A menos que estos cultivos celulares control tengan un crecimiento adecuado, los resultados del aislamiento en cultivo celular deben considerarse no válidos.
Después de la incubación apropiada y/o tras la observación de un CPE > 25 %, aspirar el medio del frasco de cultivo. Conservar congelado el medio que no ha sido utilizado hasta que se haya terminado la prueba. En el caso de que surja algún problema, se puede intentar el aislamiento vírico de este medio. El aislamiento vírico de las muestras congeladas puede ser drásticamente inferior al de las muestras frescas.
Enjuague el cultivo celular suavemente tres veces con 1 a 2 ml de HBSS (Hank´s Balanced Salt Solution, solución salina equilibrada de Hanks). Deseche todos los lavados en una solución de hipoclorito sódico. Agregar una décima parte del volumen del cultivo de ácido etilenediamino tetraacético de sodio - tripsina (0,05%) (EDTA-4Na, 0,53 mM) y dejar actuar durante 30 segundos.
Golpee suavemente el recipiente de cultivo para desprender las células. Agregar medio fresco hasta el volumen original del cultivo. Centrifugue la suspensión de células a 200-500 g durante 7-10 minutos. Resuspenda las células sedimentadas en varias gotas de PBS estéril para obtener una suspensión relativamente densa. Para ser considerados adecuados para la detección, los
portaobjetos deben contener al menos tres células por campo con un aumento de 400x.
Manche con la suspensión celular un portaobjetos limpiado con acetona y déjelo secar en un horno de convección (30°-35°C) o deje que se seque al aire rápidamente a temperatura ambiente. Fije el portaobjetos en acetona fría (2° y 8°C) durante 10 minutos y séquelo al aire completamente. Guarde los portaobjetos no utilizados con desecante a -20°C.
Procedimiento de prueba
Preparación del reactivo:
Disolución de PBS/Tween 20
1. Disuelva el contenido del paquete de PBS en 950 ml de agua destilada.
2. Agregue el concentrado de Tween 20 / Sodium Azide 100X (10 ml) al PBS y mezcle bien.
3. Lleve el volumen de la mezcla hasta 1 litro con agua destilada. Transfiéralo a un envase de conservación limpio marcado y tápelo herméticamente. Guárdelo a temperatura ambiente Deséchelo si la disolución PBS/Tween 20 se vuelve turbia o aparece un precipitado.
Todos los demás reactivos se proporcionan listos para su uso.
Procedimiento (de tinción) inmunofluorescente indirecto sugerido:
1. Deje que los portaobjetos de control y de muestra se equilibren a la temperatura ambiente.
2. Ponga una gota de Respiratory Viral Screen 5007sobre los pocillos adecuados del portaobjetos de control. Cubra una mancha de células del portaobjetos de la muestra con una gota del Respiratory Viral Screen.
Nota: El Respiratory Viral Screen se puede utilizar para confirmar la presencia indiscriminada de virus respiratorios. Para su identificación específica se pueden utilizar los siguientes anticuerpos monoclonales de Light Diagnostics™ contra los virus particulares.
3. Cubra la mancha de células del portaobjetos de confirmación del cultivo con una gota del anticuerpo normal de ratón 5014 usado como control negativo.
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4. Incube los portaobjetos a 37°C durante 30 minutos en una cámara húmeda.
5. Lave abundantemente con disolución de PBS/Tween 20 durante 10-15 segundos.
6. Sacuda el exceso de tampón de los portaobjetos y seque cuidadosamente el área que rodea la mancha de células.
7. Añada una gota de Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate 5008 a cada pocillo.
8. Repita los pasos 4 y 5.
9. Sacuda el exceso de tampón de los portaobjetos y prepare los portaobjetos con un cubreobjetos con el líquido de preparación. Seque el exceso de líquido de los bordes del cubreobjetos.
10. Examine los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia a 100-200x en busca de células que muestren la fluorescencia de color verde manzana del FITC. Puede realizarse un examen detallado a 400x.
Interpretación de los resultados
El tipo de tinción observado dependerá del virus causante de la infección y refleja el patrón del crecimiento del virus. Los patrones de tinción observados con los virus respiratorios se describen a continuación:
Adenovirus
La fluorescencia es nuclear, citoplasmática o ambas.
La tinción nuclear es uniformemente brillante.
La tinción citoplásmica es a menudo punteada.
Influenza A y B
La fluorescencia es nuclear, citoplasmática o ambas.
La tinción nuclear es uniformemente brillante.
La tinción citoplásmica es a menudo punteada, con inclusiones grandes.
Tipos 1, 2 y 3 del virus de la parainfluenza La fluorescencia está confinada al citoplasma.
La tinción citoplasmática es punteada, con inclusiones irregulares.
Virus respiratorio sincitial
La fluorescencia se localiza en el citoplasma y se asocia a los sincitios.
La tinción citoplasmática es punteada con inclusiones pequeñas.
Células negativas
Las células muestran un color rojo pálido en el citoplasma y un color entre granate oscuro a casi negro en el núcleo. La tinción de estas células es debida a la presencia de Evans Blue como contraste.
Resulta útil examinar las células negativas antes que las positivas para determinar si hay tinción de fondo. La tinción positiva para un virus está representada por la presencia, al menos, de dos o más células intactas por campo a 400x que exhiban el tipo de fluorescencia descrito previamente.
Examine primero los portaobjetos de control para comprobar que la tinción sea la apropiada. El control positivo debe mostrar células con fluorescencia nuclear, citoplasmática o de ambas zonas, dependiendo de la etapa de crecimiento. El control negativo debe mostrar células teñidas de color rojo pálido por la tinción de contraste con Evans Blue.
Precaución: Se debe ignorar la tinción fluorescente de los fragmentos celulares, causada frecuentemente al quedar atrapado el conjugado en dichos fragmentos. Si los controles positivo y negativo no pueden distinguirse claramente, la prueba no es válida y debe repetirse.
Un resultado negativo no descarta la presencia de adenovirus, RSV, virus de la influenza A o B, o de la parainfluenza 1, 2 ó 3. El resultado negativo puede ser debido a una variedad de factores, por ejemplo: muestra inadecuada, obtención y manipulación inadecuadas de la muestra, técnica de cultivo incorrecta, uso de una estirpe celular o temperatura inadecuadas durante el aislamiento, o los factores mencionados en “Limitaciones”. Todos los resultados negativos deben informarse como "No se observa ningún virus".
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Limitaciones
• Los procedimientos adecuados de transporte y procesamiento posterior de las muestras son fundamentales para el aislamiento en cultivo y en las determinaciones directas. Por lo tanto, un resultado negativo no elimina la presencia de infección vírica. Los resultados se deben interpretar
cuidadosamente, teniendo en cuenta la evaluación clínica del paciente y otras pruebas diagnósticas.
• Para que la prueba sea válida, es necesario procesar en cada muestra los controles positivo y negativo, que deben mostrar la tinción apropiada.
• La tinción perinuclear o citoplasmática difusa puede corresponder a la unión inespecífica del anticuerpo, debida a las zonas del receptor de Fc en las células infectadas por virus del herpes35.
• Las muestras contaminadas por Staphylococcus aureus pueden exhibir fluorescencia de color amarillo verdoso pálido debido a la presencia de grandes cantidades de proteína A. La fluorescencia es el resultado de la unión no específica de la proteína A a los fragmentos Fc del anticuerpo.
• Los anticuerpos monoclonales de este kit son específicos de grupo para adenovirus y VRS y, por lo tanto, no pueden ser utilizados para distinguir los tipos.
Valores esperados
Los resultados variarán dependiendo del estado socioeconómico, la edad de la población, la localización geográfica, la época del año (algunos virus son estacionales) y la manipulación de la muestra. Se ha analizado un total de 646 muestras en dos centros de la costa este, tres centros situados en el sur y dos centros situados en el mediooeste, así como en tres centros de la costa oeste.
Los centros incluyeron hospitales, hospitales infantiles, universidades y
laboratorios de referencia. Las evaluaciones realizadas de septiembre de 1991 a julio de 1992 proporcionaron las siguientes tasas de detección: Adenovirus -- 6,7% (43/646); VRS -- 10,2% (66/646); Influenza A -- 1,7% (11/646); Influenza B -- 0,6% (4/646); Parainfluenza 1 -- 1,7% (11/646); Parainfluenza 2 -- 0,8%
(5/646); Parainfluenza 3 -- 4,3% 28/646).
Características de la eficacia diagnóstica
Análisis de la reactividad cruzada
Los estudios sobre la detección de virus y bacterias con cada anticuerpo monoclonal contenido en el Respiratory Viral Screen proporcionaron los resultados siguientes. Los cultivos ATCC® (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA se identifican por el número de la cepa. Los prototipos indicados fueron aislados por los Centers for Disease Control, Atlanta, GA. Los cultivos restantes eran aislados clínicos, a menos que se indique lo contrario.
ANTICUERPOS MONOCLONALES:
Adeno VRS Influ A
Influ B
Para 1
Para 2
Para 3 Adenovirus:
Tipos 1-47 prototipos; + 30 aislados clínicos actuales de los tipos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 37
+ - - - -
Poliomavirus: SV-40 - - - - -
Virus del herpes: 2 aislados clínicos del virus del herpes tipos 1 y 2, HSV-1 ATCC VR733, HSV-2 ATCC VR734; 1 aislado clínico de CMV y de VVZ
- - - - -
Ecovirus: Aislados clínicos tipos 1, 4, 6, 9, 11, 30, 33, prototipo eco-27, prototipo polio-2
- - - - -
Coxsackievirus:
Prototipo A14, A24var (4 aislados), B4 (2 aislados)
- - - - -
Enterovirus 70: 4 aislados - - - - -
Rinovirus: 6 aislados - - - - -
Coronavirus:
Prototipos OC43 y 229E
- - - - -
Virus de la influenza tipo A:
2 aislados de cada de Cepas A/Leningrado / 360/86 y A/Filipinas/2/82; subtipo H3N2:
A/Victoria/3/75 - 7 aislados, A/Texas/1/77 - 1 aislado, Cepas A/Inglaterra/496/80 - 2 aislados, A/Inglaterra/X/82 - 12 aislados; subtipo H1N1:
A/USSR/90/77 - 2 aislados, A/Inglaterra/333/80 - 1 aislado;
subtipos H3N2 y H1N1 todas las cepas - 25 aislados
- - + - - - -
18 ANTICUERPOS
MONOCLONALES:
Adeno VRS Influ A
Influ B
Para 1
Para 2
Para 3 Virus de la influenza tipo B:
2 aislados de B/USSR/100/83; 14 aislados de B/Singapur/222/79
- - - + - - -
Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de los prototipos de los tipos 1 y 6
- - - - + - -
Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de los prototipos de los tipos 2 y 6
- - - - - + -
Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de los prototipos de los tipos 3 y 6
- - - - +
Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de cada uno de los prototipos de los tipos 4A y 4B y 6
- - - - -
Virus de la parotiditis: Prototipo, 6 aislados y CDC V5004
- - - - -
Virus del sarampión:
Cepa Edmonston; CDC V4009
- - - - -
Virus de simio:
Cepas de referencia 5 y 41
- - - - -
VRS:
Cepas de referencia Long, A2, 18537, V1680E y V670; 30 aislados recientes de las cepas del grupo 1 (similar a Long); 30 aislados de las cepas del grupo 2 (similar a 18537)
- + - - - - -
Acholeplasma laidlawii:
ATCC 23206
- - - - -
Bordetella bronchiseptica:
ATCC 10580
- - - - -
Bordetella pertussis:
ATCC 9340
- - - - -
Bordetella parapertussis:
ATCC 15237
- - - - -
Branhamella catarrhalis:
ATCC 25238
- - - - -
Chlamydia trachomatis:
Syva
- - - - -
Corynebacterium diptheriae:
ATCC 13812
- - - - -
Legionella micdadei:
ATCC 33204
- - - - -
Legionella pneumophila:
CDC-BC 1640
- - - - -
Mycobacterium avium:
Clínico
- - - - -
ANTICUERPOS MONOCLONALES:
Adeno VRS Influ A
Influ B
Para 1
Para 2
Para 3 Mycobacterium intracellularae:
Clínico
- - - - -
Mycobacterium tuberculosis:
Clínico
- - - - -
Mycoplasma fermentans:
ATCC 19989
- - - - -
Mycoplasma hominis:
ATCC 23114
- - - - -
Mycoplasma orale:
ATCC 23714
- - - - -
Mycoplasma pneumoniae:
Clínico
- - - - -
Neisseria meningitidis:
ATCC 13077
- - - - -
Ureaplasma urealyticum:
ATCC 27618
- - - - -
Controles de la célula huésped: Todos los anticuerpos monoclonales dieron resultado negativo frente a los siguientes controles celulares:
Adenovirus Controles celulares pHEK, HEp-2, NCI-H292, RD, HLF, HeLa y A549
Poliomavirus Control de células pMK Enterovirus Controles de células RD y HLF
Paramixovirus Controles de células HEp-2, Vero y pMK
20
Comparación clínica para la confirmación del cultivo celular
La confirmación del cultivo celular de las muestras respiratorias fue probada en siete laboratorios clínicos de EE.UU. que compararon el Kit IFA para Confirmación del Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ con otros kits de diagnóstico in vitro. Los resultados son los siguientes:
ANTICUERPOS
MONOCLONALES: Adeno VRS
Influ A
Influ B
Para 1
Para 2
Para 3
Positivo verdadero 43 66 11 4 11 5 28
Positivo falso 0 0 0 0 0 0 0
Negativo verdadero 602 580 635 642 635 641 618
Negativo falso 1 0 0 0 0 0 0
Sensibilidad (%) 97,7 100 100 100 100 100 100
Especificidad (%) 100 100 100 100 100 100 100
Valor predictivo positivo (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valor predictivo
negativo (%)
99,8 100 100 100 100 100 100
La confirmación del cultivo celular de las muestras respiratorias del repositorio congelado fue probada en siete laboratorios clínicos de EE.UU. que compararon los anticuerpos monoclonales del Kit IFA para Confirmación del Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ con otros kits de diagnóstico in vitro. Los resultados son los siguientes:
ANTICUERPOS MONOCLONALES:
Adeno VRS
Influ A
Influ B
Para 1
Para 2
Para 3
Positivo verdadero 7 3 30 36 33 5 16
Positivo falso 0 0 0 0 0 0 0
Negativo verdadero 144 148 121 115 118 146 135
Negativo falso 0 0 0 0 0 0 0
Sensibilidad (%) 100 100 100 100 100 100 100
Especificidad (%) 100 100 100 100 100 100 100
Valor predictivo positivo (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valor predictivo negativo (%) 100 100 100 100 100 100 100
Resolución de problemas
La preparación de las muestras depende mucho de la técnica y puede afectar a los resultados que se obtengan. Para poder solucionar posibles problemas de eficacia, es necesario examinar todos los pasos del proceso.
Una disminución muy marcada de la fluorescencia podría indicar:
1) Un deterioro de los reactivos
2) Problemas relacionados con la microscopía 3) Otros problemas del equipo o de la técnica
• Verifique la fecha de caducidad de todos los reactivos empleados.
• Si los reactivos no hubieran caducado, verifique el funcionamiento del microscopio y vuelva a examinar los portaobjetos control.
• Si aún no se determinara el problema, verifique la operación de todo el equipo según el folleto y repita el análisis.
Para solicitar asistencia, llame al Servicio Técnico de EMD Millipore Corporation. Para encontrar la oficina más cercana, visite
www.millipore.com/offices.
La sección de “Bibliografía” de este folleto informativo de IVD de Light Diagnostics™ aparece solamente en la versión completa en inglés. Consulte esta versión acerca de los detalles específicos del producto.
Glosario de Símbolos
Símbolo Se utiliza para Símbolo Se utiliza para
Número de catálogo
El uso por parte AAAA-MM-DD o AAAA MM-
Fabbricante
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Precaución, consulte los documentos adjuntos
Contenido suficiente para
<n> pruebas
Diagnóstico in vitro de dispositivos médicos
Límites de temperatura
Consulte las instrucciones de uso
Los riesgos biológicos
Control
El control negativo
El control positivo
GARANTÍA Y LIMITACIÓN DE RESPONSABILIDAD:
1. Millipore garantiza que sus productos cumplirán con sus especificaciones publicadas cuando sean usados de acuerdo con sus instrucciones durante un período de un año desde el envío de los productos.
2. El Cliente inspeccionará los Productos cuando éstos le sean entregados. Cualquier reserva relativa a defectos obvios o a falta de Productos, debidos a una posible falta por Millipore Iberica, S.A, debe ser notificada inmediatamente por escrito al transportista y por correo certificado a Millipore Iberica, S.A, durante los tres (3) días laborables siguientes a la entrega, o como muy tarde, durante los diez (10) días naturales siguientes a la fecha de facturación, en el caso de que se trate de una falta de Productos.
3. No puede devolverse un producto sin el previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A, y sin seguir sus indicaciones al respecto. Cualesquiera de los Productos devueltos sin previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A no serán abonados en la cuenta del Cliente.
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Tween® es una marca comercial de ICI Americas Inc.
ATCC® es una marca comercial de la American Type Culture Collection Corporation.
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EMD Millipore Corporation
28820 Single Oak Drive Temecula, CA 92590 • United States Tel. : +1 (951) 676-8080 • Fax : +1 (951) 676-9209
www.millipore.com
MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hanover, Germany
LIGHT DIAGNOSTICS™
RESPIRATORY VIRAL SCREENING IFA KIT
Qualitative Identifizierung von Adenovirus, Influenza A und B, Parainfluenza Typen 1, 2, 3, und
Respiratory Syncytial Virus
Deutsche Sprachenergänzung
3108 250
Verwendungszweck
Das Light Diagnostics™ Respiratory Viral Screening IFA Kit ist für die In- Vitro-Diagnose zur qualitativen Bestätigung von Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3 und RSV (Respiratory Syncytial Virus, Pneumovirus) in inokulierten Zellkulturen bestimmt.
Zusammenfassung und Erläuterung
Respiratorische Viren sind für einen erheblichen Prozentsatz an Krankheiten der menschlichen Bevölkerung verantwortlich. Einige Viren (z. B. Influenza) sind saisonbedingt, während andere (z. B. Adenovirus) hauptsächlich unterschiedliche Altersgruppen betreffen. Respiratorische Viren können in einer beliebigen Bevölkerung für eine erhebliche Anzahl an Todesfällen verantwortlich sein. Mit der kommenden Einführung entsprechender Antivirentherapie gegen einige respiratorische Viren werden schnelle Siebtests zum Nachweis dieser Organismen unerlässlich, um eine Therapie frühzeitig bestimmen zu können. Die zwei heutzutage am häufigsten verwendeten Antivirus-Agenzien für respiratorische Viren sind Amantadin/Rimantadin für Influenza A und Ribavirin für RSV-Bronchiolitis. Beide Agenzien verfügen über unterschiedliche Wirkungsweisen, die jedoch meistens frühe Infektionsschritte wie das Eindringen oder das Freisetzen des Genoms (uncoating) einschließen40, 62. In physiologisch erzielbaren Konzentrationen blockieren Amantadin und Rimantadin spezifisch die Replikation von Influenza A12. Ribavirin verfügt über ein breites Spektrum an In-Vitro-Aktivität gegen eine Vielzahl an Viren wie RSV, Masern, Influenza A und B und Parainfluenza45,47,23.
Die Identifizierung von Viren wird im Allgemeinen auf eine der drei folgenden Arten durchgeführt: Kulturisolierung/-bestätigung, direkter Nachweis und Serologie. Hiervon ist Kulturisolierung/-bestätigung die Standardmethode in den meisten Labors. Sie ist bis heute die empfindlichste verfügbare Methode zum Nachweis von respiratorischen Viren und wird manchmal für die Bestätigung von Direktnachweisbefunden verwendet. Light Diagnostics™
Respiratory Viral Screening IFA Kit liefert mithilfe von monoklonalen Antikörpern für die Kulturbestätigung innerhalb von nur 60 Minuten klare und einfach zu interpretierende Ergebnisse.
2
Adenoviren sind für eine bedeutende Anzahl klinischer Atemwegserkrankungen verantwortlich. Erkrankungen der oberen Atemwege, die durch Adenoviren hervorgerufen werden, sind u. a. Erkältungen, Pharyngitis und Mandelentzündungen und kommen hauptsächlich bei Säuglingen und Kleinkindern vor. Bei annähernd 10% der Pneumonie im Kindesalter sind Adenoviren die wahrscheinliche Ursache44. Weitere, auf Adenoviren zurückzuführende Erkrankungen der oberen Atemwege sind unter anderen Bronchitis und Bronchiolitis31. Bei Kindern unter fünf Jahren ist Adenovirus für ca. 5 Prozent aller Fälle von ARD (acute respiratory disease, ARD-Infekt) verantwortlich. ARD kann sich in Nasenverstopfung, Coryza, Husten sowie manchmal Mandelentzündung, Fieber und Myalgie manifestieren. Beim Pharyngokonjunktivalfieber2 tritt Konjunktivitis mit ARD auf. Adenovirus wurde allgemein mit dem Pertussis-Syndrom assoziiert. Neue Studien legen jedoch nahe, dass das Vorhandensein von Adenoviren in diesen Fällen möglicherweise eine Reaktivierung eines im Tonsillargewebe vorhandenen latenten Virus aus Bordetella pertussis-Infektionen ist53.
Okulare Krankheiten, die aus einer Infektion mit Adenovirus entstanden sind, umfassen EKC (epidemic keratoconjunctivitis, Keratokunjunktivitis epidemica), akute hämorrhagische Konjunktivitis und akute Konjunktivitis follicularis.
Adenovirus steht mit mehreren Magen-Darm-Krankheiten in Zusammenhang und ist wahrscheinlich bei 7 bis 17% aller Gastroenteritiden im Kindesalter nachweisbar. Die Typen 40 und 41 wurden mit Diarrhöe und akuter Gastroenteritis assoziiert13,22,68.
Adenovirus wurde außerdem mit Intussuszeption3, akuter hämorrhagischer Zystitis54 und Meningoenzephalitis in Verbindung gebracht.
Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Adenovirus-Infektionen bei immungeschwächten Patienten möglicherweise nicht häufiger vorkommen als bei normalen Personen, jedoch schwerer verlaufen und häufiger tödlich enden können31.
Humane Adenoviren gehören zur Familie der Adenoviridae, Genus Mastadenovirus. Es handelt sich bei ihnen um unbehüllte Doppelstrang-DNA- Viren ikosaedrischer Form von 70 bis 90 nm Durchmesser30. Sie verfügen über einen Proteinmantel von 240 Hexon- und 12 Pentonkapsomeren.
Adenovirus kann in einer Vielzahl von Zelllinien kultiviert und isoliert und mit verschiedenen Methoden identifiziert werden. Geeignete Zelllinien sind unter anderen HEp-2, HeLa, KB und HEK. Graham 293-Zellen können für die Vermehrung der Typen 40 und 41 verwendet werden. Der Nachweis der Infektion wird in der Regel durch Immunfluoreszenz oder Enzym-Immunassay (EIA) nachgewiesen, ist jedoch auch durch Komplementfixierungs-, Hämagglutinationshemmungs- und Neutralisationsverfahren möglich34.
Influenza-Viren verursachen äußerst ansteckende respiratorische Krankheiten, die in der Regel zu Epidemien führen28. In den drei Typen A, B und C wird die Spezifität durch interne Nukleoprotein- und Matrixprotein-Antigene übertragen52.
Beim Erwachsenen führt eine Infektion mit Influenza-Virus im Allgemeinen zu Tracheobronchitis und Beteiligung der kleinen Atemwege42, 65 mit einer möglichen Entwicklung von Rhinitis und/oder Pharyngitis. Eine Infektion kann jedoch klinische Manifestationen von einem symptomfreien Verlauf bis hin zu Pneumonie mit Todesfolge aufweisen52. Dasselbe Spektrum einer klinischen Reaktion kann bei Kindern beobachtet werden, mit einigen deutlichen Unterschieden. Bei Kindern führen Influenza-Infektionen in der Regel zu hohem Fieber, das von fiebrigen Schüttelkrämpfen begleitet sein kann24,26,60,70,71. Influenza-Viren sind für 14 % kindlicher Fiebererkrankungen verantwortlich, bei denen die Symptome des Respirationstrakts ernst genug sind, um eine ärztliche Konsultation zu erfordern 24,71. Bei Kindern kommt häufiger eine Beteiligung des Magen-Darm-Trakts hinzu als bei Erwachsenen14, und sie entwickeln häufiger Myositis, Mittelohrentzündung und Krupp 29,38. Eine Infektion des Neugeborenen kann zu unerklärbarem Fieber führen48 und verläuft potenziell tödlich1,18,48,57.
Bei Kindern und Erwachsenen manifestieren sich Krankheiten des unteren Respirationstrakts, die mit einer Influenza-Infektion assoziiert sind, in drei Formen von Pneumonie: primäre Viruspneumonie, kombinierte viral-bakterielle Pneumonie und Influenza-Infektion gefolgt von bakterieller Pneumonie52.
Nichtpulmonale klinische Reaktionen auf eine Influenza-Infektion sind unter anderen Virämie, Kardial- und ZNS-Beteiligung, Reye-Syndrom und toxischer Schock52.
Die Influenza-Typen A und B rufen im Wesentlichen dasselbe Krankheitsspektrum hervor. Eine Infektion mit Typ A resultiert jedoch viermal
4
häufiger in einer stationären Einweisung als Typ B38, und Typ B führt häufiger zu Myositis und einer Beteiligung des Magen-Darm-Trakts11, 15, 36, 41.
Influenza vom Typ C führt selten zu Erkrankungen des unteren Respirationstrakts, ruft aber sporadisch Krankheiten des oberen Respirationstrakts hervor 38,19,50. Bei Erreichen des Erwachsenenalters haben beinahe alle Personen Antikörper gegen Typ C55.
Influenza-Viren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae. Sie sind pleomorph, gehüllt und enthalten ein segmentiertes, einzelsträngiges Negativ-Sense-RNA-Genom. Ihr Durchmesser liegt zwischen 80 und 120 nm39.
Durch Hinzufügen von Trypsin können Influenza-Viren in einer Vielzahl von Zelllinien kultiviert werden, wie MDCK (Madin-Darby canine kidney, Madin- Darby Hunde-Nierenzellen), A549-Lungenkarzinom und PMK (primary monkey kidney, primäre Affennierenzellen)20,64 wie auch die klassischen bebrüteten Hühnereier oder im Allantoin-auf-Schale-System17. Influenza-Virus kann durch Immunfluoreszenz-, Hämadsorptions- oder Hämagglutinationsverfahren mithilfe von Hühner- oder Meerschwein- Erythrozyten nachgewiesen werden. Die Isolierung/Kulturbestätigung stellt ein einfaches, empfindliches und relativ schnelles Verfahren für die Identifizierung von Influenza-Infektionen dar. Ein zytopathischer Effekt wird 3 bis 7 Tage nach Inokulation als Vakuolation und Zellverfall apparent.
Parainfluenza-Viren, kombiniert mit RSV, stellen die bedeutendsten Pathogene der oberen Atemwege bei Säuglingen und Kleinkindern dar4,6,7,37.
Es wurden vier Typen von Parainfluenza-Viren bei Kindern und Erwachsenen identifiziert. Die Typen 1 und 2 sind die Hauptursache für Laryngotracheobronchitis (Krupp). Die Krankheit verläuft bei Kindern zwischen 2 und 4 Jahren am schwersten66. Eine Infektion mit Parainfluenza Typ 3 kann ebenfalls zu Krupp führen und ist nach Respiratory syncytial virus die zweithäufigste Ursache für Säuglings-Bronchiolitis und – Pneumonie8,9,25,58,59. Der Krankheitsverlauf bei Infektionen vom Typ 3 ist bei Säuglingen unter einem Jahr am schwersten66.
Bei älteren Kindern und Erwachsenen kann die Krankheit asymptomatisch verlaufen oder wie eine normale Erkältung erscheinen67. Schwerer Krupp in früher Kindheit oder im Säuglingsalter kann in älteren Kindern oder Jugendlichen nach körperlicher Betätigung in bronchialer Hyperaktivität resultieren. Es bleibt jedoch unbestimmt, ob die bronchiale Hyperaktivität
bereits vorlag und die Pathogenese des Krupp beeinflusste, oder ob sie sich als Komplikation schweren Krupps entwickelt hat27,43.
Parainfluenza vom Typ 4 wurde bei Erwachsenen und Kindern nur mit leichten Erkrankungen der oberen Atemwege in Verbindung gebracht und ist in Zellkulturen schwer nachzuweisen66.
Parainfluenza-Viren gehören zum Genus Paramyxovirus der Familie der Paramyxoviridae. Es handelt sich bei ihnen um behüllte Viren mit einem Einzelstrang-RNA-Genom negativer Polarität und einem Durchmesser von 150- 200 nm10.
Parainfluenza-Viren werden am besten in primären Simian- oder humanen Nierenzelllinien und in LLC-MK2 angezüchtet, einer heteroploiden Nieren- Zelllinie des Rhesusaffen66. Trypsin ist im Medium für die Gewinnung der Typen 1 und 2, nicht jedoch des Typs 3 erforderlich. Die Virusinfizierung der Gewebekultur kann durch Hämadsorption von Meerschweinchen-Erythrozyten erkannt werden. Die Typen 2 und 3 können durch Synzytium-Bildung erkannt werden.
Im Alter von zwei Jahren haben die meisten Kinder RSV-Infektionen (Respiratory Syncytial Virus) durchlaufen. Diese gehören somit zu den wichtigsten durch ein Virus verursachten Kinderkrankheiten des unteren Respirationstrakts63. RSV-Infektionen resultieren in der Regel in Erkältungen mit übermäßiger Nasenschleimabsonderung, führen bei Erstinfektionen in 6 Wochen bis 6 Monate alten Säuglingen jedoch zu 25 bis 40 % zu einer Erkrankung des unteren Respirationstrakts63. In den meisten erforschten Gebieten war RSV für mehr Fälle von Pneumonie und Bronchiolitis verantwortlich als alle anderen mikrobiellen Pathogene46. Studien deuten darauf hin, dass RSV-Pneumonie und -Bronchiolitis in der Kindheit langfristig zu respiratorischen Anomalien führen können, wie eine abnorme Lungenfunktion, Asthma und wiederkehrender Husten und Bronchitis51.
RSV wurde außerdem mit SIDS (sudden infant death syndrome, plötzlicher Kindstod) in Verbindung gebracht, obwohl die Art der Assoziierung unbestimmt ist16,46,56,61,69.
Respiratory syncytial virus (RSV) gehört zur Familie der Paramyxoviridae und zum Genus Pneumovirus. Es handelt sich um ein gehülltes pleomorphes Virus mit einem Durchmesser zwischen 150 und 300 nm5,33,56 und einem Einzelstrang-RNA-Genom63.
6
RSV kann durch Immunfluoreszenz, EIA, Komplementfixierung, Neutralisierung oder Kulturisolation und –bestätigung nachgewiesen werden21,32,46,49. Für die RSV-Kultivierung ist eine Vielzahl von Zelllinien geeignet. Bei der Primärisolation sind HEp-2 oder HeLa63 zulässige Zelllinien, obwohl auch andere wie Vero, LLC-MK2 oder CV-l verwendet wurden. Das Virus erzeugt charakteristische zytopathische Effekte der Synzytium-Bildung und des Zellverfalls63.
Testprinzip
Das Light Diagnostics™ Respiratory Viral Screening IFA Kit verwendet eine indirekte Immunofluoreszenzmethode zum Nachweis von Viren in infizierten Gewebekulturen. Die mitgelieferten monoklonalen Maus-Antikörper werden an das entsprechende Virus-Antigen auf dem Objektträger der Einzelprobe gebunden. Ungebundene Antikörper werden mit PBS (phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vom Objektträger gewaschen. Anschließend wird ein mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG hinzugefügt, das an den Antigen-Antikörper- Komplex gebunden wird. Ungebundene markierte Antikörper werden mit PBS vom Objektträger gewaschen. FITC weist bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht eine apfelgrüne Fluoreszenz auf; daher kann der Komplex mithilfe von Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Zellfluoreszenz kennzeichnet eine positive Einzelprobe. Nicht infizierte Zellen werden wegen des Vorhandenseins von Evans Blue im FITC-konjugierten sekundären Antikörper mattrot angefärbt.
Das Respiratory Viral Screen-Reagenz wird zur Bestätigung des unterschiedslosen Vorhandenseins respiratorischer Viren - Adenovirus, RSV (Respiratory synctial virus), Parainfluenzatypen 1, 2 und 3 und Influenza A und B - verwendet. Die Qualität der Ergebnisse hängt von einer Vielzahl von Faktoren, wie dem Zustand der Zellen zur Kulturbestätigung, der verwendeten Fixierlösung sowie der Expertise der den Test durchführenden Techniker ab.
Kit-Komponenten
1.) Respiratory Viral Screen - 5007: Ein (1) 10 ml-Tropffläschchen mit monoklonalem Antikörpern gegen:. Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3 und Respiratory Syncytial Virus in PBS mit Protein-Stabilisator, und 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel).
Bereitgestellte Betrag ist ausreichend für 250 Tests. Schätzung basiert auf Tests von 40 ul Tropfen beruhen; tatsächliche Anzahl der Tests können variieren.
2.) Normal Mouse Antibody - 5014: Ein (1) 10 ml-Tropffläschchen mit normalem Maus-Antikörper für die Negativkontrolle in PBS mit Protein- Stabilisator, und 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel).
3.) Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate - 5008: Ein (1) 10 ml Tropffläschchen mit FITC-markiertem Ziege-Anti-Maus IgG-Antikörper in PBS mit 0,02% Evans-Blau-Gegenfärbung, 0,2% BSA und 0,1%
Natriumazid als Konservierungsmittel.
4.) Phosphate - Buffered Saline (PBS) - 5087: Eine (1) Packung Phosphate Buffered Saline-Salze ergibt nach Auflösen in destilliertem Wasser 1 Liter. In einem sauberen, verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur lagern.
5.) Tween® 20 / Sodium Azide Solution (100X) - 5037: Ein (1) 10 ml- Fläschchen mit einem Konzentrat von Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaurat (Tween 20) und Natriumazid (NaN3), in PBS 1:100 zu verdünnen.
6.) Mounting Fluid - 5013: Ein (1) 10 ml-Tropffläschchen mit Tris- Puffer, Glyzerin, Fluoreszenzverstärker und Natriumazid als Konservierungsmittel. Bei temperatur lagern bei 2º - 25ºC.
