Trabajo Práctico Nº 3 Técnicas de diagnóstico de enteroparasitosis
Objetivos: Conocer y aplicar los distintos métodos y técnicas que permiten hallar, identificar y cuantificar los parásitos propios del tubo digestivo en algunas de sus formas evolutivas.
El diagnóstico de una enteroparasitosis es normalmente posible ya que, para su propagación, los parásitos ganan el medio externo adoptando diferentes formas evolutivas.
Así, los helmintos se manifiestan por huevos o larvas y los protozoos por quistes que resultan de la multiplicación de las formas vegetativas.
El examen de la materia fecal (análisis coproparasitológico) permite diagnosticar las parasitosis del tubo digestivo y de sus órganos anexos, como así también del aparato respiratorio. De esta manera se puede determinar la existencia de parásitos en el estómago, intestino, hígado y conductos biliares, en los pulmones y en la tráquea. En las heces se pueden hallar parásitos adultos (algunos nematodes) o partes de ellos (proglótides de cestodes), huevos, larvas y formas vegetativas o quísticas de protozoos.
Existen distintos niveles de diagnóstico parasitológico, según los objetivos del examen:
Investigación: Caracterización de cepas por patogenicidad, estudios de inmunología, bioquímica, respuesta a quimioterápicos, ADN, anticuerpos monoclonales, isoenzimas, etc.
Pacientes individuales: donde el diagnóstico requiere una combinación de juicio clínico e investigación específica de laboratorio. El examen morfológico de los parásitos continúa ofreciendo la mejor forma de diagnóstico práctico.
Encuestas comunitarias: Requieren diagnóstico rápido y exacto, cualitativo y métodos diseñados para procesar grandes cantidades de muestras de heces.
El diagnóstico de las enteroparasitosis tiene objetivos inmediatos y mediatos. Los primeros se cumplen al detectar los casos individuales (laboratoristas), en centros de salud o en laboratorios particulares, mientras que los objetivos mediatos se cumplen a través de encuestas comunitarias, que permiten la detección del problema a nivel poblacional, evaluando a la vez el riesgo sanitario. En cualquier caso, los resultados permitirán considerar la eliminación de los parásitos, aconsejando el tratamiento de acuerdo al parásito y a las condiciones del paciente y/o la población en estudio.
Las técnicas de diagnóstico parasitológico pueden dividirse en cualitativas y cuantitativas. Son técnicas cualitativas aquellas que tienen por objeto identificar los parásitos en las muestras. Las técnicas cuantitativas, en cambio, son un complemento de aquéllas y tienen por objeto expresar la cantidad de formas parasitarias presentes.
Primer paso: La toma de las muestras
Para un buen diagnóstico parasitológico es indispensable la rigurosidad en la toma de las muestras:
- La materia fecal se colocará preferentemente en frascos de boca ancha con tapa hermética, y deberá ser idealmente examinada en las horas inmediatas a su recolección, para lo cual
deberá conservarse refrigerada (nunca congelada). La alternativa para conservar la muestra, si transcurriera mucho tiempo entre la recolección y el examen, consiste en emplear un líquido fijador que, salvo determinadas excepciones, debe conservar una proporción de 3:1 en volumen con respecto a la muestra. No deberá utilizarse fijador cuando se contemple realizar cultivos o en muestras destinadas para análisis cuantitativo (ver más adelante).
- En general se admite que los huevos de helmintos están uniformemente distribuidos en las heces; por lo tanto puede indicarse que la muestra se puede tomar de cualquier parte de las heces. En medicina veterinaria se puede recoger del recto de los grandes animales o inmediatamente a las deposiciones en los animales pequeños.
- Las muestras deben ser identificadas con información referida a la especie animal, sexo y edad.
- En humanos se agregará la historia clínica. Se sugiere rotular los frascos con el modelo de etiqueta siguiente:
ANÁLISIS COPROPARASITÓLOGICO
Número de registro...
Apellido...
Nombres...
Edad ... Sexo...
Domicilio...
Localidad...
- El examen seriado consiste en la toma de muestras (de 5 a 10 g) de materia fecal, durante 3-5 (a veces más) días, en un frasco con fijador, realizándose luego el examen del conjunto. El protocolo para el examen seriado no es único, y puede variar ligeramente según el problema a determinar e incluso según los criterios personales de los laboratoristas.
Alcances y limitaciones de los métodos de análisis coproparasitológico
- Parásitos tisulares. Es necesario recordar que las posturas de huevos en tejidos profundos, incomunicados con el exterior, de algunos parásitos (por ejemplo los huevos de Capillaria hepatica, retenidos en el parénquima hepático), no podrán diagnosticarse por el examen de materia fecal. Por otra parte, cuando son larvas las responsables de diferentes helmintiasis como la toxocarosis visceral, anisakiasis gástrica, hidatidosis, etc. tampoco son factibles de ser diagnosticadas por este método.
- Hipobiosis. La hipobiosis de las larvas de 4º estadío que sufren muchas especies de nematodes durante su ciclo, suele prolongarse por varios meses y es más marcada en ciertas épocas de año, según el clima. Puede existir una carga importante de parásitos en ese estado que no sería detectada por los exámenes coprológicos. (Hipobiosis: es el estado de letargo por el que pasan las L4 en la submucosa gástrica hasta que las condiciones ambientales internas y/o externas sean favorables; común en parásitos de rumiantes).
- También existe imposibilidad de detección de huevos o larvas de helmintos en las heces cuando:
- el parasitismo es sólo por gusanos machos (especies dioicas)
- inmadurez de los parásitos. En este último caso la detección es posible luego de transcurrido un tiempo, conocido para cada especie parásita, y que se detalla en la tabla siguiente:
Parásito Días desde la infección hasta la observación de huevos o larvas Strongyloides stercoralis 7
Hymenolepis nana 13 a 16 Diphyllobotrium latum 14 a 16 Taenia saginata 50 Ascaris lumbricoides 55 Enterobius vermicularis 55 a 72 Necator americanus 56 a 96 Taenia solium 75 Fasciola hepatica 90 a 120 Trichuris trichiura 92 a 137 Ancylostoma duodenale 109 a 171
Técnicas de examen cualitativo
Examen directo Macroscópico
En el examen de las heces a simple vista se debe prestar atención a la consistencia, color y aspecto general, los cuales pueden ser alterados por diversas parasitosis; así como la presencia de sangre, mucosidad, parásitos o partes de los mismos (Oxiuroideos, Ascaroideos, proglótides de cestodes).
Microscópico
La visión directa de una muestra sin concentrar se puede realizar a partir de MF fresca o conservada. Para ello se deposita en un portaobjetos una gota de solución salina isotónica (8,5 g por litro); con un palillo se toma una porción de MF que debe tener aproximadamente el tamaño de la cabeza de un fósforo (unos 2 mg.) y se deposita en la gota. Mezclar y colocar el cubreobjetos. El preparado debe ser fino y extendido en forma homogénea. Se debe observar con el objetivo de 10X y cuando se encuentra una estructura sospechosa, pasar a mayor aumento. Recorrer todo el preparado. Este método es rápido y adecuado para observar algunas formas vegetativas o quísticas de protozoos y huevos de helmintos, pero resulta poco sensible cuando la carga parasitaria es baja.
El examen directo puede mejorarse con el agregado de una gota de colorante al material, siendo el más usado la solución de lugol. Puede agregarse el colorante por
capilaridad en el borde del cubreobjetos o bien colocar la muestra directamente sobre una gota de solución de trabajo de lugol.
Técnicas de concentración
Si la carga parasitaria es baja, el examen directo puede dar falsos negativos; para reducir este error se utilizan las técnicas de concentración. Los métodos de concentración tienden precisamente a concentrar en un volumen pequeño las formas parasitarias diseminadas en la muestra, separándolas además del medio que las rodea y de otros elementos que pudieran dificultar la observación.
- Existen así técnicas físicas que, tomando como base la diferente densidad de las formas parasitarias buscadas con respecto a otros elementos contenidos en la materia fecal, separan los elementos parasitarios por flotación si se utilizan soluciones de alta densidad o por sedimentación si se utilizan soluciones de densidad cercana a la unidad, ya sea espontáneamente o por centrifugación.
- Las técnicas físico-químicas, generalmente difásicas, aprovechan la mayor afinidad de los restos fecales por algunos solventes polares (éter, acetato de etilo), mientras que los elementos parasitarios sedimentan durante un proceso de centrifugación.
Técnicas de flotación Método de Fulleborn:
Utiliza: solución saturada de NaCl (340 g de NaCl en 1000ml de AD, δ = 1147-1150), mortero, embudo, colador de malla gruesa, tubo de Borrell.
Procedimiento: 1) Triturar en el mortero 5-10 g de MF con 50 ml de solución salina (9 g NaCl en 1000 ml de AD). 2) Filtrar con el colador recogiendo el líquido en el tubo de Borrell y dejar reposar 20 min. 3) Tomar una gota de la superficie con un ansa o con una pipeta.
Colocar la gota entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio. Para que el estudio sea completo, se puede revisar el sedimento tomando una muestra del fondo, con pipeta, a las 6 hs.
Método de Willis:
Procedimiento: 1) El primer paso es igual a la técnica de Fulleborn, reemplazando el tubo de Borrell por un tubo de ensayo. 2) Colocar el líquido de filtrado en el tubo, llenándolo hasta que forme un menisco en el borde superior. 3) Colocar un cubreobjetos sobre el menisco y dejar reposar 20 min. 4) Retirar con cuidado el cubreobjetos, colocarlo sobre un portaobjetos y observar al microscopio. Los elementos parasitarios que flotaron en la solución quedan en la gota que arrastra el cubreobjetos.
Técnica de flotación en solución de azúcar:
Es una técnica especialmente indicada para huevos de helmintos de caninos y felinos.
Utiliza: Solución saturada de azúcar, δ = 1300 (550 g en 1000 ml de agua) los restantes elementos para triturar la MF, tubos de centrífuga y centrífuga.
Procedimiento: Se tritura la MF igual que en los procedimientos anteriores, se filtra colocando el líquido en un tubo de centrífuga y se centrifuga a 2500 rpm durante 5 min. Luego se toma una gota de la superficie con un ansa o pipeta y se observa al microscopio.
Técnica de flotación centrífuga (Método de Faust):
Utiliza: Solución saturada de ZnSO4. δ = 1300 (703 g en 1000 ml de agua).
Procedimiento:
- Con MF fijada:
1) Mezclar 1-2 ml de MF con 5 ml de solución salina (s.s.). Tapar y agitar hasta homogeneizar. 2) Filtrar por gasa y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga graduado. 3) Agregar al líquido del filtrado s.s. hasta completar 10 ml. 4) Centrifugar 2 min a 1700 rpm y decantar el sobrenadante. 5) Repetir tantas veces como sea necesario hasta que el agua salga límpida. 6) Agregar luego al culot 3-4 ml de ZnSO4 al 3% hasta 1 cm del borde y centrifugar 2 min a 1700 rpm. 7) Sin agitar el tubo de centrífuga, tomar con ansa o con pipeta varias gotas del menisco de la superficie y observar entre porta y cubre.
- Con MF fresca:
1) Agregar a 1-2 ml de MF 6 ml de formol al 10%. Tapar, agitar hasta homogeneizar y dejar reposar 30 minutos. 2) Redisolver el sedimento y filtrar por gasa, recogiendo el filtrado en un tubo de centrífuga graduado. Los pasos 3) a 7) son idénticos a los del procedimiento anterior.
Esta técnica permite diagnosticar huevos de densidades altas (de trematodes, acantocéfalos) o larvas (Dictyocaulus spp.)
Técnicas difásicas
Método de Telemann modificado:
Utiliza: solución de formol-sal (50 ml de formol 40% + 5 g de NaCl + 950 ml de AD), éter.
Procedimiento: 1) La MF se recoge en solución de formol-sal, en una proporción de 1:2. 2) La MF diluida se mezcla homogéneamente y se tamiza por malla metálica. 3) Verter esta solución en un tubo de centrífuga hasta las dos terceras partes del mismo. 4) Agregar éter, tapar el tubo, agitar fuertemente y destaparlo luego lentamente. 5) Centrifugar a 1500 rpm durante 3 min y eliminar el sobrenadante con un golpe seco. 6) Recoger gotas del sedimento con pipeta Pasteur, observarlas entre porta y cubreobjetos, en fresco o con alguna coloración, o guardar en cámara húmeda para el día siguiente.
Método de Ritchie modificado (formol-éter):
Utiliza: solución de formol al 10%, solución salina para los lavados, éter o acetato de etilo.
Procedimiento: 1) Colocar en un tubo de centrífuga 8 ml. de formol al 10% + 0,5-1 ml. de MF. 2) Tapar, agitar bien y dejar reposar media hora. 3) Redisolver el sedimento y filtrar por una gasa, recogiendo 7 ml. del filtrado en un tubo de centrífuga. 4) Completar con s.s. hasta 10 ml y centrifugar 2 min. a 1700 rpm. Si el sobrenadante es muy turbio, decantarlo, redisolver con s.s. hasta 10 ml. y volver a centrifugar. Si es necesario repetir este paso hasta que el sobrenadante salga límpido. 5) Decantar, agregar formol 10% hasta llegar a 7 ml y redisolver. 6) Agregar 3 ml de éter etílico (usaremos en su lugar Acetato de Etilo, por ser menos volátil) y agitar bien. Centrifugar 3 min. a 1700-2000 rpm. 7) Separar de los bordes del tubo la interfase que aparezca y desechar todo el sobrenadante. 8) Con una pipeta Pasteur tomar unas gotas del sedimento y observar entre porta y cubre. Se puede agregar una gota de s.s., y colorear con lugol. Se debe observar todo el sedimento.
Este es un método de rutina en Coproparasitología y permite observar tanto huevos de Helmintos como quistes de Amebas y Flagelados y ooquistes de Coccidios.
Examen cuantitativo
Las técnicas cuantitativas de examen de heces tienen por lo general como finalidad calcular la cantidad de huevos de helmintos presentes en ellas. La forma más común de expresar esa cantidad es en número de huevos por gramo de heces (HPG). Estos métodos tienden en última instancia a estimar la carga parasitaria a partir de la cantidad de HPG y del conocimiento de la proporción de sexos y del número de huevos por día producido por cada especie.
Parásito Tasa de oviposición Proporción de sexos Ascaris lumbricoides 200.000 huevos/día/hembra 3 ♀: 1 ♂ Ancylostoma duodenale 10-20.000 h/día/D 1 ♀: 1 ♂ Necator americanus 5-10.000 h/día/D 1,5 ♀: 1 ♂
Ejemplo:
Un recuento de huevos de Ascaris lumbricoides dio como resultado 4000 huevos fértiles y 2400 infértiles por gramo de heces. Si el paciente elimina por día unos 250 g de heces, calcular la cantidad de parásitos presentes.
Técnica de Mc Master modificada:
Material necesario: Mortero, colador y embudo. Solución saturada de NaCl (δ = 1150-1200), frasco graduado de 100 ml, pipeta, cámara de Mc Master modificada (ésta consta de dos compartimentos que permiten examinar un volumen de 2 ml).
Procedimiento: 1) Disolver 3 g de MF en sol. sat. de NaCl. Completar el volumen a 60 ml y mezclar bien. Resulta una suspensión de MF 1:20 en sol. de NaCl. 2) Filtrar, recogiendo el filtrado con un embudo en un frasco cilíndrico. 3) Tomar enseguida líquido con la pipeta y llenar cada uno de los compartimentos de la cámara. Dejar reposar 3 min. para que los huevos, que tienden a flotar en la s.s., asciendan y se ubiquen en el plano superior de cada celda de la cámara. Esto permitirá que la observación se realice en el mismo plano de foco.
4) Observar al microscopio y contar todos los huevos que se observen. El límite superior de la cámara tiene un rayado con el ancho del campo del microscopio con el objetivo de 10X, lo que facilita el recorrido (Fig. 1)
Cálculo:
En este caso se diluyeron 3 g de MF en 60 ml de s.s. De esta suspensión se observaron 2 ml.
Por lo tanto:
60 ml...3 g de MF 2 ml...0,1 g de MF
Ya que el número de huevos contados en la cámara corresponde a 0,1 g de MF, para obtener el número de huevos por gramo se debe multiplicar por 10 el número de huevos hallado.
Técnica de Kato-Katz para búsqueda, identificación y recuento de huevos de helmintos.
Material necesario: Un kit completo (Fig. 2) que se vende en el comercio incluyendo: una espátula plástica, una plantilla plástica y una rejilla metálica de 60-105 μm, portaobjetos, tiras de celofán hidrófilo de 25 x 30 o 25 x 35 mm embebidos en una solución de glicerina-verde de malaquita o de glicerina-azul de metileno al 3% (1 ml de solución acuosa de verde de malaquita al 3% o de azul de metileno al 3% + 100 ml de glicerina + 100 ml de AD).
Procedimiento: 1) La MF se hace pasar por la rejilla, utilizando la espátula para separar el material fecal de los residuos más grandes. 2) La MF pasada por la rejilla se transfiere a la plantilla que se apoya en un portaobjetos. El material fecal pasado por la rejilla debe llenar completamente el agujero de la plantilla, y debe quedar al ras de la superficie de la misma. 3) Se retira la plantilla con cuidado, de manera que el material fecal quede sobre el portaobjetos formando un pequeño cilindro. 4) Se coloca sobre la muestra fecal una tira de celofán (la tira debió estar inmersa en la solución de verde de malaquita al menos 24 hs). El portaobjetos se invierte y se comprime sobre una superficie dura y plana para que la muestra se reparta uniformemente en el celofán.
Dejar el preparado unas horas a temperatura ambiente para que el agua se evapore y la glicerina aclare el material. Los huevos de Ascaris y Trichuris permanecen visibles y reconocibles durante muchos meses en este tipo de preparados. Los huevos de Ancylostomidos en cambio se aclaran rápidamente y dejan de ser reconocibles luego de 30 minutos. El momento ideal para observar huevos de Schistosoma spp. es a las 24 hs. de su preparación.
Cálculo: Durante la observación se debe examinar sistemáticamente el preparado y anotar los recuentos de huevos para cada especie. A continuación, se debe multiplicar por el número apropiado para obtener el número de huevos por gramo de heces. Las plantillas vienen preparadas para contener una cantidad conocida de MF. Así, para una plantilla de 50 mg el factor de multiplicación es 20, para una de 20 mg se multiplica por 50, y para una de 41,7 mg se multiplica por 24.
Para que un estudio cuantitativo sea riguroso, debe tenerse en cuenta una serie de factores:
- Una baja HPG no necesariamente es indicativa de una baja carga parasitaria, ya que una parte de la población parasitaria puede no haber alcanzado aún el período de patencia, pero ya puede ser causante de enfermedad. (Ver también p. 2, Alcances y limitaciones...).
Por otro lado, las hembras viejas de los parásitos establecidos en un hospedador tienden a reducir su tasa de oviposición. Una reducción en la oviposición es además una de las manifestaciones de la respuesta inmunológica del hospedador actuando sobre la población de parásitos.
- Dado que generalmente en un mismo hospedador coexisten varias especies de nematodes con distintas tasas de oviposición y patogenicidad (especialmente en Medicina Veterinaria), el HPG debe lógicamente evaluarse teniendo en cuenta la proporción de huevos de cada una. Puede ser necesario realizar un cultivo que provea información complementaria (identificación de larvas de 3er estadío).
- Variabilidad entre muestras individuales: los valores de las muestras individuales de una población de hospedadores pueden ser diferentes, ya que dentro de una población es variable la eliminación de huevos por animal.
Obtención de larvas por cultivo
Los huevos de las distintas especies de nematodes gastrointestinales de animales tanto domésticos como salvajes son a veces muy similares. El cultivo de huevos hasta obtener larvas de tercer estadío permite distinguir los distintos géneros y especies a través del estudio de su morfología.
Técnica de Corticelli y Lai:
Material necesario: dos juegos de cajas de Petri de 10 y 15 cm de diámetro, agua.
Procedimiento: La MF se cultiva en las cajas de Petri. La muestra de MF se coloca en una caja de Petri de 10 cm de diámetro y ésta dentro de la de 15 cm, que contiene a su vez una capa de 1 cm de agua.
Al taparse la caja mayor, la más pequeña queda inmersa en una cámara húmeda. Ésta se coloca en una estufa durante 10 días a 25-27ºC, para que los huevos de los nematodes eclosionen y las larvas maduren hasta el tercer estadio.
Transcurrido el período de cultivo se invierte la cápsula pequeña sobre el agua de la grande y en 24 hs. se producirá la migración de las L3 al líquido. Finalmente se recoge el líquido y se concentran las larvas por centrifugación o decantación, para su posterior recolección con pipeta y observación microscópica
Técnica de Roberts O’Sullivan modificada:
Con esta técnica, el cultivo de los huevos presentes en las heces, se realiza en frascos de vidrio.
Procedimiento: Se colocan 50-100 g de MF mezclada con telgopor picado, dentro de frascos de vidrio de aprox. 300 ml. Se agrega agua hasta formar una capa de 1 cm en el fondo del frasco y se cultiva durante 10-15 días en estufa a 25º. Pasado el tiempo de cultivo, se llena el frasco con agua tibia hasta el borde y se invierte sobre una caja de Petri de 15 cm de diámetro.
Se deja 24 hs para que las larvas migren hasta el agua acumulada en la caja de Petri. Luego se recoge el agua y se concentran las larvas por decantación o centrifugado para su observación posterior. (Fig. 3).
Técnica de Baermann:
Esta técnica, basada en el hidrotropismo y termotropismo positivo de las larvas, permite la recuperación de las mismas de cualquier sustrato.
Material necesario: Un embudo de vidrio de 15 cm de diámetro conectado a un tubo de goma, pinza de Mohr, un tubo de centrífuga de 50 ml, un trozo de alambre tejido de 10 cm de diámetro, un trozo de gasa doble de 10 cm de diámetro, solución de azul de metileno al 2%, agua a 36º C, cámara para recuento de larvas.
Procedimiento: Colocar la MF fresca, extendida sobre el trozo de gasa, y ésta sobre el alambre tejido. Llenar el embudo de agua a 36º C cerrando el paso del tubo de goma con la pinza de Mohr. Colocar la MF, con la gasa y el alambre tejido en contacto con el agua, sin que esta cubra totalmente las heces. Dejar en reposo 18-24 hs. Recoger, abriendo la pinza de Mohr, no menos de 50 ml del líquido acumulado en el fondo del embudo. Centrifugar 5 min a 2500 rpm. Revisar el sedimento en la cámara de recuento agregando previamente dos gotas de solución de azul de metileno (las larvas de Dictyocaulus spp. se tiñen de color rosado) (Fig.4).
Técnica de Harada-Mori:
Se recomienda para un número limitado de nematodes de gran importancia clínica:
Necator americanus y Ancylostoma duodenale, cuyos huevos son casi idénticos. Actualmente se usa para Strongyloides stercoralis. En este caso se requiere el cultivo de siete días consecutivos.
Este método es recomendable para trabajos a campo y examen de grandes poblaciones por su simplicidad, fácil manipulación, limpieza y buena recuperación de larvas.
Procedimiento: 1) Preparar una tira de papel de filtro de 15 x 2 cm, con un pliegue longitudinal en la línea media. 2) Se diseminan 0,5 g de MF en una capa fina, sobre las dos terceras partes superiores de la misma. Luego se introduce en un tubo de ensayo de 180 x 18 mm, sumergiendo el extremo limpio en 4-5 ml de agua. La MF no debe tocar el agua para evitar la proliferación de hongos y bacterias perjudiciales para el desarrollo y detección de las larvas. Se debe usar agua destilada para evitar la acción deletérea del cloro. Se usan heces frescas y se debe tapar el tubo y mantener a temperaturas de 10-25º C. Al cabo del período de incubación observar el agua con lupa, las larvas se verán nadando y luego de extraer el papel de filtro, se tomará una gota con pipeta y se observará al microscopio. Las larvas pueden matarse colocando una pequeña llama debajo del portaobjetos (un encendedor) y mueren extendidas.
Métodos especiales
Método de Graham o hisopado anal:
Las técnicas coproparasitológicas vistas no permiten descubrir los huevos de Oxyuroideos como Enterobius vermicularis que son puestos fuera del tubo digestivo del hospedador y depositados en los pliegues radiados del ano. La técnica de Graham permite obtener estas muestras en forma rápida y sencilla.
Procedimiento: La toma de la muestra debe hacerse por la mañana, sin higiene anal previa inmediata (higienizarse la noche anterior). Consiste en la aplicación de celofán adhesivo (“cinta scotch”) en la zona de los pliegues radiados, con un dedo enguantado o con ayuda de un tubo de ensayo o espátula. Luego se pega la cinta sobre un portaobjetos y se practica el examen microscópico directamente por transparencia.
ANEXO
Técnicas de laboratorio para el diagnóstico de protozoosis intestinales
El diagnóstico de protozoosis intestinales ofrece en general mayores dificultades que el de las helmintiasis. Los trofozoítos son sumamente lábiles, salen al exterior con las heces diarreicas y son alterados y destruidos con gran rapidez fuera del hospedador. Por esta razón, si se quiere observar trofozoítos, el examen debe ser rápido o en su defecto se debe fijar la muestra con un fijador apropiado para realizar un extendido y colorearlo.
Para diagnosticar las protozoosis es necesario hacer un examen seriado, teniendo en cuenta que los quistes no se distribuyen homogéneamente en la muestra. Los trofozoítos deben buscarse en los elementos patológicos como moco, pus, tejido esfacelado, etc.
Fijadores utilizados - PVA:
Este líquido fijador se puede adquirir en el comercio ya preparado. En el supuesto de que se prepare en el laboratorio, se debe tener sumo cuidado dado el peligro que representan algunos de los reactivos. Se prepara a partir de una solución de Alcohol polivinílico (PVA), Glicerol y Agua destilada más otra solución de Cloruro mercúrico, Etanol y Ácido acético. Si bien es un excelente fijador para trofozoítos y permite la realización de frotis para colorear, presenta varias desventajas, la principal de la cuales es su hipertoxicidad (HgCl2). Algunos países prohíben o desaconsejan su utilización.
- SAF:
Preparación: 1,5 g de Acetato sódico + 2 ml de Ácido Acético + 4 ml. de Formaldehído + 92,5 ml de Agua destilada.
☺ Ventajas: Es muy estable. Conserva los trofozoítos. Permite realizar frotis para colorear.
Desventajas: Sólo permite técnicas de concentración difásicas. Los frotis no responden muy bien a la coloración tricrómica.
- MIF:
Preparación: Se compone de dos soluciones, MF e I, que deben prepararse y conservarse separadas en frascos topacio:
Solución MF: 40 ml de Tintura de merthiolate de Lilly + 5 ml de Formaldehído + 1 ml de Glicerina + 50 ml de Agua destilada.
Solución I: 10 g de Ioduro potásico + 5 g de Yodo metálico + 100 ml de Agua destilada.
(Disolver el IK en agua, agregar el I0 y finalmente el resto de agua).
☺ Ventajas: Es fijador y colorante a la vez. Conserva todas las formas parasitarias. Permite técnicas de concentración variadas.
Desventajas: Ambas soluciones son fotolábiles y de estabilidad limitada (MF: 3 meses, I: 1 mes). Debe prepararse en el momento de usar. Debe prepararse en cantidades exactas (Ej. 4,7 ml. de MF + 0,3 ml. de I para 0,5 ml. de heces). No permite la realización de frotis.
- Formol al 10 %:
Preparación: 10 ml de Formaldehído comercial + 90 ml de Agua destilada.
☺ Ventajas: Es económico y simple. Es estable. Permite aplicar cualquier técnica de concentración. Es excelente fijador para Coccidios y Microsporidios.
Desventajas: Destruye los trofozoítos. En consecuencia, no es bueno para realizar frotis fecales.
A excepción del MIF, que se usa en proporciones específicas, la relación entre el volumen de fijador y la muestra debe ser de 3:1 en volumen.
Colorantes para visión directa, sin fijación
- Sudán III (para identificación de lípidos): 70 ml de una solución saturada de Sudán III en Acido acético + 30 ml de Alcohol 90º. Estable. Los lípidos se colorean de rojo vivo.
- Solución de Lugol: 1 g de Ioduro potásico + 1,5 g de Yodo metálico + 100 ml de Agua destilada. Estable varias semanas. Como solución de trabajo: se utiliza diluido al 1:2 en Agua destilada. Tiñe el citoplasma amarillo, la cromatina pardo-negruzco y el glucógeno pardo- caoba. ☺ Ventajas: da buen contraste y es bueno para quistes de Protozoos. Desventajas:
deshace los trofozoítos.
- Eosina: solución acuosa de Eosina al 1 %. Estable. Es un colorante vital. Conserva el movimiento, pero no es bueno para identificación.
- Bailinger – Faraggi: 50 mg de Violeta Cristal + 10 mg de Fucsina básica + 20 ml de Alcohol 96º + 4 ml de Fenol y completar hasta 100 ml con Agua destilada. Se guarda en frasco ámbar. Estable. Como solución de trabajo: Se utiliza diluido 1:1 en Agua destilada. Los núcleos se tiñen de negro y el citoplasma rojo-violeta.
- Solución amortiguada de Azul de Metileno (AMA): 46,3 ml de Solución A + 3,7 ml de Solución B + 0,5 g de Azul de Metileno + 50 ml. de Agua destilada. Estable indefinidamente.
Solución A: 1,2 ml de Ácido Acético glacial + 98,8 ml de Agua destilada.
Solución B: 1,6 g de Acetato sódico + 100 ml de Agua destilada.
Es un colorante vital. Los núcleos se ven azul oscuro y el citoplasma azul claro. Puede dejar trofozoítos sin teñir, pero la buena coloración del núcleo ayuda en la identificación.
Las soluciones de Lugol y de Bailinger Faraggi también se pueden usar para visión directa en heces fijadas con PVA, SAF o Formol al 10%.
- Tinta china: Se usa para Blastocystis hominis en heces frescas o conservadas. La tinta china Pelikan más formol al 40% (sin diluir) hasta llegar a una concentración final de 10 ‰.
Confección de frotis fecales para preparaciones permanentes En qué casos se requiere la confección de preparaciones permanentes?
♦ Para identificación de Coccidios.
♦ Para confirmación e identificación de trofozoítos, en caso de duda.
♦ Para identificación específica de quistes.
♦ Mantenimiento de un registro permanente.
♦ Envío a un laboratorio de referencia.
1- Realización de la extensión a) Si la muestra está fijada con PVA:
Tomar una porción de la muestra fijada (bien mezclada) con un palillo y hacer una extensión fina y homogénea haciendo girar el palillo o bien aplicándola con un movimiento en zigzag.
Dejar secar bien antes de teñir (8 a 10 horas, pero pueden quedar sin teñir hasta 3-4 semanas).
b) Si la muestra está fijada con SAF:
Debe realizarse una serie de lavados por centrifugación con solución fisiológica (de 7 a 10 lavados) antes de hacer la extensión. Es necesario impregnar el portaobjetos con albúmina de huevo antes de realizar la extensión, para asegurar la adherencia de la muestra. Esto último se aplica a la MF fijada con cualquier fijador distinto del PVA.
c) El frotis para la búsqueda de Coccidios puede prepararse a partir de materia fecal fresca o previamente fijada.
Si la MF es fresca, se realiza el frotis en un portaobjetos con ayuda de un palillo aplicador, se deja secar y se fija en metanol por 5 minutos. Dejar secar y luego proceder a la tinción.
Si la MF ya está fijada con Formol al 10%, realizar el frotis con el palillo, dejar secar y proceder a la tinción.
Un método de concentración consiste en mezclar en un tubo de centrífuga 6 ml de Formol al 10% y 1-2 ml de MF. Tapar y agitar bien. Filtrar a través de una gasa, recogiendo el filtrado en un tubo de centrífuga. Centrifugar tres minutos a 2000 rpm. Decantar el sobrenadante y con el sedimento realizar el frotis.
También se puede realizar el frotis a partir del sedimento obtenido por la técnica del formol-éter, aunque algunos autores no lo recomiendan.
2- Métodos de tinción permanente de frotis fecales.
Para frotis preparados con material fresco o conservados con PVA o SAF.
a) Hematoxilina férrica Preparación:
Solución madre A: Disolver 1 g de cristales de Hematoxilina en 100 ml de acohol 95%, dejar expuesto a la luz por una semana y luego filtrar.
Solución madre B: 1g de Sulfato ferroso de amonio + 1 g de Sulfato férrico de amonio + 1 ml de Acido clorhídrico + 97 ml de Agua destilada.
La solución de trabajo se prepara combinando 25 ml de la solución A y 25 ml de la solución B al menos tres o cuatro horas antes de la tinción.
Procedimiento:
Sumergir los portaobjetos 5 minutos en alcohol 70%.
2 minutos en alcohol 50%
5 minutos en agua de la canilla
10 minutos en la solución de trabajo de Hematoxilina 1 minuto en agua destilada
1 minuto en solución de ácido pícrico*
10 minutos en agua corriente
10 minutos en alcohol 70% (+ 1 gota de NH3 en los 5 últimos min.) 5 minutos en alcohol 95%
Deshidratar en alcohol absoluto y en luego en xilol. Colocar el medio de montaje y cubrir con un cubreobjetos.
* Partes iguales de ácido pícrico acuoso saturado y agua destilada.
Aspecto de la muestra teñida: Elementos de fondo y citoplasma azul grisáceo. Núcleos azul oscuro a negro.
b) Técnica de Ziehl Neelsen modificada (para Coccidios) Se basa en la propiedad ácido resistente de la pared del ooquiste.
Preparación:
Solución Colorante de Carbol- Fucsina: Disolver 3,15 g de Fucsina básica en 100 ml de alcohol 96°. Agregar una solución de 45 ml de Fenol (obtenido por calentamiento a 56 en Baño María) + 855 ml de Agua destilada. Mezclar y dejar reposar 1-2 días. Filtrar y guardar en frasco topacio. Es estable indefinidamente.
Solución Decolorante: Solución acuosa de Acido sulfúrico concentrado al 7% (añadiendo a 93 ml. de Agua destilada, con cuidado y lentamente, 7 ml de Ácido sulfúrico concentrado).
Solución Contracolorante: 0,3 g de Azul de Metileno + 30 ml de alcohol 96°. Agregar 100 ml de solución acuosa de Hidróxido potásico al 0,01%. Guardar en frasco topacio. Estable indefinidamente.
Procedimiento:
-Con el frotis totalmente seco, hacer unos pases suaves por la llama de un mechero
-Cubrir con solución colorante 8 minutos con un papel de filtro impregnado con la solución.
Cada dos minutos se debe pasar una llama por debajo del portaobjetos (unos cuatro pases de la llama de un mechero o encendedor, hasta que del preparado se desprendan ligeros vapores).
-Eliminar el papel de filtro, dejar enfriar y lavar por corriente rápida con la solución decolorante, dejando luego el frotis cubierto con solución decolorante durante un minuto -Lavar con agua corriente.
-Escurrir y cubrir con solución contracolorante tres minutos con papel de filtro.
-Eliminar el papel de filtro y lavar con agua corriente.
-Dejar secar y observar con objetivo de inmersión.
Aspecto microscópico de la muestra teñida:
Los ooquistes se ven de color rojo vivo destacando sobre el fondo azul. El diagnóstico de la especie se hace en base al tamaño del ooquiste (en humanos).
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Fig. 1. Cámara de Mc Master para la cuantificación de huevos de helmintos en materia fecal.
Fig. 2. Kit de Kato Katz para recuento de huevos de helmintos. A, Espátula, B, plantilla de plástico, C, rejilla de nailon, D, portaobjetos.
Fig. 3. Técnica de Roberts O’Sullivan modificada para cultivo de larvas.
Fig. 4. Aparato de Baermann para recuperación de larvas de nematodes.
