Ojo de poeta (

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Grupo de investigación fitoquímica

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Ojo de poeta (Thunbergia alata): Estudio preliminar de su potencial químico y antifúngico.

Estudiante

Miguel Ángel Vanegas Romero

Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de biólogo.

Director

Geison Modesti Costa, QF, MSc., PhD Departamento de Química Pontificia Universidad Javeriana

Bogotá D.C., Colombia

Segundo Director

Claudia Bravo Chaucanés, Biol, MSc., PhD Departamento de Microbiología Pontificia Universidad Javeriana

Bogotá D.C., Colombia

Trabajo de Grado

Pontificia Universidad Javeriana

Facultad de Ciencias

Programa de Biología

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ÍNDICE GENERAL.

1. Resumen ……….3

2. Palabras clave……….3

3. Introducción………3

4. Materiales y métodos………..5

4.1. Material vegetal………...5

4.2. Preparación de los extractos………...5

4.3. Análisis fitoquímico preliminar (AFP) ……….6

4.3.1. Prueba de carotenoides 4.3.2. Prueba de esteroides y terpenos 4.3.3. Prueba de flavonoides 4.3.4. Prueba de taninos 4.3.5. Prueba de saponinas 4.3.6. Prueba de cardiotónicos 4.3.7. Prueba de cumarinas 4.3.8. Prueba de alcaloides 4.4. Cromatografía en capa delgada (TLC) y cada delgada de alta eficiencia (HPTLC) ……….8

4.5. Análisis por Cromatografía Líquida Por Ultra Eficiencia Acoplada a Detección Por Arreglo de Diodos (UPLC-DAD) ……….8

4.6. Cromatografía de ultra eficiencia acoplado a espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo (UHPLC-MS-QTOF) ………..….….….….---………….8

4.7. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y concentración mínima fungicida (MFC)………...……… ..……… ..………....8

4.7.1. Preparación del inóculo 4.7.2. Microdilución para la determinación de la MIC 4.7.3. Determinación de la concentración mínima fungicida 5. Resultados/Discusión……….………9

5.1. Análisis fitoquímico preliminar (AFP) ……….……….…….9

5.2. Cromatografía en capa delgada (TLC) y cada delgada de alta eficiencia (HPTLC) ……….……….……….………10

5.3. Cromatografía líquida de Ultra eficiencia (UPLC) y Cromatografía liquida de gases acoplada a masas (LC-MS) ……….……….……….……14

5.3.1. Extracto hojas T. alata 5.3.2. Extracto tallo T. alata 5.4. Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Fungicida……….……….……….………..19

5. Conclusiones……….……...21

6. Agradecimientos……….22

7. Referencias………....…..22

8. Anexos……….….25

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. Resumen:

Thunbergia alata (ojo de poeta) es una especie vegetal originaria del este de África. Se encuentra ampliamente cultivada en regiones tropicales del mundo considerándose como una especie de alto riesgo de invasión en algunos países, incluyendo Colombia. Las comunidades utilizan esta especie para tratar la malaria. No obstante, los estudios químicos y biológicos para esta especie son escasos. Por esta razón, la presente investigación tiene como objetivo explorar la composición química y actividad antifúngica en extractos de tallo y hojas de T. alata. Para esto, se empleó análisis fitoquímico preliminar (AFP) y técnicas analíticas tales como: TLC, HPTLC, UPLC y LC-MS, así como se evaluó la actividad antifúngica de extractos de hojas y tallo de T. alata. Los resultados indicaron la presencia de carotenoides, terpenos y esteroides, flavonoides, taninos y saponinas. En el extracto de hojas se identificó la presencia de ácido clorogénico y en tallos, rutina. Con relación a los ensayos biológicos, los extractos de hojas de T. alata evaluados mostraron efecto antifúngico contra C. albicans y C. auris a 10 mg/mL y 5 mg/mL, respectivamente.

2. Palabras clave:

Thunbergia alata, actividad antifúngica, HPTLC, UPLC, C. albicans. C. auris.

3. Introducción:

La búsqueda de metabolitos biológicamente activos que presentan las plantas es una de las estrategias empleadas para el desarrollo de nuevos fármacos (Morantes et al., 2007). Inicialmente, se buscan plantas que han sido empleadas por las poblaciones para el tratamiento de enfermedades.

Una de las especies que se ha utilizado en las comunidades para el tratamiento tradicional de algunas enfermedades como la inflamación, fiebre y malaria es Thunbergia alata, conocida popularmente en Colombia como ojo de poeta. Es una especie vegetal originaria del Este de África tropical (Okello et al., 2010; Hamill et al., 2000; Housti et al., 2002), enredadera ampliamente cultivada y naturalizada en regiones tropicales del mundo (Starr et al., 2003) siendo identificada por presentar márgenes ondulados, peciolo alado de 2-6,5 cm de largo, flores solitarias sobre pedúnculos largos, corola anaranjada y hojas sagitadas (Figura 1) (Wagner & Bladt, 1996).

Adicionalmente, T. alata tiene un hábito agresivo, es trepadora de otra vegetación y forma una densa manta sobre las áreas, considerándose como una especie invasora, principalmente en áreas tropicales y subtropicales alrededor del mundo (Batianoff y Butler, 2003; Lockwood et al., 2005).

Figura 1. Thunbergia alata. Tomado de: (Sarmiento, L. s.f.).

En Colombia, es una de las diez especies invasoras más problemáticas a nivel nacional (García-Duque et al., 2016).

Son múltiples factores los que permiten tener una distribución tan amplia a T. alata y presentar un hábito agresivo.

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4 Entre los principales, se encuentran la presencia de parénquima que rodea los tejidos conductores, garantizando conducción de agua y transferencia de azúcar, generando presiones osmóticas que permiten un aumento del volumen de agua en las traqueidas (Carlquist, 2001). Lo anterior le proporciona a T. alata mejor adaptación a condiciones climáticas, como los Andes Colombianos, y le otorga de mayor resistencia a daños mecánicos (Carlquist, 1985). Además, el parénquima axial proporciona una mayor flexibilidad a los tallos y la presencia de células lignificadas le proporciona la capacidad de un crecimiento vegetativo agresivo sobre otras especies (Quijano-Abril et al., 2021).

Desde el punto de vista químico, Damtoft et al., (1994) identificaron los siguientes compuestos químicos de T.

alata: 6-epi-stilbericosido, alatosido y thunalosido (Estructura–ver Anexo 1) por resonancia magnética nuclear.

Así mismo, se han identificado compuestos fenólicos como el ácido L-málico, feruloilamico y ρ-cumaroylamico con técnicas de HPLC y gliceroles como el diacilglicerol y triacilglicerol por TLC (Schultz and Ohlrogge, 2000).

Como se puede observar, no son muchos los trabajos previos con esta planta. Dado su amplia ocurrencia en diversos países y la preocupación de expertos por su comportamiento invasivo, más estudios se hacen relevantes con la finalidad de ampliar el conocimiento químico y de actividad biológica para esta especie.

En este sentido, una actividad que podría ser de interés terapéutico es la actividad antifúngica. Muchos extractos vegetales y metabolitos secundarios han presentado esta actividad, muchas veces, sin los efectos secundarios causados por agentes antimicrobianos sintéticos (Teng y Lee, 2014; Newman y Cragg, 2020).

Uno de los microorganismos estudiados es Candida albicans, un patógeno oportunista que se comporta como una especie de hongo comensal, frecuentemente benigno, al formar parte de la microbiota de la piel y del tracto gastrointestinal y genitourinario del hombre. Sin embargo, dependiendo del estado inmunológico del hospedero (alteración de los mecanismos de defensa), puede convertirse en un patógeno (Sudbery, 2011).

Los casos habituales de candidiasis, una enfermedad infecciosa que se puede presentar como lesiones superficiales en la piel hasta la forma sistémica diseminada, son producidos por el principal agente causal, C. albicans (Pardi y Cardozo, 2002). La candidiasis es una de las micosis más importantes y de mayor frecuencia en la cavidad bucal humana, siendo una infección frecuente de la cavidad oral de los adultos de avanzada edad (Webb et al., 1998;

Runke, 2002). Además, si se propaga por el organismo, puede generar candidemia y candidiasis con una tasa de mortalidad entre el 30 y el 50% (Sudbery, 2011). En Colombia, representa el 88% de las infecciones fúngicas en pacientes hospitalizados (De Bedout y Gómez, 2010; Cortes y Prada, 2012; Cortes et al., 2020).

El mayor problema añadido a estas enfermedades son las cepas microbianas resistentes a múltiples fármacos y el aumento de microorganismos con susceptibilidad reducida a los antibióticos (Selvamohan et al., 2012). Una de las cepas que se ha incrementado en los últimos años es Candida auris, un patógeno humano emergente y multirresistente del cual no se habían reportado puntos de corte de MIC hasta 2018 (Parra-Giraldo et al., 2018;

Lockhart et al., 2017). De una colección de 54 aislamientos, el 93% eran altamente resistentes al fluconazol (Saris et al., 2018). En Colombia, se emitió, en el año 2016, alerta nacional sobre la circulación de esta levadura emergente resistente, con tasas de mortalidad que varían significativamente entre las regiones geográficas a nivel mundial desde el 32,5 al 72% (Jeffery-Smith et al., 2018). Durante el periodo 2018-2019, se confirmaron 650 casos de infección invasiva por C. auris en Colombia siendo Bogotá, Atlántico, Bolívar y Valle del Cauca donde se acumulan más del 70% de los casos en el país (Lizarazo, 2019).

Adicionalmente, la disponibilidad de fármacos antifúngicos, a diferencia de los antibióticos, es escasa, debido a que las dianas terapéuticas son compartidas con la célula eucariota animal, lo que ha generado fenómenos tóxicos y efectos secundarios adversos en el ser humano (Oteo, 2016), limitando el alcance y descubrimiento de nuevos

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5 agentes antifúngicos. Por esta razón, se ha fomentado la búsqueda de nuevas moléculas y/o compuestos que sean menos tóxicos, más económicos y que se desarrollen como prometedores antifúngicos.

La determinación de la sensibilidad in vitro de patógenos, como C. albicans y C. auris, frente a los fármacos convencionales o extractos naturales de plantas constituye un ensayo importante para la evaluación del potencial antifúngico presente en los compuestos bioactivos de plantas. Actualmente, se dispone del método de referencia estandarizado por Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) para la determinación in vitro de las concentraciones mínimas inhibitorias (MIC’s) de compuestos antifúngicos. Así, la determinación de MIC’s permite observar y evaluar el grado de sensibilidad de una cepa y la actividad biológica de un compuesto dado que puede ser de interés terapéutico, representando una fuente importante de principios activos frente a patógenos humanos.

Teniendo en cuenta las altas tasas de mortalidad y la gran diseminación de C. albicans y C. auris en los últimos años y al considerarse T. alata como una especie invasora, poco explorada química y farmacológicamente, se hace interesante ampliar el conocimiento de la especie, quizás con vistas a un posible uso que se le pueda dar a futuro (Prakash et al., 2020).

En este contexto, el presente Trabajo de Grado tiene como objetivo explorar la composición química y actividad antifúngica de Thunbergia alata, con el fin de ampliar las investigaciones realizadas hasta el momento. Para cumplir con este objetivo general, se buscará conocer los metabolitos secundarios mayoritarios de la especie a investigar, así evaluar la actividad antifúngica de extractos de T. alata contra C. albicans y C. auris.

4. Materiales y métodos:

4.1. Material Vegetal:

La especie a investigar se encuentra entre las seleccionadas en el marco del Programa GAT-Colombia Científica y fue escogida debido a los usos etnobotánicos, la amplia distribución en Colombia y la poca investigación química y biológica realizada hasta el momento.

Hojas, flores y tallo de Thunbergia alata fueron proporcionadas por el Programa GAT, siendo colectadas en Pacho, Cundinamarca.

Esta investigación fue autorizada por el Contrato de Acceso a Recursos Genéticos y Productos Derivados N° 212 (RGE 0287-6), entre la Pontificia Universidad Javeriana y el Ministerio de medio Ambiente y Desarrollo Sostenible de la República de Colombia.

4.2. Preparación de los extractos:

El material vegetal se secó en un horno con aire circulante a 35 °C, durante 96 horas para su posterior trituración en un molino de cuchillas. Al material vegetal seco y molido se le realizó una extracción por percolación EtOH al 96%, en una proporción 1:10, a temperatura ambiente, protegido de la luz, en 4 ciclos de 24 horas. Los extractos de diferentes ciclos fueron agrupados y se concentraron a presión reducida mediante rotaevaporación a temperatura no superior a 35 °C y fueron almacenados a temperatura ambiente en frascos debidamente rotulados para su posterior análisis.

Respecto a las flores, para las cuales se evaluaron el perfil de carotenoides, se pesaron 30 g de material seco, luego se agregaron 90 mL de H2O y gotas de HCl hasta llegar a pH de 1. Posteriormente, se sonicaron durante 20 minutos.

Se filtró en un recipiente stock y se liofilizó.

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6 4.3. Análisis fitoquímico preliminar (AFP):

Estos análisis se realizaron siguiendo la metodología de Sanabria y Bilbao (1997) con modificaciones.

A partir del extracto EtOH de hojas, se pesaron 50 mg de este y se agregó etanol y H2O, relación 1:1.

Posteriormente, se agregaron 3 mL de éter de petróleo y se agitó la mezcla en vortex. Se formaron dos fases, la superior corresponde a la fracción en éter y la inferior, fracción etanólica.

Otros 30 mg del extracto crudo fueron pesados y se agregaron 10 mL de HCl 5%. Posteriormente, la solución fue agitada por 15 minutos, a una temperatura de 60 °C. Luego, se enfrió y filtró hasta obtener una solución transparente, denominada extracto ácido.

A estos, se realizaron diez ensayos mostrados en la tabla 1.

Tabla 1. Pruebas empleadas para el análisis fitoquímico preliminar (AFP) de los metabolitos a evaluar.

Metabolito Prueba Control positivo

Carotenoides Salkowski -Caroteno

Esteroides y terpenos Liebermann-Burchard Tillandsia usneoides

Flavonoides Shinoda Rutina

Leucoantocianidinas Rutina y kampferol

Taninos Cloruro férrico Ácido tánico

Gelatina-sal Ácido tánico

Saponinas Espuma Quinua

Cardiotónicos Molisch Digitalis purpurea

Cumarinas Fluorescencia 7-hidroxicumarina

Alcaloides Dragendorff Cafeína

4.3.1. Prueba de carotenoides:

Se realizó una prueba de Salkowski para determinar la presencia de carotenoides. Para esto, a 1 mL de ácido sulfúrico al 85% se añadió, lentamente por las paredes de un tubo, 1mL de extracto etéreo. La presencia de carotenoides se determinó por la aparición de una coloración marrón en la interfase. Como control positivo, se usó solución de β-caroteno y control negativo, agua destilada.

4.3.2. Prueba de esteroides y terpenos:

Mediante la prueba de Liebermann-Burchard se determinó la presencia de esteroides y terpenos. Para esta prueba, se agregaron cuatro gotas del reactivo de Liebermann-Burchard a 0,5 mL de extracto etéreo. La presencia de esteroides se determinó por la aparición de una coloración azul-verdosa. Para el control negativo se usó agua destilada y como control positivo, extracto de Tillandsia usneoides, el cual se caracteriza por contener triterpenos entre sus compuestos mayoritarios.

4.3.3. Prueba de flavonoides:

Para identificar flavonoides se realizaron las pruebas de Shinoda y Leucoantocianidinas. Para la primera prueba, a 0,5 mL de extracto etanólico se le agregó un trozo de magnesio metálico y cinco gotas de HCl al 10%. La presencia de flavonoides se determinó por la aparición de una coloración rosada. De control positivo se usó solución de rutina y control negativo, agua destilada.

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7 Respecto a la prueba de Leucoantocianidinas, a 1 mL del extracto etanólico se añadió 1 mL de HCl al 10%.

Posteriormente, se calentó a baño de maría durante diez minutos a temperatura de ebullición. La presencia de flavonoides se determinó por la aparición de una coloración rosada. Como control positivo se usó solución de rutina y kaempferol de control negativo, agua destilada.

4.3.4. Prueba de taninos:

Para la determinación de taninos se emplearon las pruebas de cloruro férrico y gelatina-sal. En el primer caso, se agregaron dos gotas de la solución de cloruro férrico en etanol al 1% a 0,5 mL de extracto etanólico. La presencia de taninos se determinó por la aparición de precipitado y una coloración azul. Se usó ácido tánico de control positivo y agua destilada de control negativo.

Respecto a la prueba de gelatina sal, se agregó 1 mL del reactivo gelatina-sal a 1 mL del extracto etanólico. La presencia de taninos se determinó por la aparición de precipitado. Se empleó el mismo control positivo y negativo de las pruebas de cloruro férrico.

4.3.5. Prueba de saponinas:

Se realizó la prueba de espuma para la identificación de saponinas, en la cual se tomó 1 mL de extracto etanólico y se agregaron 5 mL de agua. Se agitó vigorosamente durante 5 minutos. La presencia de saponinas se determinó por la formación de espuma en forma de panal por al menos 5 minutos en la parte superior del tubo de ensayo.

Como control positivo se usó extracto de quinua y de control negativo, agua destilada.

4.3.6. Prueba de cardiotónicos:

Se realizó la prueba de Molisch para la identificación de cardiotónicos. Para esto, se mezclaron 0,5 mL de extracto etanólico y 0,5 mL de reactivo de Molisch, se vertió 1 mL de esta mezcla gota a gota por las paredes de un tubo con 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. La presencia de cardiotónicos se determinó por la presencia de una coloración violeta en la interfase. Como control positivo se usó extracto de Digitalis purpurea (dedalera) y control negativo, agua destilada.

4.3.8. Prueba de cumarinas:

Para el análisis de cumarinas se empleó la prueba de fluorescencia. Inicialmente, se calentó mediante baño de maría, a temperatura de ebullición, 1 mL de extracto etanólico durante cinco minutos, se colocó dentro del tubo un papel de filtro plegado impregnado con solución 0,1 N de NaOH y se observó su fluorescencia en luz ultravioleta. La presencia de cumarinas se determinó por la fluorescencia del papel en el tubo. Como control positivo se usó solución de 7-hidroxicumarina y de control negativo, agua destilada.

4.3.9. Análisis de alcaloides:

Para la determinación de alcaloides se emplearon las pruebas Dragendorff en la cual a 1 mL de extracto ácido se le agregaron cuatro gotas del reactivo Dragendorff. La presencia de alcaloides se determinó por la formación de un precipitado oscuro. Como controles positivos se usó cafeína y como control negativo se empleó agua destilada.

4.4. Cromatografía en capa delgada (TLC) y capa delgada de alta eficiencia (HPTLC):

Para determinar los perfiles cromatográficos, sobre todo a aquellos metabolitos cuyo resultado en el AFP fue positivo, se realizaron cromatografías por TLC y HPTLC, en placas de Silica-gel con soporte de aluminio e indicador de fluorescencia F254 de Merck® y placas HPTLC de 20 x 10 cm o 10 x 10 cm de silica-gel F254 de Merck®, respectivamente. Para los análisis por HPTLC se utilizó el equipo Camag® HPTLC, constituido por:

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8 automuestrador, cámara de migración, revelado y detección. Se emplearon los extractos a una concentración de 3 mg/mL, al igual que los estándares, se aplicaron 10 µL de cada uno. Según el caso, se emplearon reveladores como vainillina sulfúrica, reactivo natural y ρ-anisaldehído sulfúrico. Las fases móviles fueron empleadas de acuerdo al grupo de metabolito a evaluar, y está descritas en las respectivas figuras (Ver Resultados y Discusión).

4.5. Análisis por Cromatografía Líquida Por Ultra Eficiencia Acoplada a Detección Por Arreglo de Diodos (UPLC-DAD):

El análisis por UPLC-DAD se llevó a cabo en un Acquity H Class UPLC Waters® con un detector por arreglo de diodos, bomba cuaternaria, desgasificador y automuestreador. Los datos fueron procesados usando el software Empower® 3. Se empleó una columna de fase reversa (C18) Phenomenex® Kinetex 1,7 µm de 100 x 2,1mm, mantenida a 25 °C ± 1 con un gradiente de elución de acetonitrilo (solvente A) y ácido fórmico al 0,1% en agua (solvente B) de la siguiente manera: 17 - 70 % A (0 - 20min), 70%-95 % A (20 – 30 min), 95 % A (30 – 32 min), 95 - 17% A (32 – 40 min), con un flujo de 0,40 mL min^-1 y un volumen de inyección de 3 µL. Para la detección, la longitud de onda empleada fue 320 y 350 nm.

4.6. Cromatografía de ultra eficiencia acoplado a espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo (UHPLC-MS-QTOF):

Los análisis fueron realizados en un equipo LCMS 9030 Shimadzu Scientific Instruments ® (Maryland, EE. UU.) con detector UV y acoplado a un espectrómetro de masas Q-TOF e ionizador ESI. Se emplearon las mismas condiciones cromatográficas empleadas en el análisis por UPLC descritas anteriormente. El espectrómetro de masas se operó en modo negativo de ionización, los datos fueron analizados a través del software Lab Solutions.

4.7. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y concentración mínima fungicida (MFC):

Se realizó el método de microdilución en caldo siguiendo las normas de padronización en el protocolo M27-A2 para levaduras del Clinical laboratory Standards Institute CLSI (NCCLS, 2008).

4.7.1. Preparación del inóculo:

Partiendo de un cultivo stock de la cepa de referencia C. albicans SC5314 del Laboratorio de Micosis Humanas y Proteómica, se realizó un repique en Agar Sabouraud Dextrosa (SDA) y se incubó a 37 °C durante toda la noche.

Posteriormente, se tomó una pequeña alícuota de la levadura, se resuspendió en solución salina 0,85% y se agitó en vortex. La suspensión celular se ajustó en un lector de Elisa BIO RAD a una densidad correspondiente a la escala 0,5 McFarland a una absorbancia de 595 nm equivalente a una concentración de 1x10⁶ células/mL de la solución preparada. Por último, se realizó una doble dilución 1/50 y una dilución 1/20 con el medio RPMI-1640 con glutamina tamponado con ácido 3-[N-morfolino] propanosulfónico (MOPS), ajustado a pH 7,0 hasta obtener un inóculo final de 1-5x10³ células/mL. Se incluyó un control de esterilidad (solo medio RPMI-1640) y un control de crecimiento (Cultivo en RPMI-1640 libre de extracto). Se realizó el mismo procedimiento para dos aislados clínicos resistentes al fluconazol: C. albicans PUJ/HUSI 256 y C. auris PUJ/HUSI 537 y el aislado clínico susceptible al fluconazol: C. auris PUJ/HUSI 435. Las 3 cepas mencionadas son aislados clínicos de pacientes del Hospital Universitario San Ignacio de Bogotá, Colombia

4.7.2. Microdilución para la determinación de la MIC:

En relación con la prueba de microdilución, una solución de los extractos brutos diluidos en DMSO a una concentración stock de 200 mg/mL se diluyeron mediante diluciones seriadas en una microplaca estéril de 96 pozos. Se realizaron ensayos por triplicado. La concentración inicial de los extractos se ajustó a 20 mg/mL en

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9 medio RPMI-1640. En los pozos A1, A2 y A3 se agregaron 200 µL del extracto de T. alata (hojas) y en los pozos A4, A5 y A6 se agregaron 200 µL del extracto de T. alata (tallo). En la fila 7 y 8 se agregó 100 µL de fluconazol como control antifúngico iniciando en la concentración 128 µg/mL. El punto de corte del fluconazol es < 2 µg/mL (sensible). Desde la segunda fila, se realizaron diluciones seriadas en base 2 hasta los pozos H1, H2, H3, H4, H5 y H6. Las concentraciones fueron evaluadas en un rango de concentración entre 10.000 hasta 78,1 µg/mL. La concentración final de DMSO fue inferior al 2% (v/v) (dilución seriada desde los pozos A9 a H9). El DMSO se agregó para confirmar que la exposición a este solvente no influye en el crecimiento de la cepa evaluada.

Para el caso de la microplaca donde se evalúa la actividad antifúngica contra C. albicans SC5314, en los pozos de la columna 12 (A hasta D) se agregaron 200 µL de RPMI como control negativo y en la misma columna (E hasta H) se agregaron 100 µL de RPMI y 100 µL de la cepa C. albicans SC1314 como control positivo. Respecto a las cepas C. albicans 256, C. auris 435 y C. auris 537, el control positivo y negativo se agregaron en la fila 10. Cada placa se incubó a 37 °C por 48 h. El diagrama de las placas se agregó como Anexo 2.

La lectura se realizó de manera visual a las 48 horas para evidenciar la presencia o ausencia del crecimiento fúngico, por medio de observación de turbidez en el medio comparado con el control de crecimiento (libre de compuesto antifúngico). La lectura de las absorbancias fue realizada a 595 nm, 2 días después de la incubación a 37 ºC con el extracto y el antifúngico, en un espectrofotómetro de microplacas.

4.7.3. Determinación de la concentración mínima fungicida:

Adicionalmente, fue evaluada la posible actividad fungicida (MFC), considerada como la concentración más baja en que se inhibe el crecimiento del hongo (en más del 90%) en el medio utilizado. A partir de los resultados de las microplacas multipozo y las diluciones seriadas (10.000 – 78,12 µg/mL) del extracto evaluado, se inocularon 5 µL de la suspensión de C. albicans o C. auris vs extractos de cada uno de los pozos donde no se observó crecimiento. El subcultivo fue incubado en Agar Sabouraud Dextrosa a 37 ºC durante 24 h. Igualmente, se incluyó el pozo con fluconazol y los controles positivo y negativo.

5. Resultados y discusión:

5.1. Análisis fitoquímico preliminar (AFP):

En el análisis fitoquímico preliminar se obtuvieron resultados positivos para esteroides y terpenos, taninos y saponinas (Tabla 2).

Tabla 2. Resultados del AFP. Actualmente, no se encuentra disponible en el laboratorio- .

Metabolito Prueba Control positivo Resultado

Carotenoides Salkowski -Caroteno Negativo

Esteroides y terpenos Liebermann-Burchard Tillandsia usneoides +

Flavonoides Shinoda Rutina No conclusivo

Leucoantocianidinas Rutina y kampferol Negativo

Taninos Cloruro férrico Ácido tánico ++

Gelatina-sal Ácido tánico ++

Saponinas Espuma Quinua ++

Cardiotónicos Molisch Digitalis purpurea Negativo

Cumarinas Fluorescencia 7-hidroxicumarina Negativo

Alcaloides Dragendorff Cafeína Negativo

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10 No obstante, estos ensayos, aunque se consideran específicos, sensibles y ampliamente aceptados, no están libres de arrojar falsos positivos. Por ejemplo, la prueba de Liebermann-Burchard puede dar resultados positivos para cualquier esteroide o triterpenoide con un doble enlace como carotenos y xantofilas y no solo para esteroides y terpenos (Bilbao, 1997). Respecto a flavonoides, con la prueba de Shinoda puede indicar la posible presencia de flavonoides que contienen en la estructura un núcleo benzopirona tales como flavonas, flavonoles, flavanonas, isoflavonoides y xantonas (Monedero, 2016). El extracto mostraba una coloración rosado tenue, indicativo de estos tipos de compuestos (Bilbao, 1997).

En el caso de taninos, los resultados mostraron una posible presencia de estos mediante la prueba de cloruro férrico y gelatina-sal. En la primera, se evidenció una coloración azul oscura indicando la posible presencia de taninos derivados del ácido gálico. En la segunda, se formó un precipitado producto de la unión por enlaces cruzados de un biopolímero (como la gelatina) con taninos ya que son hidroxilos fenólicos (Villareal, 2015).

Por último, en la prueba de espuma se obtuvieron resultados positivos indicando la posible presencia de saponinas en T. alata debido a la formación de abundante espuma producto de la disminución de la tensión superficial del agua (Bilbao, 1997).

5.2. Cromatografía en capa fina (TLC) y en capa delgada de alta eficiencia (HPTLC):

Se realizaron ensayos en TLC y HPTLC para los resultados positivos del AFP. Primero, para esteroides y terpenos se realizó una TLC con la fase móvil (Fm) tolueno: cloroformo: metanol (4:4:1) y revelador: Anisaldehído sulfúrico. Los resultados se muestran en la figura 2. Como patrón, se utilizó extracto de Tillandsia usneoides (especie previamente estudiada en el grupo, rica en triterpenos) y se evaluaron el perfil cromatográfico de hojas y tallo. Posterior a la revelación y calentamiento, con luz natural se evidenciaron manchas azules, púrpuras y grises en el patrón y en los extractos, indicativo de monoterpenos, triterpenos y esteroides, respectivamente, corroborando lo obtenido anteriormente (Gerlach et al., 2018).

Figura 2. TLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para esteroides y terpenos. Fe: Silica gel. Fm: tolueno: cloroformo: metanol (4:4:1). Revelador: Anisaldehído sulfúrico. Visualización: Luz natural. 1.

Extracto de Tillandsia usneoides; 2. Extracto de tallo de T. alata; 3. Extracto de hojas de T. alata.

De igual manera, se realizó una TLC de los dos extractos para saponinas con la Fm: butanol: Agua: Ácido acético (84:14:7) y revelador: Anisaldehído sulfúrico y calor. Como estándar se usó extracto de Passiflora edulis var.

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11 edulis (especie previamente estudiada en el grupo, rica en saponinas). Las saponinas se detectaron en los dos extractos por la coloración azul, azul-violeta, asociada también a la polaridad (Wagner & Bladt, 1996) (Figura 3).

Se evidencia que cada extracto tiene un perfil diferente atribuible, posiblemente, a diferentes compuestos.

Figura 3. TLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para saponinas. Fe: Silica gel. Fm:

butanol: Agua: Ácido acético (84:14:7). Revelador: Anisaldehído sulfúrico y calor. Visualización: Luz natural. 1.

Extracto de Passiflora edulis var. edulis; 2. Extracto de hojas de T. alata; 3. Extracto de tallo de T. alata.

Debido a que se obtuvieron resultados positivos para taninos en el AFP, se realizó una TLC para los dos extractos con la Fm: Tolueno: Acetato de etilo: Ácido fórmico (3:4:1) y revelador, FeCl3. El estándar usado fue ácido tánico.

Se presentó una coloración azul oscura en el extracto de hojas, característico para taninos hidrosolubles (Dávalos et al., 2013). La figura 4 indica la posible presencia de taninos hidrolizados en hojas de T. alata.

Figura 4. TLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para taninos. Fe: Silica gel. Fm: Tolueno:

Acetato de etilo: Ácido fórmico (3:4:1). Revelador: FeCl3. Visualización: Luz natural. 1. Ácido tánico. 2. Extracto de hojas de T. alata; 3. Extracto de tallo de T. alata.

Se realizaron ensayos en HPTLC para flavonoides glicosilados y agliconas. Para los primeros, se utilizó la Fm:

Acetato de etilo: Acetona: Ácido acético: Agua. (6:2:1:1) y revelador, reactivo natural. Se utilizó rutina como

(12)

12 patrón. El resultado se muestra en la figura 5. La rutina presenta un color amarillo-verde y un Rf=0.4, también observado en el extracto de tallo de T. alata (Wagner y Bladt, 1996).

Figura 5. Cromatografía por HPTLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para flavonoides glicosilados. Fe: Silica gel. Fm: Acetato de etilo: Acetona: Ácido acético: Agua (6:2:1:1). Revelador: Reactivo natural. Visualización: UV-365 nm. 1. Rutina; 2. Extracto de hojas de T. alata; 3. Extracto de tallo de T. alata.

Lo que se puede notar claramente en este cromatograma, es el perfil diferenciado entre hojas y tallos. En hojas se observa una predominancia de colores azul florecientes, mientras en tallos se observa la predominancia de manchas de color verde – amarillas. Según Wagner y Bladt (1996), la presencia de flavonoides frecuentemente viene acompañada de ácidos fenólicos carboxílicos (Ej: Ácido cafeico, clorogénico), los cuales también se pueden observar en las mismas condiciones cromatográficas. Por esta razón, se realizó adicionalmente otra TLC de ácido fenólicos con Fm: Tolueno: AcOEt: Ac. Fórmico (9:4:1) y patrón de ácido cafeico visualizando color azul fluorescente en hojas de T. alata, característico de ácidos fenólicos (Figura 6).

(13)

13 Figura 6. TLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para ácidos fenólicos. Fe: Silica gel.

Fm: Tolueno: AcOEt: Ac. Fórmico (9:4:1). Revelador: Reactivo natural. Visualización: UV-365 nm. 1. Ácido cafeico; 2. Extracto de hojas de T. alata.

Respecto a los flavonoides tipo agliconas, la Fm utilizada fue: Hexano: Acetato de etilo: Ácido fórmico (10:6:1).

El resultado evidencia que la quercetina (patrón), de un color amarillo oscuro y Rf=0,35, no se visualiza en ambos extractos, descartando la posible presencia, al menos predominante, de flavonoides tipo agliconas en T. alata (Figura 7).

Figura 7. TLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para flavonoides agliconas. Fe: Silica gel. Fm: Hexano: Acetato de etilo: Ácido fórmico (10:6:1). Visualización: UV-365 nm. 1. Quercetina. 2. Extracto de hojas de T. alata; 3. Extracto de tallo de T. alata.

Debido a que la corola de T. alata es llamativa y presenta una coloración anaranjada, se realizó una TLC para identificar la presencia de pigmentos responsables del color de las flores. Se utilizó como patrón -caroteno y Fm:

tolueno: acetato de etilo (9:1) y se evaluó el extracto de flores de T. alata dando resultados positivos para carotenoides al evidenciarse bandas de coloración amarillo a naranja con luz y revelador natural (Cornejo, 2011) (Figura 8).

(14)

14 Figura 8. TLC para visualización de perfiles cromatográficos específicos para carotenoides. Fe: Silica gel. Fm:

tolueno: acetato de etilo (9:1). Visualización: Luz natural. 1. -caroteno. 2. Extracto de flores de T. alata.

5.3. Cromatografía líquida de Ultra eficiencia (UPLC) y Cromatografía liquida de gases acoplada a masas (LC-MS):

5.3.1. Extracto de hojas de T. alata:

Se realizaron ensayos en UPLC debido a que se considera la técnica más utilizada para el análisis de plantas gracias a su amplitud de metabolitos posibles de análisis, permitir alta resolución, sensibilidad y selectividad (Tistaert et al., 2011). Además, tiene una gran importancia en la determinación de compuestos fenólicos, metabolitos que posiblemente presenta T. alata según los resultados de HPTLC (figura 5) (Oliveira, 2015; Spáčil et al., 2008). Del análisis cromatográfico por UPLC se obtuvo el cromatograma del extracto de hojas con 3 picos principales (Figura 9).

Figura 9. Cromatograma UPLC y espectros DAD del extracto de hojas de T. alata a 320 nm.

Los 3 picos principales corresponden a compuestos diferentes ya que el tiempo de retención varía. Debido a que los resultados de TLC y HPTLC mostraron posible presencia de ácidos fenólicos (ácido cafeico, clorogénico) en el extracto de hojas (Figura 5), se realizaron ensayos en UPLC para corroborar lo anterior ya que los espectros DAD en este análisis muestran dos bandas principales de absorción, con destaque para la banda con máximo de absorción alrededor de 320nm, con un hombro en menor longitud de onda. El pequeño tiempo de retención debido a la alta polaridad es un indicativo de los ácidos fenólicos (Lin & Harnly, 2007).

Se realizó una comparación del cromatograma anterior de hojas con los cromatogramas del ácido cafeico y clorogénico, medidos a 320 nm, para comprobar la posible presencia de estos ácidos fenólicos en el extracto de T.

alata.

El ácido cafeico muestra un pico mayoritario en 7.10, el espectro DAD muestra un pico mayoritario que absorbe a 323,5 nm y dos minoritarios que absorben a 216,9 y 238,1 nm (Figura 10) (Meenu et al., 2016), similar a dos de los picos de absorbancia en el espectro del extracto de hojas (Figura 8).

(15)

15 Figura 10. Cromatograma y espectro UV del ácido cafeico, medido a 320 nm.

Respecto al ácido clorogénico, muestra un pico mayoritario en 7.20, el espectro DAD presenta un pico mayoritario a 327.4 nm y dos picos minoritarios entre 215 y 250 nm (Figura 11), similar al espectro del tercer pico de hojas de T. alata (Figura 8).

Figura 11. Cromatograma y espectro UV del ácido clorogénico, medido a 320 nm.

Cabe destacar que, en los resultados obtenidos, el ácido clorogénico presentó un tiempo de retención mayor que el ácido cafeico. No obstante, en otros estudios el ácido clorogénico eluye primero que el ácido cafeico, en fase reversa, debido a que el ácido clorogénico es un éster del ácido cafeico y ácido quínico proporcionando una mayor polaridad frente al ácido cafeico (Spáčil et al., 2008). Quizás, por un error experimental, el ácido clorogénico eluyó después que el ácido cafeico. Siendo así, tentativamente, el pico mayoritario del extracto de hojas que eluye en el minuto 6.80 corresponde a una estructura más parecida al ácido clorogénico que el cafeico.

Para el caso de hojas, el cromatograma obtenido en el UHPLC-QTOF se muestra en la figura 12, similar a obtenido en UPLC (figura 8).

AU

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00

AU

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60

Minutes

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00

(16)

16 Figura 12. Cromatograma de hojas de T. alata obtenido en HPLC-QTOF.

Se realizó el espectro de masas del pico 1, cuyo tiempo de retención fue de 5.986 minutos y que mostró una masa de 353,14 m/z (figura 13), corroborando la presencia de ácido clorogénico.

Figura 13. Espectro de masas del pico 1 del extracto de hojas de T. alata.

De igual manera, se realizó una búsqueda en cada una de las señales del cromatograma la masa correspondiente al ácido cafeico (179 g/mol). Sin embargo, no se encontró la masa característica ratificando los resultados obtenidos en UPLC donde se indicaba la presencia de ácido clorogénico y no cafeico, pero a diferencia de la TLC, donde inicialmente se indicaba la presencia de ácido cafeico.

5.3.2. Extracto de tallo de T. alata:

El extracto de tallo, según los resultados de HPTLC, posiblemente presenta rutina (figura 5). Por esta razón, también se realizó análisis cromatográfico por UPLC obteniendo varios picos principales, medidos a 350 nm (figura 14), y se comparó con el cromatograma de rutina (figura 15). Se obtuvo el espectro UV del pico mayoritario del extracto de hojas que eluyó a los 9.45 min ya que en ese tiempo también eluyó el estándar de rutina (Figura 15). Al comparar los máximos de absorbancia del extracto y el estándar, son las mismas longitudes de onda de máxima absorción (254,7 y 353,1) corroborando que posiblemente el extracto de tallo presenta rutina (Ladino y López, 2016).

(17)

17 Figura 14. Cromatograma UPLC y espectro DAD del extracto de tallo a 350 nm.

Figura 15. Cromatograma UPLC de rutina (azul) y extracto de tallos (negro) de T. alata, medido a 350 nm.

AU

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18

Minutes

7.80 8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00 9.20 9.40 9.60 9.80 10.00 10.20 10.40 10.60 10.80 11.00 11.20 11.40

(18)

18 Se analizó la muestra de tallo de T. alata mediante UHPLC-TQ-MS obteniendo el cromatograma de la figura 16, similar al obtenido por UPLC (figura 14). Posteriormente, se realizó una búsqueda de las moléculas con m/z de 609, masa característica de la rutina después de ser desprotonada (esta masa se corroboró en el UHPLC-QTOF- MS, donde se analizó el estándar de rutina). Este análisis se realizó mediante un análisis de monitoreo de iones seleccionados (SIM). En la figura 17 se observa el cromatograma con dos picos, en los tiempos de retención 8.580 (mayoritario) y 10.489 minutos, indicando que estas señales presentan una masa de 609 m/z, y juntamente con los datos obtenidos previamente, corrobora la presencia de rutina como uno de los flavonoides mayoritarios.

Figura 16. Cromatograma y espectro de masas del extracto de tallo de T. alata, mediante HPLC-TQ-MS.

Figura 17. Cromatograma del extracto de tallo mediante análisis SIM por HPLC-QTF-MS.

5.4. Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima fungicida:

(19)

19 En la tabla 3 se muestran los resultados de los ensayos biológicos para la evaluación de la actividad anti-Candida de los extractos 6.1 y 6.3 contra los aislados clínicos.

Tabla 3. Resultados de la actividad antifúngica (MIC90): Menor concentración del extracto necesaria para inhibir el crecimiento fúngico (in vitro) del 90% de las cepas estudiadas.

Extracto C. albicans SC5314 (mg/mL) MIC/MFC

C. albicans 256 (mg/mL) MIC/MFC

C. auris 435

(mg/mL) MIC/MFC

C. auris 537

(mg/mL) MIC/MFC T. alata

(hojas)

10/10 5/10 5/10 5/10

T. alata (tallo)

10/10 10/10 10/10 10/10

El extracto de hojas de T. alata presentó actividad contra la cepa de referencia SC5314 en la mayor concentración (10 mg/mL) y a 5 mg/mL para los otros aislados clínicos. La MFC fue de 10 mg/mL contra C. albicans y C. auris, es decir, que el extracto ejerció un efecto fungicida sobre las cepas después de 24 h de incubación a 37 ºC. Respecto al extracto de tallo, la MIC para las cuatro cepas fue mayor a 10 mg/mL. Debido a que se evidenció crecimiento de Candida spp. en los pozos que evaluaban la actividad antifúngica, no se realizaron ensayos de actividad fungicida para este extracto.

En la Figura 18 se muestra el ensayo biológico para la evaluación de la actividad anti-Candida de los extractos 6.1 y 6.3 contra la cepa de referencia SC5314, realizado en microplacas de 96 pozos, evidenciando que la concentración mínima inhibitoria es de 10 mg/mL para el extracto de hojas (6.1).

Figura 18. Resultados del ensayo de microdilución en caldo para la determinación de la CMI de los extractos de hojas y tallos de T. alata contra C. albicans SC5314.

En la Figura 19, es presentada la concentración mínima fungicida (MFC), considerada como la concentración más baja en que se inhibe el crecimiento del hongo en el medio utilizado. El resultado en la placa de Petri muestra que, en las concentraciones seleccionadas, el extracto de hojas de T. alata ejerce un efecto fungicida sobre C. albicans a 24 h de incubación en la mayor concentración (10 mg/mL) (pozos A1, A2 y A3).

Filas 1,2 y 3: Extracto hojas T. alata con C. albicans iniciando en 10 mg/mL.

Filas 4,5 y 6: Extracto tallo T. alata con C. albicans iniciando en 10 mg/mL.

Filas 7 y 8: Fluconazol Fila 9: DMSO

Fila 10: Extracto hojas T. alata Fila 11: Extracto tallo T. alata A12-D12: Control negativo (RPMI) E12-H12: Control positivo (inóculo SC5314)

(20)

20 Figura 19. Determinación de la concentración mínima fungicida (MFC) para T. alata contra C. albicans SC5314.

Para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC), es decir, la concentración más baja (en mg/mL) del extracto que inhibe el crecimiento de la cepa SC5314, se realizó una lectura visual de los pozos, comparando la cantidad de crecimiento de cada uno o turbidez con el crecimiento del grupo control. De este modo, se determinó si hubo o no reducción de crecimiento o ausencia de este.

Adicionalmente, el valor de la MIC del fluconazol frente a la cepa de levadura SC5314 sugieren que esta se comporta como sensible al control antifúngico según lo dictado por el CLSI ya que a estas concentraciones el fluconazol inhibe el crecimiento del hongo. No obstante, con la cepa C. albicans 256 el MIC fue de 64 µg/mL, considerándose una cepa resistente al fluconazol.

Además, en el control negativo no se evidenció crecimiento del hongo mientras que en el control positivo si hubo crecimiento, descartando errores experimentales y evidenciando que no se presentó contaminación. Así mismo, se observó crecimiento en los pozos comprendidos en la fila 9, los cuales contenían DMSO (control positivo) en una dilución seriada con los mismos volúmenes empleados para tratar el extracto, concluyendo que el DMSO no interfiere con el crecimiento.

En el Anexo 4 se muestran los resultados de los ensayos biológicos para la evaluación de la actividad anti-Candida de los extractos 6.1 y 6.3 contra los demás aislados clínicos.

La lectura de absorbancias y mapas de calor se agregaron en el Anexo 5.

Diferentes investigaciones han informado sobre la actividad antifúngica de diversos extractos de plantas usadas en la medicina tradicional contra C. albicans y microorganismos de interés clínico humano (Hofling et al., 2010;

Holetz et al., 2002; Hernandez et al., 2001).

De acuerdo con nuestros resultados, la MIC evaluada concluye que, a las concentraciones definidas, el extracto T.

alata muestra efecto antifúngico en las cepas de C. albicans: SC5314 a 10 mg/mL y 5mg/mL en C. albicans 256 y C. auris 435 y C. auris 537. Aunque varios estudios han dilucidado las propiedades farmacológicas de T. alata, incluyendo efectos antimicrobianos, antivirales, antitumorales y antifúngicos, (Sultana et al., 2015; Patil & Patil, 2017; Vlietinck et al., 1995; Jenifer S et al., 2014), no hay estudios recientes que evalúen su potencial efecto antifúngico en la cepa de referencia C. albicans SC5314 o en aislados clínicos. Vlietinck y Cols (1995) reportaron en un estudio in vitro de 267 extractos de plantas, incluida T. alata, que este extracto es efectivo contra los dermatofitos y contra S. aureus y P. aeruginosa, pero no para levaduras a una concentración inicial de 500 mg/mL por medio la técnica de difusión en disco.

Cabe destacar que el extracto de hojas fue más efectivo que el de tallo ya que el primero presentó MIC´s entre 10 y 5 mg/mL mientras que el tallo no fue efectivo para inhibir Candida spp. incluso a 10 mg/mL. Se sugiere que

A1-A3: Extracto hojas T. alata con C. albicans iniciando en 10 mg/mL B1-B3: Extracto hojas T. alata con C. albicans en 5 mg/mL.

G7-G8: Fluconazol A9: DMSO C -: RPMI

C +: Inóculo SC5314.

6.1 y 6.3: Extracto solo hojas y tallos, respectivamente.

(21)

21 este resultado se debe a que algunas plantas presentan diferentes cantidades de metabolitos secundarios en diferentes partes del individuo. Por ejemplo, mayor cantidad de taninos y triterpenos (positivo en el AFP, TLC y HPTLC), compuestos que cumplen un rol en la actividad antifúngica de diferentes especies de plantas (Anand et al., 2015; Pardo et al., 2011; Sánchez-León et al., 2015). Así mismo, los ácidos fenólicos, presentes en el extracto de hojas según los resultados de HPTLC y UPLC, son de gran interés debido a la elevada capacidad antioxidante, se ha registrado que presentan actividad contra patógenos orales (Morales et al., 2012; Martínez-Rossi et al., 2008).

Además, el extracto de hojas fue más efectivo para inhibir C. auris que C. albicans ya que la MIC para el primer patógeno fue la mitad de la concentración de la segunda levadura. Esta mayor resistencia puede deberse a múltiples causas como por ejemplo una mutación en la 14-esterol demetilasa que afecta la resistencia o la sobreexpresión del gen ERG11 y las bombas de eflujo ABC1, mecanismos asociados a la resistencia de antifúngicos (Duque et al., 2020).

Se sugiere, que el efecto fungicida que presenta T. alata en Candida spp. puede deberse a la lisis de la pared celular fúngica y de la membrana citoplasmática a causa de la liberación de productos antimicrobianos o enzimas líticas de las plantas que causan la rotura del



-1.3 y



-1.6 glucanos y polímero de quitina, principales componentes de la pared fúngica, como lo reportan Karthikeyan y Thangavelu (2019) con extractos de Piper nigrum.

6. Conclusiones

Entre los principales grupos de metabolitos observados para T. alata se encontró la presencia de taninos, saponinas, flavonoides, esteroides y terpenos para los extractos de hojas y tallo. Con HPTLC se corroboró la presencia de flavonoides y también de ácidos fenólicos en tallos y hojas, respectivamente. Mediante UHPLC-QTOF-MS y UPLC-DAD, se identificó la presencia de ácido clorogénico en el extracto de hojas y rutina en el extracto de tallo.

Adicionalmente, en este trabajo se reporta por primera vez la actividad antifúngica del extracto etanólico obtenido de las hojas que presentó actividad contra C. albicans y C. auris a 10 y 5 mg/mL, respectivamente.

7. Agradecimientos:

Muchas gracias a mi familia y amigos por estar siempre presentes en el proceso de aprendizaje a lo largo de la carrera. Gracias a los compañeros de laboratorio: Luis Carlos Chitiva, Leonardo Villareal, Leonardo Guerrero y Andrea Herrera por todas las sugerencias, consejos y recomendaciones para el desarrollo del presente trabajo de grado.

Gracias al profesor Geison Modesti por haberme aceptado en el semillero hace varios años y tener tanta paciencia y apoyo a los estudiantes. Gracias al colectivo del laboratorio de Proteómica y Micosis Humanas; en especial a la Dra. Claudia Parra Giraldo y a la Dra. Claudia Bravo Chaucanés por la asesoría y los valiosos aportes relacionados con la evaluación antifúngica.

“The author(s) disclosed receipt of the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: Funding was provided by the Colombian Ministry of Science and technology (792-2017 2ª Convocatoria Ecosistema científico para la financiación de proyectos de I+D+i), World Bank and Vicerrectoría de Investigaciones, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia (contract No. FP44842-221-2018). Also, the authors would like to thank Pontificia Universidad Javeriana for its support and the Colombian Environmental Ministry for allowing the use of genetic resources and products derived (Contract number 212/2018; Resolution 210/2020)”.

(22)

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8. Anexos:

Anexo 1. Estructuras: 6-epi-stilbericoside, alatosido y Thunalosido.

Fuente: Damtoft, S., Frederiksen, L. B., & Jensen, S. R. (1994). Biosynthesis of iridoid glucosides in Thunbergia alata. Phytochemistry, 37(6), 1599-1603.

Anexo 2. Diagrama de distribución de placa para evaluar actividad antifúngica contra C. albicans SC5314

Anexo 3. Estructura del ácido clorogénico (A) y cafeico (B).

(26)

26 Fuente: Ávalos Fernández, D. S., & Mera Alcívar, F. J. (2018). Evaluación de los niveles de ácido clorogénico en granos de café verde cultivado en Ecuador (Coffea robusta) (Bachelor's thesis, Universidad de Guayaquil.

Facultad de Ciencias Químicas).

Anexo 4. Ensayos clínicos de los aislados clínicos:

C. albicans 256

Ensayo biológico para la evaluación de la actividad anti-Candida de los extractos 6.1 y 6.3 contra la cepa C.

albicans 256.

Determinación de la concentración fungicida mínima (MFC) para T. alata contra C. albicans 256.

C. auris 435

Filas 1, 2 y 3: Extracto hojas T. alata con C. albicans iniciando en 10 mg/mL.

Filas 4, 5 y 6: Extracto tallo T. alata con C. albicans iniciando en 10 mg/mL.

Filas 7 y 8: Fluconazol Fila 9: DMSO

A10-D10: Control negativo (RPMI) E10-H10: Control positivo (inóculo 256).

A1-A3: Extracto hojas T. alata con C. albicans iniciando en 10 mg/mL

B1-B3: Extracto hojas T. alata con C. albicans en 5 mg/mL.

G7-G8: Fluconazol A9: DMSO

C -: RPMI

C +: Inóculo C. auris 435.

6.1 y 6.3: Extracto solo hojas y tallos, respectivamente.