DETERMINACIÓN DE DNA DE Mycobacterium tuberculosis EN UNA MOMIA MUISCA POR METODOS MOLECULARES:
SPOLIGOTYPING Y PCR- IS6110
SANDRA EDITH BELLO ROSAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLOGICAS CON ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA CLINICA
BOGOTÁ D.C. Enero de 2006
DETERMINACIÓN DE DNA DE Mycobacterium tuberculosis EN UNA MOMIA MUISCA POR METODOS MOLECULARES:
SPOLIGOTYPING Y PCR- IS6110
SANDRA EDITH BELLO ROSAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para obtener el título de
Magister en Ciencias Biológicas con Énfasis en Microbiología Clínica
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLOGICAS CON ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA CLINICA
BOGOTÁ D.C. Enero de 2006
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
DETERMINACIÓN DE DNA DE Mycobacterium tuberculosis EN UNA MOMIA MUISCA POR METODOS MOLECULARES:
SPOLIGOTYPING Y PCR- IS6110
SANDRA EDITH BELLO ROSAS
APROBADO
___________________________ _____________________ Martha Inirida Guerrero M.Sc Arley Gómez
López Ph.D.
Directora Codirector
____________________ ___________________________ Hugo Diez M.Sc. Abel F. Martínez Martín MD. M.Sc. Jurado Jurado ______________________ Fredy O. Gamboa J. Ph.D Jurado
DETERMINACIÓN DE DNA DE Mycobacterium tuberculosis EN UNA MOMIA MUISCA POR METODOS MOLECULARES:
SPOLIGOTYPING Y PCR- IS6110
SANDRA EDITH BELLO ROSAS
APROBADO
___________________________ __________________________ Angela Umaña, Ph.D Carlos Corredor Pereira, Ph.D.
…A mis padres y a mi hijo Alejandro, quien me cedió parte de su valioso e irrecuperable tiempo para cristalizar
este sueño …
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primera instancia al grupo de Investigación de Historia de la Medicina y la Salud de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, en especial al doctor Abel Fernando Martínez, director del grupo, por su continuo apoyo y su colaboración, por el aporte de sus conocimientos, de documentación y fotografías, al doctor Bernardo Meléndez A. y Jefe Fred Manrique, miembros del grupo de investigación, por su aporte de material bibliográfico, fotografías y constante apoyo. A la odontóloga Susana Meléndez A. por su colaboración con la toma de muestra y el préstamo del equipo para la toma de la muestra, A la doctora Claudia Marcela Castro por su colaboración en parte del procesamiento de las muestras y apoyo incondicional, al Instituto Colombiano de Antropología e Historia –ICANH- por el permiso otorgado para estudiar la momia, al Museo Arqueológico de Sogamoso, por permitir el estudio en una de sus colecciones, al doctor Hugo Sotomayor y la antropóloga Alejandra Valverde, por su aporte bibliográfico inédito, a Luís Buitrago Bello, por el aporte fotográfico presentado en este escrito,
A la doctora Martha Inírida Guerrero, directora de la investigación, por su constante apoyo, por el aporte tanto de material bibliográfico inédito como no inédito, y por la infinita paciencia que tuvo durante el estudio.
A la Universidad del Quindío, por el apoyo logístico y acompañamiento en el desarrollo de la parte práctica de este trabajo, especialmente a la bióloga Sandra Milena Coronado , y al estudiante de biología Juan Felipe Ramírez.
A la familia Vaca Barreto, por su colaboración y apoyo, a mis padres y a mi hijo, por su credibilidad, apoyo constante y eterna paciencia, a Ana Rosas por su confianza y apoyo incondicional
Este trabajo de grado es presentado el 16 de agosto de 2006 TABLA DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCIÓN ……… 15 2.
MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA ………. 17 2.1.
Paleopatologia…………..………..17 2.1.1.
Estudios y evidencias de diferentes microorganismos en momias………..….18 2.1.2.
Estudios de M. tuberculosis en momias ….….………..……….19 2.2. La momia en estudio ……….……….. 27 2.3. Tuberculosis……….……….……….…….. 31 2.3.1. Historia……….……….……. 31 2.3.2. Agente etiológico………...………….………...……. 36 2.3.3. características d ela enfermedad..………..……… 33 2.3.4.
Epidemiología ……… ……….………..………… 39 2.3.5.
Tecnicas para detectar Mycobacterium Tuberculosis ..……...….. 42 2.3.5.1
2.3.5.2.
Téecnicas moleculares... 43 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION……….. 51
3.1 Formulación del problema
... 51 3.2. Justificación de la Investigación ………. 51 4. OBJETIVOS………..…………. 53 4.1. Objetivo principal……….. 53 4.2. Objetivos específicos ………. 53 5. MATERIALES Y METODOS………. 54 5.1. Diseño de la investigación……….. 54
5.1.1 Poblacion de estudio y muestra……….. 54
5.1.2 Variable del estudio ……….. 54
5.2. Métodos ………. 54 5.2.1 Toma de muestra ………... 54
5.2.1.1 Primera toma de muestras. Muestras A ……… 54
5.2.1.2 Segunda toma de muestra. Muestras B ……… 56
5.2.2 Procesamiento de las muestras ……….. 56
5.2.2.1 Descalcificación ………..… .56
5.2.2.2 Ruptura de membranas ……….… 56
5.2.2.3 Extracción de DNA micobacteriano ………... 56
5.2.2.4 Amplificación del locus DR por PCR ……….…. 53
5.2.2.5 Hibridación en membrana de Spoligotyping ……….…. 54
5.2.2.6 Revelado de la película previamente impresionada ……….… 56
5.2.2.7 Amplificación por PCR de la secuencia de inserción IS6110. 61
5.2.2.8 Electroforesis para evidenciar la amplificación de IS6110 … .. 62
5.3. Recolección de la información (momia) …….……….……… ..62
5.4. Analisis de informacion (momia)………..………….…………. 63 6. RESULTADOS Y DISCUSION ………. 64 6.1. Resultados de spoligotyping ……… 64 6.2. Resultados de PCR-IS6110 ……… ……….. 66 7. CONCLUSIONES ………..…….………. 71 8. RECOMENDACIONES ……….……….. 72 9. REFERENCIAS………...………. 73 10. ANEXOS ………. 80
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diferentes especies de micobacterias ……….. 34
Tabla 2. Genes de distinción probados entre M. tuberculosis y M. bovis.45
Tabla 3. Primers específicos para amplificar el Locus DR del genoma de M. tuberculosis. ……… 49
Tabla 4. Oligonucleotidos de los espaciadores………....… 49
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tuberculosis en una vertebra ……… .25
Figura 2. Cabeza femoral con ¿Tuberculosisi? Soacha. ……… 25
Figura 3. La momia en estudio ……… ...29
Figura 4.Cavidad abdominal de la momia ……… .30
Figura 5. Lesión a nivel de la 7ª vértebra dorsal………….………... 30
Figura 6. Lesión a nivel de T7 por medio de una Radiografía simple .. 31
Figura 7. Prevalencia de Tuberculosis a nivel mundial 2004 y ,
Figura 8. Determinación de la tasa de tuberculosis en Boyacá en el año
2002. Ubicación de Sativanorte donde se encontró la momia ……… ... 42
Figura 9. Inserción IS6110 del complejo Mycobacterium tuberculosis .. 45
Figura 10. Genoma de Micobacterium tuberculosis ……… … 47
Figura 11 .Esquema de los DR del genoma de M. tuberculosis ……… … 48
Figura 12. Esquema de la cámara de hibridización de
spoligotyping ………..……..….. 50
Figura 13. Montaje de muestras en minibloter e hibridización ……… ….59
Figura 14. Membrana en la botella giratoria y horno de hibridación …. 60
Figura 15. Revelado de spoligotyping con 1 hora de exposición …… .. 65
Figura 16. Revelado de spoligotyping con 12 horas de exposición… …65
Figura 17. Mapa de espaciadores de oligonucleótidos de diferentes especies de micobacterias del complejo tuberculosis ………. 66
Figura 18. Resultado del corrido electroforético IS6110 con cámara polaroid……… ………67
Figura 19. Resultado del corrido electroforético IS6110 con cámara digital ……… ………68
Figura 20. Foto Resultados de la repetición de PCR-IS6110. ………... 69
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Ficha técnica de la momia S010 –IV del museo arqueológico de Sogamoso………80
Anexo 2. Reporte de carbono14 de la momia S010- IX ………. 85
Las muestras de restos de pulmón, de una lesión ósea que sugiere un absceso a nivel de T4, compatible con un mal de Pott, y de restos de pulverizado en una momia muisca que del siglo XIV, de sexo masculino y de 25 a 30 años de edad aproximadamente, por estudios antropométricos, encontrada en el municipio de Sativa Norte, Boyacá, Colombia fueron analizadas por dos métodos moleculares: spoligotyping y PCR-IS6110, para determinar la presencia de DNA de Mycobacterium tuberculosis. La técnica de spoligityping no mostró resultados positivos, mientras que la técnica de PCR-IS6110 mostró bandas de 254 Kb compatibles con una inserción del genoma de micobacterias pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis la muestra interna de absceso de la momia. Se encontró DNA micobacteriano por primera vez en muestras momificadas en Colombia. Se confirma la presencia de un bacilo del complejo tuberculosis, posiblemente Mycobacterium tuberculosis en la era prehispánica.
ABSTRACT
The samples of lung remains and of a bony lesion at level of T4 that suggests a wrong of Pott dissease, in a mummy muisca since 1.300 + / - B.C., male sex, and 25 – 30 years old approximate by antropometric studies, find in Sativa Norte a small town in boyacá, Colombia were analyzed by two molecular methods: spoligotyping and PCR-IS6110, to determine the presence of DNA of Mycobacterium tuberculosis complex. The spoligotyping technique didn't show positive results, while the technique of PCR-IS6110 showed compatible bands of 254 Kb with an exclusive insert of the genoma of the micobacterias belonging to the complex tuberculosis, in one of the samples of the abscess of the mummy. Isolating DNA micobacteriano for the first time in remains mummified by molecular methods in Colombia. Confirms the presence of the tuberculous complex bacillus in the prehispanic time.
La Paleopatología es una ciencia que ha tenido gran auge en los últimos años a nivel mundial, donde se fusionan todas las ciencias posibles para realizar estudios diseñados, con el fin de responder un sinnúmero de interrogantes, que ayudarían a descifrar y comprender parte de la historia, el origen de muchas enfermedades, comportamientos sociales y culturales que han quedado enterrados en el silencio de comunidades antiguas. Hoy se descubren esos ancestros que han dado por herencia una inmensa fortuna, para que los descendientes se apropien y conozcan su vivir en aquella época y el impacto en la nuestra.
Las evidencias paleopatológicas de una momia muisca que data del siglo XIV, de sexo masculino y de 25 a 30 años de edad aproximadamente, por estudios antropométricos, encontrada en el municipio de Sativa Norte, en el departamento de Boyacá, sugiere al Grupo de Investigación de Historia de Salud en Boyacá, de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, ubicada en la ciudad de Tunja; estudiar desde todos los puntos de vista posibles, a este ancestro colombiano.
Se realizó un estudio antropológico, odontológico, patológico, histórico, sociológico, microbiológico, radiológico, por mencionar algunos, de esta momia.
Con el deseo de responder muchos interrogantes a cerca de la misma, y aportar datos valiosos en muchas areas del conocimiento. El enfoque de este estudio es básicamente de tipo microbiológico, teniendo en cuenta que la momia presenta una lesión a nivel de columna vertebral (T7), que puede sugerir un absceso compatible con un típico mal de Pott, característico de la tuberculosis (TBC) extrapulmonar; además se observan lesiones a nivel de los restos del pulmón, lo que hace pensar también en una TBC pulmonar. Esta hipótesis se verificó ya que las lesiones en mención son compatibles con otras enfermedades tanto de tipo infeccioso como no infeccioso.
Para determinar si la causa de las lesiones está dada por un Mycobacterium tuberculosis, se aisló DNA cromosomal de la micobacteria y se analizó por los métodos moleculares: Spoligotyping y PCR-IS6110 ya que permite trabajar con material antiguo y evita falsos positivos por la presencia de otras micobacterias que habitan en la tierra donde posiblemente han sido enterradas las momias o el ambiente donde han permanecido por muchos años.
El objetivo general del presente estudio fue determinar la presencia de DNA cromosomal de Mycobacterium tuberculosis en una lesión de columna vertebral a nivel de T7 en una momia muisca por los métodos descritos por primera vez en Colombia. La técnica de PCR-IS6110 mostró una banda de 254 Kb compatible con la inserción IS6110 de las micobacterias del complejo tuberculosis, confirmando la presencia del DNA de una micobacteria del complejo M. tuberculosis en muestras momificadas por primera vez en Colombia.
2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. PALEOPATOLOGÍA
El término paleo (Del griego. παλαι ς, antiguo). Significa en general “antiguo” o “primitivo”, referido frecuentemente a eras geológicas anteriores a la actual. (Paleocristiano, paleolítico). La paleopatología como tal, hace referencia al estudio de diferentes patologías evidentes o no, en restos humanos y animales que datan de mucho tiempo.
El punto crucial alrededor de los análisis de los restos con tuberculosis radica en la determinación de criterios para evaluar la presencia de la enfermedad, porque ésta tiene varias formas de presentación y manifestaciones. Las variables culturales y ambientales como domesticación, sedentarismo, agricultura, crecimiento demográfico, clima y diversidad de microambientes; son asignaciones importantes para los investigadores (Durrance. 1998).
Desde el punto de vista paleopatológico en lo que refiere al mal de Pott, las características mas importantes de las lesiones de la columna vertebral son: el compromiso frecuente de una a cuatro vértebras, la destrucción ósea es prominente, mientras que la regeneración ósea es rara, el compromiso de la parte anterior del cuerpo vertebral es frecuente, la cifosis es mas frecuente en la columna torácica, el compromiso vertebral óseo aunque se puede presentar, no es frecuente, con la excepción de los que se presentan en el atlas y el axis; los abscesos extravertebrales son frecuentes, se presentan entre el 50% y el 90% de los casos, aunque la fusión
espontánea ocurre como expresión de la regeneración ósea masiva y es muy rara (Sotomayor, 2004; Gerszten P., 2001).
En cuanto al diagnóstico de tuberculosis pulmonar en los estudios paleopatológicos cuando se conserva el pulmón; el hallazgo del complejo de Ghon
es generalmente un distintivo suficiente para hacer el diagnóstico. Cuando únicamente se encuentra tejido esquelético diferente de la columna vertebral, a menudo el diagnóstico no tiene el valor de precisión que se tiene cuando se dispone de restos de la columna y en especial, cuando se encuentran las vértebras con las características del mal de Pott (Sotomayor. 2004), sin embargo se hace necesario la identificación del ADN micobacteriano específico, utilizando técnicas de alta sensibilidad y especificidad, que puedan aplicarse al material antiguo, tal como lo sugiere Zink en su artículo publicado en el año 2003, el cual ha sido la base para desarrollar el presente estudio (Zink, 2003).
2.1.1.
ESTUDIOS Y EVIDENCIAS DE DIFERENTES MICROORGANISMOS EN MOMIAS
De acuerdo con la literatura, existen algunos parámetros clínicos que pueden orientar hacia el diagnóstico de algunas enfermedades infecciosas en momias, ya que pueden producir deformaciones y modificaciones del tejido óseo pero que no siempre existen suficientes parámetros para su identificación, lo cual dificulta el análisis y el diagnóstico. (Durrance 1998).
Existen evidencias en las artes plásticas de las culturas Mochica (Perú) y Tumaco (Colombia), de enfermedades como la leishmaniasis, la bartonelosis; la enfermedad de Chagas, hoy suficientemente documentada como problema en remotos tiempos prehispánicos por
los estudios de momias en el norte de Chile, la Tungiasis producida por la Tunga penetrans o nigua; la treponematosis, la sífilis producida por el Treponema pallidum, comprobada en Colombia en los huesos de las piernas y en los cráneos de hombres sepultados hace 5025 y 4039 años antes del presente, en Soacha (Cundinamarca), la cual pudo propagarse con facilidad por la libertad sexual que se permitían antes del matrimonio. (Sotomayor H., 1999).
En los últimos años, los métodos usados en biología molecular se están aplicando exitosamente en la paleoparasitología. Se ha logrado analizar ADN de momias y de coprolitos amplificándolo por medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP), permitiendo la identificación precisa de parásitos en muestras antiguas (Ghul F. et al. 2004). Se ha confirmado la presencia de Tripanosoma cruzi en tejidos de cuatro mil años de antigüedad pertenecientes a momias de la cultura chinchorro, confirmando la antigüedad de esta enfermedad (Guhl F., 1997), T. cruzi también ha estado presente en cuerpos de momias chilenas que datan de nueve mil años de antigüedad (Aufderheide, 2004). Se ha demostrado la presencia de ADN del Virus Linfotrópico Humano de Células T tipo I (HTLV- I) en medula ósea de una momia chilena, cuya secuencia es similar a la encontrada en Japón, asumiéndose el origen del retrovirus en Chile, sucedió como consecuencia de una migración humana prehistórica (Chuan Li H., 1999) y se ha observado DNA de Toxoplasma gondii en tejidos de ratón disecados experimentalmente (Barge M.A., 2004).
Además, se han realizado estudios micóticos con fines de conservación en tres momias pertenecientes a la colección del Museo Casa Marqués de San Jorge de la ciudad de Bogotá y en veinte momias pertenecientes a la colección del antropólogo Eliécer Silva Celis, del Museo Arqueológico de Sogamoso, para identificar los
posibles microorganismos causantes del deterioro, sin embargo es necesario profundizar los estudios para verificar si la flora micótica actúa favorablemente en el deterioro de las momias, o por el contrario las protege de la contaminación bacteriana, por la presencia de sustancias penicilínicas (Martínez- Sotomayor 2006).
2.1.2.
ESTUDIOS Y EVIDENCIAS DE M. tuberculosis EN MOMIAS
A pesar de la diversidad de etiologías que causan lesiones en los huesos y tejidos blandos y la relativa carencia de métodos apropiados para detectar patologías en material antiguo, se pueden encontrar dos bloques que agrupan los tipos de tuberculosis, pulmonar y ósea. (Durrance 1998), que se considerarían realmente, en pulmonar y extrapulmonar.
La tuberculosis pulmonar puede destruir la cavidad pulmonar (costillas y vértebras), formar nódulos o tubérculos, úlceras, fístulas, y abscesos; la tuberculosis ósea ocasiona deformaciones en la epífisis de los huesos largos, lesiones en el occipital y en las vértebras. Estas lesiones pueden confundirse con las dejadas por otros microorganismos (Durrance 1998).
Puede que la distribución del ADN de M. tuberculosis no sea uniforme en las muestras estudiadas. Así, en lesiones de Mal de Pott y de las costillas, provenientes de un entierro medieval con una antigüedad de mil años, se encontró la presencia de ácidos nucléicos de micobacterias del complejo M. tuberculosis con la secuencia de inserción IS6110, en las lesiones de la enfermedad de Pott y sólo los ácidos micólicos en las lesiones de las costillas.
En muestras de huesos de 37 momias del Antiguo Egipto, fechadas entre el 2120 y 500 años a.C. y otras 4 de 3000 años a.C, se halló ADN de M. tuberculosis en la mayoría de los restos con lesiones típicas de tuberculosis ósea, en un tercio de las muestras con lesiones inespecíficas pero probables tuberculosas y en un séptimo de las muestras sin lesiones específicas (Zink, 2001). En los restos óseos y de tejidos de 85 momias de diferentes tumbas halladas en Tebas Occidental, Alto Egipto donde se enterraba a la gente de la clase social alta, pertenecientes a los períodos Imperio Intermedio (2050- 1650 a.C.) y Período Tardío (hasta cerca de 500 a.C.), se aisló ADN de M. tuberculosis en 25 muestras. Con la técnica de spoligotyping (spacer oligonucleotide typing) se determinó exitosamente en 12 de las 25 muestras que se trataba del M. africanun , en aquellas correspondientes al Imperio Intermedio y de M. tuberculosis en el Período tardío. De esto se infiere que el M. tuberculosis está relacionado ancestralmente con el M. africanun mas que con el M. bovis, como lo habían postulado estudios anteriores (Zink, 2003). En una pleura calcificada perteneciente a unos restos no momificados, con 1400 años de antigüedad, se demostró la presencia del ADN de M. tuberculosis que fue confirmado con la determinación de los ácidos micólicos. (Donoghue, HD. 1998). En los restos óseos de dos individuos, hallados en dos regiones distintas de Lituania, con lesiones sugestivas de tuberculosis ósea y con una datación de 1.000 años a.C., se halló el ADN de M. tuberculosis (Faerman, MJ. 2000). En restos óseos de la antigua Hungría, pertenecientes a los siglos VII, VIII y XVIII, se encontró la presencia de ADN del M. tuberculosis en 2/3 de los casos, con cambios típicos o característicos, en 3/6 de los casos probables y en 3/6 de los casos con cambios inespecíficos (Haas, CJ. 2000). En tres muestras óseas de entierros medievales, con lesiones características de tuberculosis, se halló ADN de M. tuberculosis; y, se determinó la gran similitud de los ADN hallados
con el M. tuberculosis actual y ninguna relación con el M. bovis. (Taylor, 1999 ). En nueve restos óseos de un entierro rural del medioevo inglés con evidentes signos de tuberculosis ósea, se usaron técnicas de PCR para determinar si la infección fue debida a M. tuberculosis o M. bovis. En todas las muestras se halló sólo el ADN de M. tuberculosis (Mays,S, 2001).
En 1994 se descubrieron 265 entierros con criptas selladas en la Iglesia Dominica de Vac, en Hungría, correspondientes a un período entre 1731 y 1838. Se halló que el 55% de los restos óseos, de 168 individuos, tenían ADN de M. tuberculosis , existiendo una buena correlación entre las lesiones óseas y el resultado de la técnica de PCR. De esta manera se corroboraba que la tuberculosis fue muy prevalente en Europa en los siglos XVIII y XIX (Fletcher, H; 2003).
EN AMERICA
Un estudio publicado en 1981, de once momias encontradas en el sur de Perú y norte de Chile, sugiere la presencia de tuberculosis en dos de ellas, las número 6 y 7, ya que dieron positivo para una coloración de Zielh- Neelsen, confirmando la presencia de bacilos ácido- alcohol resistentes (BAAR), sugiriendo la presencia del bacilo de la tuberculosis pulmonar (Durrance. 1998), aunque el hecho de encontrar BAAR en una coloración, no es suficiente para afirmar que se trata de M. tuberculosis, pues es necesario recordar que existen micobacterias ambientales, que pueden encontrarse en la tierra, en el agua o incluso en el ambiente, donde posiblemente tuvieron contacto con la momia; y por lo tanto, la micobacteria encontrada puede ser producto de una contaminación durante la manipulación en dichas momias (Salo et al. 1994).
Existe un reporte donde se estudiaron cinco momias excavadas del desierto de Atacama en Chile, a las que se les analizó tejido óseo y
tejido blando, con el fin de encontrar segmento de DNA de M. tuberculosis, para lo cual sometieron dichas muestras a la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (Polimerasa Chain Reaction), dando como resultado la ausencia del bacilo, que inicialmente se pensó fuesen M. tuberculosis, por las lesiones asociadas (Salo et al, 1995, Durrance 1998).
Se analizó la momia de una mujer de aproximadamente 40 años de edad, mediante PCR, encontrando el fragmento IS6110 correspondiente a los microorganismos pertenecientes al complejo M. tuberculosis, donde se encuentra M. tuberculosis , ratificando el diagnóstico inicial realizado con base en los nódulos calcificados en el pulmón de la momia (Salo et al. 1994).
El estudio de 483 esqueletos y momias halladas en Arica, en Chile, datados entre 2000 a.C. y 1500 d.C., reveló la presencia de M. tuberculosis en el 1% de los restos individuales. Los casos de tuberculosis se agrupan en el período comprendido entre los años 500 y 1000 d.C., correspondiendo con el desarrollo de sociedades agro- pastorales; y, en ellos la prevalencia de tuberculosis en los restos fue de 2%. También se demostró la presencia del M. tuberculosis en restos óseos con signos de Mal de Pott, pertenecientes a una niña de doce años de edad, datados en el año 1000 d.C. (Arriaza, BT; 1995). Se encontró ADN de Mycobacterium tuberculosis en una lesión pulmonar, de un cuerpo momificado espontáneamente, que correspondía a una mujer adulta del Sur peruano, con una antigüedad de 1000 años (Salo, 1994). En tejidos de las áreas genitales de doce momias, que según el estudio son procedentes de los Andes sudamericanos, que se encuentran en el Museo de Historia Natural de Nueva York, con dataciones del año 140 al 1200 d.C., se halló el ADN de microorganismos pertenecientes al complejo M. tuberculosis en dos muestras, y otras micobacterias en siete de las muestras (Konomi, N; 2002). Sobre la
existencia de la tuberculosis precolombina, Morse (1961), revisó histológicamente las momias investigadas inicialmente por García-Frías, agregando elementos a favor de la existencia de tuberculosis antes de la conquista. Posteriormente Allison y col. (1973), encontraron varios desórdenes en órganos de un infante momificado, perteneciente a la cultura Nazca, datado en el 700 d. C. En los años siguientes, estos autores exponen diferentes casos de tuberculosis, confirmando su propagación en las comunidades amerindias previas al desembarco europeo. (Buikstra, J. y S. 1991). Análisis realizados en un varón adulto de la cultura Nazca con una antigüedad de 1000 años, demostraron la presencia de una espondilitis tuberculosa o Mal de Pott, donde se ha confirmado la presencia del Mycobacterium tuberculosis a través del estudio del ADN (Lombardi, G.P. 2000).
EN COLOMBIA
El estudio de ADN micobacteriano en momias en Colombia es relativamente una actividad nueva, por lo tanto no se cuenta con metodologías específicas y técnicas estandarizadas, desafortunadamente las técnicas de aislamiento por cultivo no son efectivas para ser aplicados en tejidos momificados o material arqueológico (Salo et al. 1994).
Los primeros testimonios sugieren la presencia de tuberculosis vertebral tanto en la cultura Muisca como en el resto del territorio colombiano, (Martínez 2006). En Colombia se han detectado lesiones compatibles con tuberculosis óseas en restos Muiscas, Guanes y Quimbayas tardíos, fechados desde los siglos XI a XIV d.C. (fig 1)., en una muestra ósea procedente del cementerio prehispánico de Soacha (siglos XI - XIII d. C.), en la sabana de Bogotá, perteneciente a los Muiscas tardíos (Sotomayor 1999, Martínez 2006) (Fig 2). El análisis osteológico de cinco tumbas excavadas ( 1, 35, 42, 43,
T-61) y una osamenta recolectada superficialmente, conducen a los investigadores a proponer este diagnóstico. Los seis ejemplares registran alteraciones vertebrales representadas por destrucción de cuerpos y segmentos paradiscales con cavitación de los mismos, comunes a los dos sexos y acentuadas en dos de los individuos (Rodríguez, J. V. 1987, Martínez 2006).
Otros hallazgos se encuentran en el yacimiento arqueológico de Marín, cerca a Samacá, en Boyacá, en el cual se informa sobre la presencia de alteraciones osteolíticas cavitatorias redondeadas en las vértebras lumbares, desde L2 a L5, en el individuo N° 36, correspondientes a un adulto joven, de sexo femenino. El examen morfoscópico y radiológico sugiere el diagnóstico de tuberculosis (Boada, A.M. 1988).
Los casos de tuberculosis advertidos en la muestra de Soacha, fueron objeto de una revisión monográfica por parte de Arregocés (1989) , confirmando la propuesta argumentada inicialmente por J. V. Rodríguez,
Figura 1. Tuberculosis en una vertebra. Bugalagrande (Valle del Cauca). Laboratorio de Antropología Física. Universidad Nacional de Colombia. Tomado de Sotomayor 1999.
Figura 2. Cabeza femoral con ¿Tuberculosisi? Soacha. Laboratorio de Antropología
Física. Universidad Nacional de Colombia. Tomado de Sotomayor 1999
quien agregó nuevos elementos al conocimiento del estado patológico, demográfico y nutricional de la población Muisca, que ocupó este punto del altiplano y que fueron comparados con otras muestras procedentes de varios lugares de la Cordillera Oriental - muiscas, laches, guanes y chitareros- (Martínez 2006). Del territorio Guane se estudiaron dos momias, realizando radiografías y escanografía, lo que permitió evidenciar entidades patológicas compatibles con tuberculosis en un individuo adulto femenino y una calcificación pulmonar en un infante. La momia N°1 G- 194, de sexo femenino, adulto joven, muestra imágenes nodulares calcificadas a nivel parenquimatoso y subpleural en el hemitórax izquierdo, que pueden ser granulomas relacionados con tuberculosis, no
extendidas al tejido óseo, según se advierte en las placas radiográficas y escenográficas. La momia N° 2, G~12980, infantil, presenta un engrosamiento y calcificación pleural lobular, acentuada al lado derecho. La antigüedad de los especimenes es de 1325± 160 A.P. para la momia N° 1 y 495± 235 A.P., para la momia N° 2 (Correal, G. I. Florez 1994). Uno de los hallazgos más importantes, en el cual es claro la existencia de este padecimiento, es en el individuo T1, masculino de 35- 40 años, procedente de Bugalagrande, en el Valle del Cauca, perteneciente al período Quimbaya Tardío (siglos XI- XVI d. C.), El esqueleto muestra trastornos en diversos puntos del cuerpo, evidenciados por abscesos en cráneo, mandíbula, costillas, vértebras y pelvis. Las secuelas de la enfermedad están representadas en la cifosis angular, cavitaciones, cloacas y demás lesiones osteolíticas que coinciden con las propuestas de otros autores para casos semejantes. Las irregularidades encontradas en diversos huesos argumentan un Mal de Pott, causante de la muerte del individuo, tras notable resistencia inmunológica debida a su buen estado físico y nutricional (Rodrígez, J.V. 1997). Se realizan estudios sobre una momia de sexo masculino y edad adulta joven, encontrada en una cueva del Departamento de Santander, en Colombia, en la cual se demuestra la existencia de Mal de Pott a través del estudio del ADN del M. tuberculosis , además de estudios imagenológicos, morfológicos y antropométricos, con lo que se observa la existencia de una gibosidad a nivel de T11- 12, con calcificaciones en la pared torácica y engrosamiento. (Etxeberria, F, Romero, W M. y Herrasti, L. 2000). A la momia del anterior caso, se le realiza un nuevo estudio por medio de la técnica de ribotipificación de ADN realizada en Estados Unidos. Estas muestras generaron un fragmento de 1100 pb (Sotomayor 2004), el cual no fue secuenciado, careciendo de rigor científico para afirmar la presencia de M. tuberculosis.
2.2. LA MOMIA EN ESTUDIO
Se entiende por momificación a los métodos de conservación de un cuerpo de manera natural o artificial, ésta última se refiere a la intervención intencional del hombre en dicho proceso (Martínez 2005). La momia muisca objeto de estudio, presenta una momificación artificial.
En el museo Arqueológico de Sogamoso de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, el antropólogo Eliécer Silva Celis, guarda desde 1962 una momia identificada con el número 44A2001 (Martínez 2006) y recodificada como S010- IX en año 2002 (Valverde 2002)(Anexo 1), aceptada por el Inventario Oficial de Bienes y Muebles del Patrimonio Nacional realizado por el Instituto Colombiano de Antropología e Historia (ICAN); datada por la Universidad de Uppsala 615 + / - 35, que equivale al prehispánico siglo XIV de nuestra era y exactamente al año 1335 + / - 35 (1950 – 615) (anexo 2), que fue entregada para la Exposición “Medicina Muisca”, realizada en el Museo de Historia de la Medicina y la Salud de la UPTC en el 2002, en Tunja; al interrogar sobre sus orígenes, se encontró que era oriunda de Sativanorte (Fernandez, 1999, Martínez 2005). Un manuscrito encontrado en la caja donde estaba guardada la momia en el depósito del Museo Arqueológico de Sogamoso, indica que fue entregada por el señor Abraham López Ávila, en 1962, y procede del municipio boyacense de Sativanorte, perteneciente al Cacicazgo de Tundama y estaba ubicado al Norte del territorio Muisca, en límites con los Laches (Martínez 2005). En una visita realizada por miembros del grupo de investigación al campo de la zona donde fue encontrada la momia S010- IX, en la cuenca medio del Chicamocha, en el municipio de Sativanorte, limitando con Sativasur enfrente de Socotá, y logrando ubicar a los hijos y a la viuda de Abraham López Ávila, identificaron la momia
S010- IX como la entregada, por su padre y esposo, al Dr. Silva Celis en 1962, descartándose la procedencia de Gámeza.
Manifestaron además que la momia fue encontrada por unos niños que la “apedrean y estrellan” y posteriormente es rescatada por Abraham López Ávila, quien la mantiene en su casa, en el patio, a la intemperie, durante más de seis meses antes de empacarla en una caja de cartón y llevarla al Museo Arqueológico de Sogamoso, donde se la entrega al Dr. Eliécer Silva y donde permanece, en la caja de cartón, por 40 años.
Este material antropológico fue conservado en Sogamoso, en el Museo Arqueológico de la UPTC, sin registrarse ninguna información contextual básica, como el sitio especifico del hallazgo arqueológico, el estado general, los elementos asociados al entorno, el ajuar funerario. Tampoco se conoce un estudio particular realizado sobre la momia S010- IX, en estos 43 años excepto el realizado por investigadores de la UPTC y la Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud (FUCS) (Martínez, Sotomayor. 2006) y la datación gestionada por el Grupo de Investigación de Historia de la Medicina y la Salud en Boyacá, de la UPTC (Anexo 2).
Descripción Morfológica
La momia se encuentra desenfardelada, con ausencia de la extremidad inferior izquierda, con pérdida parcial del miembro inferior derecho, del cual se conservan la pierna y el pie. Los miembros superiores se encuentran en flexión, las manos entrelazadas y atadas con un cordón, colocadas al lado derecho de la cabeza. (Fig. 3).
Figura 3: La momia en Estudio. Momia S010–IXX de la colección Silva Celis del
Museo Aqueológico de Sogamoso. (Momia en estudio) (Foto: Luis Buitrago B.) (Cortesía Museo HMYSB-UPTC)
En el interior de la cavidad toráxica se observa costillas, músculos, vértebras y restos del pulmón izquierdo en su interior (fig 4). A nivel de la 7ª vértebra dorsal, delante de la cara anterior de su cuerpo vertebral, se puede observar lo que parece un plastrón o los restos de un posible absceso formado a este nivel, a éste nivel, delante de la cara anterior de su cuerpo vertebral, se observan restos de un absceso prevertebral, en forma de huso, de 6 x 4 x 3cm, relacionado con fractura de los cuerpos vertebrales de T7 y T8. La 7ª y 8ª costillas izquierdas se muestran desplazadas hacia arriba en contraposición del resto de las demás de la caja toráxica (fig. 5). Los demás cuerpos vertebrales se evidencian sin signos de anomalía. Los estudios imagenológicos muestran una lesión a nivel de T7, que sugiere un posible mal de Pott. (Fig.6)
Restos de pulmón izquierdo
Figura 4 : Cavidad abdominal se pueden evidenciar restos de pulmón izquierdo sin
identificarse ningún órgano específico. (Foto: Luis Butrago B.) (Cortesía Museo HMYSB-UPTC)
Figura 5: Lesión a nivel de la 7ª vértebra dorsal, delante de la cara anterior de su
cuerpo vertebral, se puede observar lo que parece un plastrón o los restos de un posible absceso. 7 y 8 costillas izquierdas desplazadas hacia arriba. - Foto: Luís Buitrago B. – (Cortesía Museo HMYSB-UPTC)
Figura 6: Protuberancia y deformidad a nivel de T7 visualizada por una
2.3. TUBERCULOSIS
2.3.1 HISTORIA
El origen geográfico de la tuberculosis no ha sido la preocupación principal de algunos científicos, su presencia se ha establecido desde Egipto hasta Ellinois, Perú, Chile. (Durrance 1998).
La enfermedad micobacteriana llamada tuberculosis antes se conocía como tisis o consunción, término que significaba consumirse. Durante los siglos XVII y XVIII ocasionó 20 a 30% de todas las muertes en Londres. El nombre de consunción se asignó debido a la pérdida de peso prolongada. En 1834 la enfermedad recibió el nombre de tuberculosis y Robert Koch aisló Mycobacterium tuberculosis en 1882 (Stuart. 2000).
En los siglos XIX y comienzos del XX, esta enfermedad, la llamada “peste blanca”, sirvió de combustible a una imagenería romántica que la situó como una dolencia que atacaba particularmente a seres creativos, dotados de una sensibilidad exacerbada, proclives a entregarse a la pasión y a la elevación mística. La tuberculosis bien podría llamarse la primera enfermedad percibida como dolencia del individuo, en contraposición a otras dolencias humanas que arrasaban a poblaciones enteras, extendiendo su manto destructor masivamente, a la manera de las pestes medievales. Las características de la enfermedad que poco tenían que ver con la languidez serena que la literatura le ha atribuido al hecho de que fueron muchos los artistas e intelectuales que en los dos siglos pasados la padecieron y murieron por su causa. Para constatarlo bastaría mencionar los nombres de poetas y escritores como John Kyats, Poe, Chejov, Simona Weil, Emily Brönte, Catherine Mansfield o
Kafka a quienes la tuberculosis los llevó a la tumba (Renza M: 2004) y hasta el libertador, Simón Bolivar (Próspero A, 2004).
Al tratar de encontrar el origen de la tuberculosis en otros países, se sugiere que en Perú se ha relacionado la presencia de la tuberculosis con una sociedad sedentaria, agrícola y domesticadora de animales, al igual que una densidad poblacional relativamente grande, crearon el ambiente propicio para el desarrollo del bacilo (Durrance 1998).
Algunos investigadores afirman que los primeros portadores fueron los animales domésticos (Manchester 1983), otros afirman que una gran cantidad de personas fue el caldo de cultivo del germen, pero otros asocian la enfermedad con las plagas que llegaron a los primeros cultivos (Buikstra, 1981), a pesar de todo las evidencias de tuberculosis (Egipto, Perú) han sido halladas en lugares que dan cuenta de núcleos poblacionales ( Durrance 1998).
“Se construirá un edificio con los departamentos y anexidades propias para hospital de tuberculosos y se dotará de las rentas que su sostenimiento requiera. Esta Fundación se denominará Hospital San Carlos, en Recuerdo de mi madre …” (Ospina 1996); y se construyó como sanatorio antituberculoso, el Hospital de San Carlos al sur de Bogotá, cuyos aspectos arquitectónicos fueron los mas modernos del momento, y donde se mantenían a los enfermos provistos de buena alimentación, terrazas donde podían disfrutar de bellos paisajes. En diciembre de 1949 empezaron a recibir enfermos tuberculosos provenientes de todo el país, época en la que a pesar de conocer drogas eficaces para la lucha contra el bacilo, los tratamientos se reducían en el medio a curas de reposo, aire, sol y una buena alimentación durante largos períodos. (Maldonado, 2004, Ospina, 1996).
Respecto al agente etiológico de la tuberculosis, se sabe que existen mas de 100 especies de micobacterias unas patógenas para el hospedero humano, otras definitivamente no y algunas oportunistas difícilmente transmisibles y muy raras (tabla1) (Brooks, 2002). Respecto al origen del M. tuberculosis , se había sostenido sobre que el M. tuberculosis derivaba del M. bovis. y que ello habría sucedido entre unos 15000 y 20000 años atrás con el desarrollo de la ganadería, estudios recientes del material genético de diversas especies de micobacterias revelaron que un antiguo progenitor o ancestro común dio origen al M. canettii, del complejo M tuberculosis y a una rama de la que derivaron el M. africanum , el M. microti y el M. bovis (Brook, 2002; Brosch, R. 2002)
Los estudios del ARN 16S han indicado que el M. tuberculosis se asemeja mas a las bacterias gram positivas, pero estudios realizados recientemente de sus genomas, revelan que tienen mas parecido con las bacterias gram negativas, especialmente las que poseen genes productores y convertidores de energía como la Pseudomona aeruginosa y la Escherichia coli (Brosch, R, 2002).
2.3.2 AGENTE ETIOLÓGICO
Las micobacterias son bacterias que tienen apariencia de bacilos rectos o un poco curvos de 1 a 10 m de longitud y 0.2 a 0.6 m deμ μ ancho, resistentes al alcohol y a las condiciones ambientales. M tuberculosis es una bacteria intracelular facultativa resistente a los ácidos y a los álcalis por su complejo hidrofóbico y de capas múltiples en la pared celular que está compuesta por ceras, glucoproteínas y glucolípidos (Stuart, 2000).
Los componentes del complejo de la pared celular constan de una membrana citoplasmática interna, rodeada por una pared celular típica constituida por peptidoglucano. La pared celular está unida mediante puentes de disacárido a una capa de arabinogalactano. Se
observan ácidos micólicos y micocerósicos unidos al arabinogalactano, y la capa mas externa del complejo está formada por glucolípidos sulfatados llamados sulfátidos. Esta falange de macromoléculas hace que el complejo de la pared micobacteriana sea bastante impermeable (Stuart, 2000).
Las muestras clínicas pueden examinarse mediante la coloración de Ziehl Neelsen, tinción de Kinyoung o procedimiento de fluorocromo auramina. Muchas de las micobacterias se encuentran en el ambiente, M. tuberculosis es el principal agente de la tuberculosis, aunque en ocasiones Mycobacterium bovis produce esta enfermedad como consecuencia del consumo de leche cruda obtenida del ganado infectado (Stuart, 2000).
M. tuberculosis también puede diagnosticarse mediante siembra en cultivos específicos que contengan verde de malaquita u otros antibióticos para inhibir el crecimiento de otras bacterias, los medios mas utilizados son el Löwestein- Jensen, Ogawa- Kudoh, agar de Middlebrook 7H10, Middlebrook 7H11, entre otros, aunque con estos medios de cultivo se requiere un periodo prolongado, para observar un crecimiento visible. Existen sistemas rápidos de cultivo BACTEC y se pueden usar sondas de ácidos nucleicos, para identificar el microorganismo (Stuart. 2000).
Respecto a la clasificación, el complejo Mycobacterium tuberculosis comprende: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, M. canetti (Zink, A. 2003)
2.3.3 CARACTERÍSTICAS DE LA ENFERMEDAD
La tuberculosis es una enfermedad bifásica: una fase de infección primaria y una fase de reinfección o reactivación. La infección humana por M. tuberculosis usualmente se inicia como una infección pulmonar y se puede diseminar a otros aparatos y sistemas por el mecanismo de deglución de las secreciones infectadas o por vía sanguínea (Sotomayor. 2004).
El microorganismo llega a la columna a través de un foco en el pulmón, aparato urinario u otros sitios, generalmente por la vía hematógena o por contacto estrecho con una víscera lesionada (Martínez, 2006; Sotomayor, 2004). Las alteraciones de la columna vertebral se clasifican en cinco grandes grupos: malformaciones congénitas, procesos degenerativos, enfermedades infecciosas, neoplasias y lesiones traumáticas. Se sabe que la mitad de los casos de compromiso de la columna ocurren antes de la edad de los10 años y que el pico de presentación de la cifosis angular o mal de Pott aparece entre los 20 y los 30 años. El 50% de las personas con tuberculosis de la columna presenta mal de Pott, que afecta especialmente la región comprendida entre T8 y L 4 (Sotomayor. 2004).
Existen diferencias notables en la capacidad de las diversas micobacterias para producir lesiones en varias especies de hospederos M. tuberculosis y M. bovis, son igualmente patógenos para humanos
. La vía de infección (respiratoria en comparación con intestinal) determina el patrón de las lesiones. En los países desarrollados el M. bovis se ha convertido en una especie poco común. Algunas micobacterias “atípicas” como Mycobacterium kansasii , producen una enfermedad humana indistinguible de la tuberculosis, otras como Mycobacterium forfuitum , sólo producen lesiones superficiales o actúan como oportunistas (Brooks, 2002).
Se conocen dos lesiones importantes a nivel de pulmón, una de tipo exudativo y otra de tipo productivo. La primera es una reacción inflamatoria aguda con líquido de edema, leucocitos polimorfonucleares y, después monocitos que rodean a los bacilos tuberculosos. Este tipo de lesión se observa particularmente en el tejido pulmonar donde semeja a la neumonía bacteriana. Puede cicatrizar por resolución de modo que se absorba todo el exudado, también puede conducir a necrosis masiva del tejido, o a veces desarrollar el segundo tipo de lesión (productiva). El tipo de lesión productivo sucede cuando la lesión está totalmente desarrollada y consiste en un granuloma crónico que consta de tres zonas: la primera es una región central de células gigantes y multinucleadas que contiene bacilos tuberculosos; la segunda es una zona media de células epitelioides pálidas, con frecuencia dispuestas radialmente y la tercera zona es periférica de fibroblastos, linfocitos y monocitos. Posteriormente se desarrolla tejido fibroso en la periferia y la región central sufre necrosis caseosa. A esta lesión se le denomina “tubérculo”. Un tubérculo caseoso puede romperse en el interior de los bronquios, vaciar allí su contenido y formar la cavidad. Subsecuentemente puede cicatrizar por fibrosis o calcificación (brooks, 2002).
Como se mencionó anteriormente, el principal foco de infección es el pulmón donde se manifiesta de diversas formas como fatiga, debilidad, pérdida de peso y fiebre alta. La afección pulmonar que da lugar a tos crónica y esputo sanguinolento en general se relaciona con lesiones muy avanzadas. La meningitis o la afección del aparato urinario pueden presentarse en ausencia de otros signos de tuberculosis. La diseminación por la circulación sanguínea produce tuberculosis miliar con lesiones en muchos órganos y una tasa de mortalidad elevada (Brooks, 2002).
En algunas ocasiones se puede presentar el complejo de Ghon, que consiste en un chancro primario o foco de Ghon y una adenopatía regional. El foco de Ghon se presenta como un nódulo caseificado de 0,5 a 2 cm de diámetro. Puede situarse en cualquier lóbulo, pero se encuentra con mayor frecuencia en el pulmón derecho (55% derecho; 45% izquierdo). De preferencia se localiza en las porciones mejor ventiladas, parte baja del superior y alta del inferior. Muy raras veces en el vértice. Cualquiera que sea la localización, siempre es subpleural. En la mayoría de los casos, el foco es único, raras veces doble y aún múltiple y bilateral.
Las manifestaciones clínicas de la TBC ocurren en la etapa tardía de la enfermedad, e incluyen pérdida inexplicable de peso, fatiga constante, temperatura que puede llegar a 40ºC, sudoración nocturna, falta de aliento y sudoración el tórax, la tos es productiva, con esputo mucopurulento y a veces hemoptóico. La cavitación conduce a que el esputo se presente claramente purulento. Los pacientes con derrames pleurales en general sufren dolor pleurítico y disnea. Cuando la diseminación ocurre los síntomas reflejan la presencia de un granuloma en los tejidos afectados (Stuart. 2000).
2.3.4 EPIDEMIOLOGÍA
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que talvez la mitad de la población a nivel mundial esté infectada con M. tuberculosis (Stuart 2000), cada año hay 8 millones de casos nuevos de tuberculosis y, que aunque la enfermedad es curable, mueren 2 millones. Tres cuartas partes de los casos y las muertes por tuberculosis ocurre en personas entre los 15 y los 54 años, el grupo de edad con mayor productividad económica. (Chaparro P. E. et al. 2004). Desde 1990 el número de casos en Estados Unidos ha ido en aumento; se identifican 20.000 a 30.000 nuevos casos de tuberculosis cada año (Stuart 2000). El número total de casos
notificados por la OMS durante el año 2001, de los 210 países a los que se le solicitó información, fue de 3.813.109, de los cuales 42% correspondió a nuevos casos de de tuberculosis pulmonar con baciloscopia positiva (World Healt Organization. 2003) (Fig. 7). En Colombia La incidencia de tuberculosis por todas las formas, fue de 26 casos por 100.000 habitantes en el año 2002. 22.35 menor con relación a 1992 cuando alcanzó una tasa de 33.5 de casos por 100.000 habitantes, pero, a su vez, 20% mayor que en 1997 cuando fue de 21/100.000 habitantes. De igual manera la tuberculosis pulmonar con baciloscopia positiva descendió a una tasa de 17.8 casos por 100.000 en el 2002, 28.% menor con relación a 1992 cuando alcanzó una tasa de 25/100.000 habitantes.
25 - 49 50 - 99 100 o mas < 10 10 - 24 No reporte X /100 000
Dist r ibución de depar t ament os por r iesgo de acuer do a t asa de incidencia de TBC Colombia 2004
a.
b.
Figura 7. Prevalencia de Tuberculosis a nivel mundial – 2004 , nacional – 2002
En el 2002 cerca de las dos terceras partes de las entidades territoriales presentaron incidencias superiores al promedio nacional de 26 por 100.000 habitantes. Fueron: La Guajira, Amazonas, Vaupés, Guainía, Chocó, Putumayo, Guaviare, Meta, Arauca, Auntioquia, Quindío, Córdoba, Norte de Santander, Caquetá, Huila, Cesar, Casanare, Cauca, Vichada, San Andrés, Valle del Cauca y Tolima (Chaparro P.E. 2004). La evolución de la incidencia de tuberculosis de todas las formas en Colombia se muestra en la (Fig. 7).
Cabe resaltar que actualmente se cuenta, además de los métodos tradicionales, con métodos moleculares para realizar estudios epidemiológicos (Kamerbeek, 1997, Hazbun, 2004., Burgos M. V., 2004, Mendez J. C. 2004, Zink A. R. 2003).
A nivel nacional, aunque los indicadores epidemiológicos muestran una reducción en la incidencia de la tuberculosis, al ver la evolución desde 1970 hasta 1993 y, en especial de la tuberculosis pulmonar, esta no es real. En los últimos diez años, el comportamiento es claramente fluctuante específicamente hasta 1997, año en que se inició una tendencia sostenida a incrementarse, la cual es de tipo polinomial. La fluctuación de la incidencia puede responder a varios factores entre ellos: la variación en la búsqueda de sintomáticos respiratorios, debida a la fragmentación de la instituciones y empresas que ofrecen servicios de salud a la población y que conduce, primordialmente, a un descenso en la detección, el diagnóstico y el tratamiento de de los enfermos tuberculosos (Chaparro et al, 2002).
Existe un reporte epidemiológico del departamento de Boyacá, donde fue encontrada la momia en estudio, éste reporte muestra una tasa de incidencia de tuberculosis entre los años 1995 y 2002,
mostrando una tasa máxima del 8 casos/100000 habitantes en el año 2002 para todos los tipos de tuberculosis, una tasa de 6.1 casos/100000 habitantes en el año 1999 para tuberculosis pulmonar con bacioloscopia positiva y 1.7 casos/100000 habitantes para tuberculosis extrapulmonar en el año 2000 se observó la tasa de mayor incidencia de sintomáticos respiratorios en e año 1997 de de enfermos con baciloscopia positiva en el año 2002, la incidencia de todas las formas de tuberculosis entre los años 1998 y 2002, muestra que las personas mas afectadas son mayores de quince años, el mayor porcentaje de positividad de las baciloscopias se presentó en el año 2002. En el departamento de Boyacá se encuentran zonas de media, alta y muy alta incidencia de tuberculosis (Fig. 8).
TUBERCULOSIS
TUBERCULOSIS
BOYACA
BOYACA --2.0022.002
MUY ALTO Tasa > 50 x 100.000 hb ALTO Entre 25 y 50 x 100.000 hb MEDIO Tasa <= 25 x 100.000 hb
FUENTE ISSB
Figura 8. Determinación de la tasa de tuberculosis en Boyacá en el año 2002.
Ubicación de Sativanorte donde se encontró la momia. Tomado de ISSB, 2002
2.3.5. TECNICAS PARA DETERMINAR Mycobacterium tuberculosis
Existen varios métodos para detectar M. tuberculosis , bien sea por métodos directos donde se observa el microorganismo, por métodos inmunológicos, donde se obtienen anticuerpos específicos o bien los métodos utilizados en la última década con la biología molecular, donde se observa la presencia de fragmentos específicos de DNA o RNA de las micobacterias
2.3.5.1. TECNICAS CONVENCIONALES PARA DETERMINAR Mycobacterium tuberculosis.
Las técnicas más utilizadas y de rutina en Colombia son la baciloscopia y el cultivo. La baciloscopia se realiza tomando tres muestras de esputo durante tres días consecutivos, las cuales se extienden en portaobjetos para ser sometidas a una coloración de Ziehl Neelsen y observadas en microscopio.
El cultivo en medios como Ogawa- Kudoh, Löwstein Jesen y Middlebrook, son muy demorados debido al lento metabolismo de la micobacteria, por ende el resultado de pacientes con tuberculosis no siempre es eficaz y presenta un rango de incertidumbre. Para tener un diagnóstico rápido, eficaz y confiable, se cuenta, hoy día con métodos moleculares mas específicos (Stuart 2000., Kamerbeek, Hazbun M . 2004., Burgos M.V., 2004, Zink A. R. 2003).
2.3.5.2. TECNICAS MOLECULARES PARA DETRMINAR
Mycobacterium tuberculosis
Las técnicas moleculares utilizadas para investigar la presencia de M. tuberculosis son diversas, desafortunadamente, no todas son
aplicables a material momificado, y todas ellas incluyen los siguientes pasos dentro del proceso:.
EXTRACCIÓN DE DNA DE M. tuberculosis: Se ha denominado extracción al proceso mediante el cual se obtiene Acido Desoxirribonucleico cromosomal (cADN), Acido Desoxirribonucleico mitocondrial (mADN) o Acido Ribonucleico (ARN) a partir de una muestra determinada que puede ser tejido óseo, pelo, diente, sangre, cualquier tejido animal, vegetal, bacteriano, viral, parasitario, o micótico. En el presente estudio, restos óseos de columna y restos de pulmón, son el material momificado es el de interés. En el procedimiento se hace necesario en muchos casos el lavado previo de la muestra y pulverización de tejidos, específicamente óseo. La técnica se basa en la descalcificación de la muestra en caso de material óseo , ruptura de células bacterianas, ruptura de núcleos celulares bacterianos donde esta presente el ADN a investigar, eliminación de proteínas y otras sustancias que afectan la extracción del ADN, y finalmente precipitación y suspensión del ácido nucleico. (Zink A. , 2003; Salo W.L., 1994, Konomi N., 2002).
VERIFICACIÓN DE LA EXTRACCIÓN : Para verificar el éxito en la extracción del ácido nucleico se realiza una electroforesis en un gel de agarosa utilizando la muestra resultante de la extracción, agregando bromuro de etidio para visualizar las bandas bajo la luz ultravioleta, donde puede observarse una o varias bandas de color naranja, que será comparado con un patrón de peso molecular conocido con el fin de hacer una determinación aproximada del peso (Fernández J. 1999, Zink A. , 2003; Salo W.L., 1994, Konomi N., 2002).
AMPLIFICACIÓN : La amplificación es el proceso que logra multiplicar n veces un fragmento de ADN particular, logrando
millones de copias de una misma secuencia, por medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR – Polimerasa Chain Reaction), gracias a cambios de temperatura previamente establecidos, una cantidad suficiente de oligonucleótidos, una pareja de primers o iniciadores y otros reactivos. Esta técnica ha incrementado la utilización en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas, medicina legal y genética evolutiva, entre otras (Fernández J.C. 1999 Zink A. , 2003; Salo W.L., 1994, Konomi N., 2002).
IS6110 : Se basa en la amplificación por PCR, de un fragmento de 123 - pb o 254pb, de la secuencia de inserción IS6110 que poseen los microorganismos integrantes del complejo M. tuberculosis , este marcador ha sido previamente cuestionado, pero tras extensas reevaluaciones, se confirma la especificidad de IS6110 como un marcador para la micobacteria humano patógena. (10 Eisenach et al, 1990; Van Soolingen, 2000; Barnes P., 2003, Zink et al, 2003). La identificación de IS61110 (Fig. 9), que es un segmento único o secuencia de inserción presente en el ADN de M. tuberculosis, se correlaciona altamente con la confirmación del diagnóstico clínico. (Sotomayor. 2004).
Figura 9. Inserción IS6110 del complejo Mycobacterium tuberculosis. Tomado de
DISTINCIÓN ENTRE M. tuberculosis y M. bovis BASADA EN PCR EN MUESTRAS HISTÓRICAS: (Esta técnica es de Zink, 2003) Se usan controles de DNA de M. tuberculosis de la cepa H37Rv y para M. bovis BCG P3, se obtiene de una fuente comercial (Isogen, Maarsen, The Neterlands). Para el análisis de PCR se seleccionan cuatro productos diferentes para la amplificación: Mbov- 1/2, mtp40 - 1/2, mtp40 - 3/4, oxyR- 1/2. (Zink, 2003). (Tabla 2).
Tabla 2. Genes de distinción probados entre M. tuberculosis y M. bovis.
Obtenido de Zink, 2003
Primer Target Tamaño del Especies de Referencia
producto pb reacción Mbov- 1/2 M. bovis- especific-region 122 M. bovis mtp - 40-1/2 Fosfolipasa C gen mtp -40 150 M. tuberculosis mtp40 - 3/4 Fosfolipasa C gen mtp -40 152 M. tuberculosis
oxyR oyx R pseudogen 150 M. bovis y M. tuberculosis
PCR- RFLP. (Restriction Fragments Length Polymorphism) (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de restricción). Esta técnica se ha utilizado en algunos fluidos biológicos como esputo, biopsias, lavado broncoalveolar (BAL), para diagnosticar M. tuberculosis y otras micobacterias no tuberculosas al igual que otras bacterias (Hidaka, 2000, Barnes, 2003).
SPOLIGOTIPYNG: Esta técnica se basa en el conocimiento del polimorfismo de un locus DR del DNA de M. tuberculosis (Fig.10) , que contiene unas secuencias repetitivas directas (Direct Repeat = DR) de 34 pares de bases (pb) y unas secuencias intercaladas con las anteriores, no repetitivas de 34 a 41 pb que son las que van a
