Universidad de Concepción Dirección de Postgrado
Facultad de Ciencias Forestales - Programa de Doctorado en Ciencias Forestales
Caracterización de genes CBF (c-repeat binding factors) de
Eucalyptus globulus y su validación como genes
candidatos que regulan la resistencia al frío mediante
transformación genética en Arabidopsis thaliana
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Forestales
DARÍO ORLANDO NAVARRETE CAMPOS
CONCEPCIÓN-CHILE
2017
Profesor Guía: Sofía Valenzuela Águila Dpto. de Silvicultura, Facultad de Ciencias Forestales Universidad de Concepción
CARACTERIZACIÓN DE GENES CBF (C-REPEAT BINDING
FACTORS) DE Eucalyptus globulus Y SU VALIDACIÓN COMO
GENES CANDIDATOS QUE REGULAN LA RESISTENCIA AL FRÍO
MEDIANTE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA EN Arabidopsis
thaliana
COMISIÓN EVALUADORA
Sofía Valenzuela Águila (Profesor guía)
Bioquímico, Dr. rer. Nat __________________________
Claudio Balocchi Leonelli
Ingeniero Forestal, Ph. D. __________________________
León Bravo Ramírez
Biólogo, Dr. __________________________
Fernando Droppelmann Felmer
Ingeniero Forestal, Dr. __________________________
Director de Postgrado:
Regis Teixeira Mendonça
Ingeniería Química, Dr. __________________________
Decano Facultad de Ciencias Forestales:
Jorge Cancino Cancino
DEDICATORIA
A mis padres, Eliana y Pedro
A mis hermanos, Vanessa y Pedro Arturo
AGRADECIMIENTOS
Al concluir esta etapa, deseo poder expresar mi sincero agradecimiento a aquellas personas
que contribuyeron de una u otra manera a la elaboración de esta tesis doctoral.
En primer lugar, al proyecto y grupo de trabajo de resistencia al frío en E. globulus
(Genómica Forestal S.A.), quienes por el simple interés de descubrir y conocer, permitieron
un gran trabajo en equipo, siendo responsable y eficientes en las labores encomendadas. A
ustedes Valeria, Paula, Jorge, Javier, Braulio, Rodolfo, Javiera, Felipe y Delia, muchas
gracias.
A mi profesor guía Dra. Sofía Valenzuela, por su apoyo científico y crítico, en el
planteamiento de ideas y experimentos, así también por sus permanentes consejos,
exigencias y tenacidad de hacer de este doctorado una instancia de superación y
conocimiento, por su compresión y confianza muchas gracias.
A los miembros de la comisión evaluadora Dr. Claudio Balocchi, Dr. Fernando
Droppelmann y Dr. León Bravo, por las sugerencias y comentarios en la formulación y
planteamiento de esta investigación, como también por las correcciones a este escrito.
A Bioforest S.A., por facilitar el material vegetal utilizado en los ensayos de aclimatación
al frío.
Al Centro de Biotecnología y laboratorio de Genómica y Biología Molecular, que
facilitaron el espacio físico y equipamiento necesario para desempeñarme como científico,
pudiendo desarrollar esta investigación.
Al Dr. Luis Corcuera por acogerme en el laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad
de Ciencias Naturales y Oceanográficas, permitiendo el acceso a cámaras de cultivo para el
desarrollo de ensayos de aclimatación en plantas, especialmente a los investigadores
Alejandra y Enrique por la ayuda brindada.
A la Dra. Marta Fernández por su paciencia y constancia en el aprendizaje de técnicas
moleculares para el estudio de los genes abordados en esta investigación, como también
Al Dr. Regis Le-Feuvre por su conocimiento, compresión y claridad en el desarrollo de la
técnica de transformación genética en plantas, y también como amigo por los consejos y
entusiasmo retribuido para finalizar con creces esta investigación.
A la Dra. Priscila Moraga por fortalecer mi espíritu científico, en apoyarme a finalizar esta
etapa y por esas tantas ocasiones donde una palabra de aliento, da calma y paz al alma.
También en lo profesional por permitirme trabajar junto a ella y brindarme apoyo
económico cuando más lo necesite.
Quisiera extender mis agradecimientos a mi familia y madrina, que sin ellos nada de esto
hubiera surgido. A mis padres y madrina, por su apoyo incondicional, compresión y
ejemplo de vida, que me motivan a superarme siempre y finalizar etapas. A mis hermanos,
quienes curiosamente preguntaban – ¿En qué consistía mi investigación? – y con mucho
orgullo les comentaba al respecto. A mi hermana Vanessa, por su “apoyo habitacional” de
este último año. A mi hermano menor Pedro, quien me enorgullece por haber seguido una
carrera de ciencia, y que hace ya cuatro años recibo su apoyo día a día.
Y por último y no menos importantes a los amigos, esas personas de gran corazón que sin
tener un grado de consanguinidad, te animan y te dan la fuerza para sobre llevar los
momentos difíciles, en lo académico, como en la personal, siempre atentos a saber de uno y
preocupados por mi bienestar. A ustedes Ángela, Carolina, Claudia, Jaime, Christian, Alex,
Marcelo y Nicolás, muchas gracias.
Quisiera también expresar mis agradecimientos por el apoyo financiero a:
GENÓMICA FORESTAL S.A
TABLA DE CONTENIDO
Página
Dedicatoria iii
Agradecimientos iv
Índicede figuras vii
Índicede tablas xi
Resumen xii
Abstract xiv
Abreviaciones xvi
Capítulo I: Introducción general 1
Capítulo II: Overexpression of three novel CBF transcription factors from Eucalyptus
globulus improves cold tolerance on transgenic Arabidopsis thaliana 39
Capítulo III: Overexpression of an SKn-dehydrin gene from Eucalyptus globulus and
Eucalyptus nitens enhances tolerance to freezing stress in Arabidopsis 75
Discusión general 107
Conclusiones generales 115
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1.1 Regulación cruzada de la señalización al estrés por frío, sequía y salinidad.
Activación de vías de regulación ABA–dependiente y ABA–independiente, en respuesta al
estrés osmótico. Factores de transcripción CBF/DREB1 y DREB2, componentes claves en
la regulación al estrés por frío y deshidratación por vía ABA–independiente (modificado de
Huang y col. 2012). 10
Fig. 2.1 Multiple sequence alignment of CBF proteins in Arabidopsis (AtCBF1), Citrus
sinensis (CsCBF), E. globulus (EgCBF1), E. globulus (EglCBF1a-c-d), E. grandis
(EgrCBF1), E. gunnii (EguCBF1a), Malus domestica (MdCBF1), Prunus persica
(PpCBF1), Populus trichocarpa (PtCBF2) and Vitis vinifera (VvCBF1); the GenBank
accession number is shown in parentheses; black shading indicate identical amino acid
residues; asterisk on the alignment indicate the CBF signature sequences (CBFss); double
underline indicate AP2/ERF domain 48
Fig. 2.2 Phylogenetic tree of CBF proteins generated by the Neighbor-Joining method
using MEGA 6.0, multiple alignment full-length amino acid sequences of EglCBF1a-c-d
and CBFs from: Arabidopsis thaliana (AtCBF1-4 and AtDDF1-2), E. globulus (EgCBF1),
E. grandis (EgrCBF1-16) and E. gunnii (EguCBF1a-b-c-d) were used. AthAP2 is a
member of the AP2 family used for rooting the phylogenetic tree. Each protein has the
GenBank accession number in parenthesis. A line separated each Eucalyptus clade.
Bootstrap values are indicated for each branch and low values (<50) were removed from
the tree 50
Fig. 2.3 Relative expression analysis of three CBF genes in E. globulus plants. a
EglCBF1a. b EglCBF1c. c EglCBF1d, for four treatments of cold acclimation assay NA
(non-acclimated), CABF (cold acclimated before night frosts of −2°C), CAAF (cold
internal controls UBC and α-TUB genes. Calibrator sample corresponds to one ramet of S1
genotype at NA treatment; bars indicate fold change mean n=3; error bars represent SE;
lowercase letters on top of the bars indicate statistically significant differences between
treatments and genotype evaluated with Tukey test (p<0.05) 52
Fig. 2.4 Growth and phenotypic development of transformed and WT plants. a plant
growth at 35, 40 and 60 days after transplant to pots. b rosette diameter of different lines at
60 days. c plant height of different lines at 60 days. d lines with delayed development
growth at 80 days compared to WT plant 60 days old; bars indicate fold change mean,
n=10; error bars represent SE; asterisk on top of the bars indicate significant differences
between each transformed line compared to WT by Tukey test (p<0.05) 53
Fig. 2.5 Freezing tolerance of WT and ten transformed lines that overexpress independently
EglCBF1a, EglCBF1c and EglCBF1d genes, respectively. Control, 5-week-old plants
growing under normal conditions at 23ºC; -6 ºC 5-week-old plants under freezing treatment
and then returned to normal condition for 7 days; SR survival rate calculated as recovered
plants over total plants treated 54
Fig. 2.6 Relative expression levels of three EglCBF1 transgenes and six endogenous genes,
in ten transformed lines and WT plants. a expression of EglCBF1a in two independent
overexpressing EglCBF1a lines. b expression of EglCBF1c in four independent
overexpressing EglCBF1c lines. c expression of EglCBF1d in four independent
overexpressing EglCBF1d lines; bars indicate fold change mean, n=3; error bars represent
SE; lowercase letters on top of the bars indicate significant differences between the
respective transformed lines determined by Tukey test (p<0.05). d expression levels of two
CBF endogenous genes. e expression levels of four COR endogenous genes. The data was
normalized data with the two internal control genes EF1-α and PP2AA3; asterisk on top of
the bars indicate significant differences between each transformed line compared to WT
Fig. 2.7 Relative expression levels of COR15a in three transformed lines and WT plants
under three different temperatures: control 23 ºC, cold 4 ºC and freezing -6 ºC. The data
was normalized with the two internal controls genes EF1-α and PP2AA3; bars indicate fold
change mean, n=3; error bars represent SE; asterisks on top of the bars indicate significant
differences between each transformed line compared to WT in the respective temperature
treatment, determined by Tukey test (p<0.05) 57
Fig. 3.1 Phylogenetic analysis of dehydrin proteins from Eucalyptus species. Phylogenetic
tree was generated using PAUP program. Proteins were arranged according to their
sequence similarities 85
Fig. 3.2 Location of cis-elements associated with the four dehydrins promoter region.
Negative numbers indicate the position of nucleotides relative to the translation start site.
Gray triangle = TCA element, white triangle = Box 4, inverted gray triangle = G-Box
light responsive element, inverted black triangle = GC motif, white circle = heat
stress-responsive element, black circle = regulatory element involved in circadian control, white
square = CRT low temperature response motif, white trapezoid = CGTCA-motif, gray
trapezoid = TGA motif, black trapezoid = CAAT-BOX enhancer region, white rectangle =
ABRE motif involved in abscisic acid responsiveness, hatched rectangles = GARE-motif
gibberellin-responsive element 87
Fig. 3.3 Gene expression of three DHN genes in leaves of a Eucalyptus globulus b frost
resistant Eucalyptus nitens and c frost susceptible Eucalyptus nitens under low temperature
using two internal controls UBC and α-TUB. The asterisks on top of the bars (mean + SE)
indicate statistically significant differences among NA and CAAF treatment (*p ≤ 0.05;
**p≤ 0.01; ***p≤ 0.001) 88
Fig. 3.4 Transcript abundance of three DHN genes measured in leaves of a two Eucalyptus
abundance between an Eucalyptus globulus frost resistant genotype and the frost resistance
family (RF) of Eucalyptus nitens under low temperature using two internal controls UBC
and α-TUB. The asterisks on top of the bars (mean + SE) indicate statistically significant
differences in the CAAF treatment (**p≤ 0.01; ***p≤ 0.001) 89
Fig. 3.5 Transcript abundance of the EuglDHN2 (a) and AtERD10 (b) in seven transgenic
lines of Arabidopsis thaliana, subjected to three different temperatures (23, 4 and -6 ºC). L
represent the transgenic lines and WT is the untransformed Arabidopsis thaliana 91
Fig. 3.6 Transcript abundance of GUS under the putative promoter of 5’EuglDHN2 (a) and
5’EniDHN2, measured at 23, 4 and -6 ºC 92
Fig. S3.1 Multiple sequence alignment of EniDHNs with DHNs homologous proteins.
Identical residues are highlighted in black, residues with conservative substitutions are
shaded in gray and dashes indicate gaps in a sequence. The broken lines indicate the S
segments, solid lines indicate the K segments and dotted lines indicate the Y segments. a
EniDHN1, b EniDHN2, c EniDHN3 and d EniDHN10. The alignment was generated using
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.1 Detalles de elementos de acción cis involucrados en la expresión de respuesta al
estrés de cuatro EuglDHNs en E. globulus (modificado Fernández y col. 2012b) 17
Table S2.1 List of primers used to amplify and clone different E. globulus sequences 73
Table S2.2 Primers designed for qPCR analysis of transformed lines and WT Arabidopsis
plants 74
Table S2.3 Survival percentage, leaf damage percentage and ratio between survival and
leaf damage of three genotypes of E. globulus treated with a -6ºC night frost (F-6) after of
cold acclimation profile treatments 74
Table 3.1 Putative cis-acting regulatory elements involved in stress-responsive expression
in the promoter regions of four EniDHNs in E. nitens 86
Table S3.1 Identity percentage of four dehydrins of E. nitens with homologous dehydrins
RESUMEN
Eucalyptus globulus es la principal especie latifoliada de maderas duras y de rápido
crecimiento utilizada en la industria forestal chilena para la producción de pulpa de
celulosa, por su alto rendimiento y excelente calidad de fibra. Sin embargo, esta especie
presenta una alta sensibilidad a temperaturas de congelamiento, que afectan a su
establecimiento, crecimiento y productividad. Hace tres décadas, varios investigadores han
focalizado sus estudios en explicar los mecanismos que regulan la repuesta al frío y
congelamiento en plantas, utilizando para ello el análisis de expresión génica y
transformación genética.
En este estudio se identificó nuevos genes que codifican a factores de transcripción
C-repeat binding factor (CBF), como principales elementos de señalización en respuesta al
estrés por frío en plantas. Se determinó su expresión génica enfocándose sobre el proceso
de aclimatación al frío en tres diferentes genotipos de E. globulus, contrastantes en su
supervivencia y daño frente a exposición a heladas. También, se validó la función putativa
los genes mediante transformación genética en Arabidopsis thaliana. Adicionalmente, se
evaluó la regulación de regiones promotoras de dos genes deshidirna 2 (DHN2) de dos
especies, con diferencias en su resistencia al frío, E. globulus (Eugl) y E. nitens (Eni),
generando como hipótesis que el promotor putativo EniDHN2 presenta una mayor
inducción del gen bajo estrés por frío, como un rol importante en conferir resistencia al frío
para la especie.
El aislamiento de secuencias homologas a genes CBF permitió identificar y caracterizar tres
nuevos genes en E. globulus. Estos fueron denominados EglCBF1a, EglCBF1c y
EglCBF1d, los cuales codifican para tres diferentes proteínas de 220, 229 y 196 residuos de
aminoácidos, respectivamente. Estos presentan un dominio AP2/ERF de unión a DNA,
como también dos motivos con residuos de aminoácidos PKKP/RAGRxKFxETRHP y
DSAWR que flaquean el dominio, siendo característicos de estos factores de transcripción.
Los análisis de expresión de genes CBF determinan que el gen EglCBF1c se expresa
constitutivamente en plantas no aclimatadas y en plantas aclimatadas expuestas a heladas
EglCBF1d se inducen en respuesta al estrés por frío y congelamiento. La mayor
acumulación de transcritos ocurre en plantas aclimatadas expuestas a heladas nocturnas,
disminuyendo notablemente en el tratamiento de desaclimatación. Además, uno de los
genotipos categorizados como resistentes al estrés por frío, presentó mayores niveles de
transcritos para los tres genes evaluados en plantas aclimatadas, en comparación con el
genotipo sensible al congelamiento. Estos resultados respaldan que los factores de
transcripción CBF tendrían un importante rol en la resistencia al congelamiento en E.
globulus, lo cual ha sido reportado en varias especies de plantas, tanto herbáceas como
leñosas.
La transformación genética en Arabidopsis de los tres diferentes genes EglCBF1, induce la
acumulación de transcritos de genes COR (COR6.6, COR15a y ERD10) de respuesta a frío,
en plantas no aclimatadas. Además, induce la expresión de un gen de señalización por vía
ABA-dependiente (RAB18). La expresión relativa del gen COR15a al disminuir las
temperaturas de 23 ºC a 4 y –6 ºC, fueron mayormente inducidos en plantas transformadas
que en plantas no transformadas. La sobreexpresión de los tres genes EglCBF1 en
Arabidopsis no sólo mejoró la tolerancia al congelamiento en plantas transformadas, sino
que también inhibe el crecimiento y retrasa la floración. Estos resultados evidencian la
función putativa de los genes EglCBF1 como factores de transcripción, mejorando la
resistencia al frío y congelamiento en plantas.
Finalmente, los resultados de expresión del gen marcador (GUS) asociado a los promotores
de los genes deshidrina 2 de E. globulus y E. nitens, determinaron que el promotor del gen
EniDHN2, presento mayor acumulación de transcritos de GUS que el promotor del genes
EuglDHN2, cuando se expone a temperaturas frías, sugiriendo que estas características
ABSTRACT
Eucalyptus globulus is the main hardwood, fast growing specie used in the Chilean forestry
industry for pulp production, due to its high yields and fiber quality. However, this species
presents a high sensitivity to freezing temperatures, which affect its establishment, growth
and productivity. Three decades ago, several researchers have focused their studies on
explaining the mechanisms that regulate the cold response and freezing tolerance in plants,
using gene expression analysis and genetic transformation.
In this study, new genes coding for C-repeat binding transcription factors (CBF) were
identified, as the main elements in response to cold stress in plants. Their gene expression
was determined by focusing on the process of cold acclimation in three different E.
globulus genotypes, contrasting in their survival and damage level against frost exposure.
Additionally, the putative functions of the genes were validated by genetic transformation
in Arabidopsis thaliana. Also, the regulation of the promoter regions of two dehydrin 2
(DHN2) genes of two related species with differences in their resistance to cold, E. globulus
and E. nitens, were evaluated, raising the hypothesis that the putative EniDHN2 promoter
drives a higher gene induction under cold stress, a key role in conferring to cold resistance
for this specie.
The isolation of CBF homologous sequences allowed the identification and characterization
of three new genes in E. globulus. These were named EglCBF1a, EglCBF1c and
EglCBF1d, which encodes for three different proteins of 220, 229 and 196 amino acid
residues, respectively. All sequences present an AP2/ERF DNA binding domain and the
motifs PKKP/RAGRxKFxETRHP and DSAWR franking this domain, which are
characteristic for this transcription factors.
CBF gene expression analyzes identified that the EglCBF1c gene is constitutively
expressed in non-acclimated and acclimated plants exposed to night frosts of –2 °C as
freezing response. On the other hand, the EglCBF1a and EglCBF1d genes are induced by
chilling and freezing temperature stresses. The highest accumulation of transcripts occurs in
acclimatized plants exposed to night frosts, steeply decreasing in the treatment of
showed higher levels of transcripts for the three genes evaluated in cold acclimated plants,
compared to the freeze-sensitive genotype. These results suggest that these CBF
transcription factors could play an important role in the freezing resistance E. globulus
specie, in agreement with reports for several herbaceous and woody plants.
Arabidopsis plants transformed with the three different EglCBF1 genes induces the
accumulation COR gene transcripts (COR6.6, COR15a and ERD10) of cold response in
non-acclimated plants and additionally induces the expression of the ABA-dependent gene
RAB18. The relative expression of the COR15a gene when lowering temperatures from 23
°C to 4 °C and – 6 °C, were more strongly induced in transformed than in non-transformed
plants. The overexpression of the three EglCBF1 genes in Arabidopsis not only improved
their freezing tolerance, but also inhibited growth and delayed flowering. These results
evidence the putative function of EglCBF1 genes as transcription factors that improves cold
and freezing resistance in plants.
Finally, the results associated to marker gene expression (GUS) for the promoters of the
dehydrin 2 genes of E. globulus and E. nitens, determined that the promoter of the
EniDHN2 gene had greater GUS transcript accumulation than the putative promoter of the
EuglDHN2 genes, when exposed to chilling and freezing temperatures, suggesting that
ABREVIACIONES
ABA Ácido abscísico
ABRE (ABA binding responsive element)
Elemento regulador de respuesta a ABA
AP2/ERF (APETALA 2/ Ethylene response factor)
AtCBF1/DREB1B Gen CBF1 identificado en A. thaliana
AtCBF2/DREB1C Gen CBF2 identificado en A. thaliana
AtCBF3/DREB1A Gen CBF3 identificado en A. thaliana
AtCBF4/DREB1D Gen CBF4 identificado en A. thaliana
AtDDF1 Gen Dwarf and delayed flowering 1 identificado en A. thaliana
AtDDF2 Gen Dwarf and delayed flowering 2 identificado en A. thaliana
CBF/DREB1 (C-repeat binding factor / Dehydration response element binding 1)
Factor de transcripción en respuesta a frío y deshidratación
CBF-target Genes regulados vía de señalización factores de transcripción CBF
CBF regulon Genes regulados vía de señalización factores de transcripción CBF
COR (Cold-response gene) Genes de respuesta a frío
CRT/DRE (C-repeat / Dehydration responsive element)
Elemento regulador de respuesta a frío y deshidratación
EglCBF1a Gen CBF1a identificado en E. globulus
EglCBF1c Gen CBF1c identificado en E. globulus
EglCBF1d Gen CBF1d identificado en E. globulus
ERD (Early dehydration-inducible)
Gen inducible por deshidratación temprana
ERF (Ethylene responsive element)
Elemento regulador de respuesta a etileno
FT Factor de transcripción
kDa Kilo Dalton
KIN (Cold-inducible) Gen inducible por frío
LEA (Late embryogenesis abundant proteins)
LTI (Low temperature-induced) Gen inducido por bajas temperaturas
Mha Miles de hectáreas
qPCR PCR cuantitativa o real time PCR
1. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL
1.1. Importancia del genero Eucalyptus
1.1.1. Eucalyptus en el mundo
Eucalyptus L’ Hérit (Myrtaceae) es un género de plantas leñosas de maderas duras
extensamente plantado en el mundo. Sus plantaciones superan las 20 millones de hectáreas
a nivel mundial, siendo Brasil el país que lidera con 21%, le siguen India con 19%, China
con 13%, Australia con 5% y Chile con 3% (Iglesias-Trabado y col. 2009). Originario de
Australia, Tasmania e islas al norte (Nueva Caledonia, Nueva Guinea y archipiélago
indonesio), cuenta con más de 700 especies, dividiéndose en 13 subgéneros, incluyendo
Corymbia y Angophora (Brooker 2000; Ladiges y col. 2003 Poke y col. 2005). Del total de
plantaciones en el mundo, el 80% se encuentra representado por las especies E. grandis, E.
globulus y E. camaldulensis (Potts 2004). A éstas les siguen E. nitens, E. saligna, E.
deglupta, E. urophylla, E. pilularis, Corymhia citriodora y E. tereticornis (Potts 2004). La
principal característica de importancia en estas especies es su rápida tasa de crecimiento
(Turnbull 1999), además de características morfo-anatómicas de sus maderas con fibra
corta, estructuras de fustes rectos y cilíndricos, escasa presencia de nudos, lo que las hace
ideales para algunos procesos industriales. Algunos de los usos de estas especies en la
industria forestal son la producción de maderas aserradas, pasta de celulosa, papelera
(papeles y cartones), materiales de construcción (postes y paneles), calefacción (leña,
carbón vegetal), y aceites esenciales (Jacobs 1981). En el caso de pasta de celulosa, las
especies preferidas son E. grandis, E. urophylla y sus híbridos para regiones tropicales y
subtropicales, y E. globulus para regiones templadas (Potts 2004).
1.1.2. Plantaciones de Eucalyptus en Chile
Chile se ubica en el quinto lugar de plantaciones de Eucalyptus en el mundo con 841 miles
de ha (Mha) (Iglesias-Trabado y col. 2009; INFOR 2016). Las principales especies del
genero Eucalyptus cultivadas en el país son E. globulus y E. nitens, con 574 Mha y 255
Mha, respectivamente (INFOR 2016). E. globulus es la segunda especie forestal más
pulpa de celulosa, debido a su rápido crecimiento, alto rendimiento de celulosa y excelente
calidad de fibra (Kibblewhite y col. 2000; Ramírez y col. 2009; Costa e Silva y col. 2009).
Durante el año 2015, el incremento de 3,8% en la producción de pulpa blanqueada de
eucalipto, vino a atenuar la pérdida en la producción de pulpa de celulosa de –1,8%,
producto de la caída de 7,7% en la pulpa blanqueada de Pinus radiata, llegando a 5,12
millones de toneladas (INFOR 2016). En ese mismo año las exportaciones forestales
cayeron un 10,8%, llegando a los US$ 5.439,1 millones, aun cuando productos como la
pulpa blanqueada de eucalipto registraron un moderado incremento (INFOR 2016).
1.1.3. Eucalyptus globulus
E. globulus Labill es la principal especie plantada en climas templados libres de heladas
severas, debido a su excepcional calidad de madera, combinada con su rápido crecimiento
(Teulières y Marque 2007). Sus plantaciones en Chile se concentran en la zona centro-sur
del país, entre las regiones del Biobío y Araucanía, aunque existen plantaciones desde
Copiapó, zona norte en la región de Atacama, hasta la isla grande de Chiloé, zona sur en la
región de los Lagos (INFOR 2011). En la zona centro-sur, el clima predominante es
templado cálido con una estación seca de 4 a 5 meses y templado lluvioso con influencia
mediterránea, climas idóneos para las plantaciones de E. globulus. En la última década se
ha registrado un incremento en las plantaciones de E. globulus siguiendo un aumento
anualmente por la alta demanda de papel en el mundo (Costa e Silva y col. 2009; INFOR
2016). Dicha tendencia resulta en la necesidad de optar por sitios con condiciones
climáticas no óptimas para la especie, sitios donde episodios de heladas (temperatura < 0
ºC) se presentan con cierta frecuencia y limitan la expansión de estas plantaciones. Tales
condiciones afectan principalmente al establecimiento de plantas juveniles, ya que son
menos resistentes a condiciones ambientales extremas que plantas adultas (Close y col.
2004), también reducen la fotosíntesis, y por ende la productividad de plantas adultas
(Davidson y col. 2004). Las temperaturas mínimas toleradas por E. globulus han sido
registradas en variados estudios, Almeida y col. (1994) informaron que plantas de siete
meses de edad no endurecidas al frío, presentaban temperaturas letales al 50% de daño en
sus tejido (TL50) entre – 5,3 a – 5,6 ºC. Por otra parte, Volker y col. (1994) determinaron
bajo el criterio de TL50 estaría alrededor de los – 6 ºC. En este ámbito, Kellison (1999)
clasifica varias especies de Eucalyptus según su resistencia al frío, indicando que E.
globulus soporta heladas de poca intensidad. Sin embargo, existen reportes que indican que
mediante métodos de endurecimiento en vivero pueden inducir una resistencia al
congelamiento en plantas, registrando índices de TL50 de – 8,5, – 8 y – 9 ºC para tres
subespecies de E. globulus, subespecie globulus, bicostata y maidenii, respectivamente
(Moraga y col. 2006). En ensayos de laboratorio, con plantas de 6 meses de edad de dos
genotipos operacionales crecidos en cámaras de cultivo en condiciones normales, se ha
determinado índices de TL50 entre – 4,2 y – 4,9 ºC (datos no publicados). Tibbits y col.
(2006) estudiaron la variación genética en la resistencia al congelamiento durante invierno
de E. globulus, determinando que los patrones de resistencia al congelamiento de diferentes
procedencias, no fueron claros y presentaron poca consistencia, llegando a obtener índices
de TL50 de hasta – 8,8 ºC en algunas procedencias. Todo esto sugiere que la resistencia al
congelamiento en E. globulus es una característica variable dentro de la especie, y entre
familias, indicándose también que está bajo un fuerte control genético aditivo (Volker y
col. 1994; Tibbits y col. 2006).
1.2. Estrés y resistencia al frío en plantas
Las plantas en su área de distribución natural necesitan de un gradiente en temperaturas
óptimas para un adecuado crecimiento y desarrollo. El frío (o bien las bajas temperaturas)
es clasificado en temperaturas de enfriamiento, inferiores a los 15 ºC, y en temperaturas de
congelamiento, inferiores a los 0 ºC (Chinnusamy y col. 2007; 2010), condiciones que
limitan la distribución geográfica, crecimiento y desarrollo de las plantas, afectando
directamente la calidad y rendimiento de los cultivos. Las temperaturas de enfriamiento,
generan daño en plantas, exhibiendo síntomas tales como la disminución de la expansión
foliar, marchitamiento, clorosis e inclusive necrosis en sus tejidos (Wang 1990). Por otra
parte, las temperaturas de congelamiento provocan la muerte de los tejidos, dañando las
membranas celulares, lo que causa la pérdida de electrolitos en el apoplasto y el desbalance
1.2.1. Efecto de las temperaturas congelantes
En la mayoría de las plantas, al disminuir las temperaturas bajo los 0 ºC, presentan los
primeros indicios de daños por congelación, sobre el sistema de membranas lipídicas a
nivel celular (Steponkus 1984). Las membranas lipídicas son estructuras fluidas que
mantienen la organización y función celular, el daño sobre éstas provoca la salida de
electrolitos y la pérdida en la capacidad de transporte de la célula (Saxe y col. 2001). Estas
se ven conformadas principalmente por dos clases de ácidos grasos, saturados e
insaturados. Diferencias estructurales entre estos, como la presencia de enlaces dobles entre
átomos de carbono para los insaturados, permiten un mayor grado de fluidez de las
membranas a bajas temperaturas (Steponkus y col. 1993). Existe una transición entre ácidos
grasos saturados e insaturados, esta función es realizada por las enzimas denominadas ácido
graso desaturasas. Estas enzimas remueven dos átomos de hidrogeno desde la cadena de
carbonos en el ácido graso, generando enlaces dobles carbono/carbono. Si la célula no tiene
la capacidad de realizar la transición de ácidos grasos en sus membranas, estas se verán
afectadas por una pérdida en su fluidez al descender las temperaturas.
Por otro parte, el daño por congelación induce una deshidratación celular con la formación
de cristales de hielo, generalmente iniciada en el apoplasto, debido a que el fluido
extracelular tiene un mayor punto de congelación por presentar menor concentración de
solutos que el fluido intracelular. Esto provoca la caída del potencial químico fuera de la
célula, generando un movimiento de agua no congelada por gradiente, desde el interior de
la célula al espacio extracelular o apoplasto (Thomashow 1999; Kaminska-Rozek y
Pukacki 2005), lo cual contribuye al crecimiento de cristales de hielo existentes en el
apoplasto. La formación y crecimiento de estos cristales de hielo genera una tensión
mecánica entre la pared celular y la membrana citoplasmática, generando finalmente la
ruptura celular (Olien y Smith 1977; Mahajan y Tuteja 2005). Se han reportado proteínas
anticongelantes (AFPs antifreeze proteins) que se asocian a la superficie del cristal de hielo,
inhibiendo su crecimiento y re-cristalización (Griffith y Yaish 2004; Deswal y Sharma
2014), y de esta manera previniendo su expansión y la ruptura de estructuras celulares.
Normalmente, un cristal de hielo crece como un disco redondo, sin embargo, en presencia
crecimiento de cristales de hielo ha sido observado en extractos apoplásticos de
Deschampsia antarctica aclimatadas y no aclimatadas al frío (Bravo y Griffth 2005).
También la deshidratación celular inducida por congelación da lugar a múltiples formas de
daño a la membrana celular, incluyendo lisis celular inducida por expansión y transición de
fase lamelar a hexagonal-II (Sakai y Larcher 1987; Uemura y Steponkus 1997). Otros
elementos que pueden contribuir al daño inducido por heladas son las especies reactivas de
oxigeno (ROS), con la consecuente pérdida en la actividad metabólica,
compartimentalización celular, reducción de la fotosíntesis y desnaturalización de proteínas
(Kaminska-Rozek y Pukacki 2005).
1.2.2. Aclimatación al frío y mecanismos de resistencia a estrés
Las plantas de clima templado que experimentan frío prolongado durante el invierno, se
han adaptado a temperaturas frías y de congelamiento, alternando entre procesos de activo
crecimiento y dormacia vegetativa, de acuerdo a los cambios climáticos estacionales a los
cuales se ven expuestas. La mayoría de estas plantas, son capaces de aumentar su
resistencia al frío, mediante el proceso de aclimatación al frío. Esto ocurre cuando las
plantas se exponen a temperaturas frías no congelantes (Levitt 1980; Thomashow 1999), lo
que induce diversos cambios fisiológicos y/o bioquímicos en respuesta a bajas
temperaturas, adquiriendo una mayor resistencia a este tipo de estrés (Beck y col. 2007). En
este proceso de aclimatación pueden estar relacionados otros factores ambientales, tales
como la longitud del día y/o la disponibilidad hídrica que afecta a las plantas, para generar
una mayor tasa de endurecimiento a heladas (Beck y col. 2004; 2007). Aunque se ha
sugerido que la condición de días cortos y bajas temperaturas puede promover la
aclimatación al frío a través de vías independientes (Welling y col. 2002), solo la
estimulación combinada de días cortos y bajas temperaturas, proporciona un alto grado de
aclimatación al frío, tanto en plantas herbáceas como en leñosas (Christersson 1978; Li y
col. 2003; Puhakainen y col. 2004).
Diversos estudios han demostrado la capacidad de desarrollar mecanismos de respuesta a
cambios ambientales. En álamo y abedul, la disminución en la longitud del día al final de la
temporada de crecimiento sirve como primera señal ambiental del inicio de la dormancia
otra parte, en un genotipo de E. globulus (CN5) crecido a temperaturas de 10/5 ºC
día/noche, se ha observado un aumento de azúcares solubles y lípidos totales en hojas,
como efecto del proceso de aclimatación a bajas temperaturas, pudiendo esto conferir a este
genotipo mejor rendimiento bajo temperaturas de enfriamiento (Shvaleva y col. 2008). En
tabaco, las bajas temperaturas (15 ºC) activan la biosíntesis de ácido graso trienoico en
hojas, en comparación con plantas crecidas a 25 ºC, sugiriendo que la producción de ácido
trienoico durante la aclimatación por enfriamiento es uno de los requisitos previos para el
desarrollo de la resistencia al frío en esta especie (Kodama y col. 1995). Estudios a nivel
celular en Arabidopsis aclimatadas a bajas temperaturas (5°C), reportan una disminución en
el contenido de agua celular, seguido de incremento de proteínas en el volumen y densidad
citoplasmática, además de una disminución en la contribución de la vacuola al volumen
total de la célula (Strand y col. 1999). De esta manera, la capacidad de desarrollar estos
mecanismos de respuesta y adaptación a cambios ambientales, dependerá de la habilidad de
las plantas en aclimatarse a frío (Xin y Browse 2000).
Por lo tanto, una importante función en el proceso de aclimatación al frío en plantas es la
estabilización de membranas y componentes celulares. Optimizar la transición de ácidos
grasos saturados a insaturados en la membrana lipídica, mejoraría la fluidez de esta. A su
vez la acumulación de moléculas crio-protectoras tales como azúcares solubles (sacarosa,
rafinosa, trehalosa), componentes nitrogenados de bajo peso molecular (prolina, glicina
betaina) y polipéptidos de la familia de proteínas LEA (late embryogenesis abundant),
influirían en mantener una mayor estabilización de proteínas y fosfolípidos de membranas,
proteínas citoplasmáticas, como también mantener interacciones hidrofílicas y la
homeostasis celular (Janská y col. 2010). Adicionalmente, la acumulación de antioxidantes
enzimáticos y no enzimáticos protegen a la célula del daño oxidativo (Shao y col. 2008).
Todas estas respuestas fisiológicas y bioquímicas en las plantas son mecanismos altamente
regulados por la expresión génica. Por lo tanto, la habilidad de las plantas de aclimatarse al
frío es un rasgo cuantitativo que involucra la acción de muchos genes con pequeños efectos
aditivos (Thomashow 1990).
Las respuestas de aclimatación a bajas temperaturas gatillan diversos procesos que
mecanismo por el cual las plantas generan tal resistencia, que está dada por mecanismos de
evasión y tolerancia. Los mecanismos evasivos tienen por función evitar el frío o
congelamiento en los tejidos, como por ejemplo: dormancia de brotes y semillas,
sensibilidad al fotoperíodo, vernalización y sobre-enfriamiento (Janská y col. 2010).
Particularmente, la respuesta de sobre-enfriamiento evitan la formación de cristales de hielo
en los tejidos, disminuyendo la temperatura de nucleación del hielo (Wisniewski y Fuller
1999), lo que constituye una respuesta evasiva al congelamiento. Esto ha sido reportado en
plantas de Colobanthus quitensis aclimatadas al frío, con índices de TL50 superiores (–5,8
ºC) a las del punto de nucleación de hielo (–9,4 ºC), determinando que la especie no tolera
la congelación, y que su principal mecanismo para sobrevivir a bajas temperaturas es
sobre-enfriando (Bravo y col. 2001). Por otra parte, los mecanismos de tolerancia tienen relación
con soportar temperaturas congelantes y los efectos que estas condiciones generan, como la
formación de hielo y la consecuente deshidratación celular, sin sufrir daños irreversibles en
sus tejidos (Larcher 2003). Esto ha sido evidenciado en plantas de D. antarctica
aclimatadas al frío, al registrar temperatura de nucleación de hielo de –10,4 ºC, con índices
de TL50 de hasta –26,6 °C. Esto determina que D. antarctica es capaz de tolerar la
congelación más allá de los índices de TL50 registrados por Bravo y col. (2001). Se
considera que el dilucidar qué elementos se activan en el proceso de aclimatación al frío,
proporcionara estrategias potenciales para mejorar la resistencia al congelamiento en
plantas.
1.2.3. Estrés por frío y vías de señalización cruzada con otros estrés
Una característica notable en las plantas es su grado de adaptabilidad a condiciones
ambientales adversas, con múltiples respuestas involucrando complejas redes
interconectadas. Estas redes son activadas por diversos estímulos, ya sea fotoperiodo, frío,
salinidad, sequía, etc., y donde las plantas pueden aumentar su grado de resistencia al estrés
ambiental mediante adaptaciones físicas, interacciones moleculares y cambios celulares que
comienzan después de la aparición del estrés (Knight y Knight 2001). Sin embargo, para
simplificar la respuesta de las plantas a este estrés ambiental, es que típicamente se han
estudiado en condiciones controladas de crecimiento. En el ambiente, la exposición
una respuesta integral de las plantas a tales condiciones, aunque su interpretación muchas
veces pudiese ser compleja. De hecho, varias vías de señalización poseen elementos en
común que actúan como nodos de regulación cruzada a varios tipos de estrés (Chinnusamy
y col. 2004). Consecuentemente a lo anterior, recientemente se ha reportado que la
respuesta de las plantas a combinaciones de dos o más condiciones de estrés es única, y no
puede extrapolarse directamente desde la respuesta de las plantas a cada uno de los
diferentes estrés aplicados por separado (Suzuki y col. 2014).
Diversas condiciones abióticas producen efectos tanto generales como específicos sobre el
crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ejemplo, la sequía limita el crecimiento de las
plantas debido al declive fotosintético, las restricciones osmóticas impuestas por el estrés y
la interferencia con la disponibilidad de nutrientes a medida que el suelo se seca (Chaves y
col. 2003). La salinidad interfiere con el crecimiento de las plantas, ya que conduce a la
sequía fisiológica y toxicidad iónica (Zhu 2002). El frío también puede causar estrés
osmótico, además de su efecto directo sobre el metabolismo (Thomashow 1999). De esta
manera, el estrés por frío, estrés hídrico y estrés salino, pueden causar el mismo efecto
sobre los tejidos, y en particular sobre las células, como es la disminución del potencial
osmótico y la activación de la respuesta al estrés, operando mediante dos vías de
señalización, ácido abscísico (ABA) – dependiente y ABA – independiente (Fig. 1.1)
(Huang y col. 2012).
La biosíntesis de ABA se produce bajo condiciones de déficit hídrico en plantas,
incrementando significativamente sus niveles endógenos en condiciones de sequía y alta
salinidad, revelando un rol importante en la respuesta de las plantas a estos tipos de estrés
(Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki 1997), pero no en respuesta al estrés por frío
(Shinozaki y col. 2003). La expresión génica regulada por ABA se relaciona a factores de
transcripción tipo AREB, MYB y MYC (Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki 2000). Los
factores de transcripción AREB (ABA responsive element binding) de la familia de factores
bZIP (basic leucine zipper), presentan unión a elementos en cis ABRE (ABA responsive
elements). Diversos estudios han demostrado que factores de transcripción AREB requieren
de una señal mediada por ABA, reportando una reducción en la actividad de proteínas
como también una mayor actividad de estas proteínas en mutantes era1 (hipersensibles a
ABA) (Choi y col. 2000; Uno y col. 2000). Otros reguladores transcripcionales importantes
son las proteínas MYB y MYC, siendo activadores en la vía regulada por ABA, que son
inducibles también por sequía y alta salinidad, y su sobreexpresión no sólo da lugar a un
fenotipo hipersensible a ABA, sino también mejora la tolerancia al estrés osmótico en
plantas de Arabidopsis (Abe y col. 2003).
Por otra parte, los estudios sobre la regulación del estrés por frío en Arabidopsis han dado
como resultado el descubrimiento de una familia de factores de transcripción conocidos
como CBF(C-repeat binding factor) o DREB (dehydration reponsive element binding) que
controlan la expresión de genes en respuesta al estrés por frío mediante la vía ABA–
independiente (Thomashow 2001; Huang y col. 2012). Existen genes CBF/DREB1A y
DREB2A que se unen específicamente a elementos en cis CRT/DRE (C-repeat/
dehydration reponsive element), desempeñando la función de activadores transcripcionales
en plantas (Tomashow 2001). Se ha determinado que la expresión del gen CBF3/DREB1A
y sus dos homólogos (CBF1/DREB1B y CBF2/DREB1C), es inducida por estrés a baja
temperatura, mientras que la expresión de los dos genes DREB2 (DREB2A y DREB2B) se
induce por deshidratación (Gilmour y col. 1998; Liu y col. 1998). Estos resultados sugieren
que las proteínas CBF/DREB1 están involucradas en la expresión de genes específicos en
respuesta a frío, mientras que las proteínas DREB2 se expresan en respuesta específica a
deshidratación. Sin embargo, otros genes que son inducibles por sequía y frío, también son
inducidos mediante tratamiento de ABA exógeno, por ejemplo: los genes RD29A y RD29B,
que en sus regiones promotoras contienen elementos cis CRT/DRE y ABRE, lo que da
lugar a la regulación por ambas vías de señalización ABA–dependiente y ABA–
independiente (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki 1993; 1994; Msanne y col. 2011; Jia y
col. 2012). También los genes COR (cold-regulated): COR6.6, COR15a y COR47 son
inducidos por frío, deshidratación y ABA (Thomashow 1999; Mahajan y Tuteja 2005). Por
otra parte, se ha identificado sitios de reconocimiento a factores MYB y MYC en la región
promotora del gen RD22, que funcionan como elementos en cis en la expresión génica
inducida por sequía y ABA (Abe y col. 1997). Todo esto indica la complejidad de la
complejos sistemas reguladores de expresión génica, como por diferentes sistemas de
transducción de señales, y/o por regulación cruzada entre estos sistemas.
Fig. 1.1 Regulación cruzada de la señalización al estrés por frío, sequía y salinidad.
Activación de vías de regulación ABA–dependiente y ABA–independiente, en respuesta al
estrés osmótico. Factores de transcripción CBF/DREB1 y DREB2, componentes claves en
la regulación al estrés por frío y deshidratación por vía ABA–independiente (modificado de
Huang y col. 2012).
1.2.4. Genes en respuesta al estrés por frío
En general, los genes de respuesta al estrés pueden clasificarse principalmente en dos
factores de transcripción (FT), también denominados elementos en trans, que desempeñan
un rol esencial en la respuesta al estrés abiótico, regulando la abundancia de transcritos
(ARNm) de un amplio espectro de genes diana. Estas proteínas interactúan con los
elementos en cis presentes en las regiones promotoras de los genes que regulan, activando o
reprimiendo su transcripción. Hasta el momento, varias familias de FT y sus elementos
interactivos de acción en cis, denominados colectivamente como “regulones”, han sido bien
caracterizados como actores claves implicados en las respuestas al estrés abiótico. Dentro
de los genes funcionales, hoy en día varios son los genes reportados que pueden contribuir
con la resistencia al frío en plantas. Algunos ejemplos se mencionan a continuación: FAD8
(fatty acid desaturase 8) de A. thaliana codifica un ácido graso desaturasa que facilita una
mejor transición de ácidos grasos saturados a insaturados en los lípidos de membranas,
manteniendo el grado de fluidez de estas a medida que descienden las temperaturas (Gibson
y col. 1994). Por otro parte, la inducción de algunos genes HSP (heat shock proteins)
durante la aclimatación al frío, en Spinacia oleracea HSP70 y en Brassica napus HSP90,
codifican moléculas chaperonas que pueden estabilizar proteínas contra la
desnaturalización provocada por el congelamiento (Anderson y col. 1994; Krishna y col.
1995). Estos y otros genes regulados en respuesta al frío son denominados genes COR
(cold-regulated). Si bien los genes COR, algunos denominados como LTI (low
temperature-induced), KIN (cold-inducible), RD (responsive to desiccation) y ERD (early
dehydration-inducible), se inducen principalmente en respuesta a frío y deshidratación,
también pueden ser inducidos por alta salinidad e incluso por acción de fitohormonas como
ABA. En Arabidopsis se ha reportado que los genes COR6.6, COR15a, COR47 y
COR78/RD29A, codifican para polipéptidos hidrofílicos (Thomashow 1999). El gen
COR6.6, codifica un polipéptido de 6,6 kDa rico en alanina (Gilmour y col. 1992; Kurkela
y Borg-Franck 1992), el cual también se denomina KIN2, por presentar alta similitud en su
secuencia a la proteína KIN1, esta última similar a proteínas anticongelantes de peces
(Kurkela y Franck 1990). El gen COR15a, codifica un polipéptido de 15 kDa con región
N-terminal similar a proteínas LEA. Se ha reportado que la proteína COR15A presenta una
señal de dirección al compartimento del estroma en los cloroplastos, donde es procesada a
una proteína de 9,4 kDA (Lin y Thomashow 1992; Zhou y col. 2009). Al ser modificada,
mecanismo de tolerancia a la deshidratación provocado por el congelamiento (Steponkus y
col. 1998). Estudios de transformación genética en A. thaliana con la expresión constitutiva
de la proteína COR15a, indican un incremento de la tolerancia al congelamiento de
cloroplastos y protoplastos congelados en 1 a 2 ºC sobre el rango de temperaturas –5 a –8
ºC (Artus y col. 1996; Thomashow 1999). El gen COR47 codifica un polipéptido de 30
kDa, identificado como una proteína LEA del grupo II (Gilmour y col. 1992; Welin y col.
1995), pertenece a la familia de proteínas deshidrinas. Como función se ha determinado su
capacidad crioprotectora in vitro, sobre membranas de tilacoides aisladas de espinacas
durante ciclos de congelación-descongelación (Bozovic y col. 2013). Por último, el gen
COR78, también denominado RD29A, codifica un polipéptido de 78 kDa, siendo inducido
en respuesta al estrés por frío y desecación. Los primeros estudios describen esta proteína
con estructura semejante a proteínas LEA, suponiendo una función de protección celular
frente a la desecación (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki 1993). Sin embargo, aún no es
clara su función fisiológica durante el estrés abiótico, pues actualmente algunos autores
cuestionan que esta proteína sirva directamente como molécula protectora (Msanne y col.
2011).
Sobre la cascada de señales de los genes COR, existen genes reguladores que codifican a
factores de transcripción CBF, también inducidos por frío u otras condiciones asociadas al
déficit hídrico. Esta ruta de señalización mediada por factores CBF, es la vía de regulación
al frío más importante y altamente estudiada, que imparte resistencia al congelamiento en
las plantas (Gilmour y col. 1998; Thomashow 2001; Maibam y col. 2013).
1.2.5. Factores de transcripción CBF y la resistencia al frío en plantas
Los genes CBF (Stockinger y col. 1997) o también denominados DREB (Liu y col. 1998),
codifican factores de transcripción (FT) de la familia AP2/ERF (APETALA 2/Ethylene
Response Factor), clasificados dentro del grupo A1 de la subfamilia DREB, único en
plantas (Sakuma et al., 2002). Esta familia de FT CBF (grupo DREB-A1) se caracteriza por
presentar un dominio AP2 de unión a ADN, altamente conservado de 60 aminoácidos,
junto a dos motivos localizados inmediatamente río arriba y ría abajo del dominio AP2, con
residuos de aminoácidos de PKKP/RAGRxKFxETRHP (abreviado PKKPAGR) y
estos motivos característicos de proteínas CBF son necesarios para la correcta función y
actividad de los estos FT. El dominio AP2 tiene como función unirse al ADN en sitios con
elementos activadores en cis dentro de las regiones promotoras de genes funcionales,
activando su transcripción río abajo. Este dominio reconoce sitios en el ADN con
repeticiones de nucleótidos C como elementos en cis CCGAC (Baker y col. 1994). Estos
elementos en cis han sido identificados como elementos en respuesta a deshidratación,
llamados CRT/DRE (Stockinger y col. 1997). Específicamente los elementos CRT/DRE
son secuencias ricas en repeticiones de citosina de 6 pb (A/GCCGAC), que contienen la
secuencia core de 5 pb CCGAC, y se encuentran en regiones promotoras de los genes COR
(Baker y col. 1994; Sakuma y col. 2002; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki 2005), los
cuales como se indicó anteriormente, son genes que se inducen como respuesta al estrés por
frío y deshidratación (Stockinger y col. 1997). La relación de estos FT CBF/DREB1 en
respuesta a bajas temperaturas se ha demostrado en varias especies. En Arabidopsis, se han
caracterizado cuatro FT CBF/DREB1: AtCBF1/DREB1B, AtCBF2/DREB1C,
AtCBF3/DREB1AyAtCBF4/DREB1D (Stockinger y col. 1997; Liu y col. 1998; Haake y
col. 2002), los cuales en su secuencia nucleotídica no poseen intrones (Medina y col. 1999;
Haake y col. 2002). A nivel de proteínas, las secuencias CBF1-2-3 presentan una alta
similitud entre sus secuencias, mayor a un 85%, y con un peso molecular cercano a 24 kDa
(Medina y col. 2011). Se ha reportado que la acumulación de transcritos de estos genes
AtCBF1-2-3 ocurre entre los primeros 15 a 30 minutos de haber expuesto las plantas a 2,5
ºC, con la subsecuente inducción de genes COR (COR15a y COR78), ocurriendo después
de 2 a 4 h (Gilmour y col. 1998).
En la actualidad se han descrito FT CBF en plantas leñosas, como por ejemplo: Populus
spp. (Benedict y col. 2006), Prunus avium (Kitashiba y col. 2002), Malus x domestica
(Wisniewski y col. 2011), Citrus spp. (Champ y col. 2007), E. grandis (Cao y col. 2015), E.
globulus (Gamboa y col. 2007), E. gunnii (El Kayal y col. 2006; Navarro y col. 2009), entre
otras especies. Recientemente el genoma de E. grandis ha sido secuenciado (Myburg y col.
2014), con lo cual se han podido determinar un mayor número de genes con homología a
FT tipos CBF, encontrando 17 genes tipo CBF en E. grandis (Cao y col. 2015). En el caso
particular de E. globulus se ha descrito un solo FT CBF (EglCBF1), en el cual se induce su
una alta salinidad (Gamboa y col. 2007). Esta expresión se induce tempranamente al
exponer plantas juveniles de E. globulus a temperaturas de 4 ºC. Por otra parte, en E. gunnii
se han descrito cuatro FT CBF: EguCBF1A, EguCBF1B, EguCBF1C y EguCBF1D (El
Kayal y col. 2006; Navarro y col. 2009), reportándose que la proteína EglCBF1 descrita
para E. globulus presenta mayor similitud con la proteína EguCBF1B descrita para E.
gunnii (Navarro y col. 2009). Adicionalmente estos investigadores proponen una función
putativa para cada gen descrito, en relación al estrés por frío y congelamiento. Así, el gen
EguCBF1A de inducción rápida y de corta duración, es relacionado en respuesta a un golpe
de frío extremo. En cambio, el gen EguCBF1B con una inducción más duradera, se
relaciona con una respuesta de aclimatación al frío, pudiendo participar en la protección
basal durante los meses fríos y en respuesta a heladas progresivas. Por otra parte, el gen
EguCBF1C presenta una inducción más bien constitutiva y poco específica, vinculándolo
en la protección permanente a la célula y no en una respuesta al estrés ambiental.
Finalmente, el gen EguCBF1D presenta una mayor inducción en respuesta a heladas,
pudiendo ayudar a la célula a tolerar episodios de heladas, con o sin aclimatación previa al
frío y asociado a cambios diurnos de temperatura. Con el conocimiento proporcionado,
sería de gran utilidad poder identificar genes homólogos en E. globulus, ya que es una
especie filogenéticamente cercana a E. gunnii (Steane y col. 2011), y por ello se esperaría
encontrar genes altamente conservados con funciones similares para otorgar resistencia a
este tipo de estrés.
1.2.6. Deshidrinas, proteínas de respuesta al frío en plantas
Como ya se ha informado, diferentes tipos de estrés abiótico, como estrés por frío, hídrico y
salino, convergen en un estrés osmótico sobre los tejidos de las plantas, produciendo
deshidratación celular. Se ha observado que durante el proceso de aclimatación al frío se
inducen una serie de elementos protectores, dentro de los cuales las proteínas deshidrinas
(DHN) presentan un papel fundamental en respuesta a bajas temperaturas (Close 1996;
Strimbeck y col. 2015). Las DHN son proteínas hidrofílicas pertenecientes al grupo II de
proteínas abundantes de embriogénesis tardía (LEA), las cuales se acumulan en respuesta a
deshidratación celular, impuesta por condiciones de estrés abiótico y donde varios autores
Hanin y col. 2011; Graether y Boddington 2014). Dentro de sus funciones, sepropone que
actúan como emulsionantes o chaperonas, protegiendo estructuras celulares, ya sea
proteínas o membranas plasmáticas, frente a los cambios estructurales desfavorables
causados por la deshidratación (Kosová y col. 2007). Estas proteínas fueron identificadas
en 1990s, siendo clasificadas según sus características estructurales, con la presencia de
secuencias altamente conservadas denominadas segmentos K, Y y S (Close 1996). Por
definición, una proteína deshidrina debe contener al menos un segmento K, pudiendo
presentar de 1 – 11 copias cerca del extremo C-terminal (Close 1996; Battaglia y col.
2008). El segmento–K, es una secuencia de 15 aminoácidos ricos en lisinas
[EKKGIME/DKIKEKLPG] que puede formar una α-hélice anfipática responsable de la
interacción con componentes lipídicos de membranas e interacciones hidrofóbicas de
proteínas chaperonas con proteínas parcialmente desnaturalizadas (Close 1996). El
segmento–S, es una secuencia conservada que se encuentra en el centro de la proteína,
formado por un tramo de 4 – 10 residuos de serina contiguos [LHRSGS4-10(E/D)3], el cual
puede ser fosforilado, y esta fosforilación estaría implicada en la unión de un péptido señal
de localización nuclear (Campbell y Close 1997; Hanin y col. 2011). El segmento–Y, rico
en residuos de tirosina presenta una región conservada [T/VDE/QYGNP] cerca del extremo
N-terminal. También, existen otras regiones menos conservadas denominadas segmentos
Φ, las cuales son altamente variables entre diferentes DHNs y habitualmente ricos en
aminoácidos polares (Rorat 2006). De acuerdo con la presencia y número de
combinaciones de los diferentes segmentos K, Y y S, las DHNs se pueden dividir en cinco
subgrupos estructurales: Kn, SKn, KnS, YnKn y YnSKn (Close 1996; Battaglia y col. 2008).
Con la finalidad de identificar la función de estas proteínas, varios estudios in vitro han
demostrado que las deshidrinas de diferentes especies (COR85 de espinaca, DHN1 de maíz,
WSC120 de trigo, PCA60 de durazno y CuCOR19 de Citrus unshiu) pueden proteger a
enzimas lábiles al frío como lactato deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27), de la
desactivación por ciclos de congelación-descongelación (Kazuoka y Oeda 1994; Houde y
col. 1995; Close 1996; Wisniewski y col. 1999; Hara y col. 2001). Por otra parte, Bozovic y
col. (2013) han demostrado in vitro la capacidad crioprotectora de algunas proteínas
deshidrinas de Arabidopsis (COR47, ERD14 y LT29), sobre membranas de tilacoides
(1999) han indicado que una fracción purificada de deshidrinas de abedul fue capaz de
mejorar la actividad de α-amilasa (EC 3.2.1.1) respecto a la fracción donde las deshidrinas
fueron eliminadas por inmunoprecipitación. Si bien, el rol in vivo de las proteínas DHNs se
desconoce, esta evidencia experimental in vitro, permite inferir una función de protección
en respuesta al estrés por deshidratación impuesto por la sequía, congelamiento y alta
salinidad, y donde los mecanismos de acción estarían relacionados con la protección de
membrana, crioprotección de enzimas y protección contra estrés oxidativo (Graether y
Boddington 2014). Se conoce que, durante el proceso de aclimatación a bajas temperaturas,
se induce la expresión y acumulación de deshidrinas en muchas especies de plantas
herbáceas, como trigo y cebada (Guo y col. 1992; Fowler y col. 2001; Kosová y col. 2007),
como también en especies leñosas, Betula pubescens (Rinne y col. 1999), Cornus sericea
(Sarnighausen y col. 2002), Pinus sylvestris (Kontunen-Soppela y Laine 2001), Picea
glauca (Liu y col. 2004) y Picea obovata (Kjellsen y col. 2013). Respecto a la especie E.
globulus, Fernández y col. (2012a; 2012b) han informado la presencia de cuatro genes
deshidrinas, denominados EuglDHN1, EuglDHN2, EuglDHN3 y EuglDHN10. La
expresión relativa de estos, evidenció que los genes EuglDHN1, EuglDHN2 y EuglDHN10
se inducen y acumulan en condiciones de bajas temperaturas, con mayor abundancia de
transcritos en un genotipo resistente que en uno susceptible a heladas, mientras que
EuglDHN3 se expresó principalmente en condiciones de deshidratación. Últimamente se ha
reportado que los genes EuglDHN2 y EuglDHN10 están principalmente involucrados en el
proceso de aclimatación al frío (Fernández y col. 2015). Por otra parte, se ha reportado en
numerosos estudios que la expresión transgénica de deshidrinas que mejoran la resistencia
al frío y sequía en plantas (Hara y col. 2003; Puhakainen y col. 2004; Yang y col. 2014).
La regulación específica de los genes DHNs es compleja, se ha reportado en Arabidopsis
que la expresión de estos genes estaría regulada por deshidratación, aunque también se
inducirían por frío, sequía, salinidad y tratamientos con ABA exógeno (Thomashow 1999).
Sin embargo, estudios han reportado la expresión del gen BpuDHN1 (Betula pubescens), en
respuesta a un efecto combinado de fotoperiodo y bajas temperaturas (Welling y col. 2004),
sugiriendo que su expresión es potenciada por una exposición previa de las plantas a
cambios en la longitud del día. No obstante, esto no ha sido corroborado en otras especies
Tabla 1.1 Detalles de elementos de acción cis involucrados en la expresión de respuesta al estrés de cuatro EuglDHNs en E. globulus (modificado Fernández y col. 2012b)
Elementos
cis
Secuencia Frecuencia elementos cis
E. globulus dehydrins
Función Reference
DHN1 DHN2 DHN3 DHN10
ABRE TACGTG 3ª 1 3a 0 Respuesta ABA Baker y col. (1994)
CRT GCCGAC 4a 2ª 0 0 Respuesta a baja
temperatura Stockinger y col. (1997)
LTR CCGAAA 0 0 0 1 Respuesta a baja
temperatura White y col. (1994) a
La frecuencia observada es más alta de lo esperado para el elemento en acción en cis en la región promotora de genes DHNs, siendo estos inducidos principalmente por baja temperatura (Wisniewski y
col. 2006; Fernández y col. 2012b). Un promotor regulado por el estrés abiótico puede ser
un importante interruptor molecular implicado en la regulación transcripcional de una red
dinámica de genes asociados al proceso de aclimatación y resistencia al estrés. Sin
embargo, muchas veces la estructura y las funciones de un promotor son ambiguas,
pudiendo ser regulado por varios estímulos. Estudios de regiones promotoras de los genes
DHNs han identificados elementos activadores en cis regulados por ABA (ABRE) y
factores de transcripción CBF (CRT/DRE). En particular para genes DHNs de E. globulus,
se han reportado estos elementos cis a cada uno de los cuatro genes descritos (Tabla 1.1).
Se observa que los niveles de transcritos reportados de los genes EuglDHNs en condiciones
de baja temperatura, no están relacionados directamente con el número de elementos CRT
encontrado en las regiones promotoras putativas (Fernández y col. 2012a; 2012b), dado que
el gen EuglDHN1, con 4 elementos CTR, tiene una menor acumulación de transcrito a
bajas temperaturas que el gen EuglDHN2, el cual tiene 2 elementos CRT. Por otra parte, el
gen EuglDHN10 es inducido por bajas temperaturas tanto en hojas como en tallo, no
presenta elementos CRT, pero si elementos LTR (low-temperature responsiveness), que
han sido reportados como similares a CRT por contener la secuencia similar a CCGA
(Sakuma y col. 2002).
Otra de las especies de eucalipto plantada en Chile es E. nitens. También es una especie de
rápido crecimiento, que puede crecer en áreas de gran altitud, presentando mayor
