Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Trombofilia Hereditaria:

metodología de estudio e

interpretación

R. Lecumberri

Servicio de Hematología Clínica Universidad de Navarra

¿Qué?

¿Cómo?

¿Cuándo?

¿Por qué?

¿Consecuencias?

¿A quién?

Trombofilia

Tendencia al desarrollo de episodios trombóticos

debido a desequilibrio entre activación del sistema

hemostático y su inhibición fisiológica

Trombofilia primaria

Hereditaria

- Deficiencia de AT, PC, PS - Resistencia PC activada - Factor V Leiden - Protrombina G20210A - Hiperhomocisteinemia - ¿otras?

Adquirida

- Hiperhomocisteinemia - Anticuerpos antifosfolípido

Trombofilia secundaria

- Sepsis - Neoplasias - Embarazo/puerperio - Cirugías - Traumatismos - Inmovilización - Síndrome metabólico - Prótesis vasculares - Hiperviscosidad - Estrógenos -SMPC, HPN,...

60% de la variación de la susceptibilidad (heredabilidad) a

trombosis venosa es atribuible a factores genéticos

Factores genéticos (60%)

Factores ambientales (40%)

Souto JC, et al. Am J Hun Genet 2000; 67: 1452-9.

Qué incluir en un estudio de trombofilia

1

) Clara y consistentemente asociados con significativo

riesgo trombótico (¿OR>2?) y relativamente frecuentes

en pacientes con trombosis venosa (¿>0,5%?)

- Deficiencia anticoagulantes: Antitrombina, Proteína C y S - Polimorfismos protrombóticos: FV Leiden y PT 20210A - No incluir MTHFR

2) Potencial utilidad clínica:

- Deficiencia anticoagulantes: Antitrombina, Proteína C y S - Defectos combinados (Polimorfismos en homocigosis, o

heterocigosis compuesta)

3) Estudiados siempre en consideración con la historia

personal y familiar de trombosis.

Defecto Genético Prevalencia Prevalencia TEV (%) controles (%) Deficiencia AT 0.5-2 0.02 Deficiencia PC 3 0.2-0.4 Deficiencia PS 1.6 0.03-0.13 FV Leiden 10-15 4 PT G20210A 6-10 3 TOTAL: 25-35% Riesgo Incidencia relativo anual TEV (%)*

10-50 1.7-4.0

10 0.7-2.5

10 0.7-3.2

3-5 0.1-0.7

2-3 0.1-0.4

•Negatividad no indica que el sujeto no tiene un defecto genético protrombótico •Prueba positiva no indica que sea la causa del evento trombótico

*estudios familiares

60% de la variación de la susceptibilidad (heredabilidad) a

trombosis venosa es atribuible a factores genéticos

Factores genéticos (60%)

Factores ambientales (40%)

Cientos de estudios de asociación en SNPs en genes candidatos:

- Resultados inconsistentes o RR muy bajos (<1,5)

- ABO. Grupos no OO: 1,8-2,5 veces

A quién realizar estudio de trombofilia

En los que sea útil (coste-beneficio):

1) Alta probabilidad de encontrar defecto

Y

2) La identificación sea útil en la prevención o

tratamiento

De Stefano V & Rossi E. Thromb Haemost 2013; 110: 697-705.

• NO estudio universal

• NO individuos asintomáticos expuestos a situaciones de riesgo:

ACO, THS, embarazo, COT

(10% éxito, especialmente polimorfismos) pero bajo riesgo absoluto de desarrollo de TEV (estrategias no coste/efectivas)

(Wu & Greer. Curr Opin Hematol 2007; 14: 500-503).

A quién realizar estudio de trombofilia

1. Trombosis recurrente

2. Trombosis venosa antes de los 50 años

3. Trombosis venosa espontánea

4. Trombosis venosa de localización inusual (cerebral, mesentérica, portal,

hepática)

5. Trombosis venosa en paciente con historial familiar de trombosis venosa

6. Trombosis venosa secundaria a embarazo, uso de anticonceptivos orales o

tratamiento con terapia hormonal sustitutiva

7. Púrpura neonatal (AT, PC, PS)

8. Necrosis cutánea al iniciar AVK (PC, PS)

A quién realizar estudio de trombofilia

¿Complicaciones obstétricas? ¿Trombosis arterial?

¿Familiares asintomáticos de pacientes portadores?

Intensidad, esquema o tipo del tratamiento anticoagulante:

Prácticamente ninguna alteración trombofílica justifica una modificación de la

intensidad del tratamiento

Duración del tratamiento anticoagulante:

Prolongación solo atendiendo a la historia clínica personal y familiar

Relación con defectos trombofilicos severos:

[Deficiencia anticoagulantes (especialmente AT) y defectos combinados]

Profilaxis en situaciones de riesgo.

No debe modificarse por la presencia de una alteración trombofílica Excepción: terapia sustitutiva en deficientes de antitrombina

¿Mujeres gestantes?

Por qué realizar estudio de trombofilia

Cómo realizar estudio de trombofilia: AT

- SERPINA: IIa, Xa, XIa, XIIa, otros

- Síntesis Hepática (no dependiente de Vit. K).

- Acción biológica potenciada por glicosaminoglicanos

- Primera trombofilia descrita: Egeberg 1965

Cómo realizar estudio de trombofilia: AT

SCREENING (deficiencia si nivel <70%)

- Test funcional amidolítico (actividad anti-IIa ó Xa) con exceso de trombina /FXa en presencia de heparina. Trombina/FXa residual actúan sobre sustrato cromogénico y es inversamente proporcional a la concentración de AT en la muestra

2º TIEMPO

- Determinación antigénica (ELISA...)

- Test funcional en ausencia de heparina e incubación prolongada (actividad progresiva)

3º TIEMPO

-Estudio genético (Gen SERPINC1: cromosoma 1, 7 exones, 13.5 kb)

Tipo Deficiencia Cantidad de AT Actividad biológica Observaciones

I Disminuida Disminuida Tipo más frecuente

IIRS Normal Disminuida Anomalía sitio reactivo

IIHBS Normal Normal (en ausencia

de heparina)

Anomalía en el sitio de unión heparina-AT

IIPE Ligeramente

Disminuidos

Disminuida Disfunción proteica con

baja concentración

< riesgo de TEV

Cómo realizar estudio de trombofilia: AT

Khor B & Van Cott EM. Am J Hematol 2010; 85: 947-50

Cómo realizar estudio de trombofilia: PC

- Síntesis Hepática (dependiente de Vit. K).

- Activada por complejo Trombina-Trombomodulina (+EPCR)

- Inactiva a los factores Va y VIIIa

- Precisa de PS como cofactor

- --T M II a PC EPC R PC EPC R Va_i AP C X a VIII a_i AP C IX a X V

- Deficiencia tipo I: Cuantitativa (



Funcional y antigénica)

- Deficiencia tipo II: Cualitativa (



Funcional )

Cómo realizar estudio de trombofilia: PC

SCREENING

- Test funcional: con plasma deficiente en PC + activador específico de PC

(Protac) + cefalina. La actividad de la PC es proporcional a la prolongación del TTPa o mediante sustrato cromogénico.

- VN: 70-120%

- Mayoría heterocigotos: 30-60%

- Homocigotos o dobles heterocigotos: <25% 2º TIEMPO

- Determinación cuantitativa (ELISA) 3º TIEMPO

-Estudio genético (Gen PROC: cromosoma 2; 9 exones)

Cómo realizar estudio de trombofilia: PS

- Síntesis Hepática (dependiente de Vit. K).

- Cofactor de la PC (favorece su unión a fosfolípidos -)

- Circula en forma libre o unida a C4bBP (60%, no actividad

cofactor-PCa)

 ß

PS unida a C4b-BP

PS

PS libre

PS

C4b-BP

(40%)

_(60%)

Con actividad anticoagulan te Sin actividad anticoagulan te

Cómo realizar estudio de trombofilia: PS

SCREENING

- Test funcional coagulativo con plasma deficiente en PS + PCa + FVa. - Artefacto en caso de Resistencia a la PCa (FV Leiden)

2º TIEMPO

- Determinación cuantitativa (Inmunoturbidimétrico/ELISA) de PStotal y PSlibre 3º TIEMPO

-Estudio genético (Gen PROS1: cromosoma 3; 15 exones + pseudogen PROSP 2)

Bereczky S, et al. Clin Chem Lab Med 2010; 48 (suppl 1): S53-S66

Cómo realizar estudio de trombofilia:

AT, PC y PS

NUNCA EN EL EPISODIO AGUDO

UN MES DESPUES DE RETIRAR EL TRATAMIENTO ANTICOAGULANTE INTERPRETACIÓN ATENDIENDO A OTROS FACTORES

RESULTADO POSITIVO DEBE SER REPETIDO O CONFIRMADO EN FAMILIARES

Cómo realizar estudio de trombofilia: RPCa

Pruebas de laboratorio

Resistencia a la proteína C activada:

Plasma Normal FL, Ca2+ FL, Ca2+ PCA t t_PCA Dahl bäck Cociente = tPCA t

Respuesta anticoagulanteRespuesta anticoagulante

Cómo realizar estudio de trombofilia: RPCa

FV Leiden

1487 1701 Exón 10 5´ 3´ E1 E25 1691 • Gen FV Leiden A Factor V Leiden • Proteína FV Leiden A3 , C1 , C2 2196 1546 COOH A2 A1 1 303 317 656 709 NH₂

FVL FXa y/o Trombina

Arg 306 Arg 679 FVLa ?? PCA Gln 506 Gln 506 Gln 506 FVi

Cómo realizar estudio de trombofilia: RPCa

- Método Original: Variante del TTPa (+PCa)

- Corrección al añadir plasma (FV) normal

- Método Modificado: preincubación con plasma deficiente en FV - Mayor S y E para discriminar la presencia de FVL - No influido por TAO o heparina

- No tan fiable para otras causas adquiridas de RPCa

-3ª generación: Activador de protrombina dependiente de FV (Noscarina) - Mayor S y E para FVL (prácticamente 100%)

- Menor influencia por AL, PC, PS …

Ahorro económico: 5$ vs 60$

Prüller F, et al. N Engl J Med; 2014: 685-6.

Detección de FV Leiden

1 2 3 4

1: Marcador pares de bases 2: GG 3: GA 4: AA

67 pb

Células serie blanca

PCR Factor V Digestión MnlI

Electroforesis en gel Gradiente Ficoll Extracción DNA 267 pb 267 pb Mnl I 200 pb FVL 200 pb 67 pb 163 pb 37 pb 163 pb 37 pb 67 pb FV

Detección de G20210A

Gradiente Ficoll Células serie blanca Extracción DNA

1: Marcador pares de bases 2: GG 3: GA 4: AA 1 2 3 4 345 pb 322 pb 23 pb 322 pb 23 pb 20210G 345 pb Hind III 20210A 20210G 345 pb 345 pb 322 pb 23 pb Digestión Hind III Electroforesis en gel PCR protrombina 345 pb

Cómo realizar estudio de trombofilia:

FV Leiden y Protrombina G20210A

En cualquier

momento

Cómo realizar estudio de trombofilia:

Homocisteinemia

Cómo realizar estudio de trombofilia:

Homocisteinemia

- Determinación en ayunas

- No se precisa sobrecarga de metionina

- No se recomienda analizar el polimorfismo C677T MTHFR

- Suplementos de ac. fólico y vitamina B12 reducen los niveles

de Hcy pero ¿modifican el riesgo vascular?

Cómo realizar estudio de trombofilia:

Homocisteinemia

Di Minno MN, et al. Thromb Haemost 2010; 103: 942-61

Niveles de Factores de coagulación: ¿Sólo FVIII y FIX?

Cómo realizar estudio de trombofilia: Otros

- No clara correlación con riesgo de recurrencia - No determinan duración del tto. anticoagulante - Aumento de riesgo continuo (cut-off arbitrario)

- Influencia de variables pre-analíticas y condiciones clínicas

Nossent AY, et al. Semin Hematol 2007; 44: 77-84.

Chips múltiples SNPs

- Efecto aditivo de varios SNPs en riesgo vascular - Algoritmos matemáticos (gen-gen / gen-ambiente) - Mejoran predicción de riesgo vascular

- Consejo individualizado

Cómo realizar estudio de trombofilia: Otros

Lluis-Canella C, et al. Atherosclerosis 2012; 222: 456-63.

ALGORITMO DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO DE TROMBOFILIA

I. Situación clínica

Primaria Secundaria o mixta

Tromboembolismo venoso : <50 años

Recurrente Familiar Localización inusual

Secundaria a ACO, embarazo, THS

Necrosis cutánea dicumarínicos Trombosis o púrpura neonatal Resistencia a heparina 1) Abortos repetición 2) Trombosis arteriales recidivantes o jóvenes Asociada a factores trombogé-nicos Déficit AT, PC, PS RPCa/FVL PT 20210 SAF Déficit PC Déficit PS Déficit AT Déficit PC Déficit PS Déficit AT SAF ¿otros?

SAF: síndrome antifosfolípido; AL: Anticoagulante lúpico; AA: Anticuerpos antifosfolípido (Anticuerpos anticardiolipina y anti b2-GPI); PS: proteína S; PC: Proteína C; AT: Antitrombina; PT: protrombina; RPCa: resistencia a proteína C activada; ACO: Anticonceptivos orales; THS: Terapia hormonal sustitutiva; LES: Lupus eritematoso sistémico; CIE: Cross-inmunoelectroforesis

Evaluación rutinaria: TTPA, TP, TT

No estudio específico

salvo sospecha

II. Estudios específicos de trombofilia primaria (subrayado primera elección)

AT Funcional (anti-Fxa/IIa) Antígeno/CIE/secuenc. PC Funcional (cromogénico/coagulativo) Antígeno PS

Funcional + Antígeno libre

RPCa Funcional genético PT 20210 Genético SAF AL AA

Sin cumarínicos (al menos 3semanas) ni DOACs Sin heparina

ni DOACs

No realizar en el episodio agudo. Si positivo, confirmar en otra muestra y estudios familiares susceptibles

Estudios familiares ¿sólo defecto homocigoto o combinado?