Universidad de Córdoba
Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología
Tesis Doctoral
Papel etiopatogénico e implicaciones diagnósticas de microRNAs en el síndrome de ovario poliquístico
Etiopathogenic role and diagnostic implications of microRNAs in polycystic ovary syndrome
Beatriz Pineda Reyes
Córdoba, 25 de febrero de 2022
TITULO: PAPEL ETIOPATOGÉNICO E IMPLICACIONES DIAGNÓSTICAS DE MICRORNAS EN EL SÍNDROME DE OVARIO POLIQUÍSTICO
AUTOR: Beatriz Pineda Reyes
© Edita: UCOPress. 2022 Campus de Rabanales Ctra. Nacional IV, Km. 396 A 14071 Córdoba
https://www.uco.es/ucopress/index.php/es/
Universidad de Córdoba
Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología
Papel etiopatogénico e implicaciones diagnósticas de microRNAs en el síndrome de ovario poliquístico
Etiopathogenic role and diagnostic implications of microRNAs in polycystic ovary syndrome
Memoria de Tesis Doctoral presentada por Beatriz Pineda Reyes, licenciada en Medicina por la Universidad de Córdoba, para optar al grado de Doctora en Biomedicina por la Universidad de Córdoba.
Los Directores,
Dr. Manuel Tena Sempere Dr. Antonio Romero Ruiz
Catedrático de Fisiología de la Profesor de Bioquímica de la Universidad de Córdoba Universidad de Córdoba TENA
SEMPERE MANUEL JOSE - 30534904N
Firmado digitalmente por TENA SEMPERE MANUEL JOSE - 30534904N Fecha: 2022.02.25 00:47:51 +01'00'
ROMERO RUIZ
ANTONIO - 79221402H
Digitally signed by ROMERO RUIZ ANTONIO - 79221402H Date: 2022.02.25 00:56:59 +01'00'
TÍTULO DE LA TESIS:
Papel etiopatogénico e implicaciones diagnósticas de microRNAs en el síndrome de ovario poliquístico
DOCTORANDO/A: Beatriz Pineda Reyes
INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS
Eltrabajode Tesis Doctoral titulado “Papel etiopatogénico e implicaciones diagnósticas de microRNAs en el síndrome de ovario poliquístico” ha sido completado de forma muy satisfactoria por la doctoranda Beatriz Pineda Reyes en la Sección de Fisiología del Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología de la Universidad de Córdoba, entre los años 2014 y 2021, bajo nuestra dirección. El objetivo general de esta Tesis doctoral ha sido establecer un protocolo, basado en miRNAs, que permita detectar y clasificar pacientes con SOP, con y sin obesidad, en etapas tempranas, antes de la aparición de comorbilidades asociadas, así como avanzar en el conocimiento acerca de la etiopatogenia de esta enfermedad.
Durante el período predoctoral, la doctoranda ha cumplido ampliamente el objetivo general propuesto. Además, es de destacar que la realización de esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo de forma paralela a su trabajo como Facultativa Especialista de Área en la Unidad de Salud de la Mujer del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. En este sentido, es importante enumerar una serie de hitos reseñables alcanzados por la doctoranda durante esta etapa formativa, que incluyen: (i) contribuir al diseño y coordinación, junto con los Servicios de Ginecología y Obstetricia y de Endocrinología de este mismo hospital, de la primera consulta especializada en el diagnostico y tratamiento del SOP y sus comorbilidades asociadas (infertilidad, obesidad y síndrome metabólico); (ii) generar la primera cohorte de muestras humanas de pacientes con SOP, bien establecidas en base a criterios clínicos, en el Nodo del Hospital Universitario Reina Sofía del Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía (SSPA); (iii) ayudar a automatizar la obtención de plasma sanguíneo para investigación en SOP desde la consulta clínica, hito determinante en la agilización de
la toma de muestras en este tipo de pacientes, ya que debe hacerse en un momento muy concreto del ciclo menstrual; (iv) adquirir una considerable destreza en el manejo de diferentes técnicas de biología molecular; (v) reforzar sus conocimientos fisiopatológicos en el área de estudio y; vi) estimular su pensamiento crítico.
Por otro lado, la excelente labor investigadora de la doctoranda durante este periodo se ha traducido hasta la fecha en: (i) 1 artículo científico como co-primera autora publicado en la revista European Journal of Endocrinology, en primer cuartil del área Endocrinology & Metabolism, (ii) 1 artículo como coautora en la revista International Journal of Gynecology and Obstetrics, en primer cuartil del área Obstetrics and Gynecology, (iii) dos registros de protección intelectual, como co-inventora, en forma de patente, relacionados con el desarrollo de herramientas moleculares de diagnóstico de SOP, directamente derivadas de los resultados de esta tesis doctoral; y (iv) más de 25 posters y 2 comunicaciones orales a congresos regionales, nacionales e internacionales, entre los que destacan los de la Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia y el Congreso Internacional de Medicina Prenatal. Todo ello define, a nuestro juicio, un óptimo rendimiento de la doctoranda durante su periodo de formación predoctoral.
Por todo lo anteriormente expuesto, se autoriza la presentación de esta Tesis Doctoral.
Córdoba, 21 de febrero de 2022 Firma de los directores
Fdo.: Manuel Tena Sempere Fdo.: Antonio Romero Ruiz
TENA
SEMPERE MANUEL JOSE - 30534904N
Firmado digitalmente por TENA SEMPERE MANUEL JOSE - 30534904N Fecha: 2022.02.25 00:48:14 +01'00'
ROMERO RUIZ
ANTONIO - 79221402H
Digitally signed by ROMERO RUIZ ANTONIO - 79221402H Date: 2022.02.25 11:33:43 +01'00'
Agradecimientos
Quiero agradecer en primer lugar a mis directores de tesis, a Manolo Tena, por dejarme formar parte de su grupo y dedicarme parte de su valioso tiempo, me siento totalmente en deuda por esto; de Antonio Romero podría extenderme mucho ya que ha sido todo en esta tesis, la verdad que tengo la cierta sensación de que sin él quizás no podría presentar este trabajo actualmente, la paciencia y las ganas de hacer bien este proyecto merecen todo mi reconocimiento profesional y personal.
A Cecilia por su colaboración en todo el procesamiento de muestras y los análisis moleculares; y a Encarni, María Jesús y Sara por su apoyo y supervisión de todas las tareas de laboratorio durante toda la tesis, sin sus consejos y su experiencia todo habría sido aún más difícil.
A UCAIB, en especial a Ipek Guler por supervisar todos los análisis estadísticos. A David por la realización de toda la bioinformática y los análisis nCounter.
A Biobanco y al servicio de análisis clínicos del Hospital Reina Sofía de Córdoba.
Al servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital Reina Sofía de Córdoba, a todos mis compañeros que cada día me ayudan a ser mejor ginecóloga. A todos los que me apoyaron en el reclutamiento de pacientes, en especial a Juan Lorente y toda la Unidad de Reproducción Asistida. A José Eduardo por permitirme poner en marcha este proyecto. A mi socia, encontrarte ha sido lo mejor que me ha dado la ginecología.
Al servicio de Endocrinología del Hospital Reina Sofía de Córdoba, en especial a la Dra. Muñoz, que valoró cada una de las pacientes, y me asesoró en tanto necesité.
A cada una de las pacientes que mostraron su conformidad desinteresada para participar en el estudio y contribuir sin saberlo a mejorar la medicina.
A mi madre, un día leí de ella que era capaz de humillar las inteligencias más altivas, quien lo escribió la conocía bien, pero le faltó decir que además era la mujer más fuerte, optimista, sencilla y buena del mundo.
A mis hermanos, a Manolo y Rafa, la sal y el azúcar, lo blanco y lo negro, la responsabilidad y la locura, que han hecho que durante toda mi vida haya encontrado el equilibrio perfecto para tener una infancia sobre todo feliz y que son el mejor ejemplo para intentar ser una buena persona.
A Pepe, por su amor y por su apoyo incondicional siempre. Eres la suerte de mi vida.
A Marta, por enseñarme el significado de la palabra mamá, eres inteligente, divertida y buena, eres mi sueño hecho realidad. A Blanca, has revolucionado mi mundo, eres alegría y vitalidad en estado puro. Sois luz y vitamina para el alma. Ser vuestra madre es mi verdadera vocación y robaros tiempo para hacer esta tesis ha sido el peaje mas duro que he pagado.
A mi padre, que me impulsó y empujó a diario para realizar esta tesis, que me inculcó con su ejemplo el valor del trabajo duro cada día, que hizo que no me rindiera nunca. Gracias por hacerme sentir que podía llegar donde quisiera, por ser tu ojito derecho y por mimarme todo lo mimable. Esta tesis es tuya.
Beatriz Pineda Reyes.
ÍNDICE
RESUMEN ABREVIATURAS
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
I. INTRODUCCIÓN ... 17
I.1. DEFINICIÓN Y PREVALENCIA ... 17
I.2. ETIOPATOGENIA ... 19
I.2.1. Factores genéticos ... 20
I.2.2. Factores epigenéticos ... 21
I.2.3. Factores hormonales ... 23
I.2.3.1. Exceso de andrógenos ... 23
I.2.3.2. Alteraciones de la secreción de gonadotropinas ... 28
I.2.3.3. Alteraciones en la liberación de AMH ... 30
I.2.3.4. Alteración en la señalización GABA ... 31
I.2.4. Factores metabólicos ... 32
I.2.4.1. Obesidad. ... 32
I.2.4.2. Resistencia a insulina. ... 35
I.2.4.3. Dislipidemia ... 36
I.3. MANIFESTACIONES CLÍNICAS ... 39
I.3.1. Desregulación de la menstruación y alteración de la fertilidad .. 39
I.3.2. Hiperandrogenismo ... 39
I.3.3. Manifestaciones metabólicas ... 41
I.3.3.1. Obesidad ... 41
I.3.3.2. Alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono ... 41
I.3.3.3. Síndrome metabólico ... 42
I.3.3.4. Alteraciones relacionadas con la gestación ... 42
I.4. DIAGNÓSTICO ... 43
I.4.1. Diagnóstico clínico y criterios diagnósticos ... 43
I.4.2. Biomarcadores como herramientas auxiliares en el diagnóstico de SOP 45 I.4.2.1. Hormona antimulleriana ... 45
I.4.2.2. Ferritina y oligoelementos ... 46
I.4.2.3. Lípidos ... 47
I.4.2.4. Afamina ... 49
I.4.2.5. Prolidasa ... 49
I.4.2.6. Galectina 3 ... 50
I.4.2.7. Marcadores de inflamación y proteína sérica amiloidea ... 50
I.4.2.8. Monosacáridos ... 51
I.4.2.9. Cd40L ... 51
I.4.2.10. Glucoproteina α2 de zinc (ZAG) ... 52
I.4.2.11. Fetuínas A y B ... 52
I.4.3. miRNAs como biomarcadores no invasivos de SOP ... 54
I.5. TRATAMIENTO. ... 56
I.5.1. Dieta y modificación del estilo de vida ... 56
I.5.2. Anticonceptivos orales ... 56
I.5.3. Antiandrógenos ... 58
I.5.3.1. Espironolactona ... 58
I.5.3.2. Flutamida ... 58
I.5.3.3. Acetato de ciproterona ... 59
I.5.3.4. Finasteride ... 59
I.5.4. Insulinosensibilizantes ... 59
I.5.4.1. Metformina ... 59
I.5.5. Inductores de ovulación ... 60
II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ... 62
III. MATERIALES Y MÉTODOS ... 64
III.1. COMITÉ DE ÉTICA. ... 64
III.2. SELECCIÓN DE PACIENTES Y DISEÑO DE LA COHORTE. ... 64
III.2.1. Criterios de inclusión en el grupo Control ... 65
III.2.2. Criterios de inclusión en el grupo de Casos SOP ... 66
III.2.3. Técnica de estudio y variables ... 66
III.2.3.1. Entrada en el estudio y toma de variables antropométricas ... 66
III.2.3.2. Segunda visita y toma de variables analíticas ... 68
III.3. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE MIRNAS EN PLASMA ... 70
III.3.1. Aislamiento del Plasma ... 70
III.3.2. Aislamiento de miRNA ... 70
III.3.3. Análisis nCounter® ... 71
III.3.4. Retrotranscripción y cuantificación de miRNAs por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (Q-PCR) o cuantitativa ... 73
III.3.5. Análisis estadístico ... 74
III.3.5.1. Variables clínicas ... 74
III.3.6. Análisis bioinformático ... 75
IV. RESULTADOS ... 77
IV.1. COHORTE DE PACIENTES Y DATOS CLÍNICOS ... 77
IV.2. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE MIRNAS EN PLASMA DE MUJERES CON SOP ... 81
IV.3. DESARROLLO DE UN NUEVO MÉTODO DE NORMALIZACIÓN ... 83
IV.4. COMBINACIÓN DE MIRNAS CANDIDATOS PARA CLASIFICAR A MUJERES OBESAS Y NO OBESAS CON SOP ... 87
IV.5. DISEÑO DE UN NUEVO PROTOCOLO DE CLASIFICACIÓN DE MUJERES CON SOP UTILIZANDO DETECCIÓN DIRIGIDA DE MIRNAS EN PLASMA . 90 IV.6. PREDICCIONES BIOINFORMÁTICAS DE VÍAS DESREGULADAS DE MIRNAS EN SOP ... 92
V. DISCUSIÓN ... 97
VI. CONCLUSIONES ... 105
VII. BIBLIOGRAFÍA ... 106
ANEXOS
ANEXO I: Aprobación comité de ética de la investigación de Córdoba.
ANEXO II: Formulario de información al paciente y consentimiento informado.
RESUMEN
1. Introducción o motivación de la tesis
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una enfermedad de alta prevalencia que afecta al 5-10% del total de mujeres en edad reproductiva, cuyos síntomas se inician habitualmente durante la adolescencia o la edad adulta temprana1,2. Esta patología se caracteriza por problemas de fertilidad3, hiperandrogenismo, oligo- o amenorrea y/o ovarios quísticos4. Además, el SOP se asocia muy frecuentemente con alteraciones endocrino-metabólicas, en ocasiones severas, tales como la resistencia a insulina y obesidad, problemas cardiovasculares y de hiperplasia endometrial que pudiera desembocar en cáncer de endometrio5,6. En este contexto, está demostrado que un diagnóstico en edad adolescente acompañado de modificaciones del estilo de vida puede evitar en un alto porcentaje el desarrollo de estas patologías asociadas7. Sin embargo, en la actualidad, se estima que más del 70% de mujeres afectadas por esta patología están mal diagnosticadas o directamente están sin diagnosticar8.
Las bases fisiopatológicas de este síndrome permanecen en gran medida desconocidas, lo que obliga a un mejor conocimiento de los sistemas fisiológicos que controlan la reproducción, así como de su interacción con otras funciones corporales estrechamente relacionadas, como la homeostasis energética y metabólica9. En este contexto, datos experimentales recientes sugieren que, junto a los mecanismos genéticos clásicos, diversos sistemas de regulación epigenética participan en la modulación de aspectos clave de la función reproductiva y del estado metabólico del organismo10–12. Estos incluyen no sólo mecanismos tales como la metilación del DNA o las modificaciones postraduccionales de las histonas, sino también elementos no convencionales de regulación mediante pequeños RNAs no codificantes, de entre los que destacan los microRNAs (miRNAs)13.
Diversas evidencias experimentales sugieren que el SOP se origina antes de la pubertad, o incluso que su génesis se remonta al desarrollo fetal, aun cuando numerosas manifestaciones clínicas del mismo, tanto reproductivas como metabólicas, no aparezcan hasta la edad adulta14. De hecho, dado que el diagnóstico de SOP se basa en la identificación de una serie de criterios clínicos (por ej. Criterios
Rotterdam), éste se produce habitualmente de forma diferida, especialmente por la concurrencia en etapas más tempranas de cambios fisiológicos del eje reproductor (por ej., durante la adolescencia) que pueden enmascarar el cuadro15. Además, éste está condicionado por la necesidad de un diagnóstico diferencial de patologías que pudieran cursar con síntomas similares al SOP, tales como el síndrome de Cushing, la hiperprolactinemia, la amenorrea hipotalámica, los tumores productores de andrógenos o la hiperplasia suprarrenal congénita. En este contexto, la posibilidad de identificar de forma temprana pacientes con predisposición o en fases incipientes de SOP sería de gran utilidad, con objeto de prevenir las principales complicaciones reproductivas y metabólicas asociadas a esta patología.
Este trabajo de Tesis Doctoral se marca como objetivo último la identificación de marcadores de utilidad diagnóstica que permitan una mejora en la caracterización bioquímica y diagnóstico temprano de pacientes con SOP, posibilitando además de una mejor estratificación de los casos, la predicción de posibles complicaciones asociadas como la obesidad. Para ello, se han realizado análisis de expresión de miRNAs en muestras de plasma de pacientes con SOP, tanto a gran escala mediante la tecnología nCounter®, como dirigidos mediante PCR en tiempo real.
2. Contenido de la investigación
En base a información disponible en la literatura, se ha establecido como hipótesis de trabajo para esta Tesis Doctoral, que determinados sistemas de miRNAs participan en el control de aspectos importantes de la función ovárica, y que su desregulación puede causar determinados procesos patológicos que afectan a este órgano reproductor, tales como el SOP. Igualmente, se considera demostrado que cambios en la expresión de miRNAs específicos de tejidos, tales como el ovario y/o diversos tejidos metabólicos, en pacientes con SOP puedan tener un impacto en los perfiles circulantes de dichos miRNAs, lo que a su vez puede presentar importantes implicaciones fisiopatológicas y diagnósticas, favoreciendo en ultimo término una mejor identificación y clasificación de las pacientes afectadas.
En este contexto, el OBJETIVO GENERAL de esta Tesis Doctoral es establecer un protocolo, basado en miRNAs, que permita detectar y clasificar pacientes con SOP en etapas tempranas, antes de la aparición de comorbilidades asociadas, así como
Para alcanzar este objetivo se han implementado estudios en muestras humanas, estableciéndose tres OBJETIVOS ESPECÍFICOS (OE):
OE1: Identificar miRNAs circulantes diferencialmente expresados en plasma de pacientes con SOP.
Para alcanzar este objetivo, se generó una cohorte bien establecida mediante la colección de muestras de plasma de ciento setenta mujeres de casos (SOP) y controles durante tres años seguidos. Se establecieron cuatro grupos de estudio, de acuerdo con dos variables, el diagnóstico de SOP y presencia o no de obesidad. La obesidad se definió como IMC >30kg/m2 según estándares clínicos.
Se han caracterizado los perfiles clínicos, antropométricos y hormonales de los cuatro grupos de pacientes y controles establecidos, mediante el análisis de 32 variables diferentes. El análisis comparativo de estas variables en los cuatro grupos establecidos, puso claramente de manifiesto que los cambios significativos entre mujeres con SOP y controles se daban en los parámetros antropométricos o variables clínicas que comúnmente caracterizan al SOP (ecografía ováricas alteradas con ovarios poliquísticos, ciclos menstruales irregulares, hirsutismo, LH, ratio LH/FSH y testosterona), mientras que los cambios significativos entre mujeres obesas con IMC>30 kg/m2 y no obesas, ocurrieron en las variables antropométricas y clínicas relacionadas con el metabolismo. Este fenómeno ha ocasionado que todos los estudios y análisis posteriores se hayan llevado a cabo clasificando a las pacientes previamente según el umbral IMC> <30 kg/m2.
Para la detección de miRNAs circulantes alterados en pacientes SOP, se llevó a cabo un análisis de expresión masiva de miRNAs mediante la tecnología nCounter® en plasma de un subgrupo de mujeres con SOP (24 muestras individuales en total, de las que 19 fueron finalmente consideradas para análisis masivo de datos, en base a controles internos de calidad), separadas según padecían o no obesidad.
Nuevamente, los resultados obtenidos en este análisis masivo indicaron que para lograr marcadores útiles es más eficiente clasificar o detectar a las mujeres con SOP si previamente se estratifican según sean obesas o no obesas, ya que estos datos demuestran que la obesidad se comporta como un factor de confusión en el
diagnóstico molecular de SOP; de ahí que cuando la obesidad está presente en todos los grupos de pacientes estudiadas, la comparación entre SOP y sus controles no genera diferencias significativas. Esta evidencia también está soportada por el hecho de que aquellas comparaciones entre grupos de pacientes en los que nunca coinciden la obesidad y el SOP, fueron las que mayores diferencias generaron. Así, los análisis bioestadísticos de todos los miRNAs alterados en el análisis nCounter®
dieron como resultado diez miRNAs potencialmente interesantes.
Por otro lado, debido a la originalidad de este estudio, se estableció la necesidad de desarrollar un sistema de referencia con capacidad de normalizar valores de miRNAs individuales. Como resultado de interés de esta tesis, se ha desarrollado un método pionero de normalización, que se ha utilizado para calcular el valor final de los miRNAs individuales utilizados como biomarcadores en SOP. El valor de normalización se obtiene de la media geométrica de hsa-miR-103a-3p, hsa-miR- 125a-5p y hsa-miR-1976, y ha sido nombrado como mR3, como acrónimo de
"referencia por 3 miRNAs".
OE2: Establecer un algoritmo o combinación única de miRNAs que junto con los datos clínicos de las pacientes permita diagnosticar y clasificar a las mismas.
El siguiente paso en la búsqueda de miRNAs con capacidad de detectar y clasificar a pacientes con SOP con y sin obesidad, fue la validación individual de los candidatos seleccionados en el análisis masivo (plataforma nCounter®) del punto anterior, pero en este caso en las 176 muestras de la cohorte.
En este sentido, los diez miRNAs seleccionados fueron: hsa-miR-191-5p, hsa-miR- 27b-3p, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-33a-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-let7i-5p, hsa-miR- 28-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143-3p y hsa-miR-539-5p.
El mejor control para detectar mujeres con SOP no obesas (PL) fue el grupo control sin obesidad (NL), y el mejor control para clasificar a las mujeres con SOP y obesidad (PO) fue el grupo control con obesidad (NO).
A partir de los datos obtenidos para estos diez miRNAs medidos en toda la cohorte, se aplicaron regresiones logísticas para determinar la utilidad de los miRNAs circulantes y sus combinaciones, a fin de lograr una identificación fiable de SOP.
Estos análisis demostraron la capacidad de los diez miRNAs seleccionados para
discriminar correctamente a las mujeres con SOP no obesas (PL) de las mujeres sin SOP y con IMC<30 kg/m2 (NL). Del mismo modo, este conjunto de 10 miRNAs permitió la discriminación de mujeres con SOP y obesidad (PO) frente a mujeres sin SOP y obesidad (NO).
Según estos hallazgos, se construyó un árbol de decisiones para clasificar a las mujeres no obesas con o sin SOP. En este modelo, los miRNAs con mayor capacidad de clasificación fueron: hsa-miR-191-5p, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa- miR-28-3p y hsa-miR-142 -3p.
Usando el mismo método, se construyó un árbol de decisión para poder clasificar a las mujeres obesas con o sin SOP. En este modelo, los miRNAs que mejor clasificaban a estas pacientes fueron hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-143-3p y hsa- miR-539-5p.
OE3: Avanzar en la caracterización del papel fisiopatológico de sistemas de miRNAs en la aparición del SOP.
Mientras que el conjunto de datos descritos en este trabajo define una herramienta sólida para el diagnóstico preciso de SOP, ya sea en pacientes obesas o no obesas, estos datos presentan igualmente posibles implicaciones fisiopatológicas, relacionadas con los niveles desregulados de estos miRNAs específicos, que si bien no demuestran de manera concluyente asociaciones de causalidad, sí permiten establecer inferencias de interés patogénico, ya sea para el desencadenamiento de SOP o de sus complicaciones. En este sentido, se han usado herramientas bioinformáticas para la predicción de genes y vías biológicas potencialmente desreguladas por el conjunto de miRNA seleccionados en el contexto del SOP. Estos análisis iniciales han destacado una serie de rutas comunes, algunas relacionadas con la inflamación y la señalización de insulina que pueden contribuir a la patogénesis o complicaciones de la enfermedad. Aunque estos datos iniciales requieren validación en cohortes independientes, serán la base de futuros estudios experimentales, incluyendo estudios in vitro y análisis in vivo, con el fin de revelar la contribución potencial de estos miRNAs alterados en pacientes con SOP e implicados en la aparición de comorbilidades, incluyendo alteraciones metabólicas graves.
3. Conclusión
Las principales conclusiones que se derivan de esta Tesis Doctoral son:
1. Los sistemas de regulación epigenética mediados por miRNAs dejan huella en el plasma sanguíneo y están alterados en mujeres con SOP tanto obesas como no obesas. Además, los miRNAs alterados en SOP se solapan con aquellos alterados en la obesidad femenina. Por lo tanto, para un diagnóstico molecular correcto del SOP, es necesario hacer una separación previa de pacientes según IMC <>30 kg/m2.
2. Algoritmos formados a partir de los miRNAs, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-93a- 5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-28-3p y hsa-miR-142 -3p, tienen capacidad de clasificar a pacientes no obesas con y sin SOP.
3. Algoritmos formados a partir de los miRNAs, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-28- 3p, hsa-miR-143-3p y hsa-miR-539-5p, tienen capacidad de clasificar a pacientes obesas con y sin SOP.
4. La media geométrica obtenida por qPCR de los miRNAs hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-125a-5p y hsa-miR-1976 (mR3), es un buen valor de normalización para la cuantificación, mediante esta técnica, de miRNAs individuales en muestras de plasma de pacientes concretos.
4. Bibliografía
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ABREVIATURAS
17 OHP 17-hidroxiprogesterona
ACTH Hormona adrenocorticotrópica AES Androgen Excess Society
AMH Hormona antimulleriana ARC Núcleo Arcuato
AUC Área bajo la curva
cPSA Antígeno prostático complejo CMN Células mononucleares DHEA Dehidroepiandrosterona DHT Dehidrotestosterona DM Diabetes mellitus
EGF Factor crecimiento epidérmico fPSA Antígeno prostático libre FG Ferriman-Gallwey
FSH Hormona foliculoestimulante GABA Ácido gamma aminobutírico
GnRH Hormona liberadora de gonadotropinas GWAS Estudios de asociación de genoma completo HDL Lipoproteínas alta densidad
HOMA Índice HOMA (Homeostasis assessment model) HURS Hospital Universitario Reina Sofía
IGF Factor de crecimiento similar a insulina IL-6 Interleuquina 6
IMC Índice de masa corporal
IMIBIC Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba LASSO Operador de selección y contracción mínima absoluta
LDL Lipoproteínas de baja densidad LH Hormona luteinizante
lncRNA ARN de larga cadena no codificante miRNAs MicroRNA
mR3 Referencia por 3 microRNA NKB Neuroquinina B
NL No SOP, no obesa NO No SOP, obesa pcr Proteína C reactiva
PCR Reacción en cadena de la polimerasa PL SOP delgada
PNA Andrógenos en la etapa prenatal PO SOP obesa
PSA Antígeno prostático específico
q-PCR reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real QC Control de calidad
IR Insulinoresistencia
ROC Características operativas del receptor
ROS Especies Reactivas de Oxígeno (Reactive oxygen species) SAA Proteína sérica amiloide A
SDHEA Sulfato dehidroepiandrosterona
SHBG Proteína transportadora de hormonas sexuales.
SOP Síndrome de ovario poliquístico
TGF-b Factor crecimiento transformante beta TMAO N-óxido de trimetilamina
TNF Factor de necrosis tumoral
UCAIB Unidad central de apoyo a la investigación biomédica VAT Tejido adiposo visceral
ZAG Glucoproteína-α2 de zinc
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Representación esquemática de la esteroidogénesis 24 Figura 2. Escala de Ferriman-Gallwey 41 Figura 3: Escala de Ferriman y Gallwey 68 Figura 4: Variables clínicas grupos SOP y sanas 79 Figura 5: Variables clínicas grupos no obesas y obesas 79
Figura 6: Gráficos “Volcano” 83
Figura 7: Validación de diez miRNAs diferencialmente expresados 89 Figura 8: Curva ROC y árbol de decisión PL vs NL 92 Figura 9: Curva ROC y árbol de decisión PO vs NO 92 Figura 10: Predicción bioinformática de vías enriquecidas 95
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Criterios diagnósticos de SOP 18 Tabla 2: Grupos de casos y controles 65 Tabla 3: Variables antropométricas analizadas 67 Tabla 4: Clasificación del índice de masa corporal según OMS 67 Tabla 5: Variables analíticas 69 Tabla 6: Código de identificación y secuencia de los miRNAs 74 Tabla 7: Caracterización clínica de la cohorte de estudio 78 Tabla 8: Cuantificación relativa mediante qPCR de 18 miRNAs NO vs NL 85 Tabla 9: Cuantificación relativa mediante qPCR de 18 miRNAs PL vs NL 85 Tabla 10: Cuantificación relativa mediante qPCR de 18 miRNAs PO vs NL 86 Tabla 11: Cuantificación relativa mediante qPCR de 18 miRNAs P vs NL 86 Tabla 12: Lista de miRNAs clasificados (rangos promedio) por cuatro
métodos para la selección de genes de referencia 86 Tabla 13: Coeficientes de correlación 88 Tabla 14: Relación de las 15 vías principales generadas por las bases de datos Panther y Reactome en mujeres con y sin SOP 94 Tabla 15: Relación de las 15 vías principales generadas en mujeres con SOP no
obesas y obesas 95
I. INTRODUCCIÓN
I.1. DEFINICIÓN Y PREVALENCIA
El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP), es una enfermedad endocrino- metabólica compleja y heterogénea cuyas manifestaciones clínicas se inician en la etapa peri-puberal, con una prevalencia estimada media entre el 5-7% de mujeres en edad reproductiva, que puede alcanzar hasta el 20% según las series y criterios empleados. Este síndrome fue descrito por primera vez en 1935 por Stein y Leventhal en pacientes con obesidad, hirsutismo y anovulación crónica; además desde un punto de vista anatomopatológico, las pacientes también presentaban aumento del tamaño de los ovarios1. Desde este primer estudio, el concepto y diagnóstico del síndrome ha sufrido variaciones a lo largo de los años. Un avance significativo se produjo con el desarrollo de la tecnología para detectar y medir hormonas reguladoras de la reproducción, añadiendo al diagnóstico la secreción anómala de gonadotropinas e hiperandrogenemia2. Posteriormente surge el desarrollo de técnicas de imagen no invasivas, como la ecografía, lo que ha permitido incluir como parte del diagnóstico la morfología ovárica3.
Gracias a estos avances, surgen nuevas definiciones y protocolos de clasificación y diagnóstico del síndrome. Así, en 1990, la conferencia de NICHD (Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver) publicó por primera vez un consenso sobre las claves diagnósticas del síndrome, que se detallan a continuación:
i) Hiperandrogenismo y/o hiperandrogenemia ii) Disfunción menstrual
iii) Exclusión de otros trastornos
Posteriormente expertos de sociedades americanas y europeas se reunieron en Rotterdam (2003), donde se describieron los criterios diagnósticos más usados hasta el momento; este consenso definió que el síndrome debía ser diagnosticado cuando estuviesen presentes al menos dos de los siguientes signos o síntomas:
1) Oligo/amenorrea: La oligomenorrea se define como periodos menstruales con una frecuencia mayor a 35 días o menos de 9 ciclos en un año, y la amenorrea como ausencia total de ciclo menstrual durante al menos 3 meses consecutivos.
2) Ecografía con ovarios poliquísticos: Aparición de 12 o más folículos de entre 2 y 9 mm o bien la existencia de un volumen ovárico aumentado (mayor de 10 ml). Es suficiente con que esto suceda en uno de los dos ovarios.
3) Hiperandrogenismo clínico y/o bioquímico, con exclusión de otros trastornos relacionados con el exceso de andrógenos.
En 2006 la Sociedad de Exceso de Andrógenos (AES) se reúne, ante la falta de consenso en el campo, para definir nuevos criterios. En este caso se establece que para el diagnóstico de SOP deben estar presentes los tres criterios definidos en el apartado anterior 4.
Finalmente, el último consenso data de 2018, donde se establece que para pacientes con menarquia reciente (menos de 8 años desde la primera menstruación), la ecografía transvaginal no debe usarse como criterio diagnóstico debido a la alta prevalencia de morfología poliquística ovárica. En mujeres adultas con disfunción ovulatoria y signos o síntomas de hiperandrogenismo, no se requiere tampoco el uso de ecografía para el diagnóstico, aunque es un valor a tener en cuenta para la clasificación de fenotipos. Un resumen de los diferentes consensos de diagnóstico fue publicado en la “International evidence-based guideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome” en 2018 y en el artículo publicado por McCartney y colaboradores en 20165 (Tabla 1).
Tabla 1: Criterios diagnósticos de SOP5.
Variable Instituto Nacional
de Salud (NIH) Rotterdam Exceso de andrógenos
y la Sociedad SOP Hiperandrogenismo* Requisito Requiere dos de las tres
características (hiperandrogenismo, DO, morfología SOP ecográfica)
Requisito
Oligo-ovulación o
anovulación† Requisito
Requiere dos de las tres características (hiperandrogenismo,
DO, morfología SOP ecográfica)
Requiere DO o morfología SOP ecográfica Características
morfológicas de los ovarios
poliquísticos‡
No necesario
Requiere dos de las tres características (hiperandrogenismo,
DO, morfología SOP ecográfica)
Requiere DO o morfología SOP ecográfica
Nº de combinaciones que cumplen los criterios del síndrome de ovario poliquístico
Dos HIperandrogenismo +
disfunción ovulatoria (DO) Hiperandrogenismo +
DO+ morfología SOP ecográfica
Cuatro HiperAndrogenismo + DO+
morfología SOP ecográfica Cualquiera combinación de dos
características previas
Tres
Hiperandorgenismo + DO + morfología SOP ecográfica Hiperandrogenismo + DO Hiperandrogenismo + morfología SOP ecográfica
En este contexto, la existencia de un diagnóstico eficiente es un reto, debido principalmente a la falta de consenso y a la enorme heterogeneidad de los síntomas.
Un ejemplo que ilustra este problema es la existencia de ovarios con morfología poliquística en aproximadamente un 20% de mujeres sin SOP. Además, las pruebas diagnósticas para uno de los criterios como es el hirsutismo son subjetivas y no usan sistemas validados en todas las poblaciones. Como consecuencia, la falta de una herramienta de diagnóstico y pronóstico eficiente produce una alteración en los datos reales de prevalencia. Estas alteraciones se deben principalmente a la comparación de estudios basados en diferentes criterios diagnósticos, pudiendo utilizarse el más restrictivo (AES) o el más amplio (criterios de Rotterdam). Un estudio transversal llevado a cabo en Ankara, Turquía, en el que participaron 392 mujeres entre 18 y 45 años, muestra diferentes prevalencias de SOP según el criterio diagnóstico usado, siendo del 6,1% para NIH, 19,9% para los criterios de Rotterdam o del 15,3%, en el caso de la AES6. Además, se han encontrado discrepancias incluso entre los estudios que utilizan los mismos criterios diagnósticos, lo que puede deberse a diferencias en las poblaciones de estudio, dificultades en la definición fenotípica y las limitaciones de diseño6.
En definitiva, existe un consenso generalizado en la comunidad científica de la necesidad de mejorar las herramientas diagnósticas, especialmente al tratarse de una de las principales patologías en mujeres de edad reproductiva.
I.2. ETIOPATOGENIA
El SOP es un síndrome multifactorial donde interactúan factores genéticos y ambientales, que condicionan los diferentes fenotipos7. Aunque en los últimos años se han hecho importantes avances en cuanto al conocimiento de las causas que lo generan, sigue existiendo bastante heterogeneidad y controversia en esta área. Así, hay líneas de investigación que apoyan el exceso de andrógenos como causa principal de los trastornos encontrados en el síndrome; y por otro lado hay evidencias que apuntan al hiperandrogenismo, no como causa sino como una consecuencia de las alteraciones metabólicas. En este apartado se resumen los principales mecanismos etiopatogénicos descritos hasta la fecha.
I.2.1. Factores genéticos
La hipótesis de la base genética como inicio del SOP surge tras la observación de la agregación familiar entre pacientes afectas de SOP. Casi un 50% de las pacientes diagnosticadas tienen un familiar de primer grado diagnosticado con el síndrome8. Azziz y colaboradores publicaron en 2016 una serie de más de 100 genes implicados en el desarrollo de SOP9. Estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han establecido susceptibilidades de determinados loci en genes relacionados con la síntesis de andrógenos, señalización de insulina y foliculogénesis en pacientes con SOP. En este sentido, se establecieron correlaciones genotipo-fenotipo para ver qué afectación producía cada alteración genética; así por ejemplo, la alteración en el locus del gen receptor de hormona foliculoestimulante (FSHr) se asocia con una reducción en los niveles de FSH y la alteración en el gen receptor de la hormona luteinizante/gonadotropina coriónica (LH/CGR), que se encuentra sobre-expresado en mujeres con SOP y provoca un aumento de la sensibilidad del ovario a LH, lo que se asocia a una elevada síntesis de andrógenos en las células de la teca del ovario10. Por otro lado, estos análisis GWAS dieron a conocer un locus específico del gen DENND1a como factor de riesgo de SOP. La transcripción de DENNd1a genera dos variantes principales, V1 y V2. En concreto, la expresión de una de las variantes (V2) se encuentra en mayor proporción en células de la teca de pacientes con SOP11. La caída en la expresión de esta variante provoca que las células de la teca reduzcan la producción de andrógenos y su sobreexpresión en células tecales normales hace que cambien a un fenotipo de SOP con un aumento en la síntesis de andrógenos12. A pesar de estos datos, los análisis no son del todo concluyentes y han mostrado diferencias según las etnias, por lo que se requieren análisis adicionales de correlación genotipo-fenotipo para la mayoría de los loci identificados. Esto podría ser una herramienta de cribado de pacientes adolescentes con alto riesgo de padecer SOP, en las que una intervención en el modo de vida temprana pueda reducir las manifestaciones y comorbilidades asociadas.
En conclusión, hasta la fecha la máxima heredabilidad contabilizada en loci de susceptibilidad es menor al 10%, lo cual hace probable que factores ambientales y otros que ocurren durante el desarrollo fetal puedan estar implicados en el desarrollo del síndrome9.
I.2.2. Factores epigenéticos
Distintos factores epigenéticos parecen estar involucrados en la desregulación de la expresión de genes implicados en el desarrollo del SOP mediante modificaciones postranscripcionales que no afectan a la secuencia original del DNA. Estas modificaciones suelen ser metilaciones del DNA y modificaciones de histonas, que una vez adquiridas pueden persistir de por vida en un organismo sin necesidad de más estímulo13. Las modificaciones epigenéticas pueden desencadenarse por factores ambientales que desde la vida prenatal hacen que un individuo desarrolle una enfermedad en la vida adulta14. Dentro de la patología del SOP, el factor ambiental más estudiado y relacionado con su desarrollo ha sido la exposición por vía materna a altos niveles de andrógenos, provocando una alteración en la organización de órganos reproductivos y de circuitos hipotalámicos14.
A parte de estos mecanismos convencionales de regulación epigenética, durante las últimas décadas han surgido nuevos elementos de regulación génica, entre los que destacan los microRNA (miRNAs). Son pequeñas moléculas de RNA no codificante, de entre 18-25 nt de longitud, que operan como reguladores postranscripcionales de la expresión de numerosos genes, preferentemente mediante la unión a la región 3’ no traducida (UTR) del RNA mensajero diana, provocando en la mayoría de los casos silenciamiento génico por escisión, bloqueo de la traducción o aumento de la degradación de los transcritos.
Los mecanismos responsables del control del desarrollo y la función ovárica son diversos y muy complejos. Entre otros, evidencias recientes sugieren un papel de los sistemas de regulación por miRNAs en el ovario. Así, estudios en ratones han demostrado que la eliminación selectiva del complejo enzimático Dicer, y por tanto el bloqueo de la capacidad de generar miRNAs maduros, en el ovario resulta en una severa disfunción en la formación de folículos y alteraciones en la maduración de los ovocitos, lo que provoca una ausencia total de ovulación e infertilidad15. No obstante, la eliminación mediante técnicas de genómica funcional en ovocitos de DGCR8 (cofactor de la enzima Drosha, con la que forma un complejo enzimático activo encargado de la maduración de los miRNAs) no se tradujo en efectos adversos detectables sobre la maduración de los ovocitos16, lo que sugeriría que el proceso de maduración de los miRNAs no parece esencial para la viabilidad de los mismos, aunque no pueden descartarse fenómenos de compensación o redundancia con
otros cofactores durante el desarrollo. En líneas generales, aunque diversos estudios han mostrado la presencia de un gran número de miRNAs en el ovario, la importancia funcional de éstos y de sus dianas específicas en el desarrollo y regulación funcional de la gónada femenina aun está por determinar.
A pesar de estas evidencias, aún fragmentarias, que sugieren un papel de sistemas de miRNAs en el control del desarrollo y la función ovárica normal, sus implicaciones en patologías ováricas, incluyendo el SOP, no han sido suficientemente aclaradas. En este sentido, se ha demostrado la asociación de perfiles aberrantes de expresión de miRNAs con cuadros de infertilidad y mal desarrollo de los ovocitos17. Por otra parte, los análisis de los perfiles transcriptómicos de ovocitos de pacientes con SOP han sugerido que un gran número de genes diferencialmente expresados podrían ser dianas potenciales de regulación por miRNAs18.
Otras evidencias apuntan a la implicación de diversos sistemas de miRNAs en el control de aspectos clave del metabolismo, cuya desregulación pudiera contribuir a las manifestaciones clínicas del SOP. Así, la sobre-expresión de mir-143 inducida por obesidad se ha relacionado con la inhibición de la señalización de insulina y alteraciones del metabolismo de la glucosa; por otra parte, evidencias experimentales sugieren que el sistema Lin28/let-7 (éstos últimos, una familia de miRNAs con hasta 11 miembros en humanos) participa de forma destacada en el control del metabolismo de la glucosa19. Este sistema es especialmente interesante en el contexto de los fenómenos de control integrado del metabolismo y la función reproductora, toda vez que estudios GWAS demostraron también la relación existente en humanos entre la edad de menarquía y variaciones en o próximas al locus donde se localiza el gen Lin28B20.
Estudios recientes han demostrado que los mecanismos de regulación epigenéticos, además de en el tejido dónde realizan su función reguladora pueden dejar huella en sangre periférica, por lo que tienen el potencial de ser utilizados como biomarcadores de la enfermedad. En este sentido, se han detectado marcadores de metilación del ADN alterados en sangre periférica de pacientes con SOP, así como en sus hijas, las cuales son propensas a sufrir el síndrome21. Por otro lado, se han descrito miRNAs alterados en suero22, plasma, orina23, saliva24, semen25 y líquido folicular26, ya sea en forma libre o bien encapsulados en vesículas27. En este caso, se
ha documentado que ciertos miRNAs se expresan diferencialmente en el líquido folicular o en la sangre de los pacientes con SOP28 (este apartado se desarrolla en detalle en la sección I.4.3 de la introducción).
I.2.3. Factores hormonales
I.2.3.1. Exceso de andrógenos Esteroidogénesis
El conjunto de reacciones enzimáticas que hacen posible la síntesis de hormonas esteroideas recibe el nombre de esteroidogénesis, cuya etapa inicial depende de la translocación del colesterol al interior de la mitocondria por acción de la proteína de regulación aguda de la esteroidogénesis, StAR (Figura 1). Debido a la complejidad de estas rutas, nos centraremos en esta introducción en describir la ruta de biosíntesis de andrógenos y en concreto aquellos procesos que han sido relacionados con SOP. La reacción inicial, que provoca la conversión de colesterol a pregnenolona, se observa en las gónadas (ovarios y testículos), en las glándulas suprarrenales, placenta y en algunas células del sistema nervioso central; comienza con la acción de la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (P450scc), precedida de la acción traslocadora del colesterol por StAR antes mencionada.
El gen CYP17A1, codifica el citocromo P450c17, el cual cataliza la conversión de pregnenolona en dehidroepiandrosterona (DHEA), iniciándose la vía clásica de síntesis de andrógenos. La actividad de la enzima P450c17 aumenta en las células de la teca ovárica de pacientes con SOP y depende de las hormonas LH en el ovario y de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) en la glándula suprarrenal29. Aunque estudios más completos de este gen no lo catalogan como causa que origina el SOP, sí que su alteración puede contribuir a la fisiopatología del mismo30.
La vía alternativa de la síntesis de andrógenos es responsable de la conversión de la progesterona (que deriva de la pregnenolona) primero en 17-hidroxi progesterona (17-OHP) y luego en androstenediona. Este primer paso es catalizado por la enzima 21 hidroxilasa 21A2, codificada por CYP21A2. La deficiencia de esta enzima es la principal causa de hiperplasia suprarrenal congénita; por ello, un aumento de 17- OHP podría estar relacionado con el hiperandrogenismo y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo y aunque la alteración del gen CYP21 provoca un fenotipo y síntomas similares a los de pacientes con SOP, tampoco este gen parece ser clave
24
en el origen del SOP31. La androstenediona se produce en la glándula suprarrenal a partir en la 17-OHP y requiere de la 17-hidroxiesteroide-deshidrogenasa para la conversión a testosterona, dehidrotestosterona (DHT) y estradiol.
Figura 1: Representación esquemática de la esteroidogénesis32. Incluye la vía clásica (azul oscuro) y la vía alternativa (azul claro) de síntesis de andrógenos que dan como resultado la síntesis de 5α-dihidrotestosterona (DHT). Ambas vías dependen de la translocación del colesterol al interior de la mitocondria. La vía clásica progresa desde dehidroepiandosterona hasta la testosterona, donde ésta es transformada en DHT; la aromatización de la androstenediona y de la testosterona conecta con la vía de síntesis de estradiol (rosa). Los esteroides de la vía alternativa no se pueden aromatizar y llegan a la síntesis de DHT sin pasar por la testosterona.
La foliculogénesis normal requiere de la síntesis de andrógenos ováricos. Sin embargo, se trata de un proceso complejo donde el exceso de andrógenos puede producir una foliculogénesis desordenada que da como resultado un folículo inmaduro y una atresia folicular. Así, en un folículo ovárico en condiciones fisiológicas, la LH actúa sobre las células intersticiales y tecales induciendo secreción de androstenediona. La FSH actúa sobre las células de la granulosa y activa la aromatización de androstenediona a estradiol por la acción de la aromatasa. El
1 N. Krone et al., Genotype-phenotype analysis in congenital adrenal hyperplasia due to P450 oxidoreductase deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 97, E257–E267 (2012).
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3 V. Dhir et al., Differential inhibition of CYP17A1 and CYP21A2 activities by the P450 oxidoreductase mutant A287P. Mol. Endocrinol. 21, 1958–1968 (2007).
4 A. V. Pandey, P. Kempn ´a, G. Hofer, P. E. Mullis, C. E. Flück, Modulation of human CYP19A1 activity by mutant NADPH P450 oxidoreductase. Mol. Endocrinol. 21, 2579–2595 (2007).
5 C. E. Flück, S. Parween, M. N. Rojas Velazquez, A. V. Pandey, Inhibition of placental CYP19A1 activity remains as a valid hypothesis for 46,XX virilization in P450 oxidoreductase deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 117, 14632–14633 (2020).
6 N. Reisch et al., Prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia caused by P450 oxidoreductase deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 98, E528–E536 (2013).
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Cholesterol
Pregnenolone Progesterone
17-hydroxy-
pregnenolone 17-hydroxy- progesterone
11-deoxy- corticosterone
11-deoxy-
cortisol Cortisol Cortico-
sterone Aldo-
sterone
Dehydroepi-
androsterone Androstene- dione
5α-pregnane- 17α-ol-3,20-
dione
5α-17-hydroxy- pregnanolone
5α-androsterone
Testosterone 5α-dihydro- testosterone
(DHT) Estrone
17β-Estradiol
Classic androgen
pathway
Alternative androgen
pathway
Mineralocorticoids
Glucocorticoids
Estrogens
CYP17A1POR
CYP19A1POR CYP17A1POR
CYP17A1POR CYP17A1POR
CYP17A1POR
CYP21A2POR
POR CYP21A2
CYP19A1POR
5α-androstanediol
SRD5A2 SRD5A1
SRD5A1
Fig. 1. Schematic representation of steroidogenesis including the classic androgen pathway (dark blue) and the alternative androgen
biosynthesis pathway (light blue), both resulting in the synthesis of potent 5α-dihydrotestosterone (DHT). Alternative pathway steroids are 5α-reduced upon pathway entry and therefore cannot be aromatized. The electron donor enzyme P450 oxidoreductase (POR) supports the activities of CYP21A2 21-hydroxylase (yellow), CYP17A1 17α-hydroxylase (white), CYP17A1 17,20-lyase (blue), and CYP19A1 aromatase (pink) in a mutation-dependent, differential manner.
Reisch et al. PNAS | June 30, 2020 | vol. 117 | no. 26 | 14635
StAR
desarrollo de un folículo dominante se asocia con un incremento en los niveles de estradiol, que dominan sobre las concentraciones de andrógenos33.
En mujeres sanas premenopausicas, la capa interna de la teca del folículo del ovario y la zona fascicular de la corteza suprarrenal contribuyen casi de forma similar a la secreción de andrógenos34. La LH y la ACTH son las hormonas responsables de controlar las enzimas implicadas en la formación de androstenediona a partir de colesterol en el ovario y en la glándula suprarrenal respectivamente. A partir de esta androstenediona se produce la testosterona en tejidos circulantes como pulmón, hígado o piel. En el tejido adiposo, ésta se convierte, por un lado en estrona, lo que hace que en mujeres obesas sea frecuente encontrar un estado hiperestrogénico y por otro lado, en la glándula suprarrenal, en DHT por la acción de la 5a-reductasa sobre dicha testosterona35.
Moduladores autocrinos, paracrinos y endocrinos
La interacción entre las funciones de las células de la teca y de la granulosa con la síntesis de diferentes factores paracrinos es esencial tanto para el desarrollo de ovocitos como para la transición del folículo primordial al folículo primario y la ovulación34. Cada proceso de la foliculogénesis esta controlado por diferentes factores, siendo la FSH la que regula la selección del folículo dominante36.
Los andrógenos y los estrógenos son moduladores negativos de los efectos de la LH, mientras que el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y la insulina desempeñan un papel modulador positivo, provocando estos dos últimos una acción sinérgica con la LH y por ende un aumento en la producción ovárica de andrógenos.
El ovario posee receptores para IGF, y en condiciones de hiperinsulinemia la insulina se une a ellos provocando un aumento en producción de andrógenos por las células tecales. Esto induce un descenso de la concentración de proteína transportadora de hormonas sexuales (SHBG) con el consiguiente aumento de andrógenos libres.
Otros moduladores son: i) las inhibinas, las prostaglandinas y la angiotensina que promueven la síntesis de andrógenos, y ii) el factor de crecimiento transformante beta (TGF)-β, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de necrosis tumoral (TNF) y las citoquinas que juegan un papel inhibidor en la producción androgénica33. Tanto el TGF como el EGF inhiben la aromatasa, y consecuentemente la síntesis de estradiol.
La producción ovárica de andrógenos también está indirectamente correlacionada con el desarrollo de las células de la granulosa y la actividad aromatasa asociada. La conversión de androstenediona a estradiol ocurre en un folículo sano que mide aproximadamente 8 mm de diámetro. Sin embargo, en folículos atrésicos, no se producen, siendo el resultado un aumento de la concentración de androstenediona.
Este mecanismo se interrumpe en los folículos atrésicos y quísticos, que se generan por un desequilibrio entre andrógenos, hormona antimulleriana (AMH), LH y FSH.
Así, un exceso de LH produce un aumento en la secreción de andrógenos, pero la conversión de andrógenos a estradiol no es suficiente en este contexto de atresia, y esto da lugar a un paro en el crecimiento folicular con la aparición de un mayor número de folículos atrésicos, que provoca una anovulación crónica. Los folículos que miden >2-5 mm de diámetro crecen bajo la influencia de FSH en las células de la granulosa.
La activina es responsable de la inducción de la producción de estrógenos, mientras que simultáneamente inhibe el efecto de la inhibina y, por consiguiente, la producción de andrógenos en las células de la teca.
Exposición prenatal a andrógenos
Según la teoría de Barker, acontecimientos adversos durante el desarrollo embrionario como la desnutrición, la exposición a toxinas o cambios hormonales, puede aumentar la susceptibilidad del individuo a desarrollar ciertas enfermedades crónicas37.
En relación al SOP, investigaciones en monos Rhesus demostraron que la presencia de elevados niveles de andrógenos intra-ováricos inhibía la apoptosis y promovía la proliferación de células de la granulosa con una alta tasa de expresión de receptores de andrógenos38. Por otro lado, el equipo de Abbott y colaboradores estudiaron la evolución de monos Rhesus sometidos a altos niveles de andrógenos durante la gestación, confirmando los resultados anteriores39. En un estudio posterior, los machos de oveja nacidos de madres expuestas a testosterona mostraron una mayor expresión del receptor de FSH en los testículos40. La FSH aumenta el nivel sérico de AMH (ver apartado I.4.2 de la introducción) al promover la proliferación de células de Sertoli.
En humanos, múltiples estudios han centrado sus esfuerzos en demostrar esta teoría. Así, Xita y colaboradores llevaron a cabo una revisión de trabajos basados en estudios con mujeres sometidas a altos niveles de andrógenos durante la gestación debido a hiperplasia suprarrenal congénita o tumores productores de andrógenos y concluyeron que a pesar de la normalización de dichos niveles tras el nacimiento, estas mujeres manifestaban anovulación y otros síntomas del SOP41.
Por otro lado, Petermann y colaboradores compararon a las niñas de madres con SOP con niñas nacidas de madres sanas (grupo control). Los resultados mostraron que el nivel sérico de AMH y el volumen ovárico en el grupo de niñas nacidas de madres con SOP fue significativamente mayor que en el grupo control durante la infancia y la niñez42. Similares resultados obtuvieron Crisosto y colaboradores al comparar a niñas de entre 11 y 17 años nacidas de madres con SOP vs madres sanas, encontrando en las primeras niveles mas elevados de AMH, LH e insulina43. Además, estos mismos autores demostraron previamente que si durante el embarazo la paciente con SOP era tratada con metformina los niveles de AMH eran similares a los encontrados en el grupo control44.
Finalmente, es importante destacar la relación directa entre mujeres embarazadas que padecen SOP y el desarrollo del síndrome durante la edad adulta de sus hijas y que se achaca a la exposición prenatal a niveles de elevados de testosterona. En este contexto, en los embarazos normales, el radioinmunoensayo y la espectrometría de masas han demostrado ser herramientas útiles para predecir el sexo fetal según los niveles de testosterona. De esta manera, se han determinado los niveles de testosterona en el líquido amniótico de mujeres embarazadas con y sin SOP a las 12- 24 semanas, quedando de manifiesto el potencial en cuanto a programación epigenética en el útero durante el desarrollo postnatal debido al hiperandrogenismo fetal45.
En definitiva, muchos de los casos de mujeres con SOP podrían originarse durante la etapa prenatal, en una forma de programación temprana alterada, dando lugar a cambios en la función y la morfología ovárica, como se describe en los modelos experimentales y en humanos. Sin embargo, los síntomas están ocultos hasta la etapa postpuberal, cuando se desatan todos los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la alteración de la reproducción y el metabolismo.
