Relaciones evolutivas en la subtribu Espeletiineae Cuatrec. utilizando secuencias de cloroplasto, ejemplo de un radiación de páramo

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(1)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias Departamento de Ciencias Biológicas. Rela ciones evoluti vas en la subtri bu Espeletiineae Cua trec. utiliza ndo secuencias de cloroplasto, ejemplo de una radia ción de pá ramo. Tesis para optar al título deBiologa. María Pinilla Vargas 200522023 Santiago Madriñán Restrepo Depa rtamento de Ciencias Biológi cas, Uni versidad de los Andes Bogotá, 2011.

(2) Resumen La familia As tera ceae es la más di versa de las Angi ospermas . Su ori gen se ha da tado en el Eoceno temprano por regis tros palinológicos. Dentro de es ta familia se encuentra la subtri bu Espeletiinae que tiene cerca de 143 especies y subespecies en 8 géneros que ocupan a ni vel alti tudinal desde los 2000m.s .n.m en adelante, incluyendo el bosque al to‐andino, el subpá ramo, y pá ramo hasta cerca de los 4800 m.s .n.m. Los pá ramos son sistemas montanos típicos de los Andes del norte que ocurren a pa rti r de los 3800 ms nm que surgieron en el Pleistoceno y es tuvieron sujetos a fluctua ciones alti tudinales a causa de las gla ciaci ones . Pa ra es te tra bajo se utiliza ron regi ones del cl oroplas to (matK, trnF, ndhD, ndhF, trnLrpl32, rpl16, petD, ndhCtrnV, trnG3, ycf6psbM, rpoBtrnV, trnGtrnG2G, rps16) y secuencias de NCBI pa ra di ferentes especies dentro de las As tera ceae. Se cal cul ó un reloj molecular pa ra la familia y se realiza ron análisis filógenéti cos pa ra las secuencias sepa radas y concatenadas. Las regiones del cl oroplas to por sepa rado no son útiles pa ra la determina ción de las rela ciones entre la subtribu. En cuanto a todas las regiones conca tenadas, l os resul tados tampoco permi ten desci fra r cla ramente las rela ciones entre el grupo pero si di viden a la subtri bu en dos clados pri ncipales uno con especies de Venezuela y el nor‐oriente de Colombia y otro con especies del centro y sur de Colombia hasta el Ecuador. La edad es timada del grupo son 4.66 millones de años atrás .. 2.

(3) Introducción La subtribu La fa milia As tera ceae es la más di versa de las Angiospermas en términos de especies, géneros y dis tribución más a mplia. El ori gen de es ta familia se ha da tado en el Eoceno temprano, cerca de 50 millones de años a trás , basándose en el registro fósil de dis tintas pa rtes del hemisferi o sur [1]. Dentro de es ta familia, en la tribu Heliantheae, se encuentra la subtri bu Espeletiinae que tiene cerca de 143 especies y subespecies en 8 géneros , distribuidos en un á rea de 1700 km2 desde el norte de Ecuador hasta la montaña li toral de El Ávila en Venezuela [2]. Es ta subtri bu está compues ta por los géneros : Ruilopezia, Libanothamnus, Paramiflos, Carramboa, Coespeletia , Espeletia, Espeletiopsis y Tamania, es te últi mo siendo monotípico. En es tudios anteriores se ha confi rmado la monofilia de la subtribu utilizando el ma rcador nuclear ITS y se estableció que su grupo hermano es el género Ichthyothere [3]. Los géneros Carramboa y Coespeletia son completa mente endémicos de la cordillera de Mérida en los Andes venezolanos , Ruilopezia es esencialmente endémico de es te sitio, con excepción de una de sus 24 especies que apa rece fuera del rango. Libanothamnus se encuentra en Venezuela pero ha radiado a los montañas del norte de Colombia en el pá ra mo de Ta má . Espeletiopsis se distribuye en su ma yor pa rte a lo largo de la cordillera. 3.

(4) Oriental colombiana y Espeletia está ampliamente distribuido por Colombia y el norte de Ecuador. El género monotípico Tamania es tá res tringido al pá ra mo de Tamá [2]. Entre la subtribu se distinguen dos grupos morfológi cos principales, los a rbores centes como Carramboa, Libanothamnus y Tamania y las cauli rosulas como Ruilopezia, Coespeletia, Espeletiopsis, Espeletia y Paramiflos. Los páramos A ni vel al ti tudinal , es tas plantas ocupan desde l os 2000m.s .n.m en a delante, i ncluyendo el bosque al to‐andino, el subpá ramo, y pá ramo has ta cerca de los 4800 m.s .n.m. Los pára mos son sis temas montanos típi cos de los Andes del norte que ocurren a pa rti r de los 3800 msnm. Estos ecosistemas. apa recieron en el Pleistoceno, tras el. levanta miento final de los Andes entre 2 a 4 millones de años a trás y han es tado sujetos a las fluctua ciones climá ti cas resultantes de las os cilaciones entre periodos gla ciales e interglaciales [4]. Debido a estas fluctuaciones, el rango al ti tudinal del pá ramo a va riado, ocupando franjas más bajas en las montañas y por lo tanto un á rea ma yor. Es to permi tió que exis tiera conecti vi dad entre poblaciones a ctualmente sepa radas entre s í y que los rangos actuales fuera n coloni zados siguiendo el mismo pa trón de las islas oceáni cas. Es te fenómeno ha permi tido explica r la gran cantidad de endemismos presentes en los pá ra mos que se han producido por el aislamiento de las poblaciones y la gran cantidad de ni chos disponibles tras el úl timo má ximo glacial [5].. 4.

(5) El cloroplasto El cloroplas to se ha convertido en una de las pri ncipales regiones utili zadas pa ra inferi r filogenias de plantas , dada su fá cil mani pulación y menor esfuerzo en su secuencia ción[6]. Por ejemplo, las regiones rbcL y matK han sido propues tas por el consorcio de códi gos de ba rras de la vida cómo las más idóneas pa ra plantas [7]. Las regiones no codifi cantes se han propues to como las más útiles a ni veles ta xonómicos ba jos , dado que son más propi cios a va ria r y por lo tanto proveen más cantidad de ca ra cteres informa ti vos pa ra pa rsimonia por secuencia . Pa ra grupos de plantas de ra diaciones muy recientes como es el caso de la subtri bu Espeletiinae ha sido pa rti cula rmente difícil genera r sufi ciente señal filogenéti ca para es tima r las relaciones evoluti vas incluso en secuencias de rá pida evolución [8]. Dentro del cloroplasto, se han propuesto va rias regiones como efi cientes para elabora r filogenias por el número de ca ra cteres informa ti vos , entre estas se encuentran rps 16, rpl 16, trnG, rpoB‐trnC, las cuales se utiliza ron en este es tudio [6]. El objeti vo de es te tra bajo es reconstrui r las rela ciones intra‐subtribu utilizando la informa ción brindada por el cloroplasto, mediante la cual se puedan establecer correctamente los lími tes de cada género que la compone. Por otra pa rte se pretende realiza r un reloj molecula r pa ra hallar la fecha de la di vergencia de es ta subtri bu y compa ra rla con la forma ción de los pá ramos.. 5.

(6) Metodología Regiones del cloroplasto Se obtuvieron las secuencias de 12 regiones del cloroplasto del traba jo de tesis de maes tría de Adriana Sánchez y de doctorado de Mauri cio Dia zgra nados . Entre regiones se encontra ban: matK, trnF, ndhD, ndhF, trnLrpl32, rpl16, petD, ndhCtrnV, trnG3, ycf6psbM, rpoBtrnV, trnGtrnG2G, rps16. La región ndhCtrnV se omi tió de los análisis ya que tenia muy ba ja calidad. Se obtuvieron es tadísti cos de cada secuencia como su longi tud, porcenta je de va ria ción y ca ra cteres informa ti vos de pa rsimonia utilizando PAUP y Geneious [9,10]. Se revisaron las secuencias pa ra fil tra rlas por calidad y se clasifi ca ron según las especies traba jadas con cada región del cloroplasto (Ver Anexo1.). Se alinearon las secuencias por región utilizando el algori tmo del programa MUSCLE en Geneious. Se realiza ron análisis de má xi ma pa rsimonia para cada una de estas regiones utilizando el programa PAUP. Se obtuvieron a demás los índi ces de consistencia y retención pa ra los alineamientos de las regiones y se hi zo un Boots trap de 1000 repetici ones para obtener el soporte de las ramas . Se obtuvo el consenso es tri cto. Pos teriormente se usó el programa Ga rli para cal cula r las filogenias de má xima verosimilitud [11]. Se realiza ron 1000 repeti ciones Bootstra p pa ra obtener el soporte. Las regiones rps16 y trnG3 se exa mina ron ta mbién mediante el servidor online del progra ma Ra xML pa ra obtener los mejores á rboles con su repecti vo s oporte [12].. 6.

(7) Se utilizó el progra ma FigTree pa ra revisa r y edi ta r los á rboles obtenidos por estos métodos[13]. Se hi cieron redes de hapl otipos pa ra las regiones pa ra poder evalua r mejor la informa ción contenida en las secuencias usando el programa Splits Tree [14]. Concatenación de las regiones Por otra pa rte se realizó un gran alineamiento compa rtido de todas las especies que tuviera n al menos la mi tad de las regiones secuenciadas . Especies que solo se habían traba jado pa ra una región se excluyeron. Se obtuvieron los modelos de sus titución pa ra cada región utiliza ndo Modeltes t pa ra poder utiliza rlos en el análisis de Inferencia Ba yesiana [15]. El alineamiento se conca tenó en el progra ma Geneious y se realizó un análisis de má xi ma verosimili tud usando Ra xML con pa rti ciones , de Inferencia Ba yesiana con l os modelos pa ra ca da región en Mr. Ba yes y de Má xi ma Pa rsimonia con Paup en el servi dor del Depa rta mento de Ciencias Biol ógi cas [16]. Pa ra el análisis de má xima pa rsimonia del alineamiento conca tenado se hi cieron 1000 répli cas boots trap y se obtuvo el consenso estri cto. Los á rboles obtenidos se revisa ron y edi ta ron usando el programa Fi gtree .. 7.

(8) Datación del origen de la subtribu Se obtuvieron las secuencias de 121 especies de las subfamilias Asteroideae, Barnadesioideae,Carduoideae,Mutisioideae de las regiones ITS, 5.8S, ITS2 de NCBI (ver Anexo2) Se utilizó como outgroup pa ra el análisis de má xima verosimili tud a 5 especies de la fa milia Calyceraceae, siguiendo el concepto de APweb [17]. Estas secuencias también se obtuvieron de Genbank. Pa rte de las secuencias de la subtribu Espeletiineae se obtuvieron del tra bajo de maestría de Adriana Sánchez. Pos teriormente se alinea ron es tas secuencias en Geneious usando el algori tmo MUSCLE. Se cal culó un á rbol de má xi ma verosimili tud en Ra xml pa ra comproba r que las relaci ones entre las subfa milias eran las mismas que las reportadas por APweb. Pos teriormente se realizó un reloj molecula r en el que se usaron como puntos de calibra ción el fósil des cri to por Ba rreda, el cual tiene una edad de 47.5 m.a y fue ubi cado en la di vergencia entre la subfa milia Ba rnadesioideae y el res to de la familia y la tasa de ‐9 sus tituciones por si tio por año×10 de 0.05 tomada de Ka y et al. 2006 [1, 18]. Utilizando. BEAUti se generó el a rchi vo xml usando el proceso de especiación de Yule, un reloj rela jado lognormal, las respecti vas calibra ciones y 40 millones de genera ciones que posteri ormente se corri ó en BEAST [19]. Los á rboles fueron a rreglados en TreeAnotator, se revisaron las autocorrelaciones en Tra cer y posteri ormente se edi ta ron en Fi gtTree [13].. 8.

(9) Resultados Regiones del cloroplasto En cuanto a la va ria ción de las secuencias se encontró que la región con ma yor porcenta je de va riación y ma yor número de ca ra cteres informa ti vos pa ra pa rsimonia fue la región rps16, seguido de la región trnG3.(Gráfi ca 1.). En general se obtuvo muy poca va ria ción y ca ra cteres informati vos para las regiones traba jadas con respecto a los resul tados obtenidos con otros ta xa como Magnolia o Prunus. Análisis de parsimonia máxima: En general pa ra las once regiones se obtuvieron muchas politomías en los á rboles de consenso es tri cto. Al gunos clados se ma ntienen pa ra dos o más regiones del cl oroplas to como Carramboa trujillensis‐ Ruilopezia vergarae, Espeletia schultzii‐Espeletia batata, Espeletia killipii‐Espeletia grandiflora, Espeletia estanislana‐Espeletiopsis santanderensis, Espeletia barclayana‐Espeletia incana. Se encontró muy poca defini ción de las rela ciones dentro de la subtribu utilizando esta metodología. Análisis de verosimilitud máxima: Los á rboles obtenidos por verosimilitud má xima también presentan muchas poli tomías . Ha y al gunos clados que se compa rten en dos o más regiones como Espeletia schultzii ‐ Espeletia batata, Espeletia estanislana – Espeletiopsis santanderensis, Carramboa. 9.

(10) trujillensis – Ruilopezia vergarae, Espeletia grandiflora – Espeletia killipii, Espeletia barclayana – Espeletia incana. Redes de haplotipos: Las redes obtenidas mos tra ron que no ha y mucha va ria ción en las secuencias pa ra todas las regiones ya que se encuentran muchas “intera cci ones ” entre ta xa que no pueden deberse a hibrida ción porque el cloroplasto se hereda por la l ínea ma terna úni camente (ver Anexo).. Porcentaje de variación por región en Espeletiinae 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0. Grafica 1. Porcentaje de variación para cada una de las 11 regiones secuenciadas de cloroplasto.. 10.

(11) Regiones concatenadas Análisis de parsimonia máxima: Es te á rbol , dado que la recons trucción de la filogenia se realizó utilizando el consenso es tri cto no proporcionó ma yor informa ción sobre las rela ciones entre los géneros y especies de la subtribu (Árbol 1.) Análisis de verosimilitud máxima: En el á rbol obtenido se dis tinguen dos clados pri ncipales, uno venezolano y otro colombiano. El clado más basal es el venezolano lo cual sugiere que la radia ción de estas plantas comenzó en el norte y se fue di versifi cando ha cia el sur. Por otra pa rte, no se obtiene sufi ciente resolución pa ra resol ver las rela ciones dentro de es tos dos grupos . Se ha ce evidente que los géneros que componen es ta subtri bu no son monofiléti cos (Árbol 2). Analisis de Inferencia Bayesiana: Es te á rbol presenta el mismo patrón de dos clados principales, el colombiano y el venezolano en la base. Los géneros son pa ra filéti cos y las relaciones no son claras , no habiendo sufi ciente soporte pa ra da r conclusiones a cerca de la es tructura de la subtribu (Árbol 3.) Reloj Molecular: La filogenia de má xima simili tud refleja las rela ciones obtenidas anteriormente pa ra las Asteraceae y publi cadas en el APweb, donde la subfamilia Barnadesioideae se ubi ca en. 11.

(12) la base del á rbol . Todas las subfamilias apa recen como monofiléti cas , la subtribu Espeletiinae ta mbién y se encuentra dentro de la subfamilia Asteroideae. Se obtuvo buen soporte pa ra la ma yoría de los clados (Árbol 4) Se obtuvo tras la calibra ción una fecha pa ra la subtri bu Espeletiinae de 4.66 millones de años a trás (Árbol 5). Se encontra ron dos clados internos con fechas de 3.7 y 3.4 millones de años . Se puede observa r que los géneros dentro de la subtribu no son monofiléti cos . Se encontra ron fechas pa ra la di vergencia de Espeletia killipi y Espeletia grandiflora de 202000 años a trás, pa ra Espeletiopsis caldasii y Espeletiopsis corymbosa de 108200 años a trás y para Carramboa trujilloii y Carramboa littleii de 2,096 m.a .a. La fa milia Asteraceae tiene una edad esti mada por la calibraci ón de 49.2 maa .. 12.

(13) Imagen 1. Árbol de parsimonia máxima para las regiones concatenadas con soporte bootstrap.. 13.

(14) Imagen 2. Árbol de máxima verosimilitud que muestra los dos clados principales: el venezolano y el colombiano. Repeticiones bootstrap=1000.. 14.

(15) Imagen 3. Árbol consenso de inferencia bayesiana con las probabilidades posteriores marcadas sobre las ramas. 5 millones de generaciones. 15.

(16) Imagen 4. Árbol de verosimilitud máxima para a región ITS, 5.8S y ITS 2 de la familia Asteraceae. En gris claro la subfamilia Barnadesioideae, en gris medio la subfamilia Carduoideae, en gris oscuro la subfamilia Mutisioideae y en lila la subfamilia Asteroideae con la subtribu Espeletiinae resaltada. El soporte bootstrap se encuentra anotado en las ramas. 16.

(17) Imagen 5. Filogenia calibrada de la familia Asteraceae. Los valores de probabilidad posterior se encuentran mapeados en colores sobre el árbol de la siguiente manera: Rojo de 0.9 a 1, rojo oscuro de 0.7 a 0.9, negro 0.5 a 0.7, azul inferiores a 0.5. Las edades se encuentran anotadas en los nodos.. Discusión Las regiones del cloroplas to por sepa rado no son útiles pa ra la determina ción de las rela ciones entre la subtribu. En la grá fi ca1. se puede observa r que la va ria ción en las regiones es muy poca, si se compa ra con los val ores encontrados por Sha w et. al. en el 2005 en es tas mismas regi ones para otros géneros a l o la rgo de las angiospermas .. 17.

(18) Es te patrón de ba ja va riabilidad en las secuencias se ha encontrado en otros grupos como Diplostephium, Lupinus y Halenia de los pá ramos [20,21,22 y Dendrosenecio del monte Kenia [23]. En cuanto a todas las regiones conca tenadas, los resul tados ta mpoco permi ten desci fra r cla ramente las rela ciones entre el grupo pero si di viden a la subtribu en dos clados pri ncipales uno con especies de Venezuela y el nor‐oriente de Colombia y otro con especies del centro y s ur de Colombia hasta el Ecuador. Es ta metodología presenta mejores resul tados que las secuencias del cloroplasto evaluadas una a una aunque toda vía apa recen muchas politomías y rela ciones no resuel tas con sufi ciente soporte es tadísti co por lo que se hace evi dente que es necesa rio combina rlas con secuencias del núcleo o ma rca dores de AFLPs . Se ha hipotetizado que los procesos de forma ción de es tos sis temas de al ta monta ña como son los pá ramos o el Monte Kenia son los responsables de es te patrón de poca va ria ción en el cl oroplas to[23]. Las fluctuaciones al titudinales debidas a las glacia ciones pudieron produci r cuellos de botella en las pobla ciones de estas plantas lo cual expli ca ría la poca va ria ción en las secuencias. Dado que el cloroplasto se hereda por pa rte materna, es te no es tá sujeto a recombina ción y por lo tanto se ha ce más evidente es te proceso que en regiones del núcleo. Por otra pa rte, la corta edad del grupo, es timada en el á rbol 5 como 4.66 millones de años a trás puede ser también culpable de que no se ha ya a cumulado sufi ciente va ria ción en es tas secuencias.. 18.

(19) Es ta edad es un poco ma yor a la eda d del pá ra mo, la cual es tá esti mada en un ra ngo de 2 a 4 m.a.a . [3]. Es to sugiere que la di versifi ca ción de es tas plantas empezó a una al tura un poco menor, como el bosque al to andino y se ven ejemplos de es to en los géneros de rango alti tudinal más ba jo como Ca rra mboa y Libanothamnus, que además tienen una morfología a rbores cente [2]. En otros es tudi os se han encontra do edades simila res para clados andinos . Por ejemplo pa ra el nodo andi no del género Lupinus se es timó una edad de 1.47 m.a.a [21].Pa ra es te género a demás fue también muy difícil determina r las relaci ones dentro del clado andino dada la poca informa ción presente en las secuencias. Las especies de pá ramo del género Oreobolus col oniza ron este nuevo hábi ta t dentro de un ra ngo de edad de 2 a 3 m.a .a [24] y por otra pa rte, los miembros de pá ramo de la fa milia Valeriana ceae, específica mente del género Valeriana tienen una eda d de 3.47 m.a .a .[25]. Se ha hecho evidente que el levantamiento de l os Andes tuvo gra n influencia en la di versi fi cación de las plantas del Neotrópi co, siendo causa de la gra n di versidad presente en es ta región. Su apa ri ción cambió radi calmente la historia del conti nente sura merica no y brindó a las plantas una gran cantidad de nuevos ni chos por explota r [26]. Los pá ramos son pa rte de es tas nuevas oportunidades de di versifi ca ción y por l o tanto se puede conclui r que la radia ción de la subtri bu Espeletiinae fue moldeada por es te evento geológi co. Las fluctuaci ones en la al ti tud debidas a las glacia ciones , permi tieron. 19.

(20) la dispersión de es tas especies desde Venezuela hasta Colombia y el norte de Ecuador y la poca informa ción presente en el cloroplasto dela ta lo reciente de es te proceso.. Referencias [1] Ba rreda , V. D, L. Palazzesi,M. C. Tellería ,L. Ka tinas,J. V. Cris ci ,2,3,5 K. Bremer,6 M. G. Passalia,R. Corsolini ,R. Rodríguez Bri zuela ,F. Bechis. 2010. Eocene Pa ta gonia Fossils of the Dais y Fa mil y. Science 2010 329:1621 [2] Cua trecasas, José. 2008. Manus cri to de José Cutrecasas úl tima versión (31 ma rzo 2008). Por publi ca r [3] Raus cher, J. T. 2002. Molecular phyl ogeneti cs of the Espeletia complex (Astera ceae): evidence from nrDNA ITS sequences on the closest relati ves of an Andean adapti ve radia tion. Ameri can Journal of Botany 89(7): 1074‐1084. [4] Van der Ha mmen, T.1974. The Pleistocene changes of vegetation and clima te in tropi cal South Ameri ca. Journal of Bi ogeography (1947)1:3‐26 [5] Hooghiemstra , H & T. Van der Hammen. 2004. Qua terna ry Ice‐Age dyna mi cs in the Col ombian Andes : developing an unders tanding of our lega cy. Philosophical Transa ctions of the Royal Society of London. Series B: Bi ologi cal Sciences. 359, 1442:173‐181. 20.

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(24) Anexos Anexo 1. Imagen 6. Red de haplotipos para la región rpl16 del cloroplasto.. 24.

(25) Imagen 7. Árbol de parsimonia máxima para la región rpl 16. Consenso estricto de 46 árboles encontrados.. 25.

(26) Imagen 8. Árbol de verosimilitud máxima de la región rps16. Repeticiones bootstrap 100.. 26.

(27) Anexo 2 Números de registro de las secuencias utilizadas en Genbank Nombre GB AF465904 AF465903 AF465902 AF465901 AF465900 AF465899 AF465898 AF465897 AF465896 AF465895 AF465894 AF465893 AF465892 AF465891 AF465886 AF465885 AF465884 AF465883 AF465882 AF465881 AF465880 AF465879 AF465875 AF465868 AF465866 AF465865 AF465864 AF465863 AF465862 AF465861 AF465860 AF465857 AF465856 AF465855 AF465854 AF465849 AF465848. Especie y región Paramiflos glandulosa ITS Ruilopezia atropurpurea ITS Ruilopezia marcescens ITS Ruilopezia ruizii ITS Rumfordia floribunda ITS Rumfordia guatemalens is ITS Rumfordia guatemalens is ITS Rumfordia pe nnine rvis ITS Rumfordia revealii ITS Smallanthus connatus ITS Smallanthus fruticosus ITS Smallanthus je lskii ITS Smallanthus maculatus ITS Smallanthus meridensis ITS Smallanthus microcephalus ITS Smallanthus oaxacanus Smallanthus pyramidalis Smallanthus quiche nsis Smallanthus riparius Smallanthus siegesbeckius Smallanthus sonchifolius Smallanthus uvedalius Tamania chardonii Carramboa littlei Carramboa trujillensis Espeletia pycnophylla Espeletia schultz ii Espeletiops is jimenez‐quesadae Espeletiops is pannosa Ichthyothere agrestis Ichthyothere granville i Ichthyothere latifolia Ichthyothere macdanie lii Ichthyothere rufa Ichthyothere scandens Ichthyothere te rminalis Libanothamnus humbertii Espeletiops is santande rensis Coespeletia moritziana ITS Coespeletia spica ta ITS Espeletiops is angustifolia Espeletiops is caldassi Espeletia killipii Espeletia grandiflora Espeletia anglicana Espeletia boyacensis. Autor Jason T. Rausche r. Adriana Sánchez A.. 27.

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