CAPITUI;O V
BACTERIAS HETEROTROFAS (Continuación)
3. Bacterias anaerobias que necesitan hidrógeno combinado.
BACT^RIAS DESTRUCTORAS DE I,A C^I,UI,OSA:
a) Anaerobias.
b) Aerobias.
c) Termófilas.
d) Desnitrificantes.
3. Bacterias aaaerobias. - No se conoce ninguna bacteria abso- lutamente anaerobia, es decir, que sólo pueda vivir y desarrollarse en total ausencia de oxigeno (pág. i3). I,as anaerobias estrictas parecen estimuladas por la presencia de pequeñas cantidades de osígeno libre, aun cuando pueden vivir en total ausencia de este gas.
I,a primera generación de una bacteria anaerobia, en cultivo, es más sensible a la presencia de oxfgeno que las generaciones siguientes, y dentro de una generación, toleran peor el oxígeno en las primeras edades del cultivo.
McI,eod y Gordon (68) han destacado la incapacidad de producir catalasa de las bacterias anaerobias. 1~n el desarrollo aerobio de las bacterias se forma peróxido de hidrógeno, que sería perjudicial para ellas de no existir la catalasa, que desdobla el peróxido en agua y oxf- geno inactivo. A1 carecer las bacterias anaerobias de la capacidad de formar catalasa, cuando se desarrollan en condiciones aerobias están sometidas a la acción perjudicial del agua oxigenada. ^1 efecto nocivo del aire sobre las bacterias anaerobias en estado vegetativo se hace patente con una exposición de sólo cuarenta minutos, mientras que en las esporas no se manifiesta al cabo de tres horas (2 y 27).
Las bacterias anaerobias intervienen en el suelo en un número con- siderable de importantes procesos, algunos de los que hemos mencio- nado ya, y entre los que merecen destacarse: formación de amoníaco a partir de los proteidos; fijación del nitrógeno atmosférico por bac- terias libres, más iutensa, probablemente (77), que la llevada a cabo por bacterias aerobias, y descomposición de celulosa, peptinas y proteidos.
^l solo carácter de anaerobias no sirve para caracterizar bacterias que difieren tan fundamentalmente en su metabolismo, como las qne obtienen su energía de la celulosa, las que toman su nitrógeno del nitrógeno atmosférico, las que pueden obtener oxígeno de los nitratos
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y sulfatos o las que ocasionan el desprendimiento de olores pesti- lentes de las prote^nas complejas. Mientras que el anhídrido carbó- nico es el gas principal producido por las bacterias aerobias, las anaero- bias se caracterizan por originar diversos gases, tales como el metano y el hidrógeno en la descomposición de los glúcidos; el ácido sulfhí- drico en la reducción de los sulfatos; óxidos de nitrógeno y nitrógeno libre en la reducción de los nitratos; determinadas aminas, hidrógeno sulfurado, nitrógeno y sus ógidos y mercaptanes, como resultantes de la descomposición de los proteidos. Además, las bacterias anaerobias forman ácidos acético, butírico, propiónico, fórmico y láctico, alco- holes etílico y butílico, y en algunos casos, acetona.
De entre los varios sistemas de clasificación de las bacterias anaerobias del suelo, reproducimos el siguiente, propuesto por ^^Vaks-
man (io2): ^
I.-Bacterias que actúan prindpalmente sobre hidratos de carbono:
i. - Bacterias que utilizan ampllamente hidratos de carbono sencillos y almídones como fuentes de energfa, denominadas por varios auto- res sacarolíticas. A este grupo pertenecen las bacterias butíricas clasificadas de ordinario como una sola espede: Bacillus amylo- bacter A. :lfeyer y Bredemann. $stas bacterias descomponen los azúcares, con formadón de áddo butfrico y Rases.
a) Bacterias. fijadoras de nitrógeno: Clostridium pastorianum Wino- gtadsky (Bac, amylobacter van Thieghem, Bac. amylocyme Perdrix, Bac, butyricus Botkin, Granulobacter saccarobuty- ricum Befjeriack, Bac. ordhobutilicus Grimbert, Clostridium americanum Ptiagahefm, Bac. amylobacter A. M. y Bred.), y formas afines encontradas prácticamente como abundantes ea casi todos los auelos. Bste organ{smo o grupo ha sido clasi- ficado por Bergey como Cdostridium butyricum Prazmowsky- y por Lehmann y Newmann, como Bac. pastorianum Wino, gradsky.
b) Bac. wekhii Migula (Bac. aerogenes capsulatus Weleh y Nutall, Bac. per/ringens Veillon y Zuber, Bac, enteritidis sporogenes Kleín). BastondUos cortos, de 4 a 8 µ x i a i,s µ, aíslados o en parejas, inmóvilea, que forman esporas ovales, centrales o escéntrícas, encapsulados. Bncontrada repetidas veces en el suelo y en las aguss residuales.
z. - Bacterias que descomponen los compuestos pécticos.
a) Grupo del Bac. amylobackr, que ineluye al Clostridium pastorianum (ígual que i, a)). I,as formas que ocasionan el enriado del lino han sido descrítas con nombtes diveraos, entre ellos el Plec- tridium de Fribea y Wínogradsky, el Clostridium de Behrens^
el Plectridium pectinovorum de Beijerínck y van Delden.
b) Bac. Jelsineus Carbone. Bastondllos, de o,3 a o,q µ x 3 a g µ, que se preseatan aislados, en pares y en cadenas, móviiea con flageloa perítricos. Esporas ovales, terminales, Gram positivos.
No producen áddo butlrIco en el enriado del lino.
3. - Bacterias qne desrnmponen la celulosa.
a) Bacterias anaerobias que descomponen la celulosa a la temperatu- ra ordinaría. Bntre ellas se encuentran las productoras de hidrógeno y de metano, de Omellansky; el Bac. cellulos^
dissolvans Khouvíne, y otras.
b) Bacterias termófilas: Clostridium thermocellum Víljcen, Fred y Peterson.
II.-Bacteriae que ad:úan prIndpalmente sobre los prótidos.
i. - Pormas fuertemente proteolíticas. •
a) Bac. sporegenes Metdwihoff (Glostridium sporogenes (Metcluii- koff) Bergey y ml). Bacilo mbvil, con flagelos perítricos, Gram posítívo, con extremos redondeados, de 3 a y µ x o,6 a o,8 µ.
Una de las bacterias más fuertemente proteolíticas que se co- nocen. Descompone los prótidos rnn formacidn de gas, enne- gredmiento del medio y producdón de an olor marcado. );as esporas, subterminales, se forman proato. Se encuentra abun- dantemente en el sudo, estiércol, polvo y aguas residuales.
b) Bac. oadamatis maligni Koch ( Vibrion septique Pasteur, Clostri- dium oedematis maligni (Koch) Bergey y col.). E;ncoatrado en el intestino del hombre y en el suelo. Descompoae los pró- tidos con formaddn abuadante de gas, sin ennegrecer el medio.
c) Bac. putrificus Bienstodc (Clostridium puirificus Bergey y col.).
Badlo rnn flagelos perítricos, móvil. F'orma esporas ovales, graades, termínales. Posee propíedades saca.rolíticas débiles y descompone fuertemente los prótidos, con ennegredmiento del medio y desprendimiento de olor fétido. La leche es dige- rida gradualmente, sin coagulacíóa rápida.
d) Bac. histolytticus Weimberg y Seguin (Clostridium histolytícum Bergey y col.). Bad1o de 3 a 5 µ x o,s a o,^ µ, móvil con fla- gelos perftricos, que se presentan aislados o en parejas. Des- compone los prótídos ain desprendimiento de gases, ennegre- ce el medio y posee olor nauseabundo. Este organísmo ha sido aislado del suelo por Peterson y Hall.
e) Bac, botultinus van Ermengen (Clostridium botulinum Bergey y rnl.). Badlos gruesos, con estremos redondeados y esporas ovales subterminales. Descompone los prótidos con forma- ddn de gasea y ennegredmiento del medio. >~I habitat natural de esta espede está eztendido por todo el mundo, tanto en los suelos vfrgenes y forestales como en loa cultivados.
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s. - Organiemoe dEbilmeate proteolitícoa.
a) Bac. bifer+westaus Tíeaier ^ Martelly (Clostridium 6iJermc+^taxs (Tisaíer y Martelly) Bergey y col.). Badlos de 5 a 6 µ x o,8 a r µ, inmóvilea, preaeatQndade aialadoa o en cadenas wrtaa.
iyaporas ovalea, centralea. I.os baatondllos no engrnesan al esporular. Produce áddo y gas con loa hidratoa de carbono.
Dearnmpone los prótídoa oon deaprendimíeato gaseoao y en- negredmimto dei medio. Arede desarroUarae hasta loa go^.
b) Bac. t^taxi Nfoolaiet (Closhidium tetani (Níeolaiet) Holland).
Badloe móvíks, oon flageloa perltricos, de 4 a 8 µ x o,4 a o.6 µ, incapaces de ntilizar los hidratos de carbono. Eanegrecen el medio de caltivo. Pasaa al auelo mn el eatiércol, habiendo aido comprobada sn eziatenda m muchas muestraa de auelo.
5e han aislado del ando o de otras fuentes, que pueden in- dícar un habitat m él, bacteríae anaerobfas de eacaso poder pro- teolítico, pero capacea de atacar a diversoa hidratoa de carbono con formadón de gas, q tales como Bac. ckauvei Arloing, Corne- vla y Thomas (Clostridium cáauvei (Arloíng, Cornevin y Thomas) Holland).
III.-Bacterias qne obtienen au ozígeno de sales mineralea.
r. - Bacterias rednctoras de nitratos.
z. - Bacterias reductorss de sulfatos.
I,as bacterias anaerobias pueden llegar a alcanzar en el suelo cifras muy elevadas, del orden de los io millones por gramo de tierra de jardín. 1~1 gran número de bacterias anaerobias que se encuentran en los suelos forestales (de 500.00o a 5 millones por gramo de suelo) merece particular atención, así como la de las fijadoras de nitrógeno anaerobias (de ioo a io.ooo por gramo de suelo). I,as bacterias fija- doras de nitrógeno aerobias, o faltan totalmente en los suelos fores- tales, o están en número muy reducido, lo que prueba (3o y 32) el papel de las bacterias anaerobias para la fijación del nitrógeno atmos- férico en estos suelos.
Bacterias destructoras de la celulosa. - Fstas bacterias han sido objeto de particular atención a causa de que la celulosa es el material orgánico más abundante entre los que recibe el suelo y a que existen bastantes bacterias que pueden desarrollarse utilizando la celulosa como material energético, y algunas son incapaces de emplear otra f uente de energía.
I,as bacterias destructoras de celulosa pueden dividirse en los siguientes cuatro grupos: anaerobias, aerobias, termófilas y desni-
trificantes, de los que el primero parece ser el de mayor importarr- cia (8o y I^3) en los procesos que se llevan a cabo en el suelo.
aJ BACT^RIAS ANAEROBIA5 DE5TRUCTORA5 D^ I.A CEI.UI,OSA. - Al frente de este grupo deben figurar las bacterias, ya clásicas, aisladas por Omeliansky (75) a fines del siglo pasado: Bac. methanigenes I,ehmann y Neumann y Bac. f ossicularum I,ehmann y Neumann, que fueron las primeras bacterias que se demostraron definítivamente capaces de descomponer la celulosa en forma de papel de filtro o de algodón.
Ambos organismos se encuentran en aquellas sitios donde, en condiciones anaerobias, se destruyen tejidos vegetales, por ejemplo, en el esti^rcol o en el cieno de los pantanos y ríos.
Para su aislamiento, Omeliansky empleaba estiércol de caballo 0 cieno del río Neva, inoculados en frascos completamente llenos de un medio que contenía, además de papel de filtro, los siguientes ele- mentos:
Fosfato btpotásico (KfHPOi) ... . . .. . . . i,o gramos.
Sulfato magnésim (b1gS0^ • qH^O) ... . . . . .. . o,s r Sulfato amónico (NH^)^ SO^ ... ... . . . i,o r Carbanato cáldrn (CaCO') ... io,o r Ci,oruro sódico (NaCI) ... . . . Indidos.
Agua destilada ... iooo c. c.
El sulfato amónico puede ser reemplazado por una cantidad igual de fosfato amónico, de peptona o de asparagina.
Los frascos inoculados se incuban a una temperatura de 34^ a 35^.
A1 cabo de unos ocho días empieza el desprendimiento de gases de Ia fermentación, que, al principio, consisten en una mezcla de hidrógeno, metano y anhídrido carbónico; pero que después de varios resiembros en medio nuevo, terminan por contener una mezcla de metano y anhídrido carbónico, en la proporción de 3 a i cuando los cttltivos son jóvenes.
^n esta fase, cuando el gas desprendido no contiene hidrógeno, el cultivo es casi puro, pudiendo ser aumentada su pureza mediante pas- teurizaciones realizadas antes de los resiembros, siempre que las espo- ras del fermento metánico estén formadas. Por este medio se destru- yen los organismos contaminadores que no formen esporas.
Examinando al microscopio un cultivo obtenido de este modo, se observa que contiene unos bacilos delgados, de o,4 ^ x 5 µ, que se colorean fácilmente y se encuentran en gran número depositados sobre las fibras de celulosa, por lo que muchos de ellos están curvados
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y conservan la forma de la sección de la fibra aun después de separa- dos de ésta rnediante lavados. A medida que el cultivo envejece y avanza la destrucción de la celulosa, los bacilos se alargan hasta alcanzar una longitud triple de la primitiva, empezando a percibirse un engrosamiento en uno de los extremos. que se tiñe más intensa- mente, constituyendo finalmente una espora esférica de z µ de diá- metro, en cuyo momento el Bac. methanigenes presenta su aspecto más caractertstico.
I,a destrucción de la celulosa puede seguirse microscópicamente.
A1 iniciarse el ataque, el papel de filtro toma una coloración anaran- jada o amarilloanaranjada, apareciendo con numerosos agujeros y los bordes corroídos. Finalmente pierde su estructura fibrosa y se acumula en el fondo del frasco en forma de un sedimento negrusco o anaranjado. El proceso de la destrucción es lento y puede durar varios meses. Durante el perlodo de fermentación vigorosa, el des- prendimiento de gases varía de 3,5 c. c. a i5 c. c. por gramo de celu- losa. Adernás de los gases indicados, durante la fermentación se for- man ácidos grasos volátiles.
Con el Bac, methanigenes aparece asociado el Bac, f ossicularum, que desprende hidrógeno durante la fermentación de la celulosa. Sus es- poras germinan mucho más lentamente que las del primero, hecho que fué aprovechado por Omeliansky para su separación. Como hemos indicado, en el primer cultivo preparado para el aislamiento del Ba- cillus methanigenes, el gas desprendido contenía hidrógeno y metano.
Si dicho cultivo, poco tiempo después de iniciado el desprendimiento gaseoso, se calienta durante quince minutos a una temperatura de 75^, las células del bacilo metánico procedentes de la germinación de las esporas quedan destrufdas, mientras que las esporas del pro- ductor de hidrógeno, que no han germinado todavía, permanecen vi- vas. Repitiendo esta operación en tres o cuatro generaciones sucesi- vas se llega a obtener un cultivo que sólo desprende hidrógeno y anhídrido carbór^co, en el que se encuentran bacilos de o,5 µ X 4 a 8 µ de longitud en los cultivos jóvenes, y en los viejos pueden alcanzar de io a ^5 µ de longitud. ^as esporas, esféricas y terminales, son de mayor diámetro que en el Bac. methanigenes, midiendo i,5 µ de diá- metro. A1 igual que este último, las células vegetativas no toman con el yodo la coloración azul o púrpura caracterfstica del Bac. amylobacter.
I,a fermentación hidrogenada de la celulosa progresa más lenta- mente que la metánica, y a la temperatura óptima (35^) puede con- tinuar ininterrumpidamente durante más de un año. El gas, hidró-
geno y anhídrido carbónico, se forma con más lentitud; aproximada- mente, 8 c. c. por gramo de celulosa en las veinticuatro horas. Ade- más de los gases mencionados, durante la fermentación se forman ácidos acético y butírico, trazas de ácido valérico y alcoholes superio- res, asf como pigmentos y substancias aromáticas, que dan al cultivo un aroma parecido al del queso.
Ni el Bac. methanigenes ni el Bac, fossicularum han podido obte- nerse en cultivos puros en la forma habitual, ya que ninguno de los dos se desarrollan en los medios sólidos ordinarios a base de agar o gelatina, habiendo fracasado todos los intentos en este sentido.
En iq23, Khouvine (56) describió otro organismo anaerobio des- tructor de la celulosa aislado del intestino del hombre: el Bac. cellulosae dissolvens Khouvine. (Clostridium dissolvens (Khouvine) Bergey y cola- boradores), interesante porque, además de otros productos, suministra alcohol etílico en proporción de un 8 por ioo de la celulosa fermen- tada. NTorfológicamente, el Bac. cellulosae dissolvens se parece mucho al Bac. fossicularum, del que se diferencia por sus esporas, ovales en lugar de esféricas y de mayor tamaño: 2 µ x 2,5 µ. Fste organismo se desarrolla bien hasta en temperaturas de 57^, y a este respecto, repre^enta una fase de transición hacia las bacterias termófilas. Fué cultivado en un medio líquido conteniendo substancias fecales como fuente de nitrógeno: las bacterias se adhieren fuertemente a las fibras celulósicas del papel, lo que permite separarlas de las contaminaciones que son arrastradas al lavar el papel con la solución de sales esteri- lizada.
En la fermentación de la celulosa, único hidrato de carbono al que ataca, además de hidrógeno y anhídrido carbónico, se forma ácido acético y butírico, alcohol etílico y un pigmento pardoamarillento.
Únicamente se recupera, en los productos de la fermentación aislados, e155^15 Por Zoo del carbono fermentado. Madame Khouvine cree que el resto se encuentra en el líquido de fermentación en forma de hidratos d e carbono solubles , que son capaces d e ser absorbidos por el intestino.
Este organismo se ha encontrado también distribuído abundante- mente en toda clase de suelos.
En el conducto intestinal de las larvas de Potosea cuprea Fabr., aisló Werner (io6) un organismo anaerobio, Bac. cellulosam fermentans (Clostridium werneri Bergey y col.), capaz de atacar rápidamente a la celulosa, ayudando asf al insecto en su proceso digestivo. Otros investigadores han señalado también la naturaleza anaerobia de las
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bacterias que desrnmponen la celulosa en el aparato digestivo de los caballos, ganado, termites y larvas de in.sectos.
b^ BACT^RIAS AEROBIAS DESTRUCTORAS DE CEI,ULOSA. -^1 prl-
mer mícroorganismo de este tipo fué descrito por van Iterson (95) ^ bajo el nombre de Bac. ferrugineus (Cellulornonas ferruginea Bergey y rnl.), como un delgado bacilo, muy movible, no esporógeno, que se encuentra en el suelo de jardín, en el humus, en las hojas secas, etc.
Puede obtenerse colocando en un plato un trozo de papel de filtro, que se espolvorea con fosfato amónico magnésico, se cubre con otro trozo de papel, se humedece rnn una solución al o,og por ioo de fos- fato bipotásico, se inocula con tiena de la indicada anteriormente y se incuba a 28^.
A los cuatro o cinco días aparecen sobre el papel unas manchas pardoamarillentas; en ellas, el papel va siendo descompuesto en una substa.ncia mucilaginosa, en la que, observada al microscopio, se advierten diversos microorganismos, entre los que predominan dos tipos: el ya mencionado Bac. ferrugineus y una forma cocoide grande.
Ln una fase m^as avanzada de la descomposicíón, los restos de las fibras aparecen envueltos en una masa mucilaginosa de micrococos.
Van Iterson atribuyó la descomposición de la celulosa al Bac. ferrugi- neus, y consideró la fortna cocoide como un organismo en simbiosis con aquél, que aun cuando por sí solo es incapaz de atacar a la celu- losa, ayuda al primero a destruirla.
Durante una investigación sobxe la descomposición aerobia de la celulosa en los suelos de Rothamsted, Hutchinson y Clayton (si), ais- laron un microorganismo aerobio S^irochaeta cyto^haga Hutchinson y Clayton, muy semejante al Bac. ferrugineus, utilizando una solu- ción de sales minerales inoculada con suelo, en la que estaba introdu- cido parcialmente un trozo de papel de filtro. A1 cabo de cuatro o seis días de incubación a 2s^, aparecían en el papel, en la parte no sumer- gida, pero pró.zima al líquido, unas manchas pardoamarillentas, en las que el papel iba perdiendo consistencia, y donde se podía observar, con ayuda del microscopio, que contenfa bacilos delgados y cocos de tamaño grande. Tras de muchas tentativas consiguieron un cultivo liquido en el que sólo se encontraban bacilos; pero los resiembros en medio nuevo, al cabo de algunos días, presentaron nuevamente la asociación de cocos y bacilos, lo que hizo que Hutchinson y Cla.yton considerasen a las primeros como una fase del ciclo evalutivo del or- ganismo.
En los cultivos jóvenes de Spirochaeta cyto^haga predomina la forma de bacilos de o,3 a o,4 µ por 3 µ de longitud, afilados en los extremos y frecuentemente encorvados. Aun cuando no se han podido observar flagelos, los bacilos presentan un movimiento de rotación lento, pero marcado. 5on muy fle^cibles, tomando a menudo formas de S, de O ó de U; a medida que el cultivo envejece va siendo más fre- cuente la forrna de cocos, o xfase esporoide^. I,os esporoides miden i,5 µ de diámetro, y se tiñen mucho más intensamente que los bacilos. I,os esporoides no pueden considerarse como esporas, ya que basta para destruirlos el calentamiento a 60^ durante diez minutos.
Winogradsky (ii3), posteriormente, en un estudio sistemático de algunas bacterias aerobias del suelo destructoras de celulosa, estable- ció los siguientes géneros:
Género Cytophaga Winogradsky, ig2g.
Bastoncillos largos, fleguosos, con extremos afilados, conteniendo gránulos metacromáticos. Incapaz de usar como alimento substan- cias carbonadas, con egcepción de la celulosa que hidroliza. Su des- arrollo sobre los medios de cultivo habituales es lento.
1♦a especie ttpica es Cytophaga hutchinsoni Winogradsky, que fué el organismo descrito por Hutchinson y Clayton como S^irochaeta cito^ihaga.
i. - Cyto^haga hutchinsoni Winogradsky.
Bastoncillos de o,3 a o,4 µ x 3 a 8 µ, aislados o en cadena, que se tiñen con dificultad, pero presentan gránulos fuertemente teñidos.
Gram, negativa. Reproducción probable por los gránulos temdos (^ artrósporas? ). I,os cultivos viejos presentan formas cocoides grandes.
Se desarrolla en gel silíceo y ataca la celulosa en este medio, for- mando grandes colonias mucilaginosas de color naranja.
Aerobia facultativa.
Temperatura óptima: 20^.
Habitat: Suelo. Desintegra las fibras vegetales.
2. - Cyto^haga aurantiaca Winogradsky.
Bastoncillos largos, de i µ x 6 a 8 µ, puntiagudos, inmóviles. Gram negativos.
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5obre gel silíceo con celulosa forma colonias de color rosa na- ranja.
3. - Cytophaga rubra Winogradsky.
Bastoncillos largos, de o,4 µ x 3 µ, ligeramente curvados, con un pequeño gránulo cerca de cada extremo. Movilidad no demostrada.
Gram negativo.
Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias mucilaginosas rojas.
4. - Cytophaga dutea Winogradsky.
Bastoncillos de o,4 µ por 3 µ. Gram negativos. No se ha aislado eu cultivo puro.
Sobre gel sílíceo con celulosa forma colonias mucilaginosas, ama- rillo brillante.
^. - Cytophaga tenuissima Winogradsky.
Más tenue que las otras especies.
1lorma colonias mucilaginosas color verde oliva sobre el gel silíceo con celulosa.
Género Cellvibrio Winogradsky, 1929•
Bastoncillos largos, ligeramente curvos, con extremos redondeados.
Muestran gránulos, que se tiñen fuertemente (^artrósporas?), que pa- recen relacionados con la reproducción. Móviles con flagelos polares.
Oxida la celulosa formando oxicelulosa. Sobre medios ordinarios de cultivo muestra crecimiento débil.
I,a especie tipo es Cellvibrio ochracea Winogradsky.
i. - Cellvibrio ochracea Winogradsky.
Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, de o,^ µ x 2,5 a 5 µ, raramente en espiral. Móviles. Gram negativos.
5obre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilagino- sas, color ocre claro.
2. - Cellr^ibrio flavescens Winogradsky.
Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, con gránulos metacromáticos. Gram negativos.
Sobre gei silíceo con celulosa forma coloni^s difusas, mucilaginosas, color amarillo claro.
Género Cellfakicula Winogradsky, 1929•
Bastoncillos cortos, que no egceden de a µ, puntiagudos, con grá- nulos metacromáticos. I,os cultivos viejos presentan formas cocoideas.
:Vlóviles con un flagelo polar. Osida la celulosa y la transforma en oYicelulosa.
I,a especie tipo es Cell f akicula viridis Winogradsky.
Z. - Cellfakicula viridis Winogradsky.
Bastoncillos curvos, rollizos, de o,7 µ X 2 µ, con extremos ligera- mente puntiagudos. Móviles. Gram negativos.
Forma colonias difusas, mucilaginosas, de color verde, sobre gel silíceo con celulosa.
2. - Cell f al.cicula mucosa Winogradsky.
Bastoncillos curvos, rollizos, de o,7 µ X a µ, con extremos ligera- mente aguzados. Móviles. Gram negativos.
Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilaginosas, color crema.
3. - Cell f alcicula f usca Winogradsky.
Muy parecida a la anterior, presentando autolisis en los cultivos viejos.
1^1 gel silíceo con celulosa empleado por Winogradsky puede pre- pararse del modo siguiente: Se pone en placas de Petri, en la forma in- dicada anteriormente, una mezcla de una solución normal de xCl y su equivalente de una solución de silicato potásico. Después que se ha formado el gel, se colocan las placas durante veinticuatro horas en agua corriente, y luego, varias veces, en agua destilada hervida, hasta que queden libres de cloruros. Cinco gramos de papel de filtro, fina- mente desmenuzado, se mezclan con ioo c. c. de una solución que contenga:
t^a)a HPOa . ... . . . ... .. . . . .. ... .. . . .. . g,oo gramos.
Mg SOa ... i,oo ^ SG ... i,oo r FeSOa ... 0,02 r Agua destllada ... i.ooo c.c.
De la anterior solución se egtienden porciones de unos 2 c. c. sobre el gel de cada placa, espolvoreando con una pequeña cantidad de CaC08. I,as placas se colocan en una estufa a 60^, hasta que la super-
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ficie del gel quede libre de exceso de líquido. Se colocan entonces pe- queñas partículas de suelo sobre la placa, que se cubre y se pone a incubar. A los tres o cuatro días se desarrollan colonias de color anaran- jado, arnarillo, etc., que se extienden sobre el medio de cultivo. De es- tas colonias se pueden hacer trasplantes a matraces que conten- gan un gramo de papel de filtro y 25 c, c. de la solucián anterior. I,os organismos empiezan a desarrollarse como pequeños lunares colorea- dos, sobre el papel, que posteriormente forman una masa mucilagi- nosa e^tendida por todo éste. Mediante repetidos trasplantes puede llegar a obtenerse la bacteria en cultivo puro.
Además de los organismos mencionados anteriormente, Kellerman, McBeth y otros (54 Y 55)^ así como McBeth y Scales (66), han descrito numerosas bacterias aerobias que consideran como destructoras de celulosa. Para el aislamiento de estos organismos, los autores ameri- canos emplearon la siguiente ^olución:
Fosfato bipotá.rirn (K^HPO^) ... . .. .... .. t,o gramos.
Sulfato magnésíco (MgSO^ • 7H^0) . . . . r,o ^ Cloruro sódico (NaCI) ... . . . T,o r Sulfato amónirn (I1H^)^ SQ^ . . . . 2,0 >
Carbonato cálcico (CaCOs) .. ... . . . zo,o ^r Agua cozriente ... iooo c. c.
b;l sulfato amónico puede reemplazarse por peptona.
En matraces de ^rlenmeyer de 20o c. c. se colocan papeles de filtro de io cm. de diámetro y se añaden ioo c. c. de solución hasta que quede cubierto el papel.
I,os matraces preparados se esterilizan y se inoculan con una pe- queña cantidad de la substancia a examinar, incubándolos a 30^. 1<os primeros síntomas de fermentación son un enturbiamiento de la solu- ción seguida por una apariencia corroída del papel, lo que tiene lugar de los cinco a los diez días de incubación. Entonces se toma un trozo del papel atacado y se introduce en un matraz de control que conten- ga un trozo de papel estéril suspendido en la solución de sales. Si, por agitación del frasco, se rompe antes el papel atacado que el de control, ha llegado el momento de la inoculación de otro matraz que contenga papel de filtro y solución, con un trozo de papel atacado. Después de tres o cuatro trasplantes en el perfodo más corto posible, el papel ata- cado se coloca en un matraz con agua esterilizada y se agita vigorosa- mente hasta que el papel quede desmenuzado. De esta suspensión se preparan diluciones en la forma acostumbrada para el aislamiento de cultivos puros en uno de los medios que se indican a continuación:
Agar-celulosa. - A un litro de amoníaco diluído que contenga diez partes de amoníaco (de o,qoo de p. e.) por tres de agua, se añade un ligero exceso de carbonato cúprico. I,a mezcla se agita vigorosamente y se deja reposar hasta el dfa siguiente. I,uego se decanta la solución de óxido de cobre amoniacal, y se disuelven en ella z5 gramos de pa- pel de filtro sin lavar. F^sta solución se diluye hasta io litros y se pre- cipita la celulosa, acidificando lentamente con ácido clorhídrico di- lufdo (2o por ioo). El lfquido se diluye nuevamente hasta 20 litros, se deja sedimentar la celulosa y se decanta el líquido. I,a celulosa pre- cipitada se lava varias veces con agua acidulada con clorhídrico hasta que el agua de los lavadas no contenga cobre, y luego, con agua des- tilada hasta arrastrar todo el clorhídrico. La celulosa se deja reposar varios dias, y finalmente se hace una suspensión a1 z por ioo. A 50o c. c. de esta suspensión se agregan io gramos de agar y goo c. c. de la solución de sales antes indicada.
Agar-almidó^t. - Diez gramos de almidón de patata se suspenden en 80o c. c. de agua fría. I,a suspensión se hierve, agitando, hasta que se reduzca su volumen a goo c. c. A esta solución se añaden io gramos de agar y 50o c. c. de solución de sales.
Agar-patata. - A ioo gramos de patatas machacadas se añaden 80o c. c. de agua corriente. I,a mezcla se lleva al baño de vapor durante treinta minutos y se filtra a través de algodón. A 50o c. c. del filtrado se agregan io gramos de agar y 50o c. c. de solución de sales.
Agar-dextrosa. - Diez gramos de glucosa y ig gramos de agar se disuelven en 50o c. c. de agua corriente, y esta solución se mezcla con 50o c. c. de solución de sales.
^s caracterfstico de los cultivos de estas bacterias que produzcan unas zonas transparentes alrededor de las colonias, que no son debidas a la neutralización del carbonato cálcico ni a una acción enzimática de las bacterias, sino a la invasión del medio por un gran número de bacterias (98). I,os resiembros de las colonias tienen menos marcado el cerco claro, que desaparece al tercero o cuarto trasplante.
Estas bacterias de Kellerman y sus colaboradores, así como otras aisladas por Sack (8^), fueron incluídas por Bergey en el género Cellulo- monas, caracterizado por bacterias en forma de pequeños bastoncillos con extremos redondeados, no esporógenos, móviles o inmóviles, que se encuentran en el suelo y tienen la propiedad de digerir la celulosa.
I,a especie tipo e^ Cellulomonas biaxotea (Kellerman) Bergey y col., ci- tando Bergey 33 especies, de las que i8 son móviles con flagelos perí- tricos, ^ móviles con flagelos polares y 8 inmóviles.
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C^ BACTRRIAS TERMÓPII,AS DESTRUCTORAS DE CEI.UI,OSA. - ESte grupo de bacterias no está bien estudiado. McFayden y Blaxall (67) fueron los primeros en observar que las bacterias termófilas que ha- bfan encontrado en el suelo eran capaces de fermentar la celulosa, necesitando veintiún días para descomponer el papel de filtro, o la viscosa, a la temperatura de 60^. Como productos de esta descomposi- ción, se formaban ácidos acético y butfrico, anhidrido carbónico y metano. Los organismos productoxes de esta fermentación no pudieron aislarse en cultivo puro.
Posteriormente, Kroulik (57) realizó investigaciones con ciertos organismos termófilos, y aun cuando no pudo aislarlos en cultivo puro, mediante el estudio microscópico llegó a la conclusión de que la destrucción de la celulosa era ocasionada por dos formas distintas: el Bacillus II, i, y el Bacitlus II, 2, produciéndose en ellas ácidos fórmico, acético y butírico, anh{drido carbónico e hidrógeno, este último en cantidades pequeñas. El hidrógeno sulfurado, que se formaba ocasio- nalmente en cantidades apreciables, fué considerado como producto de la reacción del hidrógeno formado con los sulfatos del medio. La destrucción de celulosa era más intensa cuando actuaba el Baci- llus II, 2, alcanzando al go por ioo, y aun más, de la celulosa empleada.
En ig23, Langwell y Hind (58) dieron noticias de una bacteria termófila destructora de celulosa que producía ácidos orgánicos volá- tiles: alcohol etílico, metano, hidrógeno y anhídrido carbónico. Aun cuando dieron una descripción del organismo y un balance de las reacciones, las investigaciones posteriores no han confirmado estos hechos ni han permitido aislarla.
Finalmente, Viljcen, Fred y Peterson (97), estudiaron la descom- posición de la celulasa por una bacteria termófila, cuya descripción morfológica dieron, y a la que denominaron Clostridium theymocellum, dudándose de que consiguieran aislarla en cultivo puro, tanto por la técnica empleada (go) como por el hecho de que al cultivarla sobre agar perdía la facultad de descomponer la celulosa. Por ello deben acogerse con reserva las propiedades que se le asignaron.
^n su escrito de tg24 afirmaron que cuando se desarrolla entre 60^ y 65^, el Cl. thermocellum descompone la celulosa rápidamente, formando un g6,8 por ioo de ácida acético y un io por ioo de alcohol etílico a los once dfas de incubación; en este período desaparece del 6o al 8o por ioo de la celulosa, quedando el resto formando un sedi- mento amarillento amorfo. En su publicación de ig26 se hace constar que el rendimiento en alcohol varfa considerablemente.
[^J BACTERIAS DFSNITRIFICANTES QU$ ATACAN A I.A CEI,UI,OSA. - Algunas bacterias reductoras de nitratos pueden usar la celulosa como fuente de energía, Un medio que contenga o,25 gramos de KNO,, 0,05 gramos de K,HPO, y 2 gramos de celulosa en forma de papel de filtro, en ioo c. c. de agua corriente, se coloca llenando completamente un matraz tapado, que se inocula con cieno y se incuba anaerobia- mente a 3g^. 1~1 ataque de la celulosa empieza en una semana, y viene acompañado de la reducción del nitrato a nitrito, que a su vez desaparece en quince días. Renovado el medio, el proceso de reducción de nitratos se acelera considerablemente. La celulosa toma color ana- ranjado amarillo y consistencia mucilaginosa, descomponiéndose en fibras, que terminan por desaparecer. I,os gases que se desprenden•
son una mezcla de nitrógeno con anhídrido carbónico.
Groenewege (45) considera que el proceso de descomposición de la celulosa en presencia de nitratos es llevado a cabo por la acción simbiótica de dos grupos de organismos: uno descompone la celulosa, mientras que el otro reduce los nitratos usando como fuente de energía los productos formados en la descomposición de la celulosa. Por la acción simbiótica de los dos organismos desaparece la celulosa más rápidamente que por la acción aislada del organismo espec{fico de Ia celulosa. I,a formación de gas se inicia al segundo día, acompañada de la reducción del nitrato a nitrito y óxido de nitrógeno, con una disolu- ción gradual del papel. El proceso es sumamente activo cuando la solu- ción de cultivo se renueva por decantación.
Groenewege aisló las bacterias que intervienen en eI proceso, en- contrando varias estirpes de una bacteria aerobia, Bacterium cella- resolvens, que actúa sobre la celulosa, y los productos de la descompo- sición de ésta (ácidos acético, butírico y láctico) sirven de alimento a los organismos desnitrificantes Bacterium o^ialescens y Bacterium viscosum.
