Propiedades Mecánicas de Membranas
como Factor de Resistencia a Péptidos
Antimicrobiales
Nury Paula Santisteban Vela
Director de Tesis: Chad Leidy
Departamento de Física
Quisiera dedicar este trabajo a mi madre quien con su perseverancia y esfuerzo me ha ayudado a alcanzar mis metas y a mi hijo quien con su amor me llena de ganas
Agradecimientos
Quiero agradecer a todas las personas que me brindaron su amor y apoyo, a mi hijo que es el motor de mi vida y a mi familia quienes sacrificaron muchas cosas por permitirme alcanzar logros, por supuesto a Chad por sus enseñanzas e infinita paciencia.
Resúmen
Los péptidos antimicrobiales (PA) son cadenas cortas de aminoácidos capaces de disrumpir la función membranal en células bacterianas. Por tal razón estos pépti-dos hacen parte de los sistemas de defensas que tienen los seres vivos en contra de procesos infecciosos ya que son capaces de matar las bacterias causantes de dichos procesos. El mecanismo por el cual la disrupción de la membrana genera muerte celular es aun tema de diversos estudios. En general se cree que los PAs son atraí-dos a la membrana celular a través de interacciones electrostáticas entre los lípiatraí-dos de la bicapa y los péptidos. Para ciertos tipos de PAs, como magainin, protegrins, alamethicin y melittin, la adhesión a la membrana genera una serie de cambios configuracionales que dan lugar a la formación de poros iónicos. La formación de poros induce una perdida del potencial electroquímico de la membrana, resultando en muerte celular.
La secuencia de eventos para la generación de poros comienza con la adhesión de PAs a la superficie. Los péptidos se posicionan perpendicularmente a la bicapa generando así una reducción en el espesor de la bicapa el cual es directamente proporcional a la concentración de péptido adherido. Esta disminución del espesor genera entonces una expansión en el área de la membrana por la adición de moléculas de péptido en la región de las cabezas lipídicas. Al llegar a una concentración superficial crítica, los péptidos cambian su posicionamiento perpendicular a la bicapa y se posicionan paralelamente a los lípidos. La agregación de péptidos paralelos a la membrana da lugar a la formación de poros.
En este trabajo exploramos como el estado físico de la membrana y su organi-zación lateral es influenciada por la agregación del péptido Mag-H2. Para poder ver esto estudiamos membranas apoyadas de DMPC, POPC y DPPC por medio de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM), Espectroscopia de Fuerzas con AFM y espectroscopia de fluorescencia. En presencia y ausencia de Mag-H2.
Índice general
Índice general iv
Índice de figuras vi
Lista de Abreviaciones ix
1. Introducción 1
1.1. Glicerofosfolípidos . . . 1
1.2. Auto ensamblaje de lípidos . . . 2
1.2.1. Niveles de empaquetamiento . . . 3
1.2.2. Transiciones de fase en bicapas lipídicas . . . 4
1.3. Bacterias . . . 8
1.3.1. Bacterias Gram Negativas . . . 10
1.3.2. Bacterias Gram Positivas . . . 11
1.3.3. La Composición de las Membranas Celulares Bacterianas . . . 11
1.4. Enfermedades Infecciosas generadas por Bacterias . . . 12
1.4.1. Definición y blancos de antibióticos. . . 13
1.4.2. Resistencia Bacteriana a Diferentes Tipos de Antibióticos . . . 14
1.5. Péptidos Antimicrobiales (PA) . . . 15
1.5.1. Magainin2 y Magainin-H2 (Mag y Mag-H2) . . . 16
1.5.2. Reducción del espesor de la membrana lipídica por PAs. . . 17
1.5.3. Membranas Apoyadas, Liposomas y Lípidos . . . 21
1.5.3.1. Liposomas . . . 21
ÍNDICE GENERAL
2.1.0.2. Usando Espectroscopía de Fuerzas para medir la deformación
en la bicapa causada por un péptido Antimicrobial . . . 28
3. Materiales y Métodos 30 3.1. Materiales . . . 30
3.2. Stocks y Soluciones . . . 30
3.2.1. Lípidos . . . 30
3.2.2. Magainin-H2 . . . 30
3.2.3. Solución Salina (100 mM deN aCl) . . . 31
3.2.4. Solución de Calceina . . . 31
3.3. Preparación de Vesículas Unilaminares (VUs) . . . 31
3.4. Preparación de Vesículas Unilaminares (VUs) rellenas de calceina . . . 32
3.5. Preparación de Bicapas Lipídicas Apoyadas (BLAs) . . . 32
3.6. Medidas de Escape de Calceina . . . 33
3.7. Medidas de Laurdan . . . 33
4. Resultados 34 4.1. Suavizamiento de la membrana como factor de resistencia a péptidos Antimi-crobiales . . . 34
4.1.1. Importancia de los niveles de empaquetamiento lipídicos en la membrana como factores de resistencia a un evento de ruptura. . . 38
4.1.1.1. Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) . . . 40
4.1.1.2. Espectroscopia de Fuerzas . . . 45
4.1.2. Resistencia a Mag-H2 y su correlación con la respuesta mecánica de mem-brana . . . 52
4.1.2.1. Cambios de Grosor inducidos por Mag-H2 determinados por Microscopía de Fuerza Atómica . . . 52
4.1.2.2. Cambios en propiedades mecánicas de membranas inducidos por Mag-H2 . . . 56
5. Conclusiones 61
Índice de figuras
1.1. Auto ensamblaje de fosfolípidos en un medio acuoso para formar bicapas lipídicas.[5] 2
1.2. volumen ocupado por un lípido. Modificado de [30] . . . 4
1.3. Representación esquemática de la transición de fase termotrópica para una bicapa lipídica que pasa de un estado gel ordenado a un estado líquido-cristalino ó fluido. los diagramas de la membrana representan el nivel de empaquetamiento de cada estado[36]. . . 5
1.4. Representación esquemática del posicionamiento de la sonda fluorescente Laur-dan entre los fosfolípidos. . . 7
1.5. Representación esquemática de las diferencias en bacterias Gram negativas y Gram positivas (modificado de [40]). . . 10
1.6. Estructura química de los ácidos grasos de fosfolípidos membranales(Modificado de[41]). . . 12
1.7. Principales blancos de antibióticos.(Modificado de [40]). . . 14
1.8. Principales mecanismos de la resistencia a antibióticos.(Modificado de [40]). . . . 15
1.9. Secuencia de aminoácidos de Mag 2. Modificado de ([10]). . . 16
1.10. Secuencia de aminoácidos de Mag- H2. Modificado de ([10]). . . 17
1.11. En la parte (a) podemos ver el péptido sobre a la bicapa lipídica. En la parte (b) podemos ver el péptido ya insertado en la bicapa lipídica que ha reducido el grosor de la bicapa y generado diferentes poros en la bicapa.[28] . . . 18
1.12. Esquema de un poro toroidal.[19] . . . 18
1.13. Ilustración del efecto deNB/Len la reducción del grosor de una bicapa de DOPC
inducida por melitina. Estas gráficas se realizaron a partir de la relación1.8. [20]. 21
ÍNDICE DE FIGURAS
2.1. Esquema de una curva de fuerza realizada en una BLA, El cantilever se mueve con velocidad constante hacia la bicapa. La primera deflección de la punta es debida a las interaciones elctrostáticas y de hidratación entre la bicapa y la punta seguida de la deflección propia de cuando la punta entra en contacto directo con la membrana. Esta primera región puede ser considerada de deformación elástica, a medida que la punta deforma la membrana va aumentando la fuerza aplicada resultando finalmente en un evento de ruptura de la membrana.[2] . . . 26
2.2. Midiendo la fuerza de adhesión entre membrana y vidrio con AFM. La anterior figura es una muestra esquemática de la curva de fuerza-desplazamiento contra el desplazamiento de la punta hacia la muestra. La fuerza de adhesión es tomada de la máxima fuerza alcanzada a medida que la punta se aleja de la membrana hasta la fuerza de separación una vez la punta a liberado completamente la membrana.[31] 27
2.3. Esquemas asociados con las posibles formas de penetración de la punta a la bicapa cuando la punta ejerce una creciente fuerza sobre la bicapa. En (a) la punta penetra a través de la bicapa induciendo una compresión en el área de cada lípido cercano a la punta. En (b) la punta induce una compresión de los lípidos generando asi una expansión en el area lateral de cada lípido asociada a la compresión vertical de estos últimos. [2] . . . 28
4.1. Intensidad de la calceina liberada a medida que Mag-H2 genera poros en los liposomas de POPC a través del tiempo con una concentración de péptido de3
µM a 45oC . . . . 36
4.2. Actividad de Mag-H2 en POPC, DMPC y DPPC . . . 37
4.3. Medidas del nivel de empaquetamiento de la membrana realizadas con Laurdan en función de la temperatura realizadas en vesículas de100nmde DPPC y POPC 39
4.4. (Panel A) Imagen de membrana de DPPC a24oC(figura a) y45oC(figura b). Las
barras representan una longitud de 1µm. (Panel B) Histogramas que muestran los pixeles de altura Z en las imágenes a y b. Los dos picos principales representan la superficie de la mica y la parte más alta de los parches de la membrana de DPPC. . . 41
4.5. (Panel A) Imagen de membrana de POPC a30oC (figura a) y45oC (figura b).
(Panel B) Histogramas que muestran los pixeles de altura Z en las imágenes a y b. Los dos picos principales representan la superficie de la mica y la parte más alta de los parches de la membrana de POPC. . . 43
4.6. Curvas típica de Fuerza de acercamiento contra separación de la punta a la membrana de POPC a30oC. . . . 45
ÍNDICE DE FIGURAS
4.7. (Gráfica de barras lateral)Histograma de Fuerza de rompimiento de la membrana de POPC a30y45oC(bin size= 0.5nN).(Gráfica de barras inferior) Histograma
de Distancia de penetración de la punta en la membrana de POPC 30 y45oC
(bin size= 0.5nm). (Gráfica XY central)Distancia de penetración de la punta en la membrana contra la Fuerza necesaria para romperla a30y45oC. . . 47
4.8. Curvas de Fuerza contra separación de acercamiento de la punta a la membrana de POPC a30oCy45oC . . . . 48
4.9. (Gráfica de barras lateral)Histograma de Fuerza de rompimiento de la membrana de DPPC a45oC (bin size= 2.5nN).(Gráfica de barras inferior) Histograma de
Distancia de penetración de la punta en la membrana de DPPC a 45oC (bin size= 0.5nm). (Gráfica XY central)Distancia de penetración de la punta en la membrana contra la Fuerza necesaria para romperla a45oC. . . . 50
4.10. Distancias de Penetración Dp vs Fuerza de Ruptura Fr para la membrana de
POPC a30oCy45oC y para la membrana de DPPC a45oC . . . . 51
4.11. (Panel A) Imagen de membrana de DPPC a 45oC sin Mag-H2(figura a)y con
2µM de Mag-H2 (figura b). (Panel B) Histogramas que muestran los pixeles de altura Z en las imágenes a y b. Los dos picos principales representan la superficie de la mica y la parte más alta de los parches de la membrana de DPPC. . . 53
4.12. (Panel A) Imagen de membrana de POPC a 45oC sin Mag-H2(figura a)y con
2µM de Mag-H2 (figura b). (Panel B) Histogramas que muestran los pixeles de altura Z en las imágenes a y b. Los dos picos principales representan la superficie de la mica y la parte más alta de los parches de la membrana de POPC. . . 55
4.13. (Gráfica de barras lateral)Histograma de Fuerza de rompimiento de la membrana de DPPC con2µMde concentración de Mag-H2 y sin Mag-H2 a45oC(bin size=
2nN).(Gráfica de barras inferior) Histograma de Distancia de penetración de la punta en la membrana de DPPC con 2 µM de concentración de Mag-H2 y sin Mag-H2 a45oC(bin size= 0.5nm). (Gráfica XY central)Distancia de penetración de la punta en la membrana contra la Fuerza necesaria para romperla a45oC en
presencia y ausencia de Mag-H2 . . . 57
4.14. (Gráfica de barras lateral)Histograma de Fuerza de rompimiento de la membrana de POPC con2µMde concentración de Mag-H2 y sin Mag-H2 a45oC(bin size=
0.5nN).(Gráfica de barras inferior) Histograma de Distancia de penetración de la punta en la membrana de POPC con2µM de concentración de Mag-H2 y sin
Lista de Abreviaciones
−0
I Energía por molécula para los péptidos en estado I
∆A Cambio en el área superficial de la membrana.
0S Energía intrinseca de ligamiento por péptido para los péptidos en estado S
AS Incremento de área superficial de la bicapa inducido por un péptido
Ka Coeficiente de estiramiento superficial de una bicapa
KB Constante de Boltzmann
L Número de lípidos presentes en una bicapa
n Número de péptidos necesarios para generar un poro
NB Cantidad de péptidos presentes en determinada muestra
Nn Número de poros presentes en una bicapa
NS Número de péptidos en el estado S
P C Fosfatidilcolina
P E Fosfatidil etanolamina
P G Fosfatidilglicerol
AFM Microscopía de Fuerza Atómica (AFM por sus siglas en inglés Atomic Force Microscopy)
Mag-H2 Magainin-H2
Mag2 Magainin2
1
Introducción
Todas las células están compuestas de moléculas orgánicas las cuales podemos clasificar en cuatro clases diferentes:azúcares,amino ácidos,nucleótidos y los ácidos grasos.
Estas moléculas se combinan formando entidades más grandes llamadas macromoléculas ó macromoléculas ensambladas. Hay cuatro clases de dichas entidades, los polisacáridos, las proteínas (también llamadas poliaminoácidos ó polipéptidos), los ácidos nucleicos (también llamados polinucleótidos) y lasgrasas (lípidos y membranas).
1.1.
Glicerofosfolípidos
Los glicerofosfolípidos son los lípidos mas abundantes en las células. Estos lípidos son deri-vados del sn-glicerol-3-fosfato en donde se esterifican dos ácidos grasos en la posición sn 1 y 2 del glicerol formando el compuesto 1,2-diacil-sn-glicerol-3-acido fosfórico. Al ácido fosfórico se agregan diferentes grupos funcionales que normalmente son neutros pero polares (como glicerol) o con carga positiva (como colina) generando un grupo fosfatidil-X, el cual corresponde a la cabeza polar del glicerofosfolípido [30].
Los glicerofosfolípidos que se encuentran en las membranas celulares tienen una carga neta negativa o neutra a pH fisiológico. Esto depende del grupo funcional X vinculado al fosfatidil
dos clases de modificación que se pueden observar en los àcidos grasos son la longitud de la ca-dena, la presencia de insaturaciones y de ramificaciones. Por su parte, la longitud de las cadenas va a depender del número de carbonos los cuales puedes oscilar entre 14 y 22 en células huma-nas [39]. Adicionalmente las cadenas pueden presentar insaturaciones, las cuales corresponden a dobles enlaces entre dos cabonos adyacentes. Generalmente se presentan cadenas lipídicas monoinsaturadas, pero la presencia de polinsaturaciones también es prevalente llegando hasta tener cuarto o seis insaturaciones en cadenas largas (20:4 y 22:6). En membranas bacterianas también son prevalentes la presencia de ramificaciones en las cadenas que se generan con la presencia de grupos metilos en los carbones terminales de la cadena lipídica [39].
1.2.
Auto ensamblaje de lípidos
Figura 1.1: Auto ensamblaje de fosfolípidos en un medio acuoso para formar bicapas lipídicas.[5]
A diferencia de los azúcares, los amino ácidos y los nucleótidos, los cuales se conforman como polímeros estabilizados por puentes covalentes, los lípidos se agrupan formando ensambles su-pramoleculares de partículas estabilizados por interacciones débiles no covalentes [30], las cuales están dominadas por la energética de interacción entre el lípido y el medio acuoso. La cabeza polar interactúa favorablemente con agua a través de puentes de hidrogeno. En cambio, las cadenas de hidrocarbonos, al ser apolares no presentan interacciones electrostáticas favorables con el agua. Al entrar en contacto con el medio acuoso, los hidrocarbonos que conforman las cadenas lipídicas inducen un alto nivel de orden en las moléculas de agua que las rodean. Estas estructuras ordenadas de agua presentan un costo entrópico alto no favorable. Al agregarse los lípidos se inducen la liberación desplazan las moléculas de agua que rodeaban el lípido hacia el medio, induciendo un aumento en la entropía del sistema [30]. Este aumento en entropía repre-senta una energía libre favorable que promueve el proceso de auto agregación. Adicionalmente,
se presentan interacciones tipo van der Waals entre las cadenas de hidrocarbonos de lípidos vecinos que proveen una energía de interacción adicional que permite estabilizar el sistema auto ensamblado[30].
Las estructuras lipídicas auto ensambladas dependen de la geometría de las moléculas lipí-dicas. En el caso de tener moléculas con geometría cónica se generan estructuras miscelares, las cuales son pequeñas esferas con un núcleo conformado por cadenas de hidrocarbonos y una su-perficie conformada por las cabezas polares expuestas al medio acuoso. Normalmente los lípidos propensos a generar estructuras miscelares contienen solo una cadena de hidrocarbonos (lisolí-pidos y detergentes). En el caso de tener moléculas cilíndricas los lí(lisolí-pidos generan estructuras laminares denominadas bicapas. Las bicapas están conformadas de dos capas de moléculas en donde las cadenas lipídicas de cada capa se orientan hacia el interior de la lamina y las cabezas polares se orientan hacia el exterior de la lamina para entrar en contacto con el medio acuoso como se muestra en la figura1.1. Los lípidos con propensidad para formar bicapas son lípidos con dos cadenas de hidrocarbonos [30].
La bicapa lipídica cumple la función de barrera y reguladora de transporte en las células. La membrana es esencial para mantener los gradientes electroquímicos necesarios para la síntesis de biomoléculas en mitocondrias y bacterias y para la propagación de impulsos en neuronas. Adicionalmente, la alta movilidad lateral de los lípidos promueve los procesos de agregación dinamica de proteínas membranales lo cual es útil para la regulación de procesos de señaliza-ción. Esta alta movilidad lateral es consecuencia de las interacciones débiles entre lípido-lípido y lípido-proteína [8]. Otra consecuencia importante de las interacciones débiles entre los lípidos es que la bicapa se puede considerar como un ensamble de moléculas débilmente acopladas en dos dimensiones fluctuando en una matriz acuosa [30]. Como consecuencia, este ensamblaje de lípidos puede presentar comportamientos relacionados a un sistema de partículas débilmente acopladas, como transiciones de fase termotrópicos y composicionales y la posible coexistencia de fases, los cuales no se presentan en otros tipos de ensamblajes moleculares como proteínas y ácidos nucleicos.
Dondeves el volumen ocupado por un lípido,aes el área transversal ocupado por la cabeza polar y l es la longitud del ácido graso junto con la cabeza polar (ver figura (1.2)). Como el volúmen ocupado por un lípido cilíndrico esVc=al, su nivel de empaquetamiento será igual a
uno y servirá de referencia para sugerir el tipo de agregado lipídico que formará un conjunto de lípidos con la misma forma.
Figura 1.2: volumen ocupado por un lípido. Modificado de [30]
Dependiendo a su estructura los diferentes tipos de lípidos poseen diferentes niveles de em-paquetamiento. Por ejemplo, lípidos con un sólo ácido graso pueden tener varios niveles de empaquetamiento dependiendo del tamaño efectivo de su cabeza. En el caso de lípidos con dos ácidos grasos, la presencia de insaturaciones en la cadena del ácido graso genera cambios en dicho nivel, ya sea si la insaturación es de tipo cis, en cuyo caso el nivel de empaquetamiento se hace mayor ó de tipo trans en la que el nivel de empaquetamiento se hace menor.
El nivel de empaquetamiento de los lípidos que conforman una bicapa lipídica está relacio-nado con el nivel de fluidez de la misma. Una bicapa con un nivel de empaquetamiento bajo presenta baja fluidez y a medida que el nivel de empaquetamiento se hace más grande la fluidez de la membrana se hace mayor.
1.2.2.
Transiciones de fase en bicapas lipídicas
Las membranas lipídicas pueden estar presentes en diferentes fases dependiendo de la tem-peratura del sistema. Estos estados están separados por transiciones de fase termotrópicas que en el caso de sistemas monocomponentes son altamente cooperativas y asemejan a una transi-ción de primer orden[36].
líquido-cristalino. La fase gel es un estado sólido-ordenado en donde el nivel de empaquetamiento es bajo o cercan a uno, la movilidad lateral es muy baja (asemejando a un estado sólido) y las cadenas lipídicas se encuentran en una configuración de mínima energía o totalmente extendida (cadenas ordenadas). La fase liquida-cristalina es un estado con nivel de empaquetamiento más alto, de alta movilidad (asemejando a un líquido) y en donde las cadenas presentan rotaciones generando configuraciones no totalmente extendidas. Para sistemas puros, una bicapa en fase gel pasa a un estado líquido-cristalino en un pequeño rango de temperatura (∆T) Como se muestra en la figura (1.3). Por el contrario, si el sistema contiene varios fosfolípidos que difieren en sus temperaturas de transición, el comportamiento termotrópico del sistema se vuelve más complejo, presentando rangos de temperatura con coexistencia de fases que dependen de la composición [36].
Figura 1.3: Representación esquemática de la transición de fase termotrópica para una bicapa lipídica que pasa de un estado gel ordenado a un estado líquido-cristalino ó fluido. los diagramas de la membrana representan el nivel de empaquetamiento de cada estado[36].
La temperatura de transición (Ti) es característica de cada lípido y depende fuertemente de
la estructura de éste último y de las interacciones con los lípidos vecinos al encontrarse dentro de una bicapa. De tal forma que sistemas fuertemente interactuantes tienden a ser más ordenados
tipo cis esto genera un plegamiento de la cadena lo cual resulta en un bajo nivel de empaqueta-miento con los vecinos. Las insaturaciones tipo trans no generan este plegaempaqueta-miento y el lípido se comporta de manera muy parecida a un lípido saturado. La temperatura de transición decrece con la cantidad de insaturaciones que haya en las cadenas de los ácidos grasos que conforman el fosfolípido[36].
La naturaleza de la cabeza fosfolipídica también juega un rol importante en dichas tran-siciones. En particular, la presencia de carga en ésta genera una separación entre las cabezas fosfolipídicas que a su vez genera una disminución en la temperatura de transición de fase[36]. Adicionalmente si las cabezas polares son grandes, el impedimento estérico entre las cabezas de lípidos vecinos debilitara las interacciones lípido-lípido y reducirá la temperatura de tran-sición. Por ejemplo fosfatidilcolina (PC)tiene un grupo mas bultoso que fosfatidil etanolamina (PE) debido a la presencia de tres grupos metiles. Así que, aunque las dos cabezas polares son zwitterionicas, la temperatura de transición para PC es menor que para PE. Por otro lado el fosfatidilglicerol (PG) tiene una cabeza polar de tamaño equivalente a PE, sin embargo al tener una carga neta negativa, las repulsiones electrostáticas entre las cabezas hace que la tempe-ratura de transición de PG sea equivalente a la de PC bajo condiciones fisiológicas electrolíticas.
Existen diferentes técnicas para determinar el estado de los fosfolípidos en la bicapa y de-tectar la transición de fase. Debido a que la transición de fase gel/liquido-cristalino asemeja a una transición de primer orden tradicionalmente se ha detectado la transición de fase a través de calorimetría diferencial de barrido en donde se genera un pico en la capacidad calórica del sistema en la temperatura de transición relacionado a la entalpia de transición. Este pico en la capacidad calórica esta mayoritariamente relacionado con el cambio de energía interno de los lípidos al entrar en un estado desordenado. El ancho del pico indica el nivel de coopera-tividad del sistema. Debido a que la transición de fase no es puramente de primer orden el pico de transición no es extremadamente angosto. Para un sistema lipídico sencillo de un com-ponente el ancho del pico puede ser angosto (0,5oC) o mas ancho dependiendo del nivel de
cooperatividad. Uno de los aspectos mas interesantes de las membranas es que, si la membrana se encuentra muy cerca de la temperatura de transición se genera coexistencia de los estados líquido-cristalino y gel. Para una mezcla de dos o mas lípidos con temperaturas de transición distintos los rangos de temperatura en donde se genera coexistencia pueden ser muy amplios. Para un sistema de un componente el rango de temperaturas de coexistencia puede ser pe-queño. Cuando se presenta coexistencia de fases se observa la formación de dominios gel junto con dominios líquido-cristalinos. La coexistencia de fases puede comprometer la integridad de la membrana ya que imperfecciones en la regiones de interfase entre dominios gel y líquidos cristalinos induce un incremento en el nivel de permeabilidad de la membrana.
técnicas de espectroscopia para detectar transiciones de fase en bicapas lipídicas. Por espectroscopia de infrarrojo se puede hacer seguimiento de la vibración de los grupos CH2 de las cadenas en
función de la temperatura. El número de onda de esta vibración presenta una discontinuidad durante la transición de fase de primer orden que permite su detección. El número de onda es sensible al número de rotómeros en la cadena. Por lo tanto se detecta un incremento en el número de onda al pasar al estado líquido-cristalino. Por espectroscopia de fluorescencia exis-ten diferentes moléculas fluorescentes sensibles al estado de fases de la membrana. Por ejemplo difenolhexatrieno (DPH) es una molécula fluorescente que se intercala entre las monocapas que conforman la membrana. Al medir la anisotropía en la polarización de la fluorescencia emi-tida por la molécula se puede determinar el nivel de movilidad del interior de la membrana. Este nivel de movilidad es también altamente sensible al estado de la membrana y puede ser utilizado para determinar la temperatura de transición. En este estudio utilizamos la sonda fluorescente de tipo naftaleno llamada LAURDAN. Esta sonda fluorescente se intercala en la membrana ubicándose en la interfase agua-hidrocarbono cerca del enlace éster (ver figura (1.4. El espectro de emisión de la sonda fluorescente es sensible al nivel de polaridad del ambiente que rodea la molécula. En el estado gel LAURDAN tiende a sumergirse en el interior de la bicapa, en donde las cabezas polares de los lípidos la apantallan del medio acuoso. Esto genera un desplazamiento hacia el azul del espectro. Al incrementar el espaciamiento entre los lípidos en el estado líquido-cristalino, LAURDAN queda expuesto al ambiente acuoso y el espectro de emisión genera un desplazamiento hacia el rojo. A través de una medición de la diferencia de intensidades entre el rojo y el azul se puede determinar el nivel de hidratación de las cabezas polares y se puede detectar la transición de fase.
con proteínas integrales que atraviesan la membrana o que se adhieren a su superficie y azúcares ramificadas adheridas a las cabezas polares de los lípidos o a las proteínas. Una capa lipídica contiene millones de moléculas lipídicas y la membrana celular contiene cientos de diferentes tipos de lípidos incluyendo glicerolípidos, esfingolípidos, esteroles, carotenoides. Esta diversidad de lípidos incrementa la complejidad del comportamiento termodinámico de la membrana re-sultando en coexistencia de fases en rangos amplios de temperatura y composición[30]
Los diferentes tipos de membranas difieren básicamente en las composiciones relativas de lípidos y proteínas, variando desde un 20 % de proteínas en el caso de las membranas de la mielina neuronal, hasta un75 %de proteínas en la membrana de las mitocondrias. En general la cantidad de proteínas va ligada con la actividad metabólica, entre mayor sea esta última, se encuentra una mayor cantidad de proteínas en la membrana. Adicionalmente las proporciones de las diferentes cabezas polares difieren en gran manera entre célula y célula y entre organelo y organelo. La proporción de las diferentes cadenas lipídicas puede diferir significativamente en diferentes membranas biológicas [36].
1.3.
Bacterias
Las bacterias son microorganismos unicelulares en su mayoría, de tamaños entre1y10µm. Las bacterias son procariotas, lo que implica que no tiene núcleo definido. Por lo tanto su ADN se encuentra en el citoplasma y no se encuentra separado por ninguna membrana, además po-seen una pared celular compuesta de mureína, no popo-seen mitocondrias, no tienen organélos por tanto la única membrana biológica es la plasmática y se reproducen por bipartición binaria.
Las bacterias son los organismos vivos más antiguos y abundantes en el planeta. Se en-cuentran presentes en todos los hábitats terrestres resistiendo aún a condiciones extremas de temperatura y salinidad.
Existen diferentes tipos de clasificación bacteriana entre los cuales se encuentra la estructu-ra celular, metabolismo o diferencias en determinados componentes como ADN, ácidos gestructu-rasos, pigmentos, antígenos entre otros. Sin embargo, no esta claro aún si las diferencias que presentan las bacterias en estos criterios se deben a que pertenezcan a diferentes especies o si se deben a diferencias entre sepas de la misma especie. La dificultad principal para poder clasificar los diferentes tipos de bacterias se debe a que éstas tienen transferencia horizontal de genes, es decir ellas pueden transferir material genético a células que no son descendientes, por tanto bacte-rias muy relacionadas pueden presentar características metabólicas y morfológicas diferentes. Es por esto que los tipos de clasificación bacteriana que existen utilizan técnicas moleculares modernas como por ejemplo la secuenciación de ADN ribosómico el cual no se ve involucrado
en la transferencia horizontal.[32]
En el campo de la medicina es relevante la identificación de bacterias para poder determi-nar la especie causante de la infección y así poder aplicar el tratamiento correcto, es por esto que se han desarrollado varias técnicas de identificación de bacterias. Una de las técnicas más importantes es la técnica de tinción de membranas desarrollada por Hans Christian Gram, la cual consiste en marcar con tintes específicos diferentes muestras de bacterias en crecimiento y luego de unos minutos y un lavado se puede observar si éstas conservan aún el tinte o no, las bacterias que conservan el tinte se denominan Gram positivas y las que no Gram negativas.
Las bacterias Gram negativas se diferencia de las Gram positivas gracias a que esta presenta dos membranas lipídicas distintas y una pared de mureína en medio de estas, las Gram positivas poseen también dicha pared de mureína pero es más gruesa y una única membrana lipídica [6]. La tinción de Gram genera un color azul al interactuar con la pared de mureina, por lo tanto solo tiñe las bacterias Gram positivas que tienen expuesta esta capa al medio extracelular (ver figura 1.5).
Figura 1.5: Representación esquemática de las diferencias en bacterias Gram negativas y Gram positivas (modificado de [40]).
1.3.1.
Bacterias Gram Negativas
Las bacterias Gram negativas poseen una envoltura celular compuesta de tres partes, la primera es la membrana citoplasmática la cual es la más interna y es impermeable a iones y macromoléculas. Esta membrana mantiene un potencial electroquímico que es utilizado para la síntesis de ATP. Si se compromete la membrana plasmática se genera muerte celular. La membrana citoplasmática es seguida de una pared delgada de mureína generando un espacio intermembranal. Finalmente se encuentra la membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias y que esta principalmente compuesta de un glicolípido denominado Lipid A. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se encuentra un espacio lleno de periplasma , el cual contiene diferentes enzimas que son importantes para la nutrición de la célula[17]. La membrana externa es permeable a moléculas mediana y sales. Esto debido a que en la membrana externa se encuentran diferentes tipos de proteínas que generan canales proteicos además de polisacáridos.
1.3.2.
Bacterias Gram Positivas
Las bacterias Gram positivas poseen una envoltura celular compuesta de dos partes, la pri-mera es la membrana plasmática la cual esta seguida por el espacio periplasmático. La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como base química funda-mental el peptidoglicano, que es un polímero de N-acetil-2-D-glucosamina, unido en orientación
β−1,4con N-acetil murámico, a éste se agregan por el grupo lactilo cuatro o más aminoácidos. Esta envolutura es bastante permeable a proteínas pequeñas y moléculas medianas [29].
1.3.3.
La Composición de las Membranas Celulares Bacterianas
Las composición de las membranas bacterianas varia ampliamente entre especies diferen-tes, generalmente las bacterias Gram Negativas presentan carga negativa y contiene lípidos zwitteriónicos y aniónicos. Aunque la carga negativa se debe principalmente a PG y cardiolipi-na. Por su parte las bacterias Gram positivas generalmente sólo tienen lípidos negativos.
Además de las cargas de las cabezas lipídicas otro factor de diferenciación de los lípidos pre-sentes en las bacterias es la presencia de saturaciones en las cadenas lipídicas. La composición lipídica de una bacteria es muy importante debido a que esta, junto con la homeostasis de lípi-dos es una habilidad que tiene la bacteria que puede definir su supervivencia. La habilidad de una bacteria para modificar su composición membranal frente a cambios externos ambientales como de temperatura, osmolaridad, salinidad y pH has sido estudiada previamente [8], pero el trabajo de Zhang cubre también el mecanismo homeostático[41].
Los cambios de composición lipídica que realiza la bacteria son determinantes en cuanto a la fluidez de la membrana ya que como se explicó anteriormente, las características estructura-les de los lípidos determinan las propiedades mecánicas de la membrana como en este caso la fluidez, es así como al hacer un cambio en la composición lipídica la bacteria puede responder a estímulos externos como por ejemplo un cambio de temperatura. Debido a esta capacidad que poseen las bacterias para cambiar su composición lipídica, las bacterias presentan transiciones de fase termotrópicas muy amplias. En la Figura1.6se muestra cómo diferentes tipos de lípidos afectan la fluidez de la membrana.
Figura 1.6: Estructura química de los ácidos grasos de fosfolípidos membranales(Modificado de[41]).
Otra característica importante que poseen las bacterias es la capacidad de producir ácidos grasos con las propiedades que la membrana necesite para optimizar su función celular, ésta propiedad recibe el nombre de homeóstasis de lípidos. Es importante resaltar que ésta capacidad de cambiar los niveles de insaturaciones de los ácidos grasos de la membrana puede incluso llegar a mejorar la capacidad de respuesta de la membrana a la actividad de diferentes agentes antibacterianos como por ejemplo los PAs [41].
1.4.
Enfermedades Infecciosas generadas por Bacterias
A lo largo de la existencia de la humanidad, las enfermedades infecciosas han sido una de las causas que genera mayor número muertes en seres humanos, llegando a su punto cumbre a comienzos del siglo XX. Por ésta razón se convirtió en uno de los temas más frecuentes de la investigación médica. Entre las décadas de 1930’s y 1940’s se llevó a cabo el descubrimiento y posterior uso clínico de la penicilina, la cual fue revolucionaria en el tratamiento de las enfer-medades infecciosas generando una disminución dramática en el número de muertes generadas por éstas. Después de dicho descubrimiento, se llegó a la llamada “era de los antibióticos” en la cual se descubrieron una variedad de agentes antimicrobiales que pronosticaban la desaparición de muertes causadas por infecciones bacterianas ya que permitían controlarlas y prevenirlas.
Sin embargo contrario a lo que se pensaba esto no sucedió y las infecciones siguieron siendo la segunda causa más frecuente de muertes en los países desarrollados. El problema actual de salud pública tiene diferentes causas; el surgimiento de infecciones aún no identificadas, el re-surgimiento de infecciones tratadas anteriormente que reaparecen en formas más virulentas y las infecciones bacterianas generadas por bacterias resistentes. La resistencia antimicrobiana fue descubierta poco tiempo después del boom de la penicilina y se ha notado que el surgimiento de bacterias resistentes a cada nueva droga es algo inevitable. Para prevenir una emergencia y la diseminación de las bacterias resistentes es importante continuar con la búsqueda de nuevos agentes antimicrobiales.
1.4.1.
Definición y blancos de antibióticos.
Un antibiótico es un componente químico producido por actinomicetes, hongos ó bacterias que interfiere con alguna estructura ó proceso esencial de la bacteria, sin efectos en las células eucariotas del hospedero. Existen dos tipos de antibióticos, el primero, inhibe el crecimiento bacteriano permitiendo el control de la infección causada y el segundo que genera la muerte de las bacterias responsables de la infección.
Dada la gran variedad de antibióticos usados clínicamente, la cantidad de blancos que éstos tienen son limitados. Usualmente los antibióticos están clasificados dependiendo de su estructura química y modo de acción. Los blancos más comunes sonInhibición de pared celular y biosíntesis, Inhibición de biosíntesis de proteínas,Inhibición de biosíntesis de DNA y RNA, existen también
otro tipos de blancos un poro menos comunes como Metabolismo de ácido fólico ymembrana celular, Los diferentes principales blancos se encuentran esquematizados en la figura1.7[40].
Figura 1.7: Principales blancos de antibióticos.(Modificado de [40]).
1.4.2.
Resistencia Bacteriana a Diferentes Tipos de Antibióticos
Como se había mencionado anteriormente uno de los problemas más grandes con el uso de antibióticos es la resistencia que han desarrollado las diferentes enfermedades infecciosas a éstos. Entre las respuestas más frecuentes que han generado las bacterias a la presencia de un antibiótico están la bomba de flujo de salida, en este caso la célula afectada trata de disminuir la cantidad de antibiótico en su interior, esto lo hace ya sea aumentando el flujo de lo que sale ó disminuyendo el flujo de entrada a la célula. Otra respuesta frecuente es la Inactivación de los antibióticos, en este caso la célula afectada busca la manera de modificar ó hidrolizar el
antibiótico para reducir su eficiencia o hacerlos completamente inactivos. Por último, la célula también puede intentar hacer una alteración del blanco con el fin de reducir la afinidad del antibiótico con dicho blanco ó puede intentar generar una sobreproducción del blanco de tal manera que el antibiótico no pueda la afectar gravemente. La figura 1.8es un esquema de los
diferentes métodos empleados por las células bacterianas para generar resistencia a diferentes tipos de antibióticos [40].
Figura 1.8: Principales mecanismos de la resistencia a antibióticos.(Modificado de [40]).
Podemos entonces ver cómo las enfermedades infecciosas están en constante evolución, razón por la cual se hace de suma importancia la evolución a la par de los tratamientos para con-trolarlas y combatirlas. Una de las promesas más grande en éste campo la ofrecen los péptidos antimicrobiales.
1.5.
Péptidos Antimicrobiales (PA)
Los seres vivos estamos en permanente contacto con diversos tipos de bacterias, muchas de estas capaces de causar infecciones y enfermedades. Es por eso que los seres vivos hemos
tanto en animales como en plantas. Los péptidos antimicrobiales tienen un amplio espectro de actividad ya que pueden actuar contra bacterias, virus, hongos y parásitos eucariotas. Los modelos de acción de los PAs incluyen inhibición de la síntesis en la pared celular, formando poros en la membrana plasmática, resultando en lisis y destruyendo DNA y RNA. Un aspecto importante de los PAs es que los microorganismos no suelen generar rápida resistencia aún cuando han permanecido expuestos a éstos por largos periodos de tiempo [38].
1.5.1.
Magainin2 y Magainin-H2 (Mag y Mag-H2)
Magainin-2(Mag2) es un péptido antimicrobial aislado de la piel de la rana africana Xeno-puslaevis. Tiene un amplio espectro de actividad antimicrobial entre bacterias Gram-negativas
y Gram-positivas, hongos e induce lisis en protozoos. Mag2 además provee propiedades antivi-rales y antitumoantivi-rales haciéndolo un gran candidato para aplicaciones terapéuticas. La secuencia de aminoácidos que compone Mag2 es: GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS. En la figura 1.9
podemos ver una diagrama de la organización y secuencia de Mag2.
Figura 1.9: Secuencia de aminoácidos de Mag 2. Modificado de ([10]).
Debido a que la interacción que lleva a los péptidos a encontrar rápidamente la membrana celular de una bacteria es de tipo electrostática, para lípidos cuya cabeza polar no sea cargada la eficiencia de Mag2 se ve comprometida. En dichos casos se puede utilizar Mag-H2, el cual es una modificción de Mag-H2 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: IIKKFLHSIWKFG-KAFVGEIMNI ésta secuencia difiere en la de Mag 2 en la presencia de un nuevo aminoácido hidrofóbico que permite que el péptido busque rápidamente un ambiente hidrofóbico como lo
es el espacio entre los ácidos grasos de una membrana celular. Además es importante notar que la carga del Ma-H2 no difiere de la de Mag 2. En la figura 1.10podemos ver una diagrama de la organización y secuencia de Mag-H2.
Figura 1.10: Secuencia de aminoácidos de Mag- H2. Modificado de ([10]).
1.5.2.
Reducción del espesor de la membrana lipídica por PAs.
Uno de los mecanismos utilizados por los PAs para generar muerte celular es por medio de lisis la cual se consigue formando poros en la membrana celular. El proceso de generación de poros en la membrana por PAs comienza cuando los péptidos interactúan electrostáticamente con la bicapa, dada la interacción de tipo atractiva existente, el péptido llega a la superficie de la membrana en la cual se posiciona de forma paralela a la membrana como se muestra en la figura
1.11, provocando una tensión superficial de la bicapa (que a su vez genera una reducción en el grosor de la misma). Dado el comportamiento de tipo cooperativo existente en los péptidos se genera una acumulación de péptidos que permite generar una tensión generalizada en la membrana. Una vez que la cantidad de péptidos es muy grande, la tensión superficial presente en la bicapa aumenta tanto que para el sistema se hace más favorable energéticamente que un cierto número de péptidos cambien su posicionamiento paralelo a la superficie de la membrana
Figura 1.11: En la parte (a) podemos ver el péptido sobre a la bicapa lipídica. En la parte (b) podemos ver el péptido ya insertado en la bicapa lipídica que ha reducido el grosor de la bicapa y generado diferentes poros en la bicapa.[28]
El cambio en el grosor de la membrana lipídica como respuesta a la presencia de péptidos an-timicrobiales como Magainin ha sido estudiada y modelada por Huang [20], dada la importancia para éste trabajo la explicaremos en detalle.
Figura 1.12: Esquema de un poro toroidal.[19]
El modelo realizado por Huang [20] describe la energética del sistema en el que existe una membrana apoyada y una cierta cantidad de PAs como magainin (capaces de generar poros de tipo toroidal) lo suficientemente grande para que se generen poros. Para entrar en detalles debemos empezar por explicar el hecho de que los péptidos antimicrobiales como Mag-H2 en presencia de bicapas lipídicas tienen dos estados característicos. El primero es el estado tipo S, en el que el péptido se encuentra localizado sobre la superficie de la membrana, y el estado I que es el estado en el que el péptido junto con otros péptidos cambia su posicionamiento y
pasan de estar sobre la superficie de la membrana a estar de forma perpendicular a la superficie de la membrana en el interior de esta como lo muestra la figura1.11.
En este caso estudiaremos una coexistencia de estos dos estados, es decir un estado de equi-librio en el que hay péptidos en la superficie de la membrana y péptidos traslocados generando poros, por lo cual necesitaremos considerar un modelo de dos estados en el cual la cantidad de péptidos presentes en la muestraNB sea capaz de generar poros, lo cual implica una cantidad
de aproximadamente un péptido cada200 lípidos, es decir NB/L= 1 ≈200 con L el número
de lípidos presente en la bicapa. En el estado de equilibrio tenemosNS péptidos en el estado S
yNn poros en la membrana (los poros están formados por unnnúmero de péptidos necesarios
para generar un poro que para el caso de Mag2 es 5), luegoNB =NS+nNn. Definiendo como
XS=NS/(L+NB)yXn=Nn/(L+NB). El potencial químico de este estado de coexistencia
esta dado por:
µS =−0S+ KA
2
A2S
AL
NS
L +kBT lnXS (1.2) µN =−n0I+kBT lnXn (1.3)
donde el último término de la ecuación 1.2 viene de la entropía de mezcla de los lípidos en el estado S y la bicapa (donde KB es la constante de Boltzmann y T es la temperatura).
−0
S es la energía intrínseca de ligamiento por péptido para los péptidos en estado S. −0I es
la energía por molécula para los péptidos en estado I. Para entender el término de la mitad de la ecuación1.2 debemos empezar por explicar el hecho de que los péptidos presentes sobre la superficie de la membrana en estado S generan un incremento en el área superficial de la membrana∆A el cual se puede escribir como∆A =NSAS siendoAS el incremento del área
superficial de la bicapa inducido por un péptido en el estado S. El área total de la bicapa es
A=ALLconALes el área transversal de de un lípido. La fracción de área superficial
incremen-tada ∆AA es una deformación cuya correspondiente tensión esta dada por σ= (Ka2 )∆A
A , donde
Ka es el coeficiente de estiramiento de una bicapa yKa/2 es el coeficiente de estiramiento de
una monocapa. Luego, un incremento en el número de δNS péptidos en el estado S causa un
cambio en la energía del sistema δE = −0
SδNS +σASδNS donde el segundo término es la
energía elástica asociada a el área de estiramiento. Luego el cambio de energía por molécula en
El equilibrio termodinámico requiere que el equilibrio químico por molécula sea igual entre las 2 fases, es decir:
µn
n =µS =−n
0
I+kBT lnXn =n
− 0 S+ KA 2
A2S AL
NS
L +kBT lnXS
(1.4)
A partir de la ecuación1.4podemos llegar a :
Xn= (XS)nexp
−n
a−bNS
L
(1.5)
con a = 0S−
0
I
kBT y b = KaA2S
2AL
kBT . Dado a que generalmente el número de péptidos ligados es
mucho menor que el número de lípidos, se puede usar la aproximación XS ≈ NLS yXn ≈ NLn.
Luego podemos obtener la siguiente relación entreXn yXS:
Xn= (XS)nexp[−n(a−bXS)]. (1.6)
DeNB=NS+nNn ó NLB =XS+nXn se obtiene
NB
L =XS+n(XS)
nexp[
−n(a−bXS)]. (1.7)
Luego la ecuación1.7predice los valores deXS para un valor dado deNB/Lpara todos los
valores de n.
Para encontrar una relación entre la fracción de la reducción en el grosor de la bicapa∆h/h
y el valorNB/Lse utiliza la conservación del volumen ocupado por un lípido, luego finalmente
se obtiene que:
∆h h =
−∆A A =−
A S AL XS (1.8)
La figura1.13muestra la relación entre∆h/hyNB/Lpara diferentesn,ayb, calculadas a
partir de los datos teóricos reportados para el caso de una membrana de DOPC interactuando con Melitina por Huang en el 2009 [20].
Figura 1.13: Ilustración del efecto deNB/Len la reducción del grosor de una bicapa de DOPC
inducida por melitina. Estas gráficas se realizaron a partir de la relación1.8. [20].
1.5.3.
Membranas Apoyadas, Liposomas y Lípidos
Para medir cambios en las propiedades mecánicas de una membrana celular generalmente se utilizan sistemas modelo como membranas apoyadas, liposomas y micelas. En este caso los sistemas escogidos fueron membranas apoyadas y liposomas conformados en un 100 % de un mismo lípido. Los lípidos implementados en este trabajo fueron POPC, DPPC y DMPC (Estructura mostradas en la figuras y temperatura de transición de fase mostrada en la tabla
1.5.3.1).
1.5.3.1. Liposomas
El sistema modelo más usado para emular las propiedades mecánicas de membranas celula-res es mediante liposomas. Los liposomas son membranas unilamilacelula-res encerrando un pequeño volumen acuoso. Los liposomas tienen tamaños entre 50 y 200 nm y es muy sencillo el proceso de generar diferentes formulaciones de liposomas que difieren en composición. Al encapsular un pequeño medio acuoso los liposomas pueden ser utilizados para estudiar procesos de fuga y per-meabilidad de membrana, midiendo la cinética de fuga de moléculas fluorescentes encapsuladas. Adicionalmente los liposomas son útiles para caracterizar propiedades físicas de la membrana por espectroscopia de fluorescencia. Para los estudios de fluorescencia realizados en este tra-bajo se utilizaron liposomas de100nm de diámetro y compuestos de un único lípido sintético
Lípido Estructura Química Temperatura de transición de fase (oC)
POPC −2
DPPC 41
DMPC 23
Cuadro 1.1: Estructuras Químicas y temperaturas de transición de fase de POPC, DPPC y DMPC. Tomada de Avanti Lipids (14/10/2012)
1.5.3.2. Membranas Apoyadas
Las investigaciones de propiedades mecánicas en bicapas lipídicas realizadas con AFM ge-neralmente se hacen en membranas apoyadas. Las membranas apoyadas son bicapas lipídicas que se encuentran sobre una superficie rígida e hidrofílica como vidrio, óxido de silicio y mi-ca. Las membranas apoyadas se pueden hacer de dos maneras generales, una de ellas es la de Langmuir-Blodgett y fusión de vesículas (liposomas). En este trabajo de tesis la técnica utiliza-da es la de fusión de vesículas la cual consiste en la deposición de una suspensión de vesículas a una superficie hidrofílica y rígida, una vez las vesículas entran en contacto con la superficie se estallan conformando así una membrana plana y uniforme sobre la superficie. La presencia de una pequeña capa de agua entre el sustrato y la monocapa inferior de la membrana permite la difusión lipídica [23]. La figura 1.14muestra un esquema de una membrana apoyada. Dada la presencia de un soporte rígido muy cerca a la bicapa inferior de la bicapa, las propiedades termodinámicas de las bicapas apoyadas difieren un poco de las de las bicapas no apoyadas,
como las vesículas unilaminares[22]. Además la presencia del soporte rígido cerca a la bicapa puede ocasionar que haya una asimetría entre las dos monocapas que componen la bicapa ya que puede generar que las densidades sean diferentes en ambas monocapas[11]. La asimetría de las dos monocapas esta fuertemente ligado a las condiciones de preparación de la bicapa apoyada, incluyendo temperatura, las propiedades químicas del soporte, pero se ha encontrado que el ensamblaje de la bicapa en estado completamente líquido puede generar una transición de fase de la bicapa completa, así como también se recomienda una deposición en una super-ficie de óxido de silicio el cual posee menos rugosidades que la supersuper-ficie de mica.[2] Por esta razón el uso de fusión de vesículas para formar membranas apoyadas tiene la ventaja de generar un mejor acoplamiento entre las monocapas y un nivel de hidratación mayor lo que mejora la movilidad y el comportamiento de fases de la membrana apoyada.
Figura 1.14: Esquema de una bicapa lipídica apoyada.[2]
1.5.4.
Microscopía de Fuerza Atómica y espectroscopia de Fuerzas en
Bicapas Lipídicas
Uno de los enfoques de la física en los sistemas biológicos se debió al trabajo de D’Arcy Thompson (1917)[37] en el que planteaba la posibilidad de que las fuerzas podrían ser determi-nantes en la evolución y comportamiento de sistemas vivos. Este enfoque ha llevado a diversos
sido una herramienta muy importante para investigación en propiedades mecánicas en células individuales, biomoléculas individuales y bicapas lipídicas apoyadas (BLA)([21], [12],[16],[1].)
Está demostrado que en la actualidad la microscopía de fuerza atómica es una herramienta útil para el estudio de propiedades viscosas y elásticas de las BLAs. La espectroscopia de fuerzas en membranas apoyadas consiste en examinar eventos de salto de la punta del AFM a través de la bicapa lipídica una vez la fuerza aplicada sobre la bicapa alcanza cierto umbral [12]. Utilizando esta técnica se ha encontrado que este umbral de fuerza es afectado por la temperatura del sistema [14] o la resistencia iónica de la solución [13] o también de procesos dinámicos como la velocidad de acercamiento de la punta a la bicapa ([3],[27]). Es importante entender que el evento de salto de la punta a través de la membrana es un evento estocástico y puede revelar propiedades importantes de la bicapa lipídica como consecuencia de la mecánica molecular presente en el evento. Mas aún la dependencia de la fuerza de ruptura de la membrana con la velocidad de acercamiento de la punta a la membrana suministra información importante acerca de la energética del proceso. Decidimos utilizar esta técnica para explorar como las propiedades mecánicas de la membrana se podían correlacionar a su resistencia a péptidos antimicrobiales debido a que el evento de ruptura generado por la punta es análogo a la formación de poros en bicapas lipídicas.
Por su parte, la microscopía de fuerza atómica en bicapas lipídicas también ha sido una herramienta importante para el estudio de la respuesta dinámica de membranas bajo diferentes tratamientos [26], dado que permite estudiar las propiedades mecánicas de la bicapa lipídica en tiempo real y por tanto observar su comportamiento frente a cambio de temperatura, disolventes o incluso al ser expuestos a péptidos antimicrobiales (PAs)
2
Espectroscopía de Fuerzas en
Bicapas Lipídicas Apoyadas (BLAs)
2.1.
Elementos fundamentales de la Microscopía de Fuerza
Atómica (AFM) en BLAs
Las investigaciones realizadas a través de AFM en membranas apoyadas se dividen en 2 ramas básicas: la primera es la Microscopía de Fuerza Atómica, la cual consiste en un barrido topográfico realizado con la punta del aparato de AFM, en la cual se pueden llegar a distinguir saltos en altura en orden de décimas de nanómetros (limitado por el sensor de ruido) y hacer barridos en XY de hasta 90 µm. La segunda es la Espectroscopía de Fuerzas la cual consiste en llevar la punta del AFM hasta la muestra y una vez la punta toque la muestra, se procede a aplicar una fuerza, los experimentos realizados en este trabajo se llevaron a cabo acercando la punta a la muestra con una velocidad constante y una vez esta toca la muestra, la fuerza se incrementaba linealmente hasta llegar a un punto máximo en donde la punta se devolvía.
Figura 2.1: Esquema de una curva de fuerza realizada en una BLA, El cantilever se mueve con velocidad constante hacia la bicapa. La primera deflección de la punta es debida a las interacio-nes elctrostáticas y de hidratación entre la bicapa y la punta seguida de la deflección propia de cuando la punta entra en contacto directo con la membrana. Esta primera región puede ser con-siderada de deformación elástica, a medida que la punta deforma la membrana va aumentando la fuerza aplicada resultando finalmente en un evento de ruptura de la membrana.[2]
Una curva de fuerza típica en una bicapa lipídica es mostrada a en la figura2.1. Las espec-troscopia de fuerzas en membranas apoyadas permite obtener información tanto de la curva de aproximación a la membrana como de la de retracción.
Usualmente la curva de aproximación es utilizada para obtener información de la interacción nanomecánica, pero en algunos casos es posible extraer información de la curva de retracción como por ejemplo la fuerza de adhesión de la punta a la membrana, la gráfica2.2es un esquema de un curva de retracción. En otros casos también se pueden hacer modificaciones a la punta del AFM exponiéndola a ciertos grupos químicos y luego viendo como interactúan estos con la bicapa o con los lípidos presentes en esta[2]. En este trabajo nos enfocamos únicamente en la fuerza de aproximación.
Figura 2.2: Midiendo la fuerza de adhesión entre membrana y vidrio con AFM. La anterior figura es una muestra esquemática de la curva de fuerza-desplazamiento contra el desplazamiento de la punta hacia la muestra. La fuerza de adhesión es tomada de la máxima fuerza alcanzada a medida que la punta se aleja de la membrana hasta la fuerza de separación una vez la punta a liberado completamente la membrana.[31]
2.1.0.1. Interacción punta-BLA
A medida que la punta se acerca a la bicapa y antes de que haya un contacto directo existe una interacción electrostática entre ellas la cual puede ser observada en la curva de acercamien-to de la punta a la bicapa, esta interacción depende de los tipos de lípidos que contituyen la membrana que pueden ser cargados o zwitterionicos y por supuesto de la naturaleza química de la punta. En este caso el tipo de lípidos utilizados en las bicapas son zwiteriónicos, lo que significa que son eléctricamente neutros pero que poseen cargas positivas y negativas en áto-mos diferentes, pero resultan en una carga neta neutra. Por su parte la punta es una punta de Nitruro de silicio la cual esta cargada negativamente a PH alrededor de 7. La extensión de la interacción eléctrica existente entre la membrana y la punta depende de la concentración de sal en la solución en la que se encuentran a través de la longitud de decaimiento de Debye y puede llegar a alcanzar hasta las decenas de nanómetros en los casos de concentraciones de sal más bajas. Justo antes de que la punta entra en contacto directo con la bicapa, las fuerzas estéricas y de hidratación asociadas con la remoción de las moléculas de agua que estan interactuando
2.1.0.2. Usando Espectroscopía de Fuerzas para medir la deformación en la bicapa
causada por un péptido Antimicrobial
Uno de los temas de investigación que se puede llevar a cabo utilizando AFM y bicapas lipídicas es el estudio del cambio en las propiedades mecánicas de membranas cuando estas interactúan con proteínas membranales, como por ejemplo péptidos antimicrobiales. En dichas investigaciones se utilizan diversas técnicas como la espectroscopía de fluorescencia, la micros-copía de fluorescencia y experimentos de micropipeteo entre otros para determinar cambios en las propiedades físicas de la membrana debido a su interacción con estas proteinas. Por ejemplo, la Microscopía de Fuerza Atómica puede ser utilizada para medir el cambio en el grosor de la bicapa. Otro fenómeno asociado a péptidos antimicrobiales es la inserción, en donde se generan poros en la membrana. Aunque los poros generados por péptidos antimicrobiales tienden a ser muy pequeñosos para lograr ser resueltos por AFM. El fenómeno de disrupción de membrana por el péptido e puede ser estudiado de manera indirecta por espectroscopía de fuerza atómica, en el cual se pueden determinar cambios en las propiedades mecánicas de membranas en la presencia de péptidos, monitoreando la fuerza que debe aplicarse con la punta para romper y penetrar en una BLA.
Figura 2.3: Esquemas asociados con las posibles formas de penetración de la punta a la bicapa cuando la punta ejerce una creciente fuerza sobre la bicapa. En (a) la punta penetra a través de la bicapa induciendo una compresión en el área de cada lípido cercano a la punta. En (b) la punta induce una compresión de los lípidos generando asi una expansión en el area lateral de cada lípido asociada a la compresión vertical de estos últimos. [2]
Debemos tener en cuenta que en el proceso de penetración de la punta a la BLA se deben considerar dos escenarios posibles gracias a que el volúmen ocupado por un lípido siempre per-manence constante (Ver figura 2.3), el primer escenario consiste en una compensión del área lateral de los lípidos a medida que entra la punta a la bicapa, y un segundo escenario en el que
la punta genera una compresión en la bicapa llevando a una expasión en el área lateral de los lípidos.
En este trabajo de investigación queremos profundizar en la capacidad que tiene una mem-brana celular para responder a péptidos antimicrobiales como Mag-H2 a través de cambios en la estructura de sus lípidos. Diferentes bacterias tiene una notable capacidad para cambiar la com-posición de sus membranas en cuestión de minutos. En este trabajo de tesis queremos elucidar los principios físicos que expliquen que cambios en composición generarian mayor resistencia y porque.
Para poder profundizar en esta idea se harán varios tipos de medida, en los que trataremos primero de encontrar el papel de la composición lipídica en la membrana para ello se realizarán varios tipos de medidas:
GP LAURDAN: esta medida nos permite medir el nivel de espaciamiento de las cabezas lipídicas en las membranas por tanto es sensible a la composición lipídica de la membrana, a cambios de fase inducidos por temperatura y a cambios en el nivel de empaquetamiento generados por temperatura.
Fuga de Calceina: esta medida nos permite ver la resistencia que posee la membrana a la actividad del péptido dependiendo de su conformación lipídica, por tanto es sensible a cambios en temperatura y claramente a cambios de fase, adicionalmente observamos que también es sensible a el número de insaturaciones presentes en los lípidos que componen la membrana.
Para poder observar como las insaturaciones afectan las propiedades mecánicas de la mem-brana se utilizará la técnica de espectroscopía de fuerza por medio de AFM en la cual se observaran variaciones en las propiedades mecánicas de la bicapa inducidas por cambios de temperatura, por la presencia del péptido y por composición lipídica.
3
Materiales y Métodos
3.1.
Materiales
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)
1,2-dimyristoyl(d54)-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)
Fueron adquiridos en forma de polvo de Avanti polar lipids (Alabaster, Alabama, USA). 6-dodecanoyl-2-dimethylami- nonaphthalene (Laurdan) fué adquirido de Invitro- gen (USA). Calceina y Triton X fué comprado a Sigma (Sigma, St. Louis, USA). Magainin-H2 (GIGKF LHSAK KFGKA FVGEI MNS) fué sintetizado por United Peptide (Rockville, Maryland, USA).
3.2.
Stocks y Soluciones
3.2.1.
Lípidos
Stocks de lípidos de 20mg/ml y 40mg/ml fueron preparados disolviendo 30mg y 60 mg
en1,5 mlde cloroformo respectivamente.
3.2.2.
Magainin-H2
4mg de Magainin-H2 (MAG-H2) fueron pesados y disueltos en 1ml de agua desionizada, posteriormente fué dividido en pequeñas alicuotas de 50 µl y almacenadas a una temperatura de−30oC. Una vez una de estas alicuotas era llevada a temperatura ambiente para su posterior uso, no volvía a ser almacenada, por tanto el material no utilizado era desechado.
3.2.3.
Solución Salina (
100
mM
de
N aCl
)
Para preparar solución salina de N aCl 100 mM fueron pesados 584,44 mg de N aCl y disueltos en 90 mLde agua desionizada, después de asegurar la homogeneidad de la solución se procedía a completar100 mLde volúmen total.
3.2.4.
Solución de Calceina
Para preparar una solución de Calceina que no generara choque osmótico entre las vesículas con Calceina en su interior y el buffer exterior( HEPES10 mM conpH = 7,5), fué necesario preparar una solución de Calceina 70mM disuelta en HEPES 10 mM apH= 7,5, para ello se procedió de la siguiente manera:
1. 1,08gde Calceina fué disuelta en5mldeN aOH 1mM. 2. Se agregó 2,5mlde 100 mM de HEPES.
3. Se completó el volúmen (25ml) con agua desionizada y se agregaron pequenñas alicuotas deN aOH para llevar la solución apH = 7,5
Finalmente se calcula la concentración deN a+ (delN aOH) y de Calceina− para conocer
la osmolaridad de la solución y asi poder calcular la concentración de N aCl que debía llevar el buffer en el que estarias sumergidas las vesículas con Calceina, llegando así a que el buffer debía tener una concentración 182mM deN aCly10mM de HEPES
3.3.
Preparación de Vesículas Unilaminares (VUs)
VUs fueron preparadas secando5mgde lípidos (su equivalente en volúmen fué extraído del stock de lípidos) con nitrógeno en estado gaseoso y cuidando de generar una capa muy delgada de lípido en la superficie de un tubo de ensayo (En el caso de las VUs marcadas con Laurdan, la sonda era puesta en esta parte del proceso en un porcentaje de concentración del 0,02 %). Después del proceso de secado el tubo con los lípidos es era liofilizado una noche completa, después la muestra era hidratada con 1 mlde buffer y sometida un proceso de bortex de un minuto (en el caso de lípidos cuya temperatura principal de transición de fase es mayor a la temperatura ambiente se procedia a llevarlos a una temperatura de unos 50 oC) el cual se repetía al menos tres veces. Se dejaba la muestra en reposo alrededor de30minutos para luego
3.4.
Preparación de Vesículas Unilaminares (VUs) rellenas
de calceina
El poceso de preparación de VUs rellenas de calceina es similar al descrito anteriormente, la diferencia radica en que lis lípidos una vez secados eran hidratados con la solución de claceina descrita anteriormente y una vez eran sometidos al proceso de extrución era necesario separar las vesículas con calceina en su interior de la calceina que no estaba atrapada en vesículas, para ello se utilizó una columna fina con Sephadex−50 y buffer. En el proceso de separación era necesario poner una cantidad de500 µL de la solución resultante después de la extrucción en la parte superior de la columna. Una vez la solución entraba en contacto con el Sephadexlas VUs rellenas de calceína empezaban a separarce de la calceína que no estaba atrapada en VUs, así hasta que al final de la columna podían diferenciarce claramente las VUs marcadas de la calceina fuera de las VUs debido a que éstas primeras tenian un color amarillo claro.2mL de VUs + buffer eran recogidas al final del proceso.
3.5.
Preparación de Bicapas Lipídicas Apoyadas (BLAs)
Las membranas apoyadas se hicieron a partir de VUs de3mMde consentración lipídica, las cuales eran depositadas sobre una superficie Mica limpia, debido a que en este caso se prefería la generación de parches de bicapa lipídica y no una bicapa lipídica continua en toda la super-ficie, la solución resultante de la extrucción era diluida10veces generando así una solución con menos VUs. Un volúmen de entre100 y500µLeran depositados finalmente en la superficie de Mica limpia dejando reposar por30minutos, finalmente para remover los lípidos y VUs que no estaban adheridos a la superficie de Mica se procede a hacer un lavado de la BLA haciendo un intercambio de aproximadamente15mL de Buffer. Una vez terminado este proceso de lavado la BLA ya esta formada en la superficie de la mica.
La visualización de la membrana apoyada se lleva a cabo con un microscopio de fuerza atómica MFP-3D-BIO de Asylum Research (Santa Barbara, CA) con puntas de nitruro de silicio con constante de doblamiento nominal de 0,09 nN/m fabricadas por Olympus y de referencia TR400PB, este tipo de puntas tiene forma triangular y son ideales para trabajar con muestras de tipo biológico, dichas puntas fueron proporcionadas por el Centro de Microscopía de la Universidad de los Andes. Se llevaron acabo comparaciones entre la altura de la membrana y la superficie de mica para obtener cambios en altura para diferentes concentraciones adicionadas de Magainin- H2. Así como mediante la tecnica de espectroscopía de fuerzas se logró encontrar la fuerza necesaria para generar un rompimiento de la bicapa y la distancia que la punta penetraba en la bicapa una vez se generaba el evento de rompimiento.
3.6.
Medidas de Escape de Calceina
Las Medidas del escape de calceina a través de la bicapa se realizaron en el espectrofluoró-metro ISS (Urbana, Illinois, USA) a temperaturas de24,37oCen el caso de DMPC y45oCen el caso de DPPC y POPC, para ello la calceina fué excitada a una longitud de onda de490nm
y su emisión fué tomada a 515nm, la idea de este experimento era determinar la cantidad de péptido que necesitaba cierta cantidad de VUs para liberar por completo la calceina atrapada en el interior de éstas, para ello se necesitaba medir una intensidad inicial, que es la intensidad de la muestra con VUs sin estallar sumergidas en buffer, después se media como aumentaba la intensidad de la señal a medida que las VUs liberaban su contenido con el tiempo una vez se ponían diferentes concentraciones de péptido, finalmente, después de cierto tiempo se ponía un detergente (Triton X al 10 %) para estallar la totalidad de las VUs y medir la señal de toda la calceina una vez liberada.
Para analizar el porcentaje de calceina liberada a un tiempo dado se utliza la siguiente relación:
%Leakage= L(t)−L0
L∞−L0
(3.1)
DondeL(t)es la intensidad de la señal de calceina liberada a determinado tiempot,L0 es
la intensidad de la señal de las VUs aún sin haber liberado nada de su contenido (señal antes de poner el péptido) yL∞es la señal de el100 %de la calceina (VUs completamente estalladas).
3.7.
Medidas de Laurdan
Laurdan es una sonda fluorescente y hidrofóbica que se ubica en entre los lípidos que una vez exitada (350nm) y dependiendo de la cantidad de agua con la que este en contacto cambia la longitud de onda a la que emite (Desde 400 nm hasta 550 nm), por tanto es una sonda fluorescente que ayuda a identificar la fluidez de la membrana.
Para cuantificar los cambios en el espectro de Laurdan se calcula la polarización generalizada (GP por sus siglas en inglés) por medio de la siguiente relación:
GP = I440−I490
I440+I490
