Las enzimas como herramientas. Dr. José Luis Cárdenas López

Las enzimas como herramientas analíticas

analíticas

Dr. José Luis Cárdenas López

Las enzimas como herramientas analíticas

• Enzimas endógenas

• Enzimas exógenas

• Enzimas exógenas

• Desarrollo de biosensores

Enzimas exógenas usadas para monitorear calidad de pescado

Enzima Medición Referencia

5’-Nucleotidasa, nucleosido fosforliasa, xantina oxidasa

K-value

(Lou, 1998)

Alcohol dehidrogenasa Etanol en pescado enlatado

(Gill, 1990)

Diamina oxidasa, peroxidasa Histamina (Lopez-Sabater et al., 1993)

ELISA Identificación de

especies

(Carrera, 1996)

Glutamato dehidrogenasa Amoniaco

(Huss, 1995)

Glutamato dehidrogenasa Amoniaco

(Huss, 1995)

Octopina dehidrogenasa, piruvato oxidasa

Frescura de Scallops

(Shin et al., 1998)

Purina nucleosido fosforilasa, xantina oxidasa

ATPasa

(Cheun et al., 1996)

Putrescina oxidasa Poliaminas

(Chemnitius et al., 1992)

Trimetillamine dehidrogenasa Trimetilamina

(Wong and Gill, 1987)

Ureasa Urea

(Sheppard et al., 1996)

Xantina oxidasa Hipoxantina

(Shen et al., 1996)

Análisis Principio Ventajas Desventajas Referencia

Hx · enzimas (xantina

oxidasa, XO)

inmovilizadas en una

· simple de usar tira de ensayo

· rápido

· simple de usar fuera del laboratorio

· semicuantitativo

· solamente puede medir Hx (estados finales del deterioro)

Jahns et al. (1976)

Hx, Ino · ensayo en tira, con enzimas inmovilizadas

· rápido

· simple de usar fuera del laboratorio

· semicuantitativo

· baja reproducibilidad

· limitado a Hx e Ino (estados finales del deterioro)

Ehira et al.(1986)

Relacionadas con degradación de nucleótidos

IMP, Ino, Hx · enzima cubierta con electrodo de oxígeno

· rápido

· exacto

· más complicado y consume más tiempo que la tecnología de la prueba mediante tira

Karube et al.(1984)

Indice-K · ensayo de enzima acoplado "KV-101 Medidor de Frescura"

· rápido

· resultados

comparables a HPLC

· deben adquirirse enzimas y reactivos

· ¿costo?

· disponible

comercialmente de Orienta Electric, Niiza Saitama 352, Japón Indice-K · enzima cubierta con

electrodo de oxígeno

"Microfresh"

· rápido

· resultados

comparables a HPLC

· ¿costo? · disponible

comercialmente de Pegasus Instruments, Agincourt, ON, Canadá

• El etanol ha sido usado por muchos años como un indicador objetivo para la calidad de los productos pesqueros

• Puede ser obtenido a partir de carbohidratos por fermentación anaeróbica

(glucólisis), y/o deaminación y decarboxilación de aminoácidos como la alanina, es un metabolito común a una gran variedad de bacterias

Etanol

• Ha sido usado para medir objetivamente la calidad de una variedad de pescados, incluyendo atún enlatado

• El medio más simple y confiable para medir etanol en el tejido de pescado es el uso del equipo para la prueba de enzima comercial, disponible de Boehringer Mannheim (Alemania) o de Diagnostic Chemicals (Charlottetown, P.E.I, Canadá)

• La ventaja de emplear etanol como indicador de deterioro es su estabilidad al calor (a pesar de ser volátil) y puede ser usado para evaluar la calidad de

productos pesqueros enlatados

Las aminas biogénicas: histamina, putrescina y cadaverina

H

N-(CH

)

-NH

n=4: Putrescine; n=5: Cadaverina

u

Formada por la biodegradación de los aminoácidos ornitina y lisina por la acción de bacterias de putrefacción

Sobresaturan las enzimas degradantes de Histamina

u

Formada por la decarboxilación de histidina catalizada por las enzimas de los microorganismos

N N H

NH 2

u

Sobresaturan las enzimas degradantes de la histamina, realzando el efecto tóxico de la histamina

los microorganismos

u

Estimula la contracción y relajación del músculo liso

u

Estimula neuronas sensoras y motoras

u

Controla la secreción de ácidos

gástricos

amina oxidasa de cobre (AO)

u

Fuentes biológicas : bacterias, hongos, plantas, animales

u

Funciones biológicas: involucradas enc crecimiento celular, proliferación and diferenciación

u

Cofactores:

Polímero Redox Activo

(PVI

-dmeOs)

N N N

N

a b

O

N H

Reacción: R-CH

-NH

+ H

O + O

→ R-CHO + NH

+ H

O

Topa quinona (TPQ) Cobre

Os N

N N

Cl N

2+/ 3+

O O

H O & Cu(II)

AO

E_appl.= +200 mV vs. Ag/AgCl

Electrode

2e^-

N H

N

C H

C H

NH

NH

Histamine

Mecanismo de trabajo para los electrodos (monoenzimática)

AO

N H

N

C H

CHO

O H

Imidazoleacetaldehyde

Mecanismo de trabajo para los electrodos (BIenzimática)

NH

N CH₂ C H₂

N

H₂ H₂O

Histamine

AO_ox (TOPA -native)

H₂O₂

O H₂

HRP_red

HRP_ox

(Fe³⁺- native)

(Fe⁴⁺ = O, P⁺ inactive)

2e^- E_appl.= -50 mV

vs. Ag/AgCl

Electrode

2 Os²⁺

2 Os³⁺

2e^-

NH

N CH₂ OHC

NH₃

Imidazoleacetaldehyde

AO_red (TOPA -inactive)

O₂

(Fe = O, P inactive)

Electrode type C Electrode type D

No Os^2+/3+

Muestras de pescado- (turbot)

15 20 25 30

fish kept at -20°C fish kept at 25°C

g h is ta m in e/ k g f is h

0 5 10

0 2 4 6 8 10 12

•Contenido de histamina de pescado turbot en dos diferentes temperaturas (-20 y 25°C) analizado por el método de electródo bi-enzimático

g h is ta m in e/ k g f is h

Days

AO_ox AO_red

Electrode

H

O

O

N H

N

C H

C H

NH

N H O

H

NH

Histamine

+

+

Oxidación del producto de la rx de histamina

AO_ox

E_appl.= +200 mV vs. Ag/AgCl

Electrode

2e^-

H

O

N

C H

CHO NH

Imidazoleacetaldehyde

N H

N

C H

COOH Imidazoleacetic acid

+

Putrescina y cadaverina forman

compuestos cíclicos - ¡no se pueden oxidar más!

NH

NH

+ O

+ H

O AO

N

+ H

O

+ NH

Putrescine

1-Pyrroline - H

O NH

O

NH

NH

+ O

+ H

O

AO

N

+ H

O

+ NH

Cadaverine

1-Piperideine - H

O O

NH

ELISA para identificar

especies

Octopina deshidrogenasa para

medir frescura en escalopas

(NH ₂ ) ₂ CO + H ₂ O → CO ₂ + 2NH ₃

Ureasa

• Usada para medir amoníaco

• Amoníaco criterio de calidad microbiana

• Amoníaco criterio de calidad microbiana (tardía) de PM

• En A. clínicos la actividad de ureasa puede ser

indicadora de muchas condiciones patológicas

(piedras en vías urinarias, úlceras y males del

hígado)

Ureasa

• Hay muchos métodos para inmovilizar ureasa y estimar la urea en muestras de pescado

• Paper usando conjugado de fulereno-ureasa del 2013 en un electrodo potenciométrico del 2013 en un electrodo potenciométrico

– óptico[Kovacs, 2003], amperométric [Rajesh ,

2005; Tiwari, 2009;Kuralai 2006 ], térmico[Fulton, 1980; Xie, 1996] conductométrico[Castillo-Ortega, 2002], and potenciométrico [Ahuja, 2008, 2011;

Chen 2009]

Lo cotidiano

• Enzimas comerciales para medir algún atributo

• Precio $$ y disponibilidad