Producción de hidrocarburos en la cepa
Arthrobacter
JBH1
Ana Lucía Quijano Hoyos
Resumen: Se investigó la producción de hidrocarburos en la bacteria Arthrobacter JBH1 para establecer su potencial en la formación de biocombustibles de segunda generación. Se investigaron genes implicados en el proceso y se diseñaron primers para amplificarlos mediante una PCR. Para caracterizar los hidrocarburos formados por la bacteria se realizó una cromatografía de gases y una espectrometría de masas. En el estudio se identificó la presencia de genes oleABCD, y se diseñó una pareja de primers para amplificar el gen oleA por su papel inicial en la biosíntesis de hidrocarburos, sin embargo no se logró estandarizar la PCR. Por otra parte se observó producción de alcanos lineales y ramificados de 7, 8, 9 y 10 carbonos, sin presencia de alquenos, que podrían ser usados en maquinaria que actualmente funciona con diésel o gasolina. En conclusión, Arthrobacter JBH1 posee un gran potencial para la producción de hidrocarburos alifáticos y debe seguirse estudiando.
[Palabras clave: Arthrobacter JBH1, gen oleA, alcanos]
INTRODUCCIÓN
La disminución de las reservas de combustibles fósiles y el continuo desarrollo de la economía altamente dependiente de la energía y de compuestos derivados de los hidrocarburos, ha generado un interés por el desarrollo de nuevos combustibles. Es decir, de biocombustibles generados a partir de recursos renovables que puedan suplir la creciente demanda energética, y que además tengan una menor repercusión sobre el medio ambiente [1].
Estos biocombustibles se han clasificado en primera, segunda y tercera generación, en relación a sus mecanismos de producción y a la materia prima empleada. Los de primera y segunda generación son producidos por microorganismos heterótrofos durante la fermentación de biomasa a partir de cultivos alimentarios y no alimentarios respectivamente. Mientras que los biocombustibles de tercera generación son generados por microorganismos fotosintéticos que
convierten directamente el CO2 a hidrocarburos o precursores [2].
El bioetanol, quien pertenece a los biocombustibles de primera generación, ha sido utilizado a nivel mundial en remplazo de los combustibles fósiles para suplir la demanda energética principalmente en el sector de transporte [3]. Sin embargo, su baja densidad energética [1], el constante conflicto por el uso de la tierra con cultivos alimentarios [2], y su alta corrosividad en los sistemas de almacenamiento y distribución, ha dirigido la visión hacia la producción de otros biocombustibles. Entre estos, se encuentran los hidrocarburos alifáticos quienes son componentes predominantes de la gasolina y el diésel, y por consiguiente son más compatibles con las máquinas actuales y los sistemas de distribución existentes [4]. No obstante, el desarrollo de hidrocarburos alifáticos a gran escala a partir de cultivos microbianos aun presenta limitaciones en cuanto a la comprensión de los
diferentes mecanismos de síntesis y en la identificación de los genes y proteínas implicadas; además de la selección de microorganismos que puedan producir en mayor cantidad estos compuestos [1]. Esto genera la necesidad del estudio de nuevos microorganismos que ayuden a dilucidar un poco el panorama.
Actualmente, se ha identificado producción de hidrocarburos alifáticos en algunos microorganismos,
Xanthomonas campestris [5], Micrococcus sp., Arthrobacter sp., Stenotrophomonas sp. [6] y
Pseudomonas aeruginosa RM [7]; mientras que en otros como Vibrio furnassii M1 aún sigue en duda [8]. En el caso de Arthrobacter sp. se ha encontrado que la producción intracelular de hidrocarburos alcanza hasta un 0.93% de la biomasa seca, con reportes de compuestos alifáticos con longitud variable entre 15 y 34 carbonos [9], y particularmente en el caso de alcanos, cadenas de longitud variable entre 7 a 18 carbonos [7]. Igualmente se ha identificado que no todas las especies de Arthrobacter sp. son productoras, pues en el estudio de Frías y colaboradores (2009) sólo 4 de 8 especies evaluadas, A. chlorophenolicus TC1, A. auresences A6, A. crystallopoietes, y A. oxydans,
formaron alquenos.
Por otra parte, además de investigar los microorganismos productores de hidrocarburos, se han realizado estudios para determinar los genes implicados en estos procesos. Beller y colaboradores (2010) identificaron la importancia del gen oleA en la producción de alquenos a partir de estudios de expresión heteróloga de los genes oleABCD en una E. coli. Observaron que al expresarse únicamente el gen
Mlut_13230 (oleA) se producían cetonas precursoras de los alquenos; cuando se expresaban los genes
Mlut_13240 (oleC) y Mlut_13250(oleB) no se producía nada; y cuando se expresaba el conjunto de genes
Mlut_13230-13240-13250 se generaban alquenos. De esta forma, establecieron la importancia del gen oleA en los primeros pasos de la biosíntesis de alquenos y la necesidad de su estudio.
En ese contexto, el presente estudio buscó caracterizar la producción de hidrocarburos en la cepa Arthrobacter
JHB1. Se identificaron los posibles genes oleA, se diseñó una pareja de primers y se realizaron ensayos de cromatografía de gases y espectrometría de masas para corroborar la producción de hidrocarburos e identificar compuestos de interés.
IDENTIFICACIÓN DE LOS GENES
Para identificar los genes relacionados con la producción de hidrocarburos se anotó el genoma mediante el servidor en línea RAST (http://rast.nmpdr.org/) y se comparó con secuencias de genes oleABCD reportadas en literatura. A partir de las secuencias de aminoácidos de las proteínas OleA reportadas en los estudios de Beller y colaboradores (2010) y Friedman (2008), se realizó un blastp para identificar proteínas homólogas y establecer características como multidominio y superfamilia (Tabla 1). Se encontró que estas secuencias correspondían a la proteína 3-oxoacil ACP sintasa; quien a su vez, estaba presente en tres regiones del genoma de Arthrobacter JBH1, aquí llamadas JBH1_10, JBH1_20, JBH1_30.
Al analizar estas secuencias con un blastx se determinó que las tres pertenecían a la superfamilia de proteínas: enzimas de condensación, pero que estaban agrupadas en dos multidominios diferentes, fabF (JBH1_10 y JBH1_30) y PRK 09325 (JBH1_20). Como en el estudio de Beller y colaboradores (2010) se estableció que las proteínas pertenecientes al multidominio fabF no estaban implicadas en el primer paso de condensación de los ácidos grasos, paso esencial para el desarrollo de los hidrocarburos [10], sólo se seleccionó la proteína JBH1_20 para realizar los estudios posteriores.
Al visualizar la proteína JBH1_20 en el programa RAST se observó que estaba sucedida por dos proteínas implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos, una proteína transportadora de acilo (JBH1_21) y otra proteína tipo 3-oxoacil ACP sintasa del multidominio fabF (JBH1_22), ver Tabla 2. Como estos tres genes
eran consecutivos y todos están implicados en la biosíntesis de ácidos grasos, bien sea en el primer paso de condensación o en pasos posteriores de elongación, se decidió amplificar toda esta región. Las secuencias
de estos 3 fragmentos se presentan en el Anexo1, Anexo2 y Anexo3; y en la Ilustración 1 se observa un recuadro rojo que se resalta está región, donde la flecha roja representa la proteína JBH1_20.
Ilustración 1. Posicionamiento genes KASIII, acyl carrier protein, KASII según anotación de RAST.
Aunque el presente estudio se enfocó solamente en la proteína tipo OleA, se buscó a grandes rasgos la presencia de las proteínas OleBC(BC)D puesto que de estar presentes las cuatro proteínas, o tres si existiese una fusión de los genes oleB y oleC, existe una mayor probabilidad que Arthrobacter JBH1 produzca hidrocarburos alifáticos [11]. Se siguió el mismo procedimiento efectuado para el gen oleA, donde se buscaron proteínas homólogas para las proteínas OleB, OleC, OleBC y OleD reportadas para Arthrobacter aurescens TC1 y Arthrobacter chlorophenolicus A6, en la patente WO 2008/147781 A2 (Tabla 3).
Después de realizar un primer análisis se identificaron dos posibles genes tipo oleB, dos tipo oleC y dos tipo
oleD, cuyas secuencias se presentan en la sección de
anexos. No se halló ningún resultado concluyente respecto a proteínas tipo OleBC porque la secuencia de referencia reportada por Friedman (2008), que codifica para la proteína hidrolasa, daba múltiples coincidencias en el genoma de Arthrobacter JBH1, haciendo necesario un análisis más complejo de homología entre proteínas que salía del alcance de estudio. Por tanto, la posible presencia de genes oleABCD establece a
Arthrobacter JBH1 como un potencial candidato para la producción de hidrocarburos alifáticos, sin embargo, es importante aclarar que se necesita realizar estudios más profundos para determinar si estos 6 genes oleBCD
identificados codifican para proteínas funcionales OleBCD, y si en efecto Arthrobacter JBH1 carece de la fusión del gen oleBC.
Tabla 1. Resultado Blastp y Blastx para genes oleA.
ID Multidominio Superfamilia Hit específico Proteína Microorganismo Referencia TC1_10 PRK 09258 Cond_enzymes KAS_III 3-oxoacil
ACP sintasa
Arthrobacter
aurescens TC1 [4] [11]
Mlut_13230 PRK 09258 Cond_enzymes - 3-oxoacil ACP sintasa
Micrococcus
luteus [4]
JBH1_10 fabF Cond_enzymes - 3-oxoacil ACP sintasa
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_20 PRK 09325 Cond_enzymes KAS_III 3-oxoacil ACP sintasa
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_30 fabF Cond_enzymes KASI_II 3-oxoacil ACP sintasa
Arthrobacter
Tabla 2.Características proteínas seleccionadas para amplificar.
ID Multidominio Superfamilia Hit específico Proteína Microorganismo Referencia JBH1_20 PRK 09325 Cond_enzymes KAS_III
3-oxoacyl-ACP synthase
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_21 - PP-binding AcpP Acyl carrier protein
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_22 fabF Cond_enzymes KASI_II 3-oxoacyl-ACP synthase
Arthrobacter
JBH1 Actual
Tabla 3. Resultado blastp y blastx para genes oleBC(BC)D.
Proteína de
referencia Microorganismo Multidominio Superfamilia Proteína homologa Referencia OleB A. chlorophenolicus A6 PRK 00870 Esterase_lipase Alpha/beta hidrolase [11] OleC A. chlorophenolicus A6 PRK 09274 AFD_Class_I Acyl-CoA synthetase [11] OleBC A. aurescens A6 PRK 09274 AFD_Class_I Hydrolase [11] OleD A. chlorophenolicus A6 WcaG SDR Nucleoside-diphosphate
sugar epimerase [11]
Tabla 4. Características de los primers.
Primer Longitud MW %GC Tm Purificación FP 24 7342.9 41.7 61.2 Salt-free RP 24 7445.0 41.7 61.2 Salt-free
AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES
A partir de la región de interés comprendida por las secuencias JBH1_20, JBH1_21 y JBH1_22; de 3128pb de longitud y contenido GC de 65.21%, se diseñó una pareja de primers mediante el programa CLC Main Workbench versión 7.5.1, cuyas secuencias fueron: FP – (5’-GAATTCTATTCCGCTAAAGGTTGC- 3') para el primer forward y RP – (5'- AGATCTTTTTAGTGTGCGGTGATG-3') para el primer reverse. Se comprobó la eficiencia de los cebadores con el servidor web PrimerBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) y finalmente estos fueron sintetizados en la compañía Integrated DNA Technologies (IDT) ®. En la Tabla 4 se detallan las características de los mismos.
Mediante esta pareja de primers se realizó la estandarización de la PCR a partir del ADN extraído de la cepa de Arthrobacter JBH1 con el kit Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO). Como control positivo de la PCR se amplificó la región de 16S con los primers 27F- Forward (5'-GAGTTT
GATCTGGCTCAG-3) y 1492R- Reverse (5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’). La mezcla de la reacción de la PCR para 16S consistió en 5µl de buffer, 4 µl de dNTPS, 0.12 µl de cada uno de los primers, 0.25µl de la polimerasa Takara Ex taq HS (Clontech) y 1 µl de ADN, en un volumen total de 50 µl. El perfil de temperatura del termociclador consistió en un primer paso de denaturación a 94°C por 30seg, seguido de 30 ciclos de denaturación a 98°C por 10seg, anillaje a 55°C por 30seg y elongación 72°C por 3min y 20 seg; con un último paso a 72°C por 7min para la elongación final. Por otra parte, las condiciones de la reacción de la PCR y de los perfiles térmicos del termociclador para amplificar la región de estudio con la pareja de primers diseñados se hizo en base a las recomendaciones de Takara Bio INC [12]. La mezcla de la PCR consistió en 5µl de 10XEx taq buffer, 4 µl de dNTPS, 1.5 µl de cada uno de los primers, 0.25µl de la polimerasa Takara Ex taq HS (Clontech) y 1 µl de ADN, en un volumen total de 50 µl. El perfil de temperatura del termociclador
consistió en un primer paso de denaturación a 94°C por 30seg, seguido de 30 ciclos de denaturación a 98°C por 10seg, anillaje a 55°C por 30seg y elongación 72°C por 3min y 20 seg; con un último paso a 72°C por 7min para la elongación final.
Sin embargo, al correr el gel de electroforesis con los productos de la PCR no se obtuvo ningún resultado, así que se hicieron una serie de modificaciones en el protocolo original para lograr estandarizar la PCR. A continuación se indican los diferentes ensayos realizados:
1. Gradiente de temperatura para la temperatura de anillaje. Se probaron 8 temperaturas intermedias (67°C, 66.1°C, 64.6°C, 62.3°C, 59.4°C, 57.3°C, 55.8°C y 55°C).
2. Gradiente de DMSO. Se probó una concentración final de DMSO de 2.5%, 5%, 7.5% y 10%.
3. Gradiente de temperatura y dos concentraciones de DMSO. Se programó el termociclador con 8 temperaturas de anillaje: 70°C, 68.1°C, 65°C, 60.3°C, 54.3°C, 49.9°C, 46.8°C y 45°C; y se probaron dos concentraciones de DMSO (5% y 10%) para cada una de las temperaturas.
4. Gradiente de MgCl2. Se cambió el buffer del kit Takara Ex taq hot start polymerase, por un buffer sin concentración de MgCl2, y se varió la concentración final de MgCl2 en 1mM, 2mM, 3mM, 4mM y 6mM. Todos los ensayos tenían DMSO al 5%.
5. Se cambiaron las condiciones originales de la reacción de PCR por las condiciones usadas para amplificar 16S. Es decir, se añadió un volumen de 0.12 µl de cada uno de los primers. 6. Gradiente de concentración de dNTP’s. En el protocolo original se probaron 3 volúmenes diferentes de dNTP’s: 2 µl, 4µl y 6 µl.
No obstante, al revelar los geles para cada uno de estos ensayos no se obtuvo ningún resultado. Por ello se evaluó la integridad y pureza del ADN para descartar que el problema estuviese allí. En el primer caso se reveló un gel de electroforesis (Ilustración 2) donde se
observaron dos bandas perfectamente delimitadas correspondientes a las dos extracciones diferentes de ADN realizadas, que indican ADN en buen estado. En el segundo casó se calculó la relación OD260/OD280 en ambas extracciones, obteniendo valores de 1.92 y 1.90 respectivamente, valores que se encuentran dentro del rango aceptable. Igualmente se amplificó el gen 16S en
Arthrobacter JBH1 tomando como control positivo a
Ralstonia eutropha; en la Ilustración 3 se observa el gel con las bandas correspondientes a estos microorganismos.
Como se observa, el ADN de Arthrobacter JBH1 está en buenas condiciones y puede ser amplificado para la región de 16S. Sin embargo, aún no se ha conseguido estandarizar la PCR para los primers diseñados durante el estudio. Es posible identificar varias causas para ello; que haya sustancias inhibidoras de PCR, que el fragmento sea muy largo afectando la procesividad de la polimerasa, o que las características de Arthrobacter sp., como una bacteria Gram positiva con un alto contenido de GC, dificulten la amplificación de este fragmento
ANÁLISIS DE LOS HIDROCARBUROS
Los hidrocarburos se extrajeron a partir de un cultivo celular de 5 días de JBH1 mediante el protocolo de Bligh y Dyer [13]. El producto se inyectó en una columna de 0.85g de gel de sílice, se eluyó con 30ml de hexano y se concentró en un rotavapor hasta llegar a 1.5ml, de ser necesario, el volumen faltante se completó con hexano. Luego la muestra se reconcentró con nitrógeno gaseoso hasta llegar a 1ml. Se realizó un análisis de cromatografía de gases (CG) y espectrometría de masas (MSD) para la solución obtenida, con el equipo de cromatografía HP6860 acoplado a un espectrómetro de masas HP5975B. Las condiciones de la CG fueron gas de helio, 1ml/min; columna HP-5MS (30m por 250µm por 0.50µm); rampa de temperatura a 40°C por 5min, luego 3°C/min hasta 200°C y 10°C/min hasta 250°C, manteniendo por 5 minutos. La MSD se ejecutó en modo de impacto de electrones a 70eV y a 35µA.
Ilustración 2. Comprobación integridad del ADN.
Pozo1: escalera, Pozo 2: Extracción 1 de ADN; Pozo 3: Extracción 2 de ADN.
Ilustración 3 Amplificación del gen 16S.
Pozo 1: escalera; Pozo 2: control positivo, Ralstonia eutropha; Pozo3: Arthrobacter JBH1; Pozo 4: Control negativo.
En los cuatro ensayos de cromatografía realizados, bajo las condiciones anteriores, para caracterizar la producción de hidrocarburos de la cepa Arthrobacter JBH1, se observaron compuestos alifáticos de cadenas lineales y ramificadas, principalmente conformados por alcanos de cadena corta que llegaban hasta los 14
átomos de carbono en la cadena principal de la molécula. También se observaron alcoholes, cetonas y ácidos, que no se tuvieron en cuenta para el análisis porque no eran el objeto de este trabajo. Igualmente se presentaron varios compuestos derivados del hexano que tampoco se consideraron pues provenían del disolvente usado para eluir la columna. En la se presentan los resultados más relevantes para las cuatro cromatografías realizadas, donde se seleccionaron los compuestos que estuvieron presentes en por lo menos dos de los ensayos realizados. Se puede observar que los compuestos más comunes están formados por cadenas principales de 7, 8, 9 y 10 carbonos.
La presencia de alcanos de cadena corta concuerda con el estudio de Stroeva y colaboradores (2013), donde se reportó producción de alcanos de 7, 9 11, 13 y 15 carbonos para Arthrobacter sp. RV. Allí se menciona que el nonano es el alcano presente en mayor proporción, mientras que en el actual estudio el nonano aparece en baja cantidad y sólo en dos de las cromatografías realizadas. Adicionalmente, en el presente estudio se observó que el decano es el alcano que más aparece en los ensayos, bien sea como cadena lineal o ramificada. En todas las cromatografías aparece algún compuesto de tipo n, n-dimetil-decano, mientras que el n_decano aparece en sólo tres de los cuatro ensayos (ver Tabla 5).
Por otra parte, los resultados encontrados contrarrestan los observados por Frias y colaboradores (2009), donde se detectó en cuatro de ocho especies de Arthrobacter
evaluadas la formación de alquenos y cetonas de 27 y 29 carbonos. En el presente estudio no se observó ningún alqueno, un resultado inesperado dado que la presencia de los genes oleABCD, explicados previamente, son un indicio de la formación de alquenos, lo cual da a pensar que hay otros genes en
Arthrobacter JHB1, diferentes al complejo oleABCD,
que podrían estar implicados en la formación de hidrocarburos alifáticos.
En términos generales los resultados de las cuatro cromatografías no fueron consistentes entre sí, puesto que el perfil de compuestos varió de ensayo a ensayo,
con tan sólo unas pocas coincidencias que se observan en la Tabla 5. Esta inconsistencia entre los ensayos radica, en parte, por la baja concentración a la que se encuentran los productos generados por Arthrobacter JBH1 lo cual afecta la sensibilidad de los equipos de CG-MSD; y a su vez por la ausencia de un patrón de hidrocarburos que se pueda correr antes de las muestras y que permita identificar con mayor certeza los compuestos presentes. Igualmente dado que en los ensayos aparecen muchos compuestos conformados por átomos de sílice (resultados no incluidos), formados por la reacción entre la muestra y la columna de cromatografía, es importante evaluar si el equipo de CG-MSD está funcionando adecuadamente y brinda resultados confiables.
Por último, en la Tabla 5 se observa que la tercera y cuarta cromatografía tienen un problema relacionado con los blancos, porque en la mayoría de los
compuestos el área reportada para el blanco supera el área de la muestra. Ello conllevaría a que se descartarán los resultados obtenidos para ambos ensayos debido a mayor presencia del compuesto en el blanco que en la muestra, sin embargo, al analizar cada caso específicamente se encuentra que en la tercera cromatografía el cromatograma del blanco tiene un perfil casi idéntico al de la muestra, y que en la cuarta cromatografía el blanco posee mayor número de compuestos que la muestra en sí (resultados no presentados). De esta forma, puede ser que el problema esté en la contaminación cruzada de los blancos con la muestra, o en un error en la cromatografía por la lectura por duplicado de la muestra, es decir no leer el blanco, o que el equipo esté funcionando mal. En este sentido, los resultados aquí presentados son sólo un indicio y deben ser comprobados con nuevos experimentos, que corroboren tanto el adecuado funcionamiento de los equipos como la pureza de los blancos.
Tabla 5. Resultados cromatografía.
Primera Cromatografía: 13/02/2015 Segunda Cromatografía: 16/04/2015
RT Área Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob RT
Área Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob 10.33 4.54 3.24 2,4 dimetil heptano 94% 18.24 15.13 6.78 1 metil ciclopentanol 43% 12.56 3.51 2.43 4 metil octano 91% 19.98 2.38 NA decano 53%
Tercera Cromatografía: 23/04/2015 Cuarta Cromatografía: 29/05/2015
RT Área Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob RT
Área Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob 10.27 2.09 2.48 2,4 dimetil heptano 64% 10.26 0.93 4.24 4,4 dimetil heptano 47% 12.49 1.88 2.38 4 metil octano 83% 14.45 1.22 1.34 nonano 76% 14.46 1.27 1.20 nonano 76% 19.97 3.35 2.2 decano 93% 18.24 15.72 8.85 1 metil ciclopentanol 49% 23.08 1.48 4.51 2,4,6 trimetil decano 53% 19.98 2.71 2.49 decano 93% 23.08 1.48 4.51 2,4 dimetil decano 53% 23.09 1.81 2.07 2,4,6 trimetil decano 53% 23.09 1.81 2.07 2,4 dimetil decano 50%
CONCLUSIONES
Arthrobacter JBH1 parece ser una bacteria interesante para el estudio de la biosíntesis de hidrocarburos y para la creación de biocombustibles de segunda generación,
debido a que posee algunos de los genes implicados en este proceso, genes oleABCD, y a que se evidenció
formación de hidrocarburos alifáticos en los estudios realizados.
Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por responder en futuros estudios. En primer lugar, es importante establecer realmente cuales son los genes implicados en la formación de los hidrocarburos alifáticos identificados en este trabajo, dado que la presencia de genes oleABCD está relacionada es con la formación de alquenos, compuestos no detectados en el estudio. En ese sentido, debe comprobarse si los genes
oleABCD identificados son funcionales, y de serlo, establecer por qué no se están produciendo alquenos. Igualmente, se debe identificar cuáles son los genes que están implicados en la formación de los alcanos hallados, y realizar más ensayos para estandarizar la reacción de PCR.
Por último, dada la longitud de los hidrocarburos hallados (C7-10) se establece que podrían usarse como materia prima en combustibles como el diésel y la gasolina, quienes se caracterizan por tener hidrocarburos de 8-14 carbonos y de 5-10 carbonos respectivamente, y que están conformados aproximadamente en un 70% por compuestos saturados [14] [15].
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Johana Husserl por su asesoría y consejos a lo largo del trabajo, a Ana María Lopez por su ayuda en el laboratorio, a Adriana Jaimes y a Mariela Quintero por su ayuda en la realización de los ensayos de GC/MSD, y a Wolfram Baumann, director del departamento de química por proveer amablemente el reactivo DMSO.
REFERENCIAS
[1] Y. Yan y J. Liao, «Engineering metabolic systems for production of advanced fuels,»
Journal of industrial microbiology and biotechnology, vol. 36, pp. 471-479, 2009.
[2] A. Ruffing, «Chapter 8: Metabolic engineering of hydrocarbon biosynthesis for biofuel production,» de Metabolic engineering of hydrocarbon biosynthesis for biofuel production, liquis, gaseous, and solid biofuels - conversion techniques, INTECH, 2003, pp. 263-298.
[3] V. Gonela, J. Zhang, O. Atif y O. Raphael, «Stochastic optimization of sustainable hybrid generation bioethanol supply chains,»
Transportation research part E, vol. 77, pp. 1-28, 2015.
[4] H. Beller, E.-B. Goh y J. Keasling, «Genes involved in long-chain alkene biosynthesis in Micrococcus luteus,» Applied and environmental microbiology, vol. 76, nº 4, pp. 1212-1223, 2010.
[5] J. A. Frias, Microbial synthesis of fuel hydrocarbons: enzymes and metabolic pathways, Retrieved from the University of Minnesota Digital Conservancy, 2011.
[6] J. Frias, J. Richman y L. Wackett, «C29 Olefinic Hydrocarbons Biosynthesized by Arthrobacter Species,» Applied and environmental microbiology, vol. 75, nº 6, pp. 1774-1777, 2009.
[7] A. R. Stroeva, M. V. Giruts, V. N. Koshelev y G. N. Gordadze, «Bacterial synthesis of n-alkanes with an odd number of carbon atoms in the molecule,» Petroleum chemistry, vol. 53, nº 5, pp. 331-334, 2013.
[8] L. Wackett, J. Frias, J. Seffernick, D. Sukovich y S. Cameron, «Genomic and biochemical studies demonstrating the absence of an alkane-producing phenotype in Vibrio furnissii M1,» Applied and
environmental microbiology, vol. 73, nº 22, pp. 7192-7198, 2007.
[9] N. Ladygina, E. G. Dedyukhina y M. B. Vainshtein, «A review on microbial synthesis of hydrocarbons,» Process biochemistry, vol. 41, pp. 1001-1014, 2006.
[10] Y. Yuan, M. Sachdeva, J. Leeds y T. Meredith, «Fatty Acid Biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa Is Initiated by the FabY Class of B-Ketoacyl Acyl Carrier Protein Synthases,» Journal of bacteriology,
vol. 194, nº 19, pp. 5171-5184, 2012.
[11] L. Friedman, «Hydrocarbon-producing genes and methods of their use». Estados unidos Patente WO 2008/147781 A2, 20 Mayo 2008.
[12] TAKARA BIO INC, «Takara ex taq hot start version,» [En línea]. Available: http://www.clontech.com/takara/CO/Products
/PCR_Products/High_Performance_PCR/ibc GetAttachment.jsp?cItemId=42822&fileId=6 874927&sitex=10038:22372:US.
[13] E. C. Bligh y W. J. Dyer, «A rapid method for total lipid extraction and purification,»
Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, vol. 37, pp. 911-917, 1959.
[14] EPA, «TOXICOLOGICAL PROFILE FOR FUEL OILS,» EPA, Atlanta, 1995.
[15] M. S. Graboski, R. McCormick, T. L. Alleman y A. M. Herring, «The Effect of Biodiesel Composition on Engine Emissions from a DDC Series 60 Diesel Engine,» National Renewable Energy Laboratory, Colorado, 2003.
Anexos
ANEXO 1: Secuencia gen JBH1_20
TGGGACCTCTGCATGGATACCATGGTGCAGCGGGGCGTCACCGGCGTCATCGAACTGGCACCCGCCGGCAC ACTTGCAGGGCTCGCAAAGCGCGGCATGCCAGGAGTCAAGACGGTTGCCGTCAAGACGCCGGACGACCTCT CAGCCGCACTGGCACTCTTCGCAGAATTGGAGGGTAACGCATGAGCGTTCCCACGCTGAAACAGGCCCCCA TCCAGGAGAACACCCGCATCCTGGGAATTGGCGCTTACCGTCCGGACATCATCGTCACCAACGACGACGTC TGCCAGTGGATTGATTCCTCGGACGAATGGATCCGTCAGCGCACCGGCATCGTGACGCGCCACCGAGCACC GGCTGACGTCAGCGTTATCGACATGGCCGAAGGAGCCGCACGGGAAGCTCTGGAAAAGGCTGGTATCGAG GCCTCCGAGCTTGGCGCGGTCATCGTCTCCACGGTCACCCATCCCTACGCCACACCGTCGGCGGCTGCCAGC CTGGCTGACCGGCTGGGAGCAACGCCTGCCCCGGCTTTTGACATCTCGGCCGCCTGCGCGGGCTACTGCTAC GGCATCGCCCAGGGTGATGCCCTGGTCAGGTCCGGCGCGGCCAAGTATGTCCTGGTCGTGGGTGCGGAAAA GCTCTCCGACGTCATCGACAACCATGAGCGGACCATTTCGTTCCTGCTCGGCGACGGCGCCGGCGCGGTAGT GATCGGCCCTTCGGACACACCGGGCATCGGCCCGTCCGTCTGGGGCTCAGACGGCAGTAAGTGGGACGCCA TCGGCATGACCCGGTCCATGCTCGACGTCCGTGCCCTGAGCCAGGCAGCGCGCCAGTCGGACGAGTCCGGG GATTTCGCGCTGCTGGAAGAAGCCCAGGACCTGTGGCCGACGCTGCGCCAGGATGGCCAGACCGTGTTCCG CTGGGCCGTCTGGGAAATGGCGAAGGTGGCCCAGCAGGCCCTTGAGGCTGCCGGAGTGCAGGCCGAGGAC CTCGTGGCGTTCATCCCGCACCAGGCGAACATGCGGATCATCGACGAAATGGTGAAGAAGCTCAAGCTTCC CGAAACCGTGACCGTGGCCCGCGACATCGCGGACGCCGGCAACACCTCAGCCGCTTCCATCCCCCTGGCCA CACACCGCCTGCTGCAGGAGAATCCGGCGCTCAGCGGCGGTCTTGCGCTGCAGATCGGCTTCGGCGCCGGG CTCGTCTTCGGTGCCCAGGTAATAGTCCTTCCCTAGGAACGCCCCACACAGGCAGCATCCGCTGCCTGAACC GTTTCCGGCAGCCCCTGCCGGCAATAACAAGAAAAGGAGCCATCAATGGCTAGCAACGAAGAGATCCTGGC CGGCTTGGCTGAAATCGTCAACGAAGAGACCGGCCTCGCCCCCGAGGCTGTGG
ANEXO 2: Secuencia gen JBH1_21
GCTGGACAAGTCCTTCACCGAGGACCTGGACATCGACTCCATCTCCATGATGACCATCGTCGTCAACGCCGA AGAGAAGTTCGGCGTGCGCATCCCGGACGAAGAGGTCAAGAACCTCAAGACCGTTGGCGACGCCGTCAGCT TCATCTCCGGCGCACAGGCCTAGCCAAGGCGCCAGCCGCTCACGGCTTGGCTGGACTGCCGGCCCGGGTAT CC
ANEXO 3: Secuencia gen JBH1_22
CGGACCGGCAGTCCGGCCGCATTCAACCGGCAGCCACCTGCCCTACACCCCACACGCGGGACCCCGCCGGA GAATACCGGAGCAGGGCTGCCCACCGACAGAGAGTGATCCCATGACACGCAAAGTAGTCATTACCGGTCTG GGTGCCACAACGCCCATCGGCGGCGACGTACCCACTATGTGGAAGAACGCGCTTAAGGGGGTCTCCGGTGC ACGCACCCTGGAGGACGACTGGGTTGCCAAGTATGAACTCCCCGTCCACTTCGCGGCGCGCTGCACCACCC CGGCCCTCGACGTCCTGAGCCGCGTTGAAGCAAAGCGCATGGACCCCTCCACCCAGTTCGGCGTTATCGCCT CCCGGGAAGCATGGGCCGACTCAGGGATCACCGAGATCGACCATGACCGCCTTGCAGTTGCCTTCGCAACA GGCATCGGCGGCGTCTGGACCCTGCTGGACGCCTGGGACACCTTAAAGGAAAAAGGGCCCCGCCGTGTCCT GCCGATGACGGTTCCCATGCTGATGCCCAACGGTGTCGCAGCGGCCGTCAGCCTTGACCTTGGTGCCCGCGC GGGCGCCCACACCCCGGTATCCGCCTGCGCTTCCGGCACCGAAGCCCTCCACCTTGGCCTGGACCTGATCCG CTCCGGAAAGGCCGATGTGGTCATGTGCGGCGGCGCCGAGGCCGCGATCCACCCCATGCCGCTCGCCGCGT TCGCCTCCATGCAGGCGCTGTCCCGCCGGAACGACGACCCGCAGGGTGCATCCCGCCCGTATGACCTGGGC CGCGACGGTTTTGTCATGGGTGAAGGAGCCGGCGCGCTGGTCCTCGAAGCCGAGGAGCACGCACTGGCACG CGGTGCACGCATCTATGGCGAGCTTGCCGGCACGTCAGTCACCGCGGACGCATACCACATCACTGCCCCCG
ACCCCGAGGGCCTGGGCGCCACCCGTGCTTTGAAGGCAGCCATGTTCGACGGCCGTATCCAGGCCGAGGAC GTAGTGCACGTCAACGCACATGCCACATCGACGCCCGTCGGCGACAAGCCTGAGTACACGGCTCTCCGCGC GGCTCTGGGCAACCACATCGACAATGTGGCAGTCTCGGCCACCAAGTCGCAGATGGGCCACCTCCTGGGTG CTTCCGGCGCCGTGGAGGCAGTATTGACCGTGCTCGCCGTCTACGAGCGCAAGGCCCCGGTCACCATTAAC CTGGAAAATCAGGATCCGGAAATCCCGCTCGACGTGGTCACGTCCGCACGTGACCTCCCGTCCGGGAACAT CGTGGCCTTGAGCAACTCCTTCGGCTTCGGCGGCCACAACGCCGTCATCGCAGTACGCAGCGTCTAGCATCA CCGCACACTAAAAAGCAGGGGCCCCGCCAGTTGGCGGG
ANEXO 4: Secuencias de posibles genes oleB de Arthrobacter JBH1
Opción 1: node 108, posición 1224-2030
TGGCCATAACGCATTCCCTCTGGACCGGCATGGTGCCGGTTGACGACACGGCCTTAGCCGTCACCGACACC GGCGGTCCCGGTATCCCGCTGGTCTACCTCAACGGCCACTTCGCCACACAAGGCTACTGGCACCGGGTCATC GCCGAGCTCGGCACCGGGTTCCGGCACATCACCTACGACGAACGGGCCCGCGGCCGGAAGTCGAAGACATC GGCGGACTACTCCTTCGAGGCCGCCGTCCGCGACATCGACGCCGTCATGGCAGCCCGGGGCGTGGACCGGG CGCTGGTAGTCGGCTGGTCCTACGGGGCATTCGTCGGAGCGCACTGGGCCAGCCGGAACCCGGACCGTGCC CTGGGCGCCGTCCTGGTCGACGGCGCGCAACCGTACGACTGGCTCACCGACGCCATGGAGCAGGGGATGCC CAAGATGTTCCGGCGGATGTACCCGTTGATGCTGCTGCTGCGCCCGACCGGCCTGACCCCGCGGATGACCG CCGAACAGATGGCCGCCAGCAACATCGAGGTCGGCAAGATCGCCCGGGAGCGCAACCTAGGCCCTGTGCTC GACAACATCACCGTCCCTGTGCGGTACGTGCTCGCCTCAGGGGTGTCTTTCGGCAGCAAGGGTGACGAGCA GGAGACCATTCGTGCGGGCCTCGATCCGGTGTTCGAGCGAAGCTCGAACATCAAGCTCAGCGCAAAGGTCC CCAGCAACCACGGTGCGATCCTGCGGAAGGACTTCCGCGCCGTAGCCGACGCCGTACGGGAGACAGTGGCC GCCCACGAACAAGGGCCTGGCTGA
Opción 2: Node 1, posición (189120 – 188287)
TCAGCCGGCGAAGAAGTCGCTCAGCTCCGTGATCAGCTTGTCCGGTGCGCGGAGTACGCCGTCGTGGCCGG AGCCCTGAAGGATGGTGTAGCTGGAGCCGGACAGGACGTCGTGGATCTGGCCGCAGGCCACACCGAAGTA CGCGGGGCTCTTTTCGCCGACGACGATCAGGGTTTCCAGGGGCAGTTCCAGGAACGGCTCGGCCGGCATGT CCGCGGCGATGATCGCCTTGATTTCCCGGACGCCAGTGCGCATCAGTTCGCGCATCTGCTTGCCCATATGCG TTCCGGCGGTGAGCTTGTTGGCGATGGTGAGCATGGACAGCGGCATTCTCGAGAAAGCGCCGCCGGTTTCC AGGCCCTTCGTGAGTACCGCCAGGGCGCGGTCGTAGTCCCCGGCAGCCGTGGCACGTTCGTATTCAGCGGT CCAGTCCGCCTTGACGCTGTGGTTCACTGACACGGCGGGGTCGTAAACGGCCAGCCGTTCCACGGGAAGCG TGCGGGCCGCGTGCAGGGCCACGGCGCCACCGAAGCTGTGCCCGAACACGTCGGTGCTGGACGTGTGCTTC ATCACCGCGTCGAGGTCCCGGATGTCCGCGTCAAGGGTGTAATCCTCGGCCTGTGGCGACGACGAACCGCG GCCGCGGCGGTTGAACGTGTGCACCGGACGGCCCAGGGCTGCGCTGAGTTTCTGCGCAAACTTCGTATAGT CGGCCGCGGTGACCATGGAGGCCGGCACCACCACCACGCCGGAGCCTGCGGACGCCAGCTCGGCGCCCGTG GAGAAGAGCTCGAGTGTGCCGCCGTCGGGGGTCTTGATGTTCTCGCGCGTCAT
ANEXO 5: Secuencias de posibles genes oleC de Arthrobacter JBH1
Opción 1: Node 13, posición (103420-105243)
ATGACGGCCGGAACCGCTCCCTCAACCCGCTGGCCTGCCATCCCTAAGGACATCCGGACCTTCGCCGTCCGC CCCAACATGGTGGACTACGACGCCACCCGTGCGGCATTCTCCTGGGATGGGGCGAGGCACGAATTGTCCGG GCTGCCCCACGGCGGCGTGAACATTGCCTACGAGGCTGTAGACCGCCACGCCTCGGGCGACCGGGCAGGCC ACGAAGCCTTGCGTTTCATCCGTGCCGACGGTACCGCCCGTTCCTTGAGCTATGCGGAGTTGGCGGAACAGA CCGGACGGTTTGCGGGCGTCCTGCACGGGTTGGGGATCGGCCGGGGGGAGCGCGTATTTTCGCTCCTGGGC AGGTGCCCGGAGCTGTACATCGCGGTGTTGGGGACGCTCAAGAATGCCAGCGTGTTCTGTCCCCTGTTCTCC
GCCTTCGGCCCGGAGCCCGTCCGTCAGCGGCTCCACCTCGGGGAGGGCCGGGCGCTGGTCACAACCCGGGC GCTGTACCGGCGGAAGGTTGCCCAGATCCGCGGGCAGCTGCCGGGGCTGGAGCACATCCTGCTGATCGATG CCGAGGGCCGCCCGGATCCGGGAACCCTGGATCTGGCTGAACTGATGCGCGGCGCGGAGCCAAGGGAAAC CGCCCCGACCGGCGCCGAGGAAATGGCCCTGCTGCACTTCACCAGCGGGACAACGGGCACTCCCAAGGGG GCCATCCACGTGCACGACGCCGTCACGGCGCACAGGGCAACCGGCTACTTCGCGCTGGACCTGCACCCGGA CGACGTCTACTGGTGCACGGCCGACCCCGGCTGGGTTACCGGGACCTCGTACGGCGTGATCGCCCCCCTGA CCCATGGCGTGACCACCATCGTGGATGAAGAGGAGATGGACCCGGACCGGTGGTACCGGATCCTGGCCGAG CAGCGGGTCACCGTCTGGTACACCGCCCCCACCGCGCTCCGCATGCTGATGAAGGCAGGTGCCAGCCATGC CGCGGAGCACGATCTGTCCGCCCTGCGGTTCGTTGCCAGTGTGGGCGAACCGCTGAACCCCGAAGCGGTGG TGTGGGGCCAGGAGGCCTTCGGCCAGCCTGTCCATGACAACTGGTGGCAGACCGAAACCGGCGGCATCATG ATTTCGAACTACCCCGCCATGGAGATCAGGCCCGGCTCCATGGGCCGGCCGTTGCCCGGCGTCGAGGCCGC GATCATTGCCCGTGACCGGGACGGCAAACCGGTGATCCGGAACGGTGAGGCCGTTGTGGTGACTGACCCCG GGATGGTGGGCGAACTTGCCCTCCGGCCGGGCTGGCCATCCATGTTCCGCGGCTACCTCAACGAGGACGAG CGGTACCGGCGGTGCTTTGCCGGCGGCTGGTACCTCACGGGGGACCTGGCGAAGAAGGACACCGACGGGTA CTTCTGGTTCGTCGGCAGGGGCGATGACGTCATCAAGTCCTCAGGCCATCTGATCGGCCCGTTCGAGGTGGA GAGCTCTCTCATGGAGCACGAAGCCGTGGCTGAAGCAGGGGTGATCGGTGTCCCCGATCCCGTGGCAGGTG AGCTGGTCAAGGCTTTCGTGGAACTGCGCACCGGGTGGGAGCCCTCGGAGGCACTGAAGCTGGACATCATC GGCTTCGCCCGCAAACGCCTGGGGCCGGCAGTGGCCCCCCGGCTGCTGGACTTCACCGAGGCTTTGCCCAA GACGCGGAGCGGCAAGATCCTCCGCCGGCTGCTGAAGGCGCGTGAGCTCGGCCTTCCTGAGGGCGACACCT CGACGATCGAGTCCCCCGCAGGCCACTACCCCGGGACGCACACATGA
Opción 2: Node 98, Posición (3815-5827)
ATGTCCCAGGACACTCCCGGCTCCACCGCCACCGCTCCCGCAGCTACCGTGCAGGACGACCAGCAGGGCGA CGCCTTCGAAAACCTGCTGCACGAGAACCGCAAGTTTGCGCCGACCCCCGAGTTCGCTGCCGACGCCGTCG TCACCGCAGCCGACTACCAGGAGGCCGACGCCGACCGTCCCGCGTTCTGGGCCAGGCAGGCCCGTGAACTG CTCACCTGGTCCAAGGACTTCGACCAGGCATTGGACTGGTCCAACCCGCCGTTCGCCAAATGGTTCGTGGGC GGCGAGGTCAACGCCGCGTACAACGCCCTGGACCGGCACGTCGAGAACGGACTCGGGGACCGGGTGGCCA TCTACTTCGAAGGCGAACCAGGCGACACCCGCACCTACACCTACGCCCAGCTCACCGAGGAAGTGAAGAAG GCCGCGAACGCCTTCGAATCCCTCGGCGTTGCCAAGGGCGACCGGGTGGCCGTGTACCTGCCCATGATCCC CGAAGCCGTGATTACGCTGCTGGCCTGCGCCCGCATCGGCGCGGTGCACTCTGTGGTGTTCGGCGGGTTCTC CGCCGAGGCCCTGCGCTCCCGGATCGACGACGCCGAAGCCAAGCTCGTAGTCACCGCCGACGGCACCTACC GCCGCGGCAAGCCCAGCTCCCTGAAGACCGCCGTCGACGACGCCCTGTCCCGCGAAGGCGGGCACACCGTC CAGAACGTCGTGGTGGTCAAGCGCAACGGCCAGGACGTGGACTGGCACGAAGGCCGGGACCACTGGTGGG ACGACACCGTCGGGGCGGCATCCACCCAGCACACCGCCGTCGGGCACGACTCCGAACACCCGCTGTTCATC CTCTACACCTCCGGGACCACCGGCAAGCCCAAGGGCATCCTGCACACCACCGGCGGGTACCTCACCCAGGG CGCCTACACCCACAAGGCCGTGTTCGACCTGCACCCGGAGACGGACGTCTACTGGTGCACCGCCGACGTCG GCTGGGTCACCGGCCACTCCTACGTCGCCTACGCCCCGCTCATCAACGGCGCCACCCAGGTCATGTACGAA GGCACCCCGGACTCCCCGCACCAGGGCCGCTGGTGGGAAATCATCGAAAAATACAAGGTCTCCATCCTGTA CACCGCACCCACCGCGATCCGTACATTCATGAAGTGGGGCCGGGACATCCCGGACAAGTACGACCTCTCCT CCCTCCGCGTGCTCGGTTCGGTGGGTGAGTCCATCAACCCCGAGGCCTGGATGTGGTACCGGGACGTCATCG GCGGCAACAAGGCACCCATCGTGGACACCTGGTGGCAGACCGAGACCGGCGCCCAGATGATCGCCCCGCTG CCCGGCGTCACCGCCACCAAGCCAGGCTCCGCCCAGGTGCCGCTGCCCGGCATCGCCGTGGACGTCGTGGA CGAACTCGGCGAATCCGTGCCGAACGGCCACGGCGGTTTCCTGGTGATCCGCGAACCCTGGCCGGCCATGC TCCGCGGCATCTGGGGCGACCCGGAACGGTTCAAGGACACCTACTGGTCCCGGTTCGAAACCATGTACTTC GCCGGGGACGGCGCAAAGAAGGACGAGGACGGCGACATCTGGCTCCTGGGCCGGGTGGATGACGTCATGA ACGTCTCCGGGCACCGGCTCTCCACCACGGAGATCGAATCCGCCCTGGTCTCCCACCCGGCCGTGGCCGAA GCCGCCGTCGTGGGCGCCGCGGACGAGACCACCGGCCAGTCCGTCGTCGCGTTCGTCATCCTCCGCGGCGA CGCCGTGGACACCGGCGACCAGATCATCCAGGACCTCCGCAACCACGTGGGCAAGGAGATCGGTCCGATCG CCAAACCCAAAACCATCCTCGTGGTCCCGGAACTGCCCAAAACCCGCTCCGGCAAAATCATGCGCCGCCTC
CTCAAAGATGTCGCAGAAGGCCGCGACCCAGGCGACGCCACCACGCTGGCCGACAACACCGTCATGGCAC AGATCGCGGCATCACTGCGGAAGTAG
ANEXO 6: Secuencias de posibles genes oleD de Arthrobacter JBH1
Opción 1: Node 45, posición (37438-38298)
ATGACCATCCTCATGGCCGGCTGCGGTGATCTGGGCACCGAAGCGGGCCTGCGCTTCGCCGCTGCAGGCCA CCGGGTGGTGGGCTGGCGCCGCTCCCCGGAAAAGCTGCCTGCGGCGATCGAGGGCGTCGCCGCTGACCTGA CCGCCGCCGGCCTTCCGGCTATCCCGGCGGACACCACCGCCGTCGTCGTTGCAGTGGCAGCCGATTCACCCA CCGAGGCCGCCTACCGGGCCGCCTATGTGGACGGGCTGGCGCATGTCCTGGACGCCTTGGAACGCGACGGC GTGACGCCGCGGCGTGTGCTGTTTGTGTCTTCCACCGCCGTCTACGGCGACGCGGGCGGCGGCTGGGTCGAT GAAGGTACGACGCCGGCGCCTGGCGGCTTCTCCGGGCGCATCATCCGCGAGGCAGAGGACCTCCTGCTGTC GCGGTTGCGCGGCACCGGATCCGCCCCGGTTGTTTTGCGGCTCGGGGGAATTTACGGCCCTGGGCGGACCC GGCTCATCGACCAGGTCCGCAGCGGAGCGGCGGTTGTCCCGGACGAGCCGCGCTACACGAACCGGATCCAC CGGGACGACGCAGCAGCGGCCATAGTCCATCTGGCTTCCATGGACTCCATGCCTGCTCCGGTATATGTCGGT GTGGACAACGATCCCGCCGATCTCAGCGACGTCCTTCGTTTCCTGGCCGCCGAAATGGGCTGCCCGGAACC GCGGACGGGCCCTGCGGGGGAAGCGAGGGGCGGGAACAAACGCTGCAGCAATGCCCTGCTCCGCAGCACG GGATTCGACTTTGCCTACCCCTCCTTCCGAGAGGGCTACCGCGACATCCTGGCTGGTACCGGGGTGCGACAC CCGTAG
Opción 2: Node 2, posición (136323 – 134791)
AGTAGAGCCTTCCGCTGAGGCCCTTCGGGAAGAAAATGGCCCGCTGCCGGTAGCGGCTGCCCGTGCCGTCG GGCTCCACGGACAGTTCTAGCCAGGCGCGTCCGGGGGCGCGCATCTCAGCCCGCAGACGCAGCAGTCTTCC GCGCTCGATCCGTTCCACGCGCCACCAGTCCACCACCTCGCCGGAGGCGAGGTTGCCGGGGTGCCGGCGTC CCCGCAGGAGCCCCGCCCCGCCGGTGAGCTTGTCCAGCCAGCCCCGCACCTGCCACGCGAGGGGCAGCGAA TACCAGCCGTTCCGGCCGCCGATGCCCTCAATGATGGTCCACACATGGGCAGGATCGACGTCCCCATGGAA GGTCCGCTCGTCCACGAAGACCGTGTGGCCGGCCCAGTCCGGATCGCTGGGCAGGGGATCGGCGTCGGCCC CGGCACTGGCCCAGGTGGTCTCCACCTGGCCGTCCCGCTCCTTGCCCAGGGCCAAGGCCACCGCACGCCGG TACGGAGTCAGGCCGCCCTCAGGCACGGGAATGAACGAATCGATGTCGTGTTCCCGGGAGACGGCATCGTG CTGCAGTGACTGGACGAGCGGCAGCGACATGGACAGCGGGATGGGCGTGGTCAGGGCCACCCACATTCCG GCGAGCTTGGGGGCGGGAATGGGCAGGGCGAGCACCAGGCGGTGCGGCAGGCCGGCTTCGGCGGCGTACT CCTTCATCATCCCTGCGTAGCTGAGCACCTGCCGGCAGCCGATGTCGAACGTGCGGTTGATCTCCCCCAGCA GGGACGCGGCACCCACGAGGTAATACAGCACGTCCCGGACGGCGATGGCTTCGATTTTGTTGCGGACCCAG CTGGGCGCCGGCATCACGGGGAGGGCTTCTGACAGGTGCCGGATCATCTCGAACGAAGCGGATCCCGAACC GATGACCACGCCGGCCTGGAAAACCACCGCGTCCACGGGGCTGTCCAGGAACACCTTGCCGACGGCCTCCC GGGAGCGCATATGGGTGGACAGTTCCACGTTGGAGGGGTGCAGGCCGCCCAGGTAAACAATCCGGCTGACT CCTGCCTTGGCCGCTGCCTGCGCGGCGGTCTCCGCCATGGCTTTTTCCTTGGTTTCAAAGCCAGCGCCGGCA GCCATGGAATGGACGAGGTAGTACAGCACGTCGACCCCTGCCAGCGCTGCCTGCAGCGCGCCGCCGTCGTC GAGGCTGCTCTGGACCACCTCGACCTCGTCCAGCCAGGGCACGCCGGCTATCTTGGCCGGTGTGCGGACCA GGACCTTGACGGTGTGGCCTGCCTCCAGGAGCCGCGGCACCAGGCGGCCGCCGATGTAGCCGGTGGCGCCC GTCACCAGCACGGTGCGCGCGCCGCGGGATGTGCCGGGGATGGGGGTGTCCCCCGGACTAGTGGTTTCGCT CAT
