Biología de los Microorganismos Ingeniería Civil
Ciencias para ingeniería: Microbiología Informe
Laboratorio 3: Morfología Celular
Grupo B-37
• Matías Bustos Andia
• Julio Castro González
• Ignacio Garcés Santander
Profesores:
• Alejandra Medina Armijo
• Felipe Scott Contador
RESUMEN
En esta experiencia de laboratorio se dispuso de una muestra conocida y una muestra problema, además de una de levadura y otra de un hongo, las cuales fueron todas sometidas a distintos procesos de tinción y de fijación para luego poder ser vistas a través del microscopio óptico. Esto se realizó con el propósito de conocer experimentalmente todos los procedimientos a seguir para lograr una correcta tinción de los microorganismos de una muestra dada, como también el correcto uso del microscopio.
Resultó difícil discriminar los distintos tipos de microbios en las muestras, pese a ello, los objetivos fueron cumplidos (aunque no con el éxito deseado). Además de lo anterior, se evidenció la importancia de la tinción celular y sus distintos tipos, por ejemplo, en el área de la salud.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN 3
1.1 OBJETIVO PRINCIPAL 3
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
2.1 CONCEPTOS PREVIOS 4
2.2 TINCIONES CELULARES 4
2.3 MICROSCOPÍA 6
3. MATERIALES 7
4. METODOLOGÍA 8
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES 10
5.1 TINCIÓN DE GRAM 10
5.2 TINCIÓN SIMPLE 11
6. CONCLUSIONES 13
7. REFERENCIAS 14
1. INTRODUCCIÓN
Se dispuso de varias muestras, y se requirió aplicar distintas técnicas de tinción para luego lograr dilucidar los distintos tipos de microorganismos en las muestras presentes, mediante el microscopio.
1.1 OBJETIVO PRINCIPAL
➔ Reconocer y diferenciar distintos tipos de microorganismos, por medio de la tinción diferencial y con ayuda de un microscopio óptico.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
➔ Conocer el uso correcto de un microscopio óptico.
➔ Aplicar distintas técnicas de tinción celular que permitan la diferenciación de estas.
➔ Comprender la importancia de la tinción diferencial.
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 CONCEPTOS PREVIOS
Para entender este informe, se debe conocer primero ciertos conceptos clave:
A. Célula eucariota o eucariótica: tipo de célula más compleja que las procariontes. Poseen organelos celulares.
B. Célula procariota o procarionte: carecen de organelos celulares.
C. Levadura: corresponden a hongos unicelulares microscópicos. Sus
características metabólicas son muy utilizadas en industrias; por ejemplo, en la elaboración de la cerveza, pan e incluso en la medicina.
D. Hongo: los hongos microscópicos pueden ser unicelulares (llamados levaduras) o filamentosos (denominados mohos). Los hongos son células eucariotas, más complejas que las bacterias. Se les clasifica como
vegetales, que crecen en ambientes húmedos.
E. Pared celular: cubierta celular compuesta por una capa de peptidoglicano, el cual es un polímero de proteínas y carbohidratos, que le dan estructura y forma a la célula, y también la protege del estrés osmótico.
F. Cápsula: es una estructura externa de la célula también conocida con el nombre de glicocálix, se encuentra formada por polisacáridos o
polipéptidos. Su función es conferir protección a la célula de una posible desecación y la fagocitosis.
G. Endosporas: célula inactiva que se desarrolla al interior de ciertas bacterias, en respuesta generalmente a la privación de nutrientes, debido a que es una estructura altamente resistente para preservar el material genético de la bacteria en tiempos de estrés extremos.
2.2 TINCIONES CELULARES
A. Tinción: proceso de coloración de células que permite observar sus formas y algunas estructuras celulares. Sin tinción alguna, es casi imposible observar algún microorganismo en el microscopio óptico. De aquí viene la importancia de las tinciones en la microbiología, ya que son las primeras herramientas
que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Si en un cultivo se tiene más de un tipo de microorganismo, y se desea distinguirlos fácilmente en el microscopio, se debe aplicar una llamada tinción diferencial.
Algunos tipos de tinciones son los siguientes:
Tinción simple:
- Es aquella que hace uso de un sólo tipo de colorante (se tiñen todos los microorganismos de un solo color) y sirve para observar tamaño y forma celular. Las tinciones más comunes son la de azul de metileno, tinta china, carbolfucsina, cristal violeta y safranina.
Tinción Diferencial:
- Consiste en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color, y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. Se utiliza, justamente, para diferenciar a dos o más tipos de células presentes en una muestra.
- Dentro de este tipo de tinciones destaca la siguiente:
Tinción de gram: es empleada en bacteriología para la visualización de bacterias. La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen que supuestamente contienen bacterias no identificadas, las bacteria que mantengan un color morado serán gram+ (pues esta es la causa de tener una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, y carencia de membrana celular externa) y las que mantengan un color rosado serán gram- (debido a que poseen una pared celular con una fina capa de peptidoglicano y una membrana celular externa). La tinción de gram, desarrollada por Hans Christian Gram en 1884, sigue siendo hasta el día de hoy una de las tinciones más utilizadas, debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta ser.
B. Colorantes: son sustancias que son capaces de dar color a material
biológico, ya sea tejido, células, etc., de tal forma de hacerlos visibles ante el microscopio óptico, que de otra forma serían generalmente transparentes.
Permiten conocer la forma y tamaño de microorganismos. Los colorantes son compuestos químicos orgánicos, generalmente sales, en los cuales uno de sus iones es el portador del color. Existen: colorantes ácido o aniónico, colorante básico o catiónico y colorantes neutro.
2.3 MICROSCOPÍA
A. Microscopía: es el conjunto de procedimientos empleados en las investigaciones por medio del microscopio.
B. Portaobjeto: lámina pequeña y delgada de vidrio en la que se colocan muestras para después ser observadas en el microscopio.
C. Cubreobjeto: lámina de vidrio o plástico aún más pequeña y delgada que se coloca sobre la muestra posicionada previamente sobre el portaobjetos. Esto es necesario en algunos casos, cuando se requiere que la muestra esté segura, cubierta.
D. Frotis: extensión de una muestra líquida sobre un portaobjetos.
E. Fijación: adherencia del frotis al portaobjetos, logrando la muerte de las células. Se pueden utilizar procedimientos físicos como el calor, o químicos como alcohol metílico, éter o formalina.
F. Mordiente: compuesto cuya función es aumentar la afinidad del colorante con las estructuras celulares.
3. MATERIALES
● Muestras de microorganismos: problema, conocida y levadura en medios líquidos.
● Muestra de hongo en medio sólido.
● 7 portaobjetos.
● 1 cubreobjeto.
● Etanol.
● Lactofenol.
● Cinta adhesiva.
● Agua destilada.
● Al menos un asa.
● 1 Mechero.
● Azul de metileno
● Cristal violeta.
● Lugol.
● Safanina.
● Microscopio óptico.
4. METODOLOGÍA
1. Se dispusieron los materiales, y las muestras: la conocida, problema, levadura y hongo.
2. Se desinfectaron todos los materiales, la zona de trabajo y las manos, aplicando alcohol.
3. Se procedió a encender el mechero.
4. Luego se prosiguió a calentar la punta de la asa con el mechero, hasta el punto de que esté al rojo vivo, de modo tal de quedar esterilizada.
5. Se corta un trozo pequeño de cinta adhesiva, y se coloca sobre el medio de cultivo sólido en donde se encuentra el hongo.
6. Esta cinta se coloca en el portaobjeto.
7. Se escoge una de las muestras restantes.
8. Se procedió a tomar la muestra con el asa, para luego aplicarla al portaobjeto (después, únicamente en el caso de la levadura, se le coloca encima el cubreobjeto).
9. Se deja secar el portaobjeto.
10. Se realizaron los pasos 7, 8 y 9 para todas las muestras conocida, problema y levadura.
11. Se procedió a realizar la fijación de las muestras con 2 gotas de etanol puro, y después se dejó secar en el portaobjeto, lejos del fuego.
12. A la muestra problema y de hongo se les aplicó unas gotas de tinción de gram, mientras que a la conocida y la levadura se les aplicó tinción simple.
13. Para las muestras con tinción simple se realizó el siguiente procedimiento:
se agregaron 2 gotas de azul de metileno y se esperaron 40 segundos;
luego se procedió a lavar con agua destilada la muestra, esto último de manera cuidadosa, para impedir que se desprenda una cantidad importante de microorganismos.
14. Para las muestras con tinción de gram, se realizaron los pasos 15 a 20.
15. Se aplicaron 2 gotas de cristal violeta a la muestra y se esperaron 40 segundos; luego de esto también se lavó la muestra cuidadosamente para remover el exceso de colorante.
16. Se realizaron los pasos 16 a 20 para cada una de las muestras.
17. Se procedió a aplicar 2 gotas de lugol, y nuevamente se esperó 40 segundos; después se lavó con agua destilada para quitar el exceso de lugol.
18. Se lavó cada muestra con etanol y luego lavarlo una última vez con agua destilada.
19. Se prosiguió a agregar a la muestra 2 gotas de safranina, posteriormente se esperó 40 segundos aproximadamente para dejar actuar a esta sustancia. Posterior a esto se lava nuevamente con agua destilada.
20. Se agregaron 2 gotas de etanol y se lavó por última vez.
21. Finalmente, cada muestra ya lista fue observada apropiadamente en el microscopio, usando aumentos de 4x, 10x y 40x.
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Los resultados fueron divididos según el método de tinción aplicado:
5.1 TINCIÓN DE GRAM Muestra problema:
Fig. 1
Aunque es prácticamente imperceptible en la fotografía (fig. 1), se observaron pequeñas diferencias de color en las células que se observan, lo que indica que en la muestra habían tanto gram negativas como gram positivas, y se logró identificarlas con éxito.
Muestra conocida:
Fig. 2
Al igual que en la fig. 1, en fig. 2 no es observable el cambio minúsculo en la coloración de las células en la fotografía, sin embargo, sí se evidenció esto.
5.2 TINCIÓN SIMPLE Conocida:
Fig. 3
En la imagen de la fig. 3 son visibles pequeños puntos en la muestra, que son microorganismos. Esto significa que se pudo teñir la muestra de manera correcta.
Problema:
Fig. 4
Es notorio que se logró teñir y distinguir claramente a los microbios presentes en esta muestra (ver fig. 4), los cuales poseen una morfología característica muy distinta a todas las otras muestras (forma de gusano). Por esta misma
particularidad, probablemente se trate de una cianobacteria.
Cabe mencionar que en la muestra problema o desconocida, como dato, se sabe que sólo se encontraban dos tipos de microorganismos. De estos, sólo se logró identificar uno, que es el que se observa en la figura 4. Esto posiblemente se deba a que, al remover el exceso de colorante, anterior a la observación en el microscopio, se pudo haber removido una porción importante de
Hongo:
Fig. 5
Cabe destacar que, a la hora de extraer los microorganismos del agar que contenía hongos, se realizó demasiada presión y por ello es claro notar una cantidad muy alta de microbios en la fotografía de la figura 5. Otra causa de esto puede ser que, a la hora de sacar la cinta adhesiva, hayan permanecido en ella células de la piel o incluso pelo, entorpeciendo así la fidelidad de los resultados observables.
Levadura:
Fig. 6
Se pudieron hacer visibles los microorganismos, como se puede apreciar en la figura 6, aunque se observan burbujas de líquido, lo que indica que no se hizo un procedimiento óptimo a la hora de remover el exceso de colorante, o en el lavado de la muestra sobre el portaobjeto.
6. CONCLUSIONES
Se logró exitosamente, aunque no idealmente, extraer una cantidad adecuada de muestra de microorganismos y aplicarles distintas tinciones. Las complicaciones con los resultados se pueden deber a errores en la tinción misma o en
procedimientos relacionados a esta, como haber extraído una cantidad excesiva o muy pequeña de microorganismos. Pese a esto, se logró reconocer los distintos microorganismos presentes con ayuda del microscopio.
Los procedimientos desarrollados en esta experiencia de laboratorio tienen una real importancia en la medicina, ya que gracias a las tinciones celulares de variados tipos, y realizando procedimientos similares a los realizados en esta experiencia de laboratorio, es posible realizar un diagnóstico oportuno de agentes infecciosos en la sangre de una persona, y por ende, del tratamiento oportuno de enfermedades de este tipo. (López-Jácome, 2004)
7. REFERENCIAS
Reino de los Hongos (p. 2). Recuperado el 20/10/2017, desde
http://contenidos.ceibal.edu.uy/fichas_educativas/_pdf/ciencias-naturales/reino- de-los-hongos/006-levadura.pdf
5, E. (2017). Morfología de Hongos. Microbiologia3bequipo5.blogspot.cl.
Recuperado el 20/10/2017, desde
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.cl/2014/11/morfologia-de-hongos.html
López Jácome, L. (2004). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología (pp. 11-12). Recuperado el 21/10/2017, desde
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Portaobjetos. TP - Laboratorio Químico. Recuperado el 21/10/2017, desde https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/materiales-e- instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/portaobjetos.html
Madigan, M. (2003). Brock Biología de los Microorganismos (10a ed.). Pearson.
“Manual de Prácticas de Laboratorio de Biología de los Microorganismos”
