Ferroelectricidad en microtúbulos y sus implicaciones en la transmisión de señales

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(1)FERROELECTRICIDAD EN MICROTÚBULOS Y SUS IMPLICACIONES EN LA TRANSMISIÓN DE SEÑALES. Eliécer Ramos Dirigida por Alonso Botero Ph. D. TRABAJO PRESENTADO EN CUMPLIMIENTO PARCIAL DE LOS REQUERIMIENTOS PARA OPTAR POR EL GRADO EN FÍSICA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES BOGOTÁ COLOMBIA ENERO 2005.

(2) UNIVERSIDAD DE LOS ANDES DEPARTAMENTO DE FÍSICA Los aquı́ mencionados certifican que leyeron y recomiendan la aceptación de proyecto de grado “FERROELECTRICIDAD EN MICROTÚBULOS. Y SUS IMPLICACIONES EN LA. TRANSMISIÓN DE SEÑALES” presentado por Eliécer Ramos en cumplimiento parcial de los requerimientos para optar por el tı́tulo de Fı́sico.. Fecha: Enero 2005. Supervisor: Alonso Botero Ph. D.. Jurados: Carlos Arturo Ávila. Ferney Rodrı́guez. ii.

(3) -¿Como le fue en el examen? -No se sabe todavı́a, toca esperar... -¡Pero dı́game como le fue!, ¿Como se sintió? -¿Que importa como me sentı́ si ya lo presente? -¡Ah pues.... ...para saber si toca seguir orando! Dedicado a mi madre.... iv.

(4) Tabla de contenidos Tabla de contenidos. V. Lista de tablas. VII. Lista de figuras. VIII. Abstract. IX. Agradecimientos. X. Introducción. 1. 1. Biologı́a molecular 1.1. El citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Microtúbulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. Bioquı́mica de la tubulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4 4 7 15. 2. Ferroelectricidad en MTs 2.1. Momento dipolar de la tubulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1. Estimado computacional del momento dipolar de la tubulina 2.2. Determinación de la constante dielectrica de la tubulina . . . . . . . 2.3. Ferroelectricidad de los MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1. Descripción del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. 19 20 21 24 25 25 28. 3. Transmisión de señales basada en la ferroelectricidad de los MTs 3.1. Transferencia de energı́a a través de los MT vı́a excitaciones tipo kink 3.1.1. El hamiltoniano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2. La ecuación de movimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3. Estimado del campo eléctrico intrı́nseco de un protofilamento .. 31 31 33 36 38. 4. Conclusiones. 40. v.

(5) A. Simulación de una transición de fase ferroeléctrica en el MT A.1. Instrucciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.2. mainJack.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.3. ConsolaJack.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.4. ConsolaJack.h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.5. FachadaJack.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.6. FachadaJack.h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.7. MicroT.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.8. MicroT.h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.9. Protofilamento.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.10.Protofilamento.h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.11.Dimero.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.12.Dimero.h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.13.Monomero.cpp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.14.Monomero.h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.15.Formato de los archivos de entrada y salida . . . . . . . . . . . . A.15.1. entrada.txt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A.15.2. Archivos de salida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografı́a. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. 42 . 42 . 45 . 45 . 49 . 50 . 53 . 57 . 67 . 74 . 83 . 88 . 93 . 98 . 99 . 102 . 104 . 104 105. vi.

(6) Índice de cuadros 1.1. Principales constituyentes del citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. 2.1. Momento dipolar de la tubulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 23. vii.

(7) Índice de figuras 1.1. Sección transversal de una clamidomona . . . . . . . . . . . . . . . .. 5. 1.2. Estructura geométrica del MT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 10. 1.3. Desintegración de MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 12. 1.4. Crecimiento microtubular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 13. 1.5. Molécula de tubulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 14. 1.6. Secuencia de aminoácidos tubulina α1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15. 1.7. Secuencia de aminoácidos tubulina β1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 16. 1.8. Aminoácidos que ocurren naturalmente . . . . . . . . . . . . . . . . .. 17. 2.1. Momento dipolar de la tubulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22. 2.2. Evolución de los dipolos hacia una fase ordenada. . . . . . . . . . . .. 29. 3.1. Pozo de potencial doble. 34. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. A.1. Formato de los archivos de entrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 A.2. Ejemplo de un archivo de entrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104. viii.

(8) Abstract En este trabajo hemos querido hacer un sondeo lo mas amplio posible de las investigaciones realizadas hasta el momento en microtúbulos. De nuestra gran consulta, hemos decidido tomar uno de los modelos que consideramos mas viables, enriquecerlo con resultados obtenidos en otros trabajos y hacer una reproducción del resultado final. Todo esto con el ánimo de adquirir el bagaje necesario en el ámbito de la biofı́sica molecular para presentar en el futuro aportes más significativos y contundentes al campo aquı́ tratado. Hemos querido encajar este trabajo, no como una investigación aislada, sino como el inicio de un proyecto de vida a largo plazo. Inicialmente presentamos un compendio mas o menos exhaustivo de los conocimientos actuales en biofı́sica del citoesqueleto con un énfasis muy especial en microtúbulos. Creemos haber citado a por lo menos el 80 % de los autores que han publicado en el tema. Es por eso, que consideramos este trabajo como una valiosa fuente bibliográfica para futuras investigaciones, no solo en transporte de información, sino en cualquier rama de la biofı́sica relacionada con microtúbulos. Seguidamente, presentamos nuestra versión de un modelo presentado por Tuszynski et al en 1998 [1] sobre el carácter dipolar de los microtúbulos y su capacidad de ordenarse en un estado ferroeléctrico. Complementamos este modelo con datos obtenidos por Mershin et al [2] para la constante dieléctrica del entorno microtubular y explicamos una simulación muy confiable basada en datos experimentales de diferentes autores para predecir el momento dipolar de la molécula de tubulı́na. Finalmente mostramos una posible implicación del mencionado ordenamiento en la transmisión de energı́a a través del microtúbulo en forma de solitones tipo kink.. ix.

(9) Agradecimientos Principalmente a mi director de tesis, el Dr. Alonso Botero por las numerosas sugerencias que hizo, el tiempo que dedicó y la paciencia inagotable que mostró para conmigo durante esta investigación; a la Universidad de los Andes y en especial al Departamento de Fı́sica por ofrecer los medios fı́sicos y humanos para poder desarrollar este tipo de proyectos. Tengo el placer también de agradecer al profesor Jack Tuszynski de la Universidad de Alberta en Canadá, y del M.I.T. al profesor Andreas Mershin por facilitar sus trabajos y por servir de guı́as durante los primeros meses de adaptación. Por lo demás, quiero mencionar a las personas que amo y que fueron definitivas para sacar adelante este trabajo. A mi madre por su fe, a mis amigos, a Camilo, a Yuver, a Johann, a Gabriel, a Carolina. A todas las personas que trabajaron conmigo hombro a hombro durante el tiempo que costó esta carrera; con frı́o, con calor, tratando de estudiar, ganándonos el pan, en tantos lugares y haciendo tantas cosas diferentes. Bogotá, Colombia Diciembre 26, 2004. Eliécer Ramos. x.

(10) Introducción En las últimas décadas, biofı́sicos de todo el mundo han realizado significativos avances en la comprensión del funcionamiento de diferentes sistemas biológicos estudiando con detalle las estructuras fı́sicas de las moléculas que los componen. Tal es el caso del ADN. Importantes avances conceptuales en fı́sica (desarrollo de modelos no lineales), grandes mejorı́as en métodos experimentales de biologı́a molecular (microscopı́a y cristalografı́a electrónicas)[3] y un progreso exponencial en capacidad y velocidad computacionales, nos ubican actualmente en un punto histórico en el cual diferentes ramas de la ciencia pueden converger para tratar de explicar desde una óptica multilateral algunos de los mas misteriosos acertijos de la vida. Hoy dı́a, entender la multitud y diversidad de las funciones desarrolladas por el citoesqueleto de las células eucariotas representa un desafı́o y una prioridad cientı́fica. Las razones son varias, el interior de las células está organizado por redes de polı́meros filamentosos conformados por proteı́nas: microtúbulos y filamentos intermedios y de actina. Junto con las proteı́nas motoras estos hilos efectúan procesos fundamentales como el transporte de organelos y de sustancias quı́micas. Los microtúbulos por su parte, constituyen las estructuras más rı́gidas dentro de todo el citoplasma y por lo tanto son útiles para el transporte de materiales y para procesos igual de importantes como la mitosis en la división celular [4]. En el momento presente sin embargo, no existe una explicación satisfactoria ni capaz de predecir como estos fenómenos se organizan a nivel molecular. 1.

(11) 2 Lograr la comprensión de los fenómenos recién mencionados tendrı́a importantes aplicaciones en diversas ramas tecnológicas y cientı́ficas. Por ejemplo, comprender plenamente el papel que juegan los microtúbulos en la división celular, podrı́a elucidar posibles tratamientos para la detención del crecimiento de tumores cancerigenos [5]. Por otro lado, existe una razón adicional para estudiar el citoesqueleto celular que quizá resulta ser la mas fascinante: los mecanismos del momento a momento de la célula para la ejecución, organización, toma de decisiones y desarrollo de actividades en su interior permanecen desconocidos. En otras palabras, la respuesta a la pregunta ¿Donde esta el sistema nervioso de la célula? esta por formularse. Dado el caso de que tal sistema nervioso existiera y de que funcionara por ejemplo, en el citoesqueleto, nos enfrentarı́amos con el hecho de que las bases de los procesos cognitivos se encuentran adentro de las células nerviosas y no se deben esencialmente a agrupaciones de las mismas como se ha creı́do hasta ahora. El primero en exponer esta idea fue Hameroff [4] en 1987. Con el transcurrir del tiempo, tal posibilidad ha llevado a formular teorı́as sobre transporte y procesamiento de información a lo largo y ancho de todo el citoesqueleto, con especial interés, debido a su alto grado de rigidez y coherencia, en los microtúbulos. Esta es pues la motivación para presentar un proyecto de grado sobre microtúbulos. La biofı́sica molecular es uno de esos campos de la biologı́a en las cuales los ordenes de magnitud de tamaño, tiempo y propiedades fı́sicas se mezclan con aquellos estudiados por fı́sicos de materia condensada, especialmente los estudiosos de los denominados, soft-matter systems. Lo atractivo del tema, hace imposible creer que la humanidad no pondrá nunca todos sus esfuerzos en investigarlo. Es por lo tanto, un privilegio y una gran oportunidad para un fı́sico de un paı́s como el nuestro, entrar a investigar una rama del conocimiento tan encantadora cuando aun se encuentra en sus albores. Esta tesis es, espero yo, el principio de un proyecto de vida en lo que para muchos.

(12) 3 es el futuro de la fı́sica del presente siglo. He puesto todos mis esfuerzos en ella. Espero que la encuentren de su agrado..

(13) Capı́tulo 1 Biologı́a molecular 1.1.. El citoplasma. Para comprender los mecanismos bajo los cuales funcionan los procesos que sostiene la vida es necesario desarrollar modelos biofı́sicos. Bien sea la producción de energı́a a partir de fuentes alimenticias, la replicación del ADN, el desdoblamiento de proteı́nas, el manejo de señales, el movimiento celular, la división celular o un puñado de otras actividades; la célula tiene la responsabilidad de desarrollar estas tareas y es un gran desafı́o modelarlas matemáticamente. El conjunto de fluidos contenidos dentro de la célula se llama citoplasma. Dentro del citoplasma están ubicados ciertos pequeños compartimientos conocidos como organelos. Los organelos se especializan en realizar cada uno una respectiva función. El citoplasma es el medio liquido encerrado dentro de la célula; el citoesqueleto es la malla de filamentos formados a lo largo del citoplasma. La figura 1.1 es la fotografı́a de la sección transversal de una célula de clamidomona. En ella se puede apreciar el citoplasma con los organelos y el citoesqueleto El citoplasma constituye el medio en el cual toman lugar procesos celulares fundamentales como la respiración. Los componentes tı́picos del citoplasma están listados en la tabla 1.1 [7]. La gran mayorı́a de las células mantienen un pH neutro y su parte. 4.

(14) 5. Figura 1.1: Sección transversal de una clamidomona, se pueden distinguir los diferentes organelos y las redes de filamentos en el citoesqueleto (Tomado de [6]) seca (la carne de la célula) está compuesta de proteı́nas por lo menos en un 50 %. El resto de esta parte seca consiste de ácidos nucleicos, diferentes tipos de iones y carbohidratos. Como se puede ver en la tabla, la mayorı́a de los iones tienen carga positiva. Sin embargo, el citoplasma no tiene carga neta. La compensación es lograda por los demás constituyentes como las proteı́nas, bicarbonatos y fosfatos que por lo general están negativamente cargados. Hay creciente evidencia de la existencia de dos fases del citoplasma [8]. Estas son las ası́ llamadas fases sólida y liquida, sol y gel respectivamente. En la fase sólida la mayorı́a de los constituyentes permanecen inmóviles mientras que en la fase liquida la viscosidad del citoplasma es muy similar a la del agua [8]. La difusión en esta fase es afectada por la abundante presencia de macromoléculas. En la fase sólida la difusión es aproximadamente tres veces más lenta. La forma por la cual esta regulación se efectúa no es clara, se cree que involucra el enredamiento y desenredamiento de algunos filamentos proteicos [9]..

(15) 6. Iones Concentración Constituyentes no iónicos K+. 140 mM. proteı́na. 200-300 mg/mL. N a+. 10 mM. actina. 2-8 mg/mL. Cl−. 10 mM. tubulina. 4 mg/mL. Ca2+. 0.1 µ M. pH. 7.2. M g 2+. 0.5 mM. Constituyentes no iónicos. Cuadro 1.1: Principales constituyentes del citoplasma en una célula tı́pica de mamı́fero El citoesqueleto está compuesto por tres tipos de filamentos proteicos: microfilamentos, filamentos intermedios y microtúbulos [7]. El citoesqueleto es una estructura dinámica que permanece en constante cambio y reorganización. Tiene la responsabilidad de dar forma a la célula y rigidez suficiente para protegerla de posibles cambios en la presión osmótica exterior. Además organiza los contenidos del citoplasma, separa los cromosomas durante la mitosis y en muchos casos, da movilidad a la célula. La forma celular es regulada por un complejo equilibrio de fuerzas tanto internas como externas ejercidas por la matriz extracelular. Este balance fue descrito por Ing-ber y es conocido como tensegridad [10]. Enlaces elásticos de actina actúan como cables moleculares. Estos cables ejercen una fuerza de tensión en la membrana celular y sus constituyentes externos, halando a todos ellos hacia el núcleo. Los microtúbulos actúan como estructuras que resisten la fuerza de compresión de los cables. En muchos casos, es importante que la célula conserve su forma para ası́ poder preservar su funcionalidad. Chen et al. [11] mostraron experimentalmente que las células cambian entre diferentes programas genéticos cuando están forzadas a crecer en formas restringidas especificas. Por su parte, King y Wu [12], mostraron teóricamente como cambia la geometrı́a de la célula y su susceptibilidad debido a campos electromagnéticos..

(16) 7 La separación de los cromosomas durante la división celular es realizada por los constituyentes mas largos del citoplasma, los microtúbulos. Durante la mitosis los microtúbulos se conectan a cada cromosoma y los alinean a lo largo del plano ecuatorial de la célula. Es un misterio como funciona el balance de fuerzas que previene la separación de los microtúbulos hasta que todos los cromosomas están alineados y la división puede proseguir al unı́sono. Los filamentos intermedios tienen un diámetro de aproximadamente 10 nm y se forman por la polimerización de moléculas proteicas fibrosas tales como vimentina, keratinas y vesminas. El carácter eléctrico de estas moléculas y la geometrı́a con la que se unen hace que los filamentos intermedios sean estructuras no polares. Otra caracterı́stica importante es que los filamentos intermedios son capaces de soportar fuertes tensiones sin romperse [7]. Esta última, es quizás la caracterı́stica que les asigna su principal papel dentro de la célula; una red extensa de filamentos intermedios rodea el núcleo y forma lo que se conoce como envoltura nuclear. Por último, estos filamentos también se extienden hacia la periferia celular donde su función es mantener la integridad de la célula y pueden conectarse con la membrana celular[7]. Células especificas tienen filamentos intermedios especı́ficos, en el caso de las neuronas se llaman neurofilamentos.. 1.2.. Microtúbulos. Las razones para investigar microtúbulos (MTs) en un trabajo de grado sobre transporte de información en sistemas biológicos son varias. En general, todas ellas están basadas en indicios experimentales de los cuales mencionaremos algunos a continuación. En los paramecios, un tapete de cilios repletos de MTs actúan como.

(17) 8 antenas sensoriales y se coordinan para servir como remos y producir movimientos inteligentes. Con inteligentes quiero decir que estos movimientos le bastan al paramecio para conseguir comida, evadir a sus depredadores ubicar una pareja y eventualmente, si las cosas marchan bien, tener hijitos. En otra gran cantidad de células, flagelos también repletos de MTs cumplen las mismas funciones que los cilios en los paramecios. Durante la mitosis, los centrı́olos formados por MTs establecen regiones polares en la célula para que los ’spindles’ mitóticos que también están formados por MTs halen los cromosomas. Los cilios y los centrı́olos, son además responsables de fotodetección en organismos primitivos, y de hecho, en los conos (células de los ojos) humanos hay cilios aunque su función aun no ha sido esclarecida con precisión [13]. En organismos multicelulares, los indicios del papel de los MTs son igualmente insinuantes. Al interior de los axones de las neuronas humanas, el citoplasma está totalmente libre de organelos y todo lo que tiene son MTs y sus proteı́nas asociadas; igual sucede con las dendritas. Finalmente, la producción de tubulina y el crecimiento de los MTs en el cerebro de las ratas bebes es máxima justo después de que el animal abre por primera vez lo ojos y durante el periodo de las 48 horas subsiguientes que es considerado el de mayor aprendizaje, es la etapa de reconocimiento del entorno [1]. En resumen donde sea que se requiera organización celular, los MTs están presentes e involucrados. Los MTs son los filamentos del citoesqueleto que tienen el mayor diámetro, 25nm. Se encuentran en prácticamente todas las células eucariotas y son polı́meros de la proteı́na tubulina. Los MTs sirven como vı́as a través de las cuales las proteı́nas motoras pueden transportar materiales a lo largo de la célula y sirven como soportes para mantener la forma celular pues son las estructuras más rı́gidas del citoplasma. Dentro del cuerpo celular, la mayorı́a de los MTs emanan de los centrı́olos que también se llaman microtubule organizing centers o MTOCs. Los MT’s son estructuras polares y su extremo negativo siempre se halla anclado a estos MTOCs..

(18) 9 Ledbetter y Porter [14] fueron los primeros en describir estos pequeños tubos encontrados en el citoplasma cuya estructura ha sido ya bien establecida por técnicas de microscopı́a lumı́nica y crioelectrónica y de inmunofluorescencia. Los MTs son polı́meros formados a partir de dos proteı́nas altamente homólogas, tubulina α y tubulina β. Estas dos proteı́nas son muy similares estructuralmente y se enlazan juntas para formar un heterodı́mero llamado tubulina αβ . Este dı́mero es la subunidad básica que se polariza para formar un MT. El MT en sı́ es un tubo de 25nm de diámetro externo y 15 nm de diámetro interno figura 1.2. El pequeño tubo está compuesto por polı́meros lineales, fuertemente enlazados conocidos como protofilamentos, que están conectados por enlaces laterales mas débiles que para los MTs cultivados in vitro forman una lámina que se pliega dando origen a un tubo. Esto no sucede in vivo pues en este caso los MTOCs tienen verdaderos moldes que generan la forma tubular desde el comienzo. Los dı́meros de tubulina tienen 46x80x65 Å. Experimentos de cristalografı́a electrónica han mostrado que los dos monómeros α y β son prácticamente idénticos [3]. Sin embargo, las pequeñas diferencias permiten la posibilidad de varios tipos de red. En particular las ası́ llamadas redes A y B. Al moverse alrededor del MT en un sentido de mano izquierda, los protofilamentos de la red A tienen un desfase vertical de 4.92 nm [15]. En el caso de red B este desfase es únicamente de 0.92nm debido a que los monómeros α y β tienen roles intercambiados en protofilamentos vecinos [17]. Este intercambio da origen a una discontinuidad en la red B conocida como costura. Ver figura 1.2. Además de la variación en el tipo de red, se sabe experimentalmente que el número de protofilamentos es variable de un MT a otro. Aunque 13 es el número más común para redes in vivo, Chrétien et al. [18] han observado experimentalmente que el número de protofilamentos no necesita ser conservado a lo largo de un MT. Esto conlleva a la aparición de un defecto estructural. Este defecto no es único. Varios tipos de defectos.

(19) 10. Figura 1.2: Estructura del MT: (a) Interacciones cabeza-cola en protofilamentos lineales. Trece protofilamentos lineales se asocian lateralmente para formar polı́meros cilı́ndricos huecos de 25 nm de diámetro (MTs). (b) Una red tipo A es mostrada a la izquierda. A la derecha se ve una de las tres hélices que forman monómeros adyacentes de tubulina en la misma red. Estas hélices son mostradas tanto en (b) como en (c) en la parte derecha como una ayuda visual (Para mostrar las interacciones laterales entre monómeros adyacentes y la naturaleza helicoidal del MT) y no representa un intermedio estructural en el ensamblaje de los MTs. (c) Un MT de 13 protofilamentos organizados en una red tipo B con costura (izquierda), La estructura de red aceptada para MTs. La costura se forma porque una vuelta dada sobre la hélice resulta en un desfase de 1.5 dı́meros de tubulina (o tres monómeros de tubulina). MTs con un número de protofilamentos diferente a 13 (11-15) deben tener costura; los MT de 10 y 16 protofilamentos no tienen costura y también forman hélices. Los protofilamentos en un MT que tenga 13 son totalmente rectos. En cambio, los protofilamentos de MTs con diferentes números de protofilamentos tienden a formar hélices,[15]. Los signos más y menos indican la polaridad de los MTs y los corchetes delimitan los dı́meros dentro de la red (adaptado de Wade y Chretien 1993) (gráfica de [16])..

(20) 11 en la red son cosa común, especialmente in vitro. El número de protofilamentos puede variar entre 12 y 17. Los MTs a menudo exhiben vacancias internas y defectos de lı́nea. Como ya se ha dicho, los MT son polı́meros polares formados por la asociación de dı́meros de tubulina. Cuando un MT en particular es observado, presenta periodos de crecimiento casi continuo, interrumpidos por periodos muy cortos de rápido desintegración como se ilustra en la figura 1.4. La transición del periodo de crecimiento al de desintegración se conoce como catástrofe, mientras que el periodo opuesto es conocido como rescate. La dinámica de ensamblaje a cada extremo del MT difiere. El extremo positivo es entre tres y cinco veces mas dinámico que el negativo. En otras palabras el crecimiento y la desintegración del MT en su extremo positivo ocurren a ratas por lo menos tres veces más altas que las del extremo negativo. Sin embargo, los dos extremos son dinámicos en MTs libres [19]. Para un conjunto de MTs no estáticos, dinámica inestable es el término dado a la observación de que algunos de ellos puede crecer mientras que en su inmediata vecindad otros están encogiéndose. La dinámica inestable ha sido observada tanto in vivo como in vitro y parece corroborar tanto el carácter de no equilibrio del problema como la naturaleza estocástica del crecimiento individual de cada MT. Lo que es muy intrigante es que este comportamiento estocástico individual no impide la presencia de suaves oscilaciones colectivas en ambientes con altas concentraciones de tubulina [20, 21]. La respuesta a esta intriga de las oscilaciones es obtenida simplemente aplicando la mecánica estadı́stica al sistema. Una completa explicación del fenómeno requiere la aplicación del formalismo de la ecuación master [22, 23] o de la cinética quı́mica [24]. Vale la pena también anotar que la geometrı́a de MTs que están creciendo (protofilamento rectos )es diferente a la de los que se están desintegrando (protofilamento curvos). Esto parece ser una consecuencia directa de los cambios conformacionales que sufre la tubulina tras la.

(21) 12 hidrólisis de sus GTPs ligados [25]. El rompimiento de los enlaces laterales primero, es conforme a la diferencia en dos ordenes de magnitud en los módulos de elasticidad a lo largo del protofilamento y alrededor de la circunferencia siendo el de esta última, el menor (figura 1.3).. Figura 1.3: Cuando un MT se desintegra, se rompen primero los enlaces laterales y los protofilamento se curvan, (gráfica de [16]) El ensamble de un MT es estocástico y la rata de acortamiento durante una catástrofe es aproximadamente diez veces la rata de crecimiento [27, 28]. La probabilidad de que un MT en particular crezca, tenga nucleación o se acorte depende de la concentración de tubulina con enlace GTP, tubulina con enlace GDP y otras moléculas relevantes al proceso de ensamblaje que son encontradas en el citoplasma. Muchos modelos teóricos han ilustrado el crecimiento de un MT tal como el ilustrado en la figura 1.4. El reto actual es usar alguno de esos modelos para describir el comportamiento de un conjunto de MTs y ası́ explicar tanto la dinámica inestable como cambios en el crecimiento cuando las condiciones de reacción son modificadas (concentraciones, temperatura, etc.) [26]..

(22) 13. Figura 1.4: El crecimiento de un MT es errático. Un lento y continuo crecimiento es interrumpido por repentinos eventos catastróficos (Grafica de [26]) Finalmente, hay que anotar que los MTs son altamente sensibles al ambiente iónico, niveles de temperatura y de pH y a las concentraciones de una variedad de componentes quı́micos que los rodean. Por ejemplo, el Ca2+ promueve las ratas de catástrofe y afecta ası́ la longitud del MT[29]. Otro ejemplo: Un incremento en el valor del pH ocasiona un incremento en la concentración de tubulina para la formación de MTs [30]. Y un ejemplo último: ha sido demostrado que presiones osmóticas del orden de mega pascales reducen la rata de ensamblaje [31]. Todos estos descubrimientos son de potencial importancia en la investigación de terapias contra el cáncer debido al papel que juegan los MTs en la división celular..

(23) 14. Figura 1.5: Diagrama de la molécula de tubulina producido a partir de los datos de la cristalografı́a electrónica de Nogales et al [3]. Se puede ver la similitud entre el monómero α (mitad de arriba) y el β (mitad de abajo). Las cintas que se ven son usadas a menudo para clarificar la estructura de la proteı́na. En particular, la que tiene forma de espiral recibe el nombre de hélice α sigue la trayectoria del esqueleto de polipéptidos que forma la molécula (Gráfica de [26]).

(24) 15. 1.3.. Bioquı́mica de la tubulina. La tubulina que se polimeriza para formar MTs es un heterodı́mero compuesto por tubulina α y tubulina β. Estas dos ultimas proteı́nas son monómeros altamente homólogos y tienen estructuras tridimensionales prácticamente idénticas. Aunque esta gran similitud habı́a sido sospechada desde hacia tiempo, el hecho de que la tubulina no se pudo cristalizar durante los primeros veinte años de intentos impidió su confirmación hasta 1998. En aquel año Nogales et al [3] lograron obtener láminas de tubulina por cristalografı́a crioelectrónica en presencia de iones de zinc. La figura 1.5 ha sido creada a partir de los datos de Nogales et al. consultados en el protein data bank (PDB entry: 1 tub) usando el programa MOLSCRIPT [32]. Efectivamente, se ve la similitud entre los dos monómeros; cada uno de los cuales está compuesto de una cadena de péptidos de mas de 400 elementos de longitud. La figura 2.1 presenta los valores de carga para los veinte aminoácidos que aparecen naturalmente además de la información sobre su polaridad. Adicionalmente en las gráficas 1.6 y 1.7 se presentan con propósitos comparativos las secuencias de aminoácidos para la dos tubulinas encontradas en humanos. La secuencia es dada con el número total de aminoácidos y el peso molecular y para hacer mas fácil la lectura está dividida en grupos de 10 en 10.. Figura 1.6: Secuencia de aminoácidos tubulina α1 . (Gráfica de [3]) En las células humanas se pueden hallar seis isótipos de tubulina α y siete de.

(25) 16. Figura 1.7: Secuencia de aminoácidos tubulina β1 . (Gráfica de [3]) tubulina β. Aunque la secuencia de aminoácidos es altamente conservada en general, isótipos de tubulina α pueden diferir en algunas regiones. Es decir, algunas regiones de la tubulina α1 difieren de las mismas regiones en la tubulina α2 y ası́ sucesivamente. Recientes estudios han mostrado que las diferencias entre diferentes isótipos de tubulina α son menos pronunciados que entre diferentes isótipos de tubulina β [33]. Actualmente existen varios estudios que indican la existencia de diferentes estados conformacionales de tubulina; sin embargo, hay muy poca información cuantitativa de los posibles cambios estructurales. La primera pista de que hay mas de un estado conformacional viene simplemente de observar el ensamblaje de los MTs. En él, moléculas de tubulina ligada al GTP o lista para ensamblarse, se junta con otras idénticas y forman protofilamentos rectos. Por otro lado la tubulina ligada al GDP forma protofilamentos curvos que a veces llegan a cerrarse sobre sı́ mismos formando anillos. Otra manifestación de las diferentes posibles conformaciones vino cuando Hyman et al [34] midieron la energı́a liberada por la hidrólisis de un análogo del GTP conocido como GMPCPP. La energı́a liberada cuando este análogo estaba ligado a la tubulina fue inferior a la energı́a liberada cuando el análogo estaba libre. La especulación fue que la diferencia deberı́a quedar invertida en cambiar la conformación geométrica de la tubulina. además cuando el GMPCPP era hidrolizado sobre una molécula que estaba ligada a un MT, la energı́a liberada era aun menor. En este caso nuevamente.

(26) 17. Figura 1.8: Los veinte aminoácidos de aparición natural. El dibujo aparecen sus representaciones de una y de tres letras y también información sobre su polaridad y su carga neta. *La histidina tiene una carga neta positiva)(Gráfica de [26]).

(27) 18 se especuló diciendo que la diferencia de energı́a quedaba almacenada en el MT y podrı́a ser liberada una vez este se desintegraba. Mas recientemente, Hyman et al [35] reportaron la existencia de un cambio estructural en la tubulina que acompañaba la hidrólisis del GTP. Este cambio correspondı́a a un estiramiento del monómero de 4.05 nm a 4.20 nm. Ası́ pues, se puede almacenar energı́a localmente en forma de deformaciones elásticas. Por otro lado Tran et al. [28] argumentaron que tres diferentes configuraciones existen junto con un estado metaestable intermedio correspondientes a las conformaciones de crecimiento y de encogimiento. Ası́, por lo tanto, parece que adicionalmente a la multitud de isótipos de tubulina α y β y las numerosas modificaciones que sufren estas moléculas al ligarse a un MT, ellas pueden existir en diferentes conformaciones. La rigidez medida de un MT corresponde a un módulo de Young de 1.4GPa en estado normal y llega a ser de 3.4GPa cuando se impide la hidrólisis [36]. En un estudio independiente un módulo de Young de 4.6GPa fue encontrado a partir del doblamiento de MTs al aplicárseles una fuerza de 10pN [37]. En ambos casos el número es suficientemente grande para implicar que la célula debe recurrir a la depolimerización y no al doblamiento de sus MT para poder cambiar de forma. Finalmente, este valor medido del módulo de Young indica que doblar un protofilamento en un arco con un radio de curvatura de 20nm como observó Mandelkow et al.[27] requerirı́a 0.14 eV/dim (3.2 kcal/mol) que es apenas un poco menos que la energı́a liberada por la hidrólisis del GTP (5.1 kcal/mol). Se cree que esto podrı́a explicar la diferencia observada en la energı́a libre liberada cuando se hidroliza GTP libre comparado con la hidrólisis de GTP ligado a un MT..

(28) Capı́tulo 2 Ferroelectricidad en MTs Puesto que los MTs son polı́meros compuestos de proteı́nas, hay razón para creer que tienen naturaleza dipolar y por lo tanto deberı́an ser sensibles a eventuales campos eléctricos. Cálculos sobre las contribuciones multipolares y momentos dipolares para proteı́nas globulares similares en tamaño a la tubulina han sido realizados e indican la existencia de un momento dipolar del orden de 10−27 Cm. En todos los casos, el momento dipolar está directamente relacionado con los grupos péptidos que conforman la respectiva molécula. Residuos quı́micos en estos grupos péptidos pueden estar protonados o deprotonados dejando las hélices con una carga neta. (figura 1.5). Hay múltiples razones para investigar las propiedades ferroeléctricas de los MTs y el carácter dipolar de la tubulina. Para empezar, de poseerlas, el MT al igual que todos los materiales ferroeléctricos presentarı́a curvas de histéresis que dotarı́an al sistema tanto de irreversibilidad como de memoria [1]. Por otro lado, hay una gran cantidad de trabajo teórico que describe varias propiedades eléctricas, ópticas y cuánticas que basándose en su estructura y función se espera que los MTs tengan. Por ejemplo, la interacción de la tubulina con diferentes drogas ha estado bajo investigación y se ha pronosticado que cambios de orientación en el dipolo eléctrico de la molécula serı́an los responsables de la existencia de fuerzas atractivas de london en el proceso de enlace de la tubulina con otras moléculas también polares como lo son los anestésicos 19.

(29) 20 [38]. Finalmente, asumiendo el carácter dipolar de la tubulina, aquı́ demostraremos la posibilidad de una transición de fase ferroeléctrica y con base en ella la posibilidad de transmitir energı́a sin disipación a lo largo del MT vı́a solitones de tipo kink. Desde el punto de vista cuántico, todos los modelos basados en MTs conocidos en el momento [39, 40, 41, 42, 43, 44] asumen como hipótesis que la tubulina es capaz de algún tipo de cambio conformacional mientras está en el estado polimerizado. Esto aplica aun a los modelos mas exóticos [40, 41] que involucran efectos cuánticos que surgen debido a una diferencia en los estados gravitacionales de las conformaciones de tubulina puesto que los cambios geométricos entre los monómeros deberı́an cambiar el momento dipolar. A partir de estas suposiciones, se han hecho predicciones tales como la existencia de estados enredados de larga duración entre los dı́meros de tubulina. Además, la interacción de los dipolos de moléculas de agua con los dı́meros de tubulina juega un papel central en modelos que predicen la emisión de fotones coherentes desde los MTs [43], teleportación cuántica intracelular de estados cuánticos de dipolo y otros desde luego controversiales pero igualmente fascinantes fenómenos [42].. 2.1.. Momento dipolar de la tubulina. De acuerdo con Sackett [45] la carga neta del dı́mero de tubulina es pH dependiente, siendo positiva a valores bajos de pH y altamente negativa a valores altos. A valores fisiológicos de pH, se espera que existan ocho diferentes valores de carga, la mayorı́a de los cuales estarı́a en la región conocida como término C. El término C es un turupe de la molécula con al menos 16 residuos [3] y posee una carga neta que también depende del pH [45]. El término C no ha sido resuelto a nivel atómico pero se sabe que puede cambiar su geometrı́a dependiendo de las condiciones externas. A condiciones de pH fisiológicas (pH = 7.2), las cargas negativas de la tubulina y del mencionado término se repelen haciendo que este último se estire semejando.

(30) 21 una lanza de 4 a 5 nm de longitud que sale de la molécula hacia el citoplasma. Bajo condiciones mas ácidas, las cargas negativas del término C son neutralizadas por los iones de hidrogeno presentes y la lanza puede plegarse hacia la molécula formando una estructura mas compacta. Sin embargo, pese a que la tubulina fue resuelta atómicamente hace ya mas de seis años [3], su momento dipolar ha sido calculado únicamente a través de simulaciones computacionales como la que presentamos aquı́.. 2.1.1.. Estimado computacional del momento dipolar de la tubulina. Una primera aproximación del momento dipolar de la tubulina consiste sencillamente en tomar una carga de 10e− y multiplicarla por una separación promedio de 4nm. Obteniendo un valor de p = 1920Debyes. De manera similar, un estimado del volumen es V = 2Vglob donde Vglob se refiere al volumen aproximado de cada uno de los monómeros de radio R ≈ 26. Vglob = 4/3πR3 = 73600Å3 . Cuando una molécula es resuelta a nivel atómico y sus estructuras tridimensionales logran ser determinadas por cualquiera de las técnicas cristalográficas que existen en la actualidad, esta información es almacenada en archivos de bases de datos de proteı́nas PDB (del ingles protein database). Cada archivo PDB comienza con una breve descripción de la molécula, créditos a los autores que la resolvieron y detalles experimentales de como lo hicieron. Después el archivo lista los aminoácidos en la secuencia de la proteı́na; finalmente el corazón del archivo PDB define la posición precisa de cada átomo dentro de la estructura tridimensional de la proteı́na. Cada átomo es descrito en una lı́nea separada. Las primeras columnas definen el átomo como parte de un aminoácido en particular de la secuencia y las siguientes listan un.

(31) 22. Figura 2.1: Esquema de los aproximadamente 17000 átomos que componen la molécula de tubulina y momento dipolar estimado del dı́mero y de ambos monómeros (Gráfica de [2]) conjunto de coordenadas x, y, z que ubican con precisión el átomo dentro de la estructura. Los archivos PDB son almacenados en bases de datos publicas y se pueden bajar de Internet (www.fivth.com). Hoy dı́a, existen paquetes de software que pueden leer directamente de archivos PDF y usar las coordenadas para construir modelos tridimensionales en la pantalla del computador. Ejemplos de estos paquetes son Rasmol y Chime, otros programas combinados, pueden ser utilizados para hallar datos fı́sicos tales como el momento dipolar de la molécula. Tal es el caso de ’THE TINKER’[46, 47] y de ’CHARMM’ [48]. Para hallar el momento dipolar de la tubulina se aplicó al TINKER junto con el conjunto de parámetros del CHARMM al archivo PDB de la tubulina [49] que consiste en alrededor de 17000 coordenadas atómicas. El momento dipolar obtenido fue p = 1740D que está cercano a estimados calculados en simulaciones previas [48]. Los resultados se presentan el la tabla 2.1.

(32) 23 Dı́mero de tubulina αβ Carga eléctrica total -10e Magnitud del momento dipolar 1739 Debyes Dirección del momento dipolar θ = 83,02o ; φ = 82,97o radio de giración (gyration radius) 28.6 Å Monómero α Carga eléctrica total -5e Magnitud del momento dipolar 552 Debyes Dirección del momento dipolar θ = 79,02o ; φ = 75,21o radio de giración 26.6Å Monómero β Carga eléctrica total -5.0e Magnitud del momento dipolar 1194Debyes Dirección del momento dipolar θ = 79,7o ; φ = 75,21o radio de giración 20.6Å Cuadro 2.1: Momento dipolar de la tubulina. Ángulos polares con el MT alineados a lo largo del eje y El programa TINKER con los parámetros CHARMM ha dado muy cercanos resultados en el pasado a los valores experimentales del dipolo eléctrico para otras moléculas [50], de manera que se espera que el valor de dipolo calculado arriba p=1740D sea razonablemente cercano al real para la tubulina cristalizada según la información presente el archivo PDB [3] sin el término C. También fueron encontrados los momentos dipolares para los monómeros α y β. Notar que el valor de dipolo para el monómero β es casi el doble que el del α y que además los dos apuntan hacia abajo. Lo cual es consistente con el hecho de que tienen una estructura terciaria muy parecida (en cuanto cintas y hélices como en la figura 1.5). El volumen mı́nimo calculado usando el archivo PDB fue de 78,000 3 . Y como se esperaba, las fuerzas de Van der Walls aportaron la máxima contribución a la energı́a de la molécula [2]..

(33) 24. 2.2.. Determinación de la constante dielectrica de la tubulina. La constante dieléctrica de la tubulina puede ser determinada a partir de la relación [51] tub = n2. (2.2.1). donde n es el ı́ndice de refracción de la tubulina. El ı́ndice de refracción de una solución que contiene tubulina depende linealmente de la concentración de esta de acuerdo a la formula [2] nsol = 0,0018Ctub + 1,3352. (2.2.2). Donde nsol es el ı́ndice de refracción de la solución y Ctub es la concentración presente de tubulina. En condiciones fisiológicas, la concentración de tubulina es aprox. Ctub = 1,60mg/ml que al sustituirse en 2.2.2 da nsol = 1,34 ± 0,07. Por otro lado, podemos aproximar el ı́ndice de refracción de la solución al promedio de los ı́ndices de refracción de sus componentes pesados cada uno con su respectiva concentración porcentual, es decir si asumimos nsol =. X. C i ni. (2.2.3). i. Donde i es el contador que recorre las componentes de la solución, Ci es la concentración porcentual del i-ésimo componente y ni su respectivo ı́ndice de refracción. Una vez hecho esto, podemos separar la solución en dos partes, la tubulina y el resto y de esta manera 2.2.3 se convierte en nsol = (1 − χtub )nresto + χtub ntub. (2.2.4). Es decir ntub =. nsol − (1 − χtub )nresto χtub. (2.2.5). Donde χtub = Ct ub/ρ es la fracción de masa de la tubulina y ρ es la densidad de la solución. Y ası́ finalmente, usando nsol = 1,34 ± 0,07 y los valores de nresto obtenidos.

(34) 25 por Mershin en [2] obtenemos el siguiente valor para el ı́ndice de refracción de la tubulina ntub = 2,90 ± 0,10. (2.2.6). y sustituyendo en 2.2.1 nos da el siguiente valor para la constante dieléctrica tub = 8,41 ± 0,20. 2.3.. (2.2.7). Ferroelectricidad de los MTs. Si los cálculos presentados anteriormente son correctos y como todo parece indicar la tubulina tiene un dipolo eléctrico neto, se podrı́an presentar fases de ordenamiento dentro del MT en el cual todas las moléculas de tubulina alinearan sus dipolos en una misma dirección. Debido al entorno en el cual se encuentran embebidos los MTs, estas fases de ordenamiento tendrı́an que competir con factores térmicos que tenderı́an a romperlas. Ası́ pues, existirı́a una temperatura crı́tica por debajo de la cual el sistema pasarı́a de un estado desordenado a uno ordenado y tendrı́amos una transición de fase. Dado que la tubulina, de acuerdo a lo estudiado en el primer capitulo de este trabajo en la sección 1.3, puede presentar varios estados conformacionales, podrı́an existir varias transiciones de fase a diferentes temperaturas o a diferentes condiciones energéticas.. 2.3.1.. Descripción del modelo. A continuación introducimos nuestra versión del modelo presentado por Tuszynski et al. [1]. Tuszynski et al. representaban al MT como una red bidimensional de dipolos. Se asumı́a que cada dı́mero tenı́a un momento dipolar p = Qd, con Q = e y d = 4nm. Allı́ se lograba mapear este sistema simplificado a un modelo de 1/2 de ising. En el cual cada dı́mero podı́a estar únicamente en dos estados. Estos estados estaban.

(35) 26 determinados por la proyección del momento dipolar sobre el eje del protofilamento que podı́a valer +p o -p. A continuación presentamos las modificaciones que hicimos al modelo de Tuszynski et al. Hemos sustituido el valor de dipolo de Tuszynski et al. por el hallado en la sección 2.1.1 Hemos modificado la orientación del dipolo. Antes era arriba-abajo. Ahora es arriba-abajo2. Donde abajo2 es la orientación presentada en el sección 2.1.1 para el momento dipolar de la tubulina Cambiamos el valor de tentativo = 10 usado por Tuszynski y usamos el mas exacto calculado en la sección 2.2. Hicimos esto para mejorar los resultados hallados de la temperatura de transición de fase. Cambiamos la red bidimensional plana usada por Tuszynski et al. por una red cilı́ndrica. Aprovechando la nueva simetrı́a de lar red, cambiamos las coordenadas cartesianas por cilı́ndricas. El modelo fue desarrollado usando técnicas de programación orientada a objetos. Existe una clase y un archivo diferente para el MT, los protofilamentos y los dı́meros. Esto con el fin de hacerlo mas fácil de actualizar y posible de extender a otras simulaciones A continuación explicamos nuestro modelo y en el apéndice A presentamos el código del programa. En el modelo realizamos una simulación de Montecarlo sobre un sistema de spin 1/2 de Ising. El papel de los spines en el modelo de de Ising está en este caso representado por las orientaciones de los dipolos que fueron 1 hacia arriba o -1 hacia abajo..

(36) 27 También hicimos simulaciones con -1 representando la orientación del momento dipolar calculada en la sección 2.1.1. La interacción del sistema se tomo únicamente a primeros vecinos y la energı́a de interacción se asumió como la energı́a de interacción entre dos dipolos sencillos que es la siguiente Eij =. 1 p1 p2 − 3(p1 n)(p2 n) 4π0 r3. (2.3.1). Donde 0 es la permitividad del vacı́o, es la constante dieléctrica del medio, rij es la distancia entre los sitios ij y n es el vector que une los dipolos [52]. En nuestras simulaciones la constante dieléctrica utilizada fue la calculada en la sección 2.2. El hamiltoniano efectivo utilizado, de acuerdo a lo dicho anteriormente fue el del modelo de ising H=−. X. Eij Siz Sjz. (2.3.2). <nn>. Donde < nn > indica suma sobre primeros vecinos Siz es la proyección sobre el eje z de los valores del dipolo que de acuerdo a lo ya discutido, puede valer 1 o -1 y Eij es la energı́a de interacción dada por 2.3.1. La aplicación de un campo eléctrico en la dirección paralela al eje del MT puede servir para tener una orientación de dipolos más eficiente. En este caso el hamiltoniano efectivo es H=−. X. <nn>. Eij Siz Sjz − p. X. Siz. (2.3.3). i. Donde < nn > indica suma sobre primeros vecinos. El programa fue corrido para diferentes configuraciones iniciales de los dipolos, todas ellas generadas aleatoriamente. El algoritmo escogido para la evolución del sistema fue el llamado algoritmo de aceptación metrópolis según el cual, se escoge un dı́mero al azar y se invierte si su nueva energı́a es menor que la energı́a actual o si e−kT ∆E es menor que un número aleatorio generado entre 0 y 1. [53]..

(37) 28. 2.3.2.. Resultados. Realizamos varias simulaciones para redes con distinto número de protofilamentos todas ellas para una red tipo A. En todos los casos se observó una fase altamente ordenada por debajo de cierta temperatura crı́tica. Esta temperatura depende de los valores iniciales de y p. Para los valores escogidos por nosotros p = 1739D y = 8,41 esta temperatura resulto estar muy por encima de los valores fisiológicos (310 k). De hecho, registramos fases de ordenamiento aun para temperaturas por encima de 10000 o. K. Pero en general, fases totalmente ordenadas se encuentra hasta máximo 2000 o K.. Para valores mayores, se pueden presentar grandes defectos de dipolos con sentidos opuestos al resto de la red, con muy largas vidas medias. (Mas de 2000 iteraciones de Montecarlo). En la figura 2.2 presentamos un ejemplo de un tı́pico archivo de salida de nuestro programa. En él se puede ver la evolución hacia la fase de ordenamiento en la cual todos los dipolos se encuentran alineados en una misma dirección. El archivo mostrado en particular corresponde a la red tipo A. Los resultados de nuestras simulaciones confirman lo predicho por Tuszynski et al [1]. Las simulaciones de ellos sin embargo, predecı́an temperaturas de transición mucho menores. Incluso por debajo de las fisiológicas. Esto se debe a las diferencias en los valores de con valores de momento dipolar y de constante dieléctrica. Desde el punto de vista de la interacción dipolar, el tipo de red es crucial. En el caso de la red A como se puede ver en la figura 2.2, el desfase entre dipolos vecinos para protofilamentos adyacentes es tal, que todos los dı́meros tienden a alinearse en la misma dirección. En cambio para la red B, el desfase entre dı́meros vecinos es mucho menor. De hecho, en esta red, los dı́meros se alinean en filas casi horizontales y esto hace que en protofilamentos adyacentes los dı́meros se alineen en direcciones.

(38) 29. Figura 2.2: Evolución de los dipolos hacia una fase ordenada en la red A..

(39) 30 opuestas. Es decir, en el protofilamento 1 todos hacia arriba, en el 2 todos hacia abajo y ası́ sucesivamente. En ambos casos, la interacción a lo largo de un protofilamento es suficientemente fuerte para que sobre él, todos sus dı́meros vayan en la misma dirección. También realizamos simulaciones para MT con número de protofilamentos variable. En todos los casos, satisfaciendo las expectativas, las fases ordenadas aparecieron. Como era de esperarse, entre mas grande es un defecto, mas larga es su vida media. El profesor Botero y yo estuvimos trabajando tratando de crear un modelo por medio del cual, la interacción de estos defectos con campos eléctricos externos, como el debido al potencial de acción que suele correr paralelo a los MTs, los hiciera propagarse. Investigaciones en esta dirección podrı́an dar un poco de luz sobre el papel que juegan los MTs en los axones que están repletos de ellos..

(40) Capı́tulo 3 Transmisión de señales basada en la ferroelectricidad de los MTs Ver los MT, de acuerdo al modelo recién presentado, como una red de dipolos oscilantes y ordenados que interactúan a través de fuerzas de mediano rango, presenta maravillosas posibilidades en cuanto al transporte de información se refiere. En primer lugar, demostrar que tal ordenamiento puede presentarse a temperaturas fisiológicas, supera los obstáculos de tipo entrópico que alterarı́an cualquier tipo de señal que se quisiera propagar a través de la red. En segundo lugar, es mucho más fácil teorizar sobre redes ordenadas que sobre redes desordenadas. En la actualidad existen varios modelos de transporte de información tanto de naturaleza clásica como cuántica que asumen tal ordenamiento dipolar, aquı́ presentamos uno de los mas citados.. 3.1.. Transferencia de energı́a a través de los MT vı́a excitaciones tipo kink. Los MTs de verdad, los que están en el interior de la célula, no viven en un ambiente de equilibrio. Varias moléculas (MT associated proteins, MAPS) se adhieren a ellos por medio de reacciones quı́micas cuyos enlaces a menudo liberan energı́a. Una de las reacciones mas comunes es la hidrólisis que sufre el GTP, cuando al adherirse a las paredes del MT se convierte en GDP (pierde un grupo fosfato) liberando energı́a 31.

(41) 32 que parcialmente queda almacenada en la red de dı́meros [35]. La reacción quı́mica obedecida es la siguiente GT P 4− + H2 0 → GDP 3− + HP O42− + H + + ∆E. (3.1.1). y bajo condiciones normales libera aproximadamente ∆E = 10kcal/mol. Se cree que esta energı́a puede ser una de las causantes de la catástrofe del MT pero los mecanismos exactos se desconocen. La energı́a liberada por la hidrólisis del GTP que queda almacenada en el MT podrı́a alterar la conformación eléctrica o geométrica de la molécula de tubulina a la que se adhiere y por lo tanto cambiar su momento dipolar. En el caso de una red perfectamente ordenada, esto equivaldrı́a a la aparición de un defecto. Es forma similar, varios de estos procesos podrı́an conllevar a la aparición de varios defectos. Una vez estos defectos han sido inducidos, podrı́an propagarse a lo largo del MT. Algún tipo de mecanismo sin embargo, seria necesario para dirigirlos y evitar que su energı́a se disipara en todas las direcciones. Entre estos mecanismos podrı́amos contar los siguientes La aplicación de un campo eléctrico externo que favoreciera la propagación de la señal en una dirección. Una asimetrı́a en la estructura de la tubulina que sencillamente facilitara la propagación de la señal en un sentido. Una tensión mecánica elástica mayor en cierta dirección. Como es el caso de los enlaces longitudinales que son mas fuertes que los laterales. En este caso, los defectos tenderı́an a movilizarse no a lo largo de un protofilamento sino en sentido helicoidal..

(42) 33 Varios grupos de investigadores han desarrollado modelos no lineales de propagación de energı́a a lo largo del protofilamento del MT. Chou et al citechou mostró que kinks y pulsos estimulados por la energı́a liberada por la hidrólisis del GTP podı́an propagarse a lo largo del MT debido al acoplamiento elástico entre los dı́meros. El modelo de formación de ondas que presentamos aquı́ fue propuesto por Sataric et al. y posteriormente desarrollado por Tuszynski et al [54]. La hipótesis inicial es que los dipolos de tubulina dentro del MT están espontáneamente alineados a temperaturas fisiológicas. Demostraremos que a través de esta red ordenada de dipolos pueden viajar ondas de tipo kink, siempre y cuando exista un evento activador que suministre energı́a al sistema y que este suministro de energı́a exceda cierto valor crı́tico. En el presente modelo fı́sico, la suposición principal es que el sistema presenta una fuerte anisotropı́a axial (tiene una dirección preferida para sus dipolos) de manera que dentro del arreglo, cada dı́mero puede ser descrito en términos de un solo grado de libertad. Este grado de libertad, asumiremos que es la proyección del dipolo en el sentido del eje del protofilamento. El suministro de energı́a para generar la onda kink, puede resultar de la hidrólisis del GTP a GDP en las paredes del MT. Escogimos este fenómeno porque resulta muy atractivo desde del punto de vista biofı́sico, la energı́a liberada en él es justo la necesaria [55]. La reacción quı́mica involucrada es la siguiente. 3.1.1.. El hamiltoniano. La dinámica del sistema será descrita en términos del pozo doble de potencial figura3.1. Hacemos esto pues tal aproximación ha probado ser extremadamente útil en la fı́sica de moléculas biestables [56] también porque tiene éxito en áreas como la descripción de excitaciones dipolares en ferroeléctricos [57] pero la principal razón.

(43) 34. Figura 3.1: El doble pozo de potencial para usar este potencial es que de acuerdo con Tuszynski et al [54], el grado de libertad escogido por nosotros, la proyección longitudinal del desplazamiento del dı́mero interactúa con el resto de la red a través de un potencial anharmonico de la forma del potencial de doble pozo de orden cuarto. 1 1 V (un ) = − Au2n + Bu4n , 2 4. (3.1.2). donde un , representa la proyección del desplazamiento longitudinal del n-ésimo Dı́mero en la dirección del eje del MT. A y B son constantes tales que B > 0, es independiente de la temperatura mientras que A es una función tı́pica que puede cambiar de signo en un determinado valor de temperatura Tc , A ' −α(T − Tc ), con α > 0. Por debajo de Tc , A>0 y un tiene un máximo del potencial tal que V (0) = 0. El doble pozo tiene dos mı́nimos locales en Un = ±. r. A B. (3.1.3). A2 4B. (3.1.4). . En los cuales el potencial toma el valor Vmin = −.

(44) 35 En el caso del MT, deseamos usar el potencial anharmonico para aproximar el efecto promedio que sobre un dı́mero, tienen todos sus vecinos cuando están en su posición de equilibrio. El siguiente paso en el desarrollo de este modelo es tomar en cuenta el dato experimental de que el MT tomado como un todo representa un dipolo gigante. Es natural considerar la presencia de un campo eléctrico producido por el MT mismo. Por lo tanto, asumimos que junto con el agua polarizada que lo rodea, el MT genera un campo eléctrico uniforme paralelo a su eje. Por lo tanto, la energı́a potencial adicional asociada a cada dı́mero es Vel = −cun , c = qE,. (3.1.5). donde q denota la carga neta asociada con un dı́mero y E es la magnitud del campo eléctrico intrı́nseco al MT. Ahora podemos escribir el hamiltoniano total H=. N X 1 i=1. dun 2 k 1 1 M[ ] + (un+1 − un )2 − Au2n + Bu4n − qEun 2 dt 2 2 4. . (3.1.6). En esta última ecuación N es la cantidad de dı́meros en el Protofilamento, M representa la masa de cada Dı́mero, el primer término es la energı́a cinética, el segundo representa la energı́a potencial elástica y los dos últimos al potencial anharmonico. Para derivar una ecuación de movimiento lo mas realista posible para este sistema, es indispensable considerar la viscosidad del fluido e incluir en las ecuaciones de movimiento la fuerza correspondiente. Asumiendo por simplicidad que el entorno del MT está compuesto únicamente de agua, se pueden hacer las siguientes inferencias [58] Las moléculas de agua dipolares tienen un efecto significativo en la energı́a electrostática entre los dipolos de los dı́meros..

(45) 36 El agua, proveerá el medio viscoso que amortiguará las vibraciones de los dı́meros. El primer efecto puede tomarse en cuenta por medio de una inclusión adecuada de la constante dieléctrica. El segundo, sencillamente añadiendo la tı́pica fuerza viscosa a la ecuación de movimiento. Fv = γ. ∂un , ∂t. (3.1.7). donde γ representa el coeficiente de viscosidad que estimaremos en la siguiente sección.. 3.1.2.. La ecuación de movimiento. Con el ánimo de plantear las ecuaciones de Lagrange y hallar las ecuaciones de movimiento, aproximaremos la variable discreta un al continuo de acuerdo a la siguiente expansión en serie de Maclaurin un (t) → u(x, t) un+1 (t) → u(x, t) + R0. (3.1.8) 1 du2 (x, t) du(x, t) + ... + R02 dx 2! dx2. (3.1.9). donde R0 , representa el espaciamiento de equilibrio entre dı́meros adyacentes y tiene un valor de 8nm. Ahora podemos usar la ecuación de Euler-Lagrange d dL d dL dL ( 0) + ( ∗) − = Fν dt du dx du du donde L = T − V , es el lagrangiano del sistema y u0 =. du dt. (3.1.10) y u∗ =. du . dx. Sustituimos en. esta última ecuación las correspondientes energı́as del 3.1.6 y usamos la aproximación al continuo 3.1.9 obteniendo la siguiente ecuación de movimiento en la cual ya hemos sumado la fuerza de viscosidad 3.1.7 M. 2 d2 u du 2d u 3 − KR − Au + Bu + γ − qE = 0 0 dt2 dx2 dt. (3.1.11).

(46) 37 Es importante recordar que esta última ecuación, la coordenada x está medida a lo largo del eje del protofilamento. Como solución a la ecuación de movimiento estamos buscando ondas viajeras. Por esta razón, asumimos una solución de la forma ξ=. . |A| M (v02 − v 2 ). 1/2. (x − vt) = α(x − vt). (3.1.12). Donde desde luego α=. . |A| M (v02 − v 2 ). 1/2. (3.1.13). Sustituir 3.1.12 en la ecuación de movimiento 3.1.11 nos lleva a la siguiente ecuación diferencial ordinaria M α(v02 − v 2 )u00 − γαu0 − Au + Bu3 − qE = 0 donde u0 =. du . dξ. (3.1.14). Esta es la ecuación de un oscilador anharmonico con fricción lineal. cuyas soluciones analı́ticas de están descritas en [59] y de las cuales discutiremos brevemente una a continuación. Por conveniencia, introducimos ahora la nueva variable normalizada ψ(ξ) = u(ξ)/ω donde ω =. p. (3.1.15). A/B corresponde al mı́nimo del pozo doble de potencial en la ec.3.1.2.. La nueva ecuación diferencial ordinaria toma la siguiente forma ψ 00 + ρΨ0 − Ψ3 + Ψ + σ = 0. (3.1.16). ρ = γv[M (v02 − v 2 )A]−1/2. (3.1.17). Donde. y σ = qE. r. B A3. (3.1.18).

(47) 38 En [57] es demostrado que la ecuación 3.1.16 tiene una única solución acotada dada por Ψ(ξ) = a +. b−a . 1 + exp βξ. (3.1.19). Donde β=. (b − a) √ 2. (3.1.20). y los parámetros a, b y c satisfacen la ecuación cúbica (ψ − a)(ψ − b)(ψ − d) = ψ 3 − ψ − σ. (3.1.21). La ecuación 3.1.19 es una solución de tipo kink que por construcción se propaga a lo largo del protofilamento y tiene velocidad constante −1/2 2γ 2 v = v0 1 + 2 9d M v02. (3.1.22). Donde v0 es la velocidad del sonido en el MT que se puede calcular a partir de la p relación de dispersión v0 = K/M R0 y R0 = 8nm es la separación entre los dı́meros. La velocidad calculada en 3.1.22 es menor que la velocidad del sonido y obviamente. decrece al incrementar el ı́ndice de viscosidad γ. Es claro que v depende del campo eléctrico a través del parámetro d. Esta dependencia no es sencilla pues envuelve la ecuación 3.1.21. Sin embargo se sabe [54] que para T < Tc y campos grandes d ∼ E 1/3 mientras que para campos pequeños d ∼ ψ0 + λE, donde ψ0 = ±1 es la solución de campo medio para cuando E = 0. Con el ánimo de adquirir una mayor comprensión de este resultado haremos a continuación un estimado del campo eléctrico intrı́nseco del protofilamento.. 3.1.3.. Estimado del campo eléctrico intrı́nseco de un protofilamento. Para poder facilitar las cosas, asumiremos que la longitud Ldel MT es mucho mayor que su diámetro, L >> 25nm. Por lo tanto, para puntos que están suficientemente retirados de los extremos del MT, el campo eléctrico se puede aproximar por.

(48) 39 la sencilla ecuación E≈. Q , 4π0 r2. (3.1.23). donde q es la carga efectiva al final del MT y r es la distancia del punto en cuestión al extremo de protofilamento. Como ejemplo, tomaremos un MT que tenga 100 dı́meros. Esto nos da una longitud de L ∼ 10−6 m. Si asumimos también que cada dı́mero tiene una carga neta de -10e (sección 2.1.1) tendremos una carga total Q = 2extremos × 13protof ilamentos × 10 × e = 260e. Por lo tanto, el campo eléctrico en un punto cerca a la mitad del protofilamento será aproximadamente E ∼ 1,4x104 V /m. Este valor tiene que ser disminuido en por lo menos otro orden de magnitud debido a la naturaleza dieléctrica del medio. Lo que nos deja con un campo eléctrico final E ∼ 103 V /m. Infortunadamente un valor tan alto de campo eléctrico podrı́a tener desagradables implicaciones en la estabilidad del MT. De acuerdo con Stracke et al.[60], los MTs se desintegran al aplicarles un campo eléctrico del orden de 2 × 103 V /m. Sin embargo, tampoco hay razón para desanimarse. Lo que realmente se necesita es una base experimental mas sólida. La simulación presentada en la sección 2.1.1 confiere un carácter dipolar altamente probable a tubulina. Por otro lado, varios materiales ferroeléctricos estudiados han mostrado que pueden soportar la formación de ondas tipo kink. Tal es el caso del P b5 Ge3 O1 1 [57]..

(49) Capı́tulo 4 Conclusiones En este documento hemos presentado una revisión los más completa posible de la fisiologı́a del MT y de la estructura fı́sica y quı́mica de su principal componente, la tubulina. Hemos citado a la gran mayorı́a de los modelos clásicos sobre transporte de información y propiedades fı́sicas de estos dos sistemas. De esta gran revisión literaria, hemos explicado con detalle, una simulación que deduce con base en datos experimentales el momento dipolar de la tubulina. Los resultados obtenido fueron pα = 552D, pβ = 1193D y pαβ = 1740D. Hemos también con base en datos experimentales del ı́ndice de refracción de la tubulina y en ecuaciones elementales de la electrodinámica, logrado hacer un estimado confiable de la constante dieléctrica del entorno microtubular, obteniendo un valor de = 8,41 Una vez obtenidos estos resultados, los hemos aplicado a la reproducción de un modelo presentado por Tuszynski sobre la posibilidad de una transición de fase ferroeléctrica en el MT. Hemos obtenido tal transición de fase y hemos concluido que el estado ordenado fácilmente se puede presentar a temperaturas fisiológicas. Hemos presentado los resultados de la simulación para la red A y hemos mencionado los. 40.

(50) 41 correspondientes a la red B. Los diferentes tipos de ordenamiento en las redes nos llevaron a formular hipótesis sobre las implicaciones que estos tendrı́an en el transporte de proteı́nas y de organelos dentro de la célula, función universalmente conocida de los MTs. Posteriormente, hemos presentado un modelo que precisamente asume el ordenamiento de los dipolos de tubulina a temperaturas fisiológicas y concluye que puede haber transmisión de energı́a a lo largo del MT en forma de ondas tipo kink. Este último modelo, está representado por una ecuación diferencial en el desplazamiento elástico del dı́mero de tubulina. La ecuación fue construida incluyendo un término correspondiente a un campo eléctrico externo paralelo al eje del MT y una aproximación del efecto de los vecinos de cada molécula de tubulina como un doble pozo de potencial. Finalmente, para hacer el modelo lo mas realista posible, añadimos a la ecuación de movimiento un término que tuviera en cuenta las fuerzas disipativas que se deben al medio viscoso en el cual debe propagarse el kink. Nuestro modelo requerı́a de un evento interruptor para iniciar la propagación de la onda. Con base en estimados numéricos de energı́a liberada, hemos escogido como evento interruptor a la hidrólisis de GTP sobre las paredes del MT. y hemos presentado cálculos sobre la velocidad de propagación de la onda y del sonido sobre el cilindro microtubular. Todo esto lo hemos hecho porque las investigaciones realizadas por diferentes grupos indican que la tubulina juega un papel fundamental en la manipulación y almacenamiento de información intracelular. Y en general, las moléculas capaces de auto ensamblarse están en la frontera de la fabricación de nuevos materiales y posiblemente en el desarrollo de nuevas tecnologı́as de información..

(51) Apéndice A Simulación de una transición de fase ferroeléctrica en el MT A.1.. Instrucciones. A continuación presentamos el código del programa en C++ que mapea el sistema del MT con sus dı́meros cada uno de ellos con un dipolo en una de dos posibles orientaciones dadas en la sección 2.3 a un modelo de Ising de spin 1/2. Como se menciono en dicha sección, el programa tiene varios clases y consta de varios archivos. Quien quiera correr este programa en el futuro puede hacerlo siempre y cuando siga las instrucciones que se dan a continuación 1. El programa fue hecho en el entorno Borland C++ Builder y usa algunas librerı́as y funciones que son exclusivas de C++ y propiedad de Borland. No sé que tan sencillo sea hacer una traducción el C++ estándar que todos conocemos. La parte mas complicada quizá es el uso de los templates de listas y colas y los iteradores. Por lo tanto, si quiere correr este programa y no quiere entrar a cambiar el código (entiendo que esto seria molesto) consı́gase una versión de C++ Builder, cualquiera después de la 5a sirve. En caso de que no la pueda conseguir, en la U. de los Andes en el sexto piso del edificio W esta instalada.. 42.

(52) 43 2. Cree en su disco duro una carpeta con el nombre que usted quiera. En esta carpeta guardara el programa 3. Dentro de la carpeta que acaba de crear, cree otras tres carpetas con los siguientes nombres: consola, docs y kernel 4. Cree los archivos mainJack.cpp, ConsolaJack.cpp y ConsolaJack.h (exactamente con estos nombres, respetando mayúsculas y todo) con cualquier editor de texto y haga copy-paste de los correspondientes archivos que se presentan al final de estas instrucciones a estos nuevos archivos respectivamente. Es decir, copie en el archivo mainJack.cpp que acaba de crear lo que aparece abajo de estas instrucciones en la sección mainJack.cpp. Lo mismo con ConsolaJack.cpp y ConsolaJack.h 5. Salve los archivos mainJack.cpp, ConsolaJack.cpp y ConsolaJack.h que creo en el paso anterior en la carpeta consola que creo en el paso 3 6. Haga lo mismo que hizo en el paso 4. (solo en el paso 4), pero esta vez con los archivos Dimero.cpp, Dimero.h, Monomero.cpp, Monomero.h, Protofilamento.cpp, Protofilamento.h, MicroT.cpp, MicroT.h, FachadaJack.cpp y FachadaJack.h 7. Salve todos los archivos que creo en el paso anterior en la carpeta kernel que creo en el paso 3 8. Haga lo mismo que hizo en el paso 4 (solo en el paso 4), pero esta vez con el archivo entrada.txt. Este es el archivo de entrada para cuando corra el programa. Usted puede crear otros archivos de entrada y correr el programa con ellos siempre y cuando tengan el formato correcto. El formato correcto se presenta en los apéndices que están después de estas instrucciones..

(53) 44 9. Salve el archivo que creo en el paso anterior en la carpeta docs que creo en el paso 3. Todos los archivos de entrada y de salida del programa deben estar siempre en esta carpeta. 10. Abra el entorno C++ builder que consiguió en el paso 1 11. Dentro del programa vaya a file y escoja Close All 12. Vaya a file y escoja open, dirı́jase a la carpeta consola que creo en el paso 3 y escoja mainJack.cpp 13. Le será preguntado si desea crear un proyecto. Diga que sı́. 14. Oprima SHIFT+F11 Y añada al proyecto todos los archivos .cpp (solo los .cpp no los .h) que creo en los pasos 4 y 6 (Solo los pasos 4 y 6) 15. Ahora puede correr el programa. Compı́lelo primero con ALT+ F9 y corralo con F9. Espero que la interfaz que presenta sea suficientemente amigable para que a partir de este momento pueda usarlo por su cuenta. Cuando escoja la opción 2 se le pedirá un archivo de entrada, puede digitar el nombre del archivo entrada.txt que creo en el paso 8. O cualquiera que este en la carpeta docs y que tenga el mismo formato 16. Cuando vaya a cerrar el programa le será preguntado si desea salvar el proyecto que creó. Diga que si y sálvelo con el nombre que quiera. 17. La próxima vez que quiera abrir el programa puede omitir todos los pasos anteriores y basta con hacer doble click en el archivo que creo en el paso 16 18. Si tiene problemas puede escribirme: [email protected].

(54) 45. A.2.. mainJack.cpp. //--------------------------------------------------------------------#include <vcl.h> #pragma hdrstop //--------------------------------------------------------------------#include "consolaJack.h" using namespace std; int main() { ConsolaJack consola; consola.ejecutar(); return 0; } //---------------------------------------------------------------------. A.3.. ConsolaJack.cpp. #include "ConsolaJack.h" //--------------------------------------------------------------------ConsolaJack::ConsolaJack() { // fachada.setIteraciones(iteraciones); // fachada.setIntervalo(intervalo); } //--------------------------------------------------------------------ConsolaJack::~ConsolaJack() { } //--------------------------------------------------------------------void ConsolaJack::ejecutar() { int opcion, l; char nomArchivo[40], archivoAux[40], nomAux[30]; codRes result; struct time t; strcpy(nomArchivo, "../docs/"); while((opcion = desplegarMenu()) != 9){ switch(opcion){ case 1: gettime(&t); strcpy(nomArchivo, "../docs/");.

(55) 46 sprintf(nomAux, "jackout_09_28_%2d%2d.txt", t.ti_hour, t.ti_min); strcat(nomArchivo, nomAux); result = fachada.crearArchivoMT(nomArchivo);//recordar que todos //los archivos son creados con //el mismo formato if(result == SRV_EXITO){ printf("\nARCHIVO CREADO EXITOSAMENTE"); getch(); } else if(result == RED_VACIA){ printf("\nNo existe un MT actual, cargue uno primero con opcion 2"); getch(); } break; case 2: printf("\nIngrese por favor el nombre del archivo de entrada\t"); fgets(archivoAux, 40, stdin); strcat(nomArchivo, archivoAux); l = strlen(nomArchivo); nomArchivo[l-1]=’\0’; result = fachada.cargarMT(nomArchivo); while(result != SRV_EXITO || result == ERROR_FORMATO_ARCHIVO){ if(result == ERROR_FORMATO_ARCHIVO){ cout<<"\nHay un error en el formato del archivo."; cout<<" No se ha podido efectuar la carga.\n"; } else if(result == RED_LLENA){ cout<<"\nEn este momento el MT no esta vacio,"; cout<<" desea guardarlo en un archivo antes de cargar?\n1.Si\n2.No\n"; int aux; cin>>aux; if(aux == 1){ result = fachada.crearArchivoMT(nomArchivo); } fachada.limpiarMT(); result = fachada.cargarMT(nomArchivo); } else if(result == ERROR_ARCHIVO){ cout<<"\nNo se puede encontrar tal archivo. Es posible que la "; cout<<"ubicaion no este bien especificada\n\n"; }.