UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
BÚSQUEDA Y EVALUACIÓN DE AGENTES NATURALES
ANTITUBERCULOSOS CON PLANTAS NATIVAS DE
GUATEMALA
Adriana Rosmary González Escobar
Danicela del Milagro Mercado Montenegro
María Virginia Morán Valenzuela
Vivian Roxana Retana Albanés
QUÍMICAS BIÓLOGAS
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
BÚSQUEDA Y EVALUACIÓN DE AGENTES NATURALES
ANTITUBERCULOSOS CON PLANTAS NATIVAS DE
GUATEMALA
Informe de Seminario de Investigación
Adriana Rosmary González Escobar Danicela del Milagro Mercado Montenegro
María Virginia Morán Valenzuela Vivian Roxana Retana Albanés
Para optar al título de QUÍMICAS BIÓLOGAS
MIEMBROS DE JUNTA DIRECTIVA
Oscar Cóbar Pinto, Ph.D. Decano
Lic. Pablo Ernesto Oliva Soto Secretario
Licda. Lillian Raquel Irving Antillón, M.A. Vocal I
Licda. Liliana Vides de Urízar Vocal II
Licda. Beatriz Eugenia Batres de Jiménez Vocal III Br. Andrea Alejandra Alvarado Álvarez Vocal IV Br. Aníbal Rodrigo Sevillanos Cambronero Vocal V
CONTENIDO
1. RESUMEN 1
2. ÁMBITO DE LA INVESTIGACIÓN 2
3. ANTECEDENTES 3
3.1 Género Mycobacterium 3
3.2 Clasificación de las especies de micobacterias 3
3.3 M. smegmatis 5 3.3.1 Patogenia de M. smegmatis 6 3.4 M. tuberculosis 7 3.4.1 Características de la especie 7 3.4.2 Estructura 8 3.4.3 Crecimiento in vitro 9 3.4.4 Ácidos micólicos 9 3.4.5 Ácido alcohol-resistencia 10 3.5 Tuberculosis 10 3.5.1 Generalidades 10 3.5.2 Etiología 10
3.5.3 Cronología de los estudios sobre la tuberculosis 11
3.5.4 Epidemiología mundial y en Guatemala 12
3.5.5 Mecanismos de transmisión 13
3.5.6 Patogenia y respuesta inmune de la tuberculosis 14
3.5.6.1 Mecanismos de respuesta inmune 14
3.5.6.2 Influencia del VIH en la patogenia de la tuberculosis 16
3.5.7 Síntomas y signos 16
3.5.8 Diagnóstico de la tuberculosis 17
3.5.8.1 Diagnóstico general 17
3.5.8.2 Técnicas microbiológicas convencionales en el diagnóstico de la
tuberculosis. 17
3.5.8.3 Baciloscopía directa de la muestra 17
3.5.8.5 Identificación de las micobacterias 19
3.5.8.6 Prueba de la tuberculina (PT) 19
3.5.9 Diagnóstico anatomopatológico 20
3.5.10 Tratamiento de la tuberculosis 20
3.5.10.1 Bases bacteriológicas del tratamiento 20
3.5.11 Agentes antituberculosos 21
3.5.12 Resistencia al tratamiento antituberculoso provocada por mutaciones 24 3.5.13 Mecanismos moleculares de la emergente resistencia a algunas drogas 25 3.5.13.1 Mecanismos moleculares de resistencia a isoniacida 26 3.5.13.2 Mecanismos moleculares de resistencia a rifampicina 27
3.5.14 Tuberculosis multiresistente (Tb-Mdr) 27
3.5.15 Productos naturales como fuente de nuevos medicamentos anti-TB 28
3.5.15.1 Investigaciones recientes 29
3.5.16 Pruebas de susceptibilidad antibiótica 36
3.5.16.1 Método de difusión 36
3.5.16.2 Métodos de dilución 36
3.5.16.3 Métodos de proporción y de relación de resistencia 37
3.5.16.4 Método de prueba-E 38
3.5.16.5 Método colorimétrico de MTT 38
3.5.16.6 Método de azul de alamar en microplaca 39 3.5.16.7 Método radiométrico (Sistema Bactec 460) 39
4. JUSTIFICACIÓN 41 5. OBJETIVOS 42 6. HIPÓTESIS 43 7. MATERIALES Y MÉTODOS 44 7.1 Universo de trabajo 44 7.2 Muestra 44 7.3 Recursos 44 7.3.1 Recursos humanos 44 7.3.2 Recursos institucionales 44
7.3.3 Recursos materiales 45 7.3.3.1 Equipo 45 7.3.3.2 Cristalería 45 7.3.3.3 Materiales 45 7.3.3.4 Reactivos 46 7.3.3.5 Medios de cultivo 47 7.3.3.6 Cepas de micobacterias 47 7.4 Procedimiento 47
7.4.1 Selección de extractos de plantas 47
7.4.2 Preparación del extracto etanólico de hoja de L. styraciflua 47 7.4.2.1 Procedimiento de extracción continua por percolación 48 7.4.2.2 Procedimiento de reconcentración con rotavapor 48 7.4.3 Preparación de reactivos y medios de cultivo 49 7.4.3.1 Preparación de medio Middlebrook 49 7.4.3.2 Preparación de suplemento de Ruth 49 7.4.3.3 Elaboración de medio Middlebrook enriquecido 49
7.4.3.4 Preparación de tween 80 al 20% 49
7.4.5.5 Preparación de MTT 50
7.4.4 Evaluación in vitro de la actividad micobactericida 50
7.4.5 Preparación del inóculo 50
7.4.6 Preparación de las drogas 50
7.4.7 Realización del ensayo de tamizaje 51
7.4.8 Revelado de la placa 51
7.4.9 Lectura e interpretación de resultados 52 7.4.10 Concentración inhibitoria mínima (CIM) 52
7.5 Diseño estadístico 52
7.5.1 Tipo de estudio 52
7.5.2 Variables 53
7.5.3 Validez del estudio 53
8. RESULTADOS 54 9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 57 10. CONCLUSIONES 62 11. RECOMENDACIONES 63 12. REFERENCIAS 64 13. ANEXOS 78
13.1 Listado de extractos de plantas para tamizaje 78 13.2 Tamizaje de extractos de plantas nativas de Guatemala contra
M. smegmatis y M. tuberculosis 85
13.3 Información etnobotánica de plantas con resultado positivo para el
tamizaje de M. smegmatis 92
1. RESUMEN
La tuberculosis (TB) es una infección crónica producida por Mycobacterium
tuberculosis, que puede durar toda la vida, afecta principalmente pulmones pero puede
diseminarse a cualquier órgano o tejido del cuerpo humano (1). Factores socioeconómicos, la deficiencia en la vigilancia epidemiológica, la falta de métodos de diagnóstico rápidos y el incremento de casos del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), son factores que han favorecido el resurgimiento y diseminación de la TB (2-4).
En Guatemala, la TB es la segunda causa de morbilidad en la población, y por la aparición de cepas poliresistentes1 y multidrogo-resistentes2 favorecidas por tratamientos inadecuados o incompletos de la TB pulmonar, se ha hecho más difícil de eliminar incidiendo negativamente en el pronóstico del paciente (5).
Es por ello que en este estudio se evaluó la actividad micobactericida de doscientos setenta y ocho extractos de ciento cincuenta y cuatro plantas nativas de Guatemala utilizadas popularmente en el tratamiento de diversas infecciones, con el objetivo de buscar alternativas para el tratamiento de la TB. Para la evaluación de la actividad micobactericida se utilizó el método colorimétrico de MTT empleando cepas de M.
tuberculosis H37Rv ATCC 27294 y M. smegmatis ATCC 607. Cuarenta extractos
analizados presentaron actividad contra M. smegmatis y uno contra M. tuberculosis con actividad intermedia a una CIM de 100 µg/ml, estos hallazgos evidencian la necesidad de continuar con la búsqueda y evaluación de agentes naturales de la región que presenten actividad contra M. tuberculosis y otros microorganismos. Esta investigación forma parte del proyecto “CYTED X-11: Proyecto de búsqueda y evaluación de agentes naturales antituberculosos (PIBATUB)”, que se ejecuta dentro del marco del área de salud del programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED).
1Poliresistentes: resistentes a varios medicamentos, pero no a rifampicina e isoniacida. 2 Multidrogo resistentes (MDR): resistentes cuando menos a rifampicina e isoniacida.
2. ÁMBITO DE LA INVESTIGACIÓN
La tuberculosis (TB) se define como una infección crónica que puede durar toda la vida y es producida por Mycobacterium tuberculosis, afecta principalmente pulmones pero puede diseminarse a cualquier órgano o tejido del cuerpo humano. En Guatemala, la tuberculosis es la segunda causa de morbilidad en la población, especialmente por la aparición de este tipo de cepas (1).
La frecuencia es más elevada en grupos urbanos pobres que viven en condiciones de hacinamiento y en ciertos grupos no urbanos que probablemente tienen alta susceptibilidad genética. La pandemia por el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es uno de los factores que más ha contribuido a la diseminación de la tuberculosis. Datos publicados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) reflejan que para el año 2001, alrededor de un tercio de los 40 millones de pacientes infectados por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) en el mundo estaban coinfectados por M. tuberculosis, siendo la tuberculosis la responsable de la tercera parte de muertes entre los pacientes con SIDA, la mayor parte de estas personas vivían en países de escasos recursos económicos (2-4).
La aparición de cepas de M. tuberculosis poliresistentes y multidrogo-resistentes está favorecida por tratamientos inadecuados o incompletos de la TB pulmonar; estas cepas son más difíciles de eliminar e inciden negativamente en el pronóstico del paciente (5).
El objetivo principal de la realización del proyecto fue la búsqueda de otras alternativas para el tratamiento de la tuberculosis, por medio de la evaluación de la actividad micobactericida de extractos de plantas nativas de Guatemala (Anexo 13.1) utilizadas popularmente en el tratamiento de diversas infecciones, empleando la cepa estándar de M.
tuberculosis H37Rv ATCC 27294. La presente investigación forma parte del proyecto
“CYTED X-11: Proyecto de Búsqueda y evaluación de agentes naturales antituberculosos (PIBATUB)”, que se ejecuta dentro del marco del área de salud del programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED).
3. ANTECEDENTES
3.1 Género Mycobacterium:
El género Mycobacterium pertenece a la familia Mycobacteriaceae, ubicada dentro del orden de los Actinomycetales. También se asocia al género Corynebacterium y Nocardia (6).
3.2 Clasificación de las especies de micobacterias:
A la familia de las micobacterias pertenecen más de 100 microorganismos que principalmente se encuentran en el medio ambiente, tienen escasa capacidad patógena, pero son capaces de producir enfermedad ante situaciones de inmunodeficiencia. Aunque han recibido muchos nombres, quizás el más adecuado sea el de Micobacterias Ambientales Oportunistas (MAO) (2).
Algunas micobacterias son parásitos estrictos del hombre y de los animales como: M.
tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. ulcerans, M. leprae, M. lepraemurium, M. paratuberculosis y M. microtti. Las micobacterias se clasifican en base a la velocidad de
crecimiento, su importancia médica y el riesgo de infección (6).
Según la velocidad de crecimiento, se dividen en especies de crecimiento rápido o de crecimiento lento. Son de crecimiento rápido cuando la formación de la colonia visible se produce antes de los 7 días de incubación con una división celular de 2 a 5 horas, mientras que en una especie de crecimiento rápido la división celular varía entre 13 y 20 horas con periodos de incubación de hasta 21 días.
Los requisitos de crecimiento de los dos tipos de especies son también diferentes, todas las micobacterias cultivables patógenos para el hombre se desarrollan en el medio de Lowestein-Jensen el cual contiene huevo, glicerina y asparagina como fuentes de carbono y nitrógeno. En los medios que utilizan piruvato como fuente de carbono y nitrógeno, se desarrollan mejor M. bovis y algunas cepas de M. tuberculosis (6).
Según su importancia médica se han descrito tres categorías:
Categoría I: las principales micobacterias, responsables de la tuberculosis en el hombre y en los animales se encuentra constituido por el complejo M. tuberculosis, que es el agente causal de la mayoría de casos de tuberculosis humana, sin embargo, cualquier especie del complejo puede causar infección tuberculosa. Pueden diferenciarse con la ayuda de varias pruebas bioquímicas y fisiológicas, así como por su patogenicidad en algunas especies animales (cobayos y conejos), siendo éstas las que se describen a continuación (7):
M. tuberculosis Especie responsable de la tuberculosis humana.
M. bovis Es la responsable de la tuberculosis en los bovinos y es además patógena
para la mayoría de los mamíferos, incluyendo al hombre. Otras especies más afectadas además de los bovinos, son los caprinos, camélidos, porcinos, felinos y primates no humanos.
M. africanum Es responsable de tuberculosis en humanos como en bovinos en regiones
de África.
M. microtti No es patógeno para el hombre, es el responsable de la tuberculosis en roedores (7).
Categoría II: Las micobacterias atípicas constan de cuatro grupos que no incluyen las especies típicas además de las no cultivables (7).
Categoría III: Las micobacterias responsables de la lepra en el hombre, en ratas y ratones, siendo estas: M. leprae y M. lepraemurium, respectivamente (7).
Según el riesgo de infección, la Sociedad Europea de Micobacteriología (ESM) ha clasificado a las micobacterias en tres grupos, siendo estas especies nombradas según su grupo de riesgo:
Grupo I de riesgo: El riesgo de infección es bajo o raramente son responsables de enfermedad en el adulto, generalmente son clasificadas entre los patógenos raros.
Grupo II de riesgo: Riesgo moderado, son clasificadas entre los microorganismos patógenos potenciales u oportunistas.
Grupo III de riesgo: Riesgo de transmisión por vía aérea, la infección puede ser severa y causa de muerte. Es de riesgo elevado para el individuo pero moderado para la población. Estas especies son generalmente clasificadas entre los patógenos estrictos (6).
3.3 M. smegmatis:
M. smegmatis fue la primera especie de micobacteria reconocida después de M. tuberculosis. Aunque M. smegmatis fue aislada inicialmente de exudados de chancros
luéticos en 1884, y de secreciones genitales en 1885, posteriormente no ha sido nunca recuperada a partir de esas mismas fuentes. Se ha aislado del suelo y del agua, considerándose un microorganismo ambiental, por lo que, durante muchos años, ha sido considerada como una micobacteria no patógena. Se considera un organismo saprófito y ambiental de escaso potencial patógeno. Entre las especies que en raras ocasiones se implican en patologías humanas están M. smegmatis, M. peregrinum y M. mucogenicum (8).
En la actualidad, M. smegmatis incluye un grupo de micobacterias de rápido crecimiento y ocasionalmente pigmentadas. Las micobacterias de crecimiento rápido se definen como bacilos alcohol-ácido resistentes que forman colonias visibles en un medio sólido a partir de un inóculo diluido en un período de 5-7 días. La temperatura óptima de cultivo es 28 ºC. El 50% de las cepas clínicas producen una pigmentación amarillo-naranja tardía (2 semanas), la colonia es habitualmente elevada, rugosa y de bordes festoneados, aunque algunas cepas forman colonias lisas (8).
M. smegmatis puede ser identificada por pruebas bioquímicas, la prueba de la
arilsulfatasa a los tres días es negativa, lo que permite diferenciarla del complejo M.
fortuitum, así como la pérdida de actividad de la catalasa a 68 ºC. Como pruebas
adicionales confirmatorias para diferenciar M. smegmatis de M. chelonae y M. fortuitum se puede utilizar la catalasa semicuantitativa (inferior a 45 mm) y la reducción de los nitratos, así como las pruebas de inositol y manitol que son positivas. El crecimiento en agar McConkey sin cristal violeta la diferencia de las especies cromógenas de crecimiento rápido (9).
3.3.1 Patogenia de M. smegmatis:
Los mecanismos de virulencia y su patogenia se conocen sólo parcialmente, depende de los antecedentes de la exposición previa al organismo como sucede con otras micobacterias de crecimiento rápido, regularmente los bacilos causan infección por la inducción de la fagocitosis la cual se favorece en presencia de lípidos, en relación con la necesidad de una fuente de triglicéridos para su crecimiento o como un elemento de protección frente a los mecanismos de fagocitosis (10).
Aislamientos de M. smegmatis se han descubierto en infecciones humanas, la mayoría de los aislados identificados proceden de casos esporádicos de origen no pulmonar, sobre todo de piel (celulitis crónica) y abscesos en tejidos blandos adyacentes (adenitis y bursitis), que con frecuencia se observan varios meses después de un traumatismo, o como infecciones nosocomiales tras intervenciones quirúrgicas de diversa naturaleza. En general, se acepta que la transmisión se produce tras la exposición a elementos ambientales o quirúrgicos contaminados, si bien se ha documentado la transmisión entre humanos en un pequeño brote hospitalario asociado a M. goodii (11).
Clínicamente, estas infecciones cutáneas y subcutáneas se caracterizan por una necrosis extensa bajo una piel íntegra, con tendencia a la fistulización, y afectando, ocasionalmente, a estructuras óseas. No se han descrito casos de diseminación sistémica por M. smegmatis a partir de un foco cutáneo. Con menor frecuencia, se han comunicado infecciones
pulmonares por M. smegmatis sensu strictu y M. goodii en pacientes con ingestión o aspiración de medicamentos o alimentos particularmente ricos en lípidos, tanto en adultos como en niños inmunodeprimidos e incluso, recientemente, se ha descrito un cuadro de afección pulmonar en pacientes sin patología respiratoria o inmunológica previa. Respecto a la capacidad de diseminación sistémica de M. smegmatis, se han comunicado dos casos de bacteremia, uno de ellos asociado a un foco infeccioso en un catéter intravenoso, y el otro en un paciente pediátrico con una inmunodeficiencia grave (10).
Habitualmente, M. smegmatis es resistente a la isoniacida, rifampicina y macrólidos, siendo sensible al etambutol, aminoglucósidos, tetraciclinas, cotrimoxazol e imipenem. Excepto por los aminoglucósidos, la doxiciclina y el imipenem, el resto de los antimicrobianos no suelen ser muy eficaces, aunque se han propuesto como tratamientos alternativos las nuevas quinolonas, sulfonamidas y etambutol. Debido a que M. smegmatis y M. tuberculosis comparten una estructura muy similar, M. smegmatis ha sido ampliamente utilizada para la evaluación microbiológica de agentes antimicobacterianos como alternativa a M. tuberculosis. Utilizar M. smegmatis en ensayos microbiológicos ofrece las ventajas de ser una bacteria de crecimiento rápido que no necesita condiciones especiales para su crecimiento, además de ser considerada saprófito ambiental y de escasa significancia clínica (11).
3.4 M. tuberculosis:
3.4.1 Características de la especie:
La TB es producida por uno de los cuatro microorganismos que integran el complejo M.
tuberculosis: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microtti (2).
M. tuberculosis es un microorganismo con forma bacilar, que se comporta como aerobio
estricto. Su crecimiento está subordinado a la presencia de oxígeno y al valor de pH circundante. Es muy resistente al frío, la congelación y a la desecación, siendo por el contrario muy sensible al calor, luz solar y luz ultravioleta. Su multiplicación es muy lenta (14-24 horas), y ante circunstancias metabólicas adversas, e n t r a en un est ado l at ent e o
d u r m i e n t e , pudiendo llegar a demorar su multiplicación desde varios días hasta muchos años (2).
El reservorio de M. tuberculosis es el portador asintomático, sin embargo la fuente de infecci ón de esta enfermedad la constituye casi exclusivamente el portador sintomático, aunque t a m bi é n los animales enfermos pueden ser el origen de casos aislados.
M. tuberculosis puede estar localizado en cavidades pulmonares, pus o material sólido
caseoso, donde la penetración de antibióticos es difícil o el pH es suficientemente bajo como para inhibir la actividad de los antibióticos, cada ambiente tiene ofrece una circunstancia clínica para el desarrollo de resistencia a droga. Por ejemplo, se considera que los organismos en las cavidades pulmonares se multiplican en ambientes aeróbicos. Los localizados en focos caseosos están en un sitio donde el bajo pH inhibe la actividad de agentes como los aminoglucósidos pero provee las condiciones necesarias para la actividad de la pirazinamida (PZA). Mientras que las bacterias que se encuentran entre los macrófagos probablemente exhiben un dismiunución del metabolismo por encontrarse en condiciones microaerofílicas induciendo un estado de latencia, promoviendo la sobrevivencia por largos períodos, los factores y mecanismos que mantiene este estado aún no han sido aclarados, sin embrago, se ha propuesto que uno de estos mecanismo puede ser el del óxido nítrico (NO), que es un producto de macrófagos activados y que exhibe propiedades antimicobacterianas al inhibir reversiblemente la respiración aeróbica y el crecimiento (12).
3.4.2 Estructura:
Los bacilos tuberculosos son ligeramente curvados, alrededor de 2 a 4 µm de largo por 0.2 a 0.5 µm de ancho, pueden mostrar un contorno uniforme, pero con más frecuencia aparecen en forma de rosario, con vacuolas irregularmente distribuidas, sin teñir o con botones fuertemente teñidos con el colorante fuchsina fenicada al emplear la técnica de Ziehl-Neelsen. Las cepas difieren en su tendencia para crecer como bacilos aislados o como largas hebras llamadas cordones. Las paredes de las micobacterias contienen un peptidoglucano con diaminopimelato y
las células pueden convertirse en esferoplastos por acción de la lisozima. Las paredes tienen un contenido muy elevado de lípidos (de hasta el 60%), del cual gran parte está adherido al polisacárido. Los glucolípidos y las proteínas se ubican en una capa externa firmemente adherida a la pared y esta ubicación externa del lípido es la responsable del carácter hidrófobo de las células (13).
3.4.3 Crecimiento in vitro:
El bacilo de la tuberculosis puede crecer en medios sintéticos simples, con glicerol u otros componentes como única fuente de carbono y con sales de amonio como fuente de nitrógeno. Habitualmente se agrega una mezcla de asparagina o de aminoácidos que estimulan el inicio de la multiplicación y mejoran la tasa de crecimiento. En los medios líquidos sintéticos ordinarios, el bacilo crece como agregados adherentes que forman una película superficial. Esta propiedad mohosa es la responsable del nombre Mycobacterium. Las micobacterias muestran por lo general una marcada preferencia nutritiva hacia los lípidos; la yema de huevo ha sido un destacado constituyente de los medios ricos usados para el cultivo con fines diagnósticos. Así, aunque el bacilo de la tuberculosis es muy sensible a la inhibición por los ácidos grasos de cadena larga, se ve estimulado por ellos a concentraciones muy bajas. Las micobacterias producen quelantes del hierro, cuya competición con los quelantes del hospedero (transferrinas) pueden desempeñar un papel importante en la patogenia y la resistencia. El crecimiento del bacilo de la tuberculosis en los medios de cultivo (y en los animales) es generalmente muy lento: en medios ricos, el período más corto de duplicación observado está alrededor de 12 horas (13).
3.4.4 Ácidos micólicos:
Aunque hay muchos ácidos grasos diferentes en las micobacterias, los ácidos micólicos parecen existir sólo en las paredes celulares de estos organismos. Estos enormes ácidos grasos saturados, con radicales α-alquilo y β-hidroxilo se encuentran tanto en las ceras como en los glucolípidos. Un arabinogalactano (AG) de gran tamaño (peso molecular 31000 Kd), unido en forma covalente al peptidoglucano y a unos 30 residuos de ácidos micólicos, forma un puente entre la capa rígida y las capas externas lipofílicas de la pared celular (13).
3.4.5 Alcohol-ácido resistencia:
El género Mycobacterium presenta forma bacilar, que en algún momento de su ciclo biológico tienen la la propiedad de ser alcohol-ácido resistentes (AAR). Esta propiedad es debida a la presencia en la superficie de la micobacteria de ácidos micólicos que se encuentran unicamente en este género (13).
3.5 Tuberculosis: 3.5.1 Generalidades:
La TB, la enfermedad más antigua que ha padecido el hombre, continúa siendo la infección humana q u e mayor número de enfermos y muertes ocasiona en el mundo. El número de casos ha aumentado en los últimos años, especialmente por la aparición del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), modificando las expectativas para detener la diseminación de la infección en la población (2).
La TB es una infección crónica que puede durar toda la vida, empieza por la inhalación del material infeccioso, por ingestión o por inoculación cutánea. En fase temprana de la infección, el microorganismo se extiende al torrente sanguíneo, llega al sistema linfático y otros órganos; dejando focos que pueden producir una enfermedad clínica después de largos períodos de latencia (1).
3.5.2 Etiología:
La TB es producida por dos especies de bacterias: M. tuberculosis y M. bovis. Otras especies de micobacterias llamadas micobacterias atípicas o micobacterias no tuberculosas (MNT), pueden causar infecciones pulmonares. La infección se adquiere por inhalación de la M.
tuberculosis en aerosoles y polvo. La transmisión aérea de la tuberculosis es muy eficiente
porque las personas infectadas expulsan con la tos enormes cantidades de micobacterias, proyectándolas al ambiente, donde su capa externa formada por células les permite resistir la desecación, por lo que sobreviven durante largos períodos de tiempo en el aire (14).
3.5.3 Cronología de los estudios sobre la tuberculosis:
La tuberculosis es una enfermedad que a través de los siglos ha preocupado a la comunidad científica tal como se describe en orden cronológico:
1865 Villemin demuestra que la TB humana es transmisible por la inoculación a un conejo o a un cobayo.
1882 Robert Koch descubre el agente etiológico de la tuberculosis conocido desde entonces como “Bacilo de Koch”, y actualmente denominado M. tuberculosis. 1884 Robert Koch obtiene crecimiento del bacilo sobre suero coagulado.
1887 Nocard y Roux muestran que la adición de glicerina al medio de cultivo estimula el crecimiento del bacilo.
1890 Rivolta y Maffucci con sus estudios condujeron a la identificación del bacilo tuberculoso aviar (actualmente denominado M. avium).
1891 Robert Koch describe el fenómeno de la respuesta inmune y prepara la primera tuberculina.
1902 Dorset propone un medio de cultivo a base de huevo que será mejorado por diversos autores (Lowestein-Jensen, Coletsos, Petragnani). Smith descubre el M. bovis, agente etiológico de la tuberculosis bovina.
1921 Calmette y Guérin obtienen una vacuna antituberculosa: BCG (Bacilo de Calmette y Guérin) a partir de una cepa atenuada de M. bovis, por sucesivos subcultivos.
1944 Waksman descubre la estreptomicina (SM), el primer antibiótico activo contra el bacilo de Koch.
1946 Se descubre el ácido para-amino-salicílico o PAS como primera alternativa en el tratamiento de la tuberculosis.
1950 Se descubre el rol patógeno de otras micobacterias “no tuberculosas”, llamadas micobacterias atípicas.
1952 Se descubre la isoniacida (INH). 1967 Se descubre la rifampicina (RPM).
1980 La pirazinamida (PZA) se introduce en el esquema terapéutico, pudiendo ser reducida la duración a 6 meses.
2001 A finales de este año alrededor de un tercio de los 40 millones de pacientes infectados por el VIH en el mundo estaban coinfectados por M. tuberculosis.
2006 A comienzos de este año es detectada por primera vez una micobacteria multidrogo resistente (MDR-TB)
2007 Se contabilizan unos nueve millones de casos de tuberculosis en el mundo y la OMS estima que el 2% de ellos (unos 180000) presentan cepas MDR.
2007 En octubre, un equipo de científicos sudafricanos realiza la secuencia por primera vez el genoma de la cepa MDR, como primer paso para la elaboración de nuevos tratamientos específicos y eficaces (3).
3.5.4 Epidemiología mundial y en Guatemala:
La prevalencia mundial estimada de la tuberculosis es de 30 millones de casos. Más del 80% de los pacientes están en edad productiva entre 15 y 49 años. Los países con mayor incidencia de TB, con una tasa de un centenar o más de casos por 100 mil habitantes, son los pertenecientes a África subsahariana, la India, algunos países que pertenecieron a la Unión Soviética, Bolivia y Perú. México y España reportaron en 2002 tasas entre 25 y 49 casos por 100 mil habitantes, reportando 8.8 millones de nuevos casos y cerca de 3 millones de muertes. El 80% de los casos de TB activa se localizan en sólo 22 países, la mayor parte de ellos del este de Asia y del África subsahariana (15-18).
Entre los factores que han favorecido el resurgimiento de la TB en el mundo se encuentran la falta de vivienda adecuada, el aumento de la pobreza, los crecientes niveles de desnutrición en la población marginada, el descuido o abandono de la vigilancia epidemiológica, la escasez de recursos humanos y económicos para su control, la carencia de métodos de diagnóstico rápido y la ineficacia de las medidas de control de la transmisión de la enfermedad (16).
Junto a Haití, Bolivia y Perú, Guatemala figura entre los países de Latinoamérica con mayor incidencia de casos de TB, pese a las campañas de prevención y tratamiento (5).
En Guatemala se tienen registrados 4000 casos de tuberculosis de todo tipo por año, de los cuales 2420 son tuberculosis pulmonar y 433 casos pediátricos. La TB se desarrolla juntamente con enfermedades crónicas como la diabetes; las condiciones de pobreza agravadas por el paso del huracán Mitch en 1998, la hambruna de 2001, y la tormenta Stan en el 2005 han aumentado el número de casos de TB, de igual manera se ha visto que el número de pacientes de tuberculosis aumenta con el aumento de casos de VIH y SIDA según el Programa Nacional de Tuberculosis (5).
3.5.5 Mecanismo de transmisión:
El mecanismo de transmisión más importante y el que causa casi la totalidad de los contagios es el aerógeno. El hombre enfermo elimina pequeñas micro-gotas (en forma de aerosoles) cargadas de micobacterias cuando habla, canta, ríe o estornuda. La micobacteria tiene un tamaño inferior a los 10 micrones y las micro-gotas pueden quedar suspendidas en el aire o bien, ser inhaladas por un sujeto sano donde por su pequeño tamaño, pueden progresar hasta el alvéolo. Es en la part e dis tal del pulmón d o nd e M. tuberculosis encuentra sus condiciones ideales para multiplicarse (elevada tensión de oxígeno). Los macrófagos en primera instancia y los linfocitos después, acudirán a la zona y en la gran mayoría de los casos, lograrán detener la multiplicación deteniendo la infección pero en otros se verán incapacitados y se producirá entonces una TB pulmonar que se denomina TB primaria (2).
No obstante, a pesar de la importancia de la vía aerógena, existen otros mecanismos de transmisión menos frecuentes como son:
3.5.5.1 Vía digestiva, a través de la ingestión de carne de vacunos infectadas por
M. bovis, contagiando al hombre a través de los linfáticos faríngeos o intestinales. Esta
vía también adquiere un papel primordial en la i n fe cci ón por M. avium-intracellulare en el paciente con SIDA.
3.5.5.2 Vía urogenital, a través de la orina y de transmisión sexual. 3.5.5.3 Vía cutáneo-mucosa.
3.5.5.4 Vía transplacentaria (6).
3.5.6 Patogenia y respuesta inmunitaria de la TB: 3.5.6.1 Mecanismos de respuesta inmune:
La patogenia de la TB depende de los antecedentes de la exposición previa al organismo. La llegada de M. tuberculosis al alvéolo pulmonar suscita una reacción de fagocitosis por parte de los macrófagos alveolares. Cuando estos bacilos son escasos y de virulencia atenuada, p ue d e n ser destruidos por los macrófagos y la infección es controlada; pero si el número es elevado y su virulencia es considera b le , no sólo pueden s o br e viv ir dentro del macrófago, sino que se multiplican en su interior y terminan por destruirlo. Tanto la carga enzimática liberada en la destrucción de los macrófagos como las proteínas liberadas en el metabolismo de M. tuberculosis originan una reacción inflamatoria inespecífica, con aumento local de la permeabilidad capilar, exudación alveolar y quimiotaxis de neutrófilos, linfocitos y células mononucleares sanguíneas. Algunas células cargadas de bacilos pueden escapar con cierta facilidad del foco infeccioso migrando a través de los linfáticos hasta los ganglios regionales, donde exponen los antígenos bacilares al sistema inmunitario. Algunos macrófagos pueden superar los ganglios linfáticos para drenar al sistema venoso volviendo al intersticio pulmonar, donde dan lugar a una TB miliar más o menos extensa que, en la mayoría de los casos, se controla y cura con posterioridad. Los macrófagos, al mostrar los antígenos al sistema inmunitario, dan lugar a una proliferación clonal de linfocitos T que se diferencian en tres grandes grupos: linfocitos T helper (Th), T citotóxico (Tc) o T supresor y linfocito T de memoria. El principal papel de los Th es el de producir linfocinas, que transforman a las células monocitarias sanguíneas en macrófagos activados. Estos disponen de un a gran capacidad fagocítica y di ges t i va frente a M. tuberculosis. Las linfoci nas favorecen la quimiotaxis de linfocitos y fibroblastos hacia el foco infeccioso así como estimulan a
los linfocitos B para la producción de anticuerpos frente a diversas proteínas de M.
tuberculosis (2).
Los Tc parecen tener un papel importante en la lisis directa de los macrófagos no activados y cargados de micobacterias. Se ha especulado q u e algunas formas graves de la enfermedad tuberculosa podrían estar mediadas por una gran actividad supresora con una débil respuesta de Th, lo que determinaría una gran liberación de M. tuberculosis con escasa respuesta celular específica. Los linfocitos T de memoria son los encargados de la inmunovigilancia, su persistencia hace posible que la respuesta a una futura reactivación o una sobreinfección sea siempre una respuesta especializada (6).
El estado de latencia de M. tuberculosis, es uno de los grandes problemas con los que investigadores de esta patología se enfrentan todo el tiempo. Los factores del hospedero que inician y mantienen este estado de latencia y los mecanismos por los que la bacteria sobrevive entre esas lesiones latentes no están claros del todo. Sin embargo, se propone que uno de esos factores puede ser el óxido nítrico (NO), que es un producto de macrófagos activados y que exhibe propiedades antimicobacterianas al inhibir reversiblemente la respiración aeróbica y el crecimiento. La formación de granulomas, la inhibición de la respiración por la producción de NO y las limitaciones de O2 restringen las tasas de
replicación de M. tuberculosis en personas con tuberculosis latente. En otras palabras, la producción de NO y la formación del granuloma por el sistema inmune, tiene como función limitar la respiración aeróbica y el crecimiento de M. tuberculosis, el cual es un aerobio obligado, en estas condiciones el bacilo inicia una respuesta transcriptacional transformándose y estabilizando sus componentes vitales, promoviendo así su sobrevivencia por largos períodos de latencia. Por esta razón, se piensa en la posibilidad de que el NO sirve como señal ambiental del hospedero al patógeno, el cual descubre el nivel de activación inmune (12, 19, 20).
3.5.6.2 Influencia del VIH en la patogenia de la tuberculosis:
La infecci ón del retrovirus VIH afecta selectivamente la función y el número de los linfocitos Th o CD4+ en sangre periférica y a los macrófagos a nivel tisular. Se afecta el reconocimiento del sistema inmunitario de los antígenos tuberculosos presentados por los macrófagos no activados, alterando la respuesta de los linfocitos CD4+ mientras que la capacidad de los linfocitos Tc o CD8+ puede estar conservada e incluso aumentada. En resumen, la falta de respuesta de los linfocitos CD4+ impedirá la reacción inmunitaria completa, permitiendo una fácil diseminación de M. tuberculosis e incrementando la posibilidad de que la infección inicial progrese a enfermedad. Por otra parte, al mantenerse la acción de los linfocitos CD8+, se mantiene la acción lítica sobre los macrófagos no activados que cargados de M. tuberculosis, liberan gran cantidad de estos últimos sin que exista posteriormente una respuesta de macrófagos activados (2).
3.5.7 Síntomas y signos:
Los infiltrados apicales pequeños pueden mantenerse por meses o aún años en equilibrio con extensiones y regresiones de poca importancia y sin producir síntomas. Estos casos se descubren por radiografía de tórax; sin embargo cuando la infección llega a cierta extensión, la absorción de sustancias antigénicas produce síntomas generales y específicos como anorexia, fatiga, fiebre, escalofríos, sudores nocturnos y emaciación (1). Los síntomas que se producen por inflamación pulmonar local son también variables en intensidad e inicio. Los más frecuentes son tos y producción de esputo los que se deben a las secreciones que drenan de una cavidad y al trastorno superficial de mucosa y submucosa bronquiales. Su presencia indica enfermedad muy avanzada. La tos puede ser leve o grave y el esputo escaso, mucoide y purulento (3).
Puede haber agotamiento, pérdida de peso, debilidad y esputo sanguinolento el que puede ser consecuencia de la destrucción tisular. La necrosis puede llegar a erosionar los vasos sanguíneos que pueden romperse y llegar a producir la muerte con una hemorragia masiva (3).
La hemoptisis y el dolor torácico son síntomas que pueden presentarse y que preocupan mucho al paciente. La hemoptisis puede deberse a la ruptura de una lesión caseosa o ulceración bronquial. Suele ser leve y se acompaña de la enfermedad avanzada. En la enfermedad crónica tardía, la hemorragia puede ser copiosa y súbita por la ruptura de una arteria dentro de la pared fibrosa de una cavidad, aunque estos casos son raros, puede existir la amenaza de ahogo y se deben considerar posiciones en las que al paciente se le facilite la expectoración y el drenaje de fluidos (1).
3.5.8 Diagnóstico de la tuberculosis: 3.5.8.1 Diagnóstico general:
El estudio microbiológico de las muestras es el más importante y el único que puede aportar la certeza de la enfermedad. La TB carece de síntomas, hallazgos o datos analíticos propios q u e permitan diferenciarla con claridad de otras enfermedades respiratorias. El comienzo en la mayoría de las ocasiones es insidioso y poco alarmante, por lo que pueden pasar inadvertidos los primeros meses hasta realizar el diagnóstico. De ahí la importancia de poner en marcha las exploraciones complementarias ante la más mínima sospecha clínica (2).
3.5.8.2 Técnicas microbiológicas convencionales en el diagnóstico de la TB:
El diagnóstico microbiológico convencional de la TB se basa en cuatro etapas sucesivas, la tinción de la muestra para la observación directa a través del microscopio (baciloscopía), el cultivo en medio sólido, la identificación por técnicas bioquímicas y las pruebas de sensibilidad a fármacos (2).
3.5.8.3 Baciloscopía directa de la muestra:
M. tuberculosis es, desde el punto de vista tintorial, una bacteria Gram-positivo o
frecuentemente incolora, por lo que habitualmente no es visualizada en muestras procesadas de forma rutinaria. Es por ello que el hallazgo de bacilos alcohol-ácido resistentes (BAAR) en extensiones teñidas examinadas al microscopio es la primera evidencia de la presencia de micobacterias en una muestra clínica. La característica alcohol-ácido resistencia se debe al alto contenido lipídico de la pared micobacteriana. La técnica clásica de Ziehl-Neelsen es la
aconsejable, observándose M. tuberculosis como pequeños bastones curvados (bacilos) de color rojo sobre un fondo de tonos azulados. Esta técnica es sencilla, muy económica y reproducible en cualquier medio, por muy pobre que sea. La evaluación se realiza a 1000 aumentos y debe durar un mínimo de 10-15 minutos (2).
3.5.8.4 Cultivo de M. tuberculosis:
El cultivo de las micobacterias es el único método que puede asegurar un diagnóstico de certeza de TB, garantizar la identificación correspondiente y es el único completamente válido para evaluar el seguimiento del enfermo y asegurar la curación. Los resultados del cultivo dependen en gran parte de los pasos previos de digestión y decontaminación de las muestras. La mayor parte de muestras clínicas contienen gran cantidad de microbiota normal que crecen con mayor rapidez que M. tuberculosis. Es necesario eliminar de la muestra estos microorganismos contaminantes que impedirán el desarrollo de las micobacterias. También es importante conseguir la licuefacción de los restos orgánicos (tejidos, moco, suero y otros materiales proteicos) que rodean a los microorganismos, para que los agentes decontaminantes puedan destruir las bacterias no deseadas. Así, sobrevivirán las micobacterias y podrán tener acceso a los nutrientes del medio (2).
El cultivo tiene una serie de importantes ventajas que lo sitúan como el patrón de oro en el diagnóstico y seguimiento de los casos de TB: los cultivos son mucho más sensibles que la baciloscopía, pudiendo detectar una cantidad tan pequeña como 10 bacterias por mililitro de muestra y de esta manera permite asegurar, con certeza, la negativización y curación del paciente con el tratamiento. Sin embargo, los inconvenientes del cultivo hacen que se tenga que limitar mucho su uso, sobre todo en los países más pobres. El mayor inconveniente del cultivo convencional se deriva de la lenta capacidad de división de M. tuberculosis. Este hecho motiva que el tiempo transcurrido entre la recepción de la muestra y la emisión del resultado no sea inferior a 4-6 semanas en los medios sólidos convencionales, tiempo excesivamente elevado para esperar un diagnóstico de certeza. Su costo es muy superior al de la baciloscopía y para realizarlo se necesitan de medios específicos y una posterior conservación en
incubadora. Por lo tanto, la indicación de realización de cultivo va a depender de la endemia de TB de la zona y de los recursos e infraestructura sanitaria disponible (2).
Los métodos de cultivo tradicionales siempre se han efectuado en medio sólido, utilizando como base el huevo coagulado (Lowestein-Jensen, Coletsos, etc), o el agar (7H10 y 7H11 de Middlebrok). Estos deben ser los únicos indicados para realizar el cultivo de rutina aunque se prefiere el medio de Lowestein-Jensen. La incubación de los medios sembrados en una atmósfera enriquecida con un 5-10% de CO2 favorece el crecimiento de M. tuberculosis. Los
métodos sólidos ofrecen las ventajas de su sencillez de realización, posibilidad de realizar el conteo de colonias y de detectar crecimientos mixtos más de una micobacteria en la muestra clínica y así como su bajo costo (2).
3.5.8.5 Identificación de las micobacterias:
Las micobacterias integrantes del complejo M. tuberculosis pueden ser diferenciadas fácilmente empleando un escaso número de pruebas bioquímicas, tales como niacina, reducción de nitratos a nitritos, presencia de pirazinamidasa y presencia de catalasa termolábil, siendo M. tuberculosis positiva a estas pruebas, logrando diferenciarla de M. bovis que tiene resultados negativos. Por lo demás, cualquier estrategia de identificación que pretenda ir más allá de la simple separación de M.
tuberculosis del resto de micobacterias exige la práctica de pruebas de identificación complejas que
sean capaces de aportar un mínimo de 10-20 rasgos diferenciales. Las principales limitaciones de las técnicas bioquímicas son su complejidad, lentitud y falta de reproducibilidad, con la ventaja de su bajo costo. Estas limitaciones han estimulado el desarrollo de técnicas alternativas de identificación, como la cromatografía y las sondas genéticas. Sin embargo, sólo las pruebas bioquímicas sencillas son las indicadas a realizar de rutina en los países con escasos y medios recursos económicos (2).
3.5.8.6 Prueba de la tuberculina (PT):
La respuesta inmunitaria contra M. tuberculosis tarda de 8 a 12 semanas en ocurrir y a partir de aquí el individuo sano, infectado o enfermo, dará positivo al realizarle la prueba tuberculínica (6). La PT tiene un valor muy limitado en el diagnóstico de enfermedad
tuberculosa. Sin embargo, en niños sobre todo en menores de 5 años, donde la prevalencia de la infección por M. tuberculosis es muy baja, la presencia de una PT positiva indica, una infección muy reciente, elevada probabilidad de desarrollar enfermedad por progresión de primoinfección o bien una enfermedad activa. Es por ello que a esta edad, la PT tiene un elevado Valor Predictivo Positivo (VVP) para el diagnóstico de enfermedad tuberculosa (2).
Hay que resaltar el hecho de que un resultado negativo en la PT no excluye el diagnóstico de enfermedad tuberculosa, ya que el paciente puede encontrarse en alguna de las situaciones que pueden deprimir la respuesta a la tuberculina. Debe tenerse en cuenta que a excepción de los pacientes infectados por el VIH, los de edad avanzada son los que más frecuentemente tienen una PT negativa (2).
3.5.9 Diagnóstico Anatomo-patológico:
En ocasiones, ante casos de difícil interpretación con bacteriología negativa (diseminaciones hematógenas, TB extrapulmonar), o ante la sospecha de enfermedad neoplásica es necesario recurrir a la obtención de muestras de biopsia. El diagnóstico se basa en la observación de granulomas caseificantes, pero es necesario destacar que otras enfermedades pueden producir granulomas muy similares (2).
3.5.10 Tratamiento de la tuberculosis:
3.5.10.1 Bases bacteriológicas del tratamiento:
Las bases bacteriológicas para el tratamiento de la TB fueron razonadas en las décadas de los 50 a los 70. La primera de ellas trata de responder al elevado número de bacilos que existe en la gran mayoría de las lesiones humanas de la TB y en la capacidad de mutar que tiene M.
tuberculosis cuando alcanza un número elevado de divisiones. Para ello es necesario conocer que,
cómo primera premisa del tratamiento de la TB, siempre se deben asociar fármacos para evitar la selección de resistencias y, potencialmente, inutilizar medicamentos. La segunda gran base bacteriológica trata de responder a la diferente capacidad de crecer que tiene M. tuberculosis en las distintas lesiones humanas, en dependencia de la situación metabólica que rodea la lesión. Es por ello que es necesario mantener el tratamiento durante largo tiempo, sobre todo para dar
opción a que éste actúe sobre las poblaciones bacilares latentes, que escasamente se dividen a lo largo del tratamiento por no encontrar condiciones metabólicas adecuadas a su alrededor (13).
En la actualidad está ampliamente aceptado que la quimioterapia de la TB debe basarse en dos importantes consideraciones bacteriológicas: la asociación de fármacos para prevenir la aparición de resistencias y la necesidad de mantener durante largo tiempo la quimioterapia con el fin de poder evitar la recaída (13).
Hasta el descubrimiento de la SM en 1944, el tratamiento de la TB se limitó al reposo, buena alimentación y colapso artificial del pulmón. El valor de la estreptomicina (SM) está restringido por su toxicidad al octavo par craneal, sin embargo para el tratamiento de esta enfermedad debe ser considerado:
Para minimizar la proporción de recaídas es necesario el tratamiento a largo plazo. La combinación de dos o más fármacos retrasa la aparición de organismos
resistentes.
Unas combinaciones dan mejores resultados que otras (14).
3.5.11 Agentes antituberculosos:
La búsqueda de tratamientos antimicrobianos para atacar el agente de la TB tiene sus inicios en el siglo 20. A mitad de los años 40 se descubre la estreptomicina (SM) y el ácido para-aminosalicílico (PAS), y en los años 50 la tuberculosis se convierte en una enfermedad tratable al introducirse drogas más efectivas: isoniazida (INH) y pirazinamida (PZA). Sin embargo, con más de medio siglo de investigación y uso de quimioterapia anti-TB, existen todavía de 8 a 10 millones de nuevos casos de TB cada año y 2 billones de portadores latentes de TB, basados en la prueba de la tuberculina (14).
Características importantes del fármaco incluyen la capacidad para penetrar en los macrófagos y matar a las micobacterias. Los regímenes más antiguos consistían en utilizar
SM, PAS, INH y etambutol (EMB) como alternativa al PAS o la rifampicina (RMP) en condiciones diversas. Estos regímenes se mostraban comúnmente durante 18-24 meses. La mayor rapidez de acción de los nuevos regímenes se ha atribuido a la capacidad especial de PZA para matar los bacilos de TB en el ambiente ácido de los macrófagos, a la penetración intracelular óptima de INH, RMP y PZA, y a la actividad bactericida rápida de RMP durante las explosiones periódicas de la actividad metabólica de los bacilos latentes hasta entonces (tabla 1) (13).
Tabla 1. Fármacos antituberculosos de primera línea: Mecanismo de acción.
Fármaco
Dosis DIANA mg/Kg
Dosis 2/Semana
(mg/Kg) Efectos secundarios Control Interacciones Acción Isoniacida 5 Hasta 300 15 Neuritis Hepatitis Hipersensibilidad GOT GPT
Fenitoína Bactericida Extra e Intracelular Rifampicina 10 hasta 600 10 hasta 50 Hepatitis Reacción febril Púrpura GOT GPT Inhibe anticoncep-tivos orales. Quinidina
Bactericida todas poblaciones Esterilizante Pirazinamida 15 -30 hasta 2 g 50 Hiperuricemia Hepatitis Ácido úrico GOT GPT Bactericida intracelular Esterilizante
Etambutol 15 - 20 50 Neuritis óptica Discriminación rojo - verde Agudeza visual
Bacteriostático extra e intracelular
Estreptomicina 15 - 20 25-30 hasta 1 g Lesión VIII por Hipersensibilidad Función vestibular Audio-grama Creatinina Bloqueante neuromuscular Bactericida extracelular
Tomado de: Caminero J. et al. Manual de Neumología y cirugía torácica. Madrid: Edimsa, 1998 (p. 1389-1419).
Actualmente, el régimen más usado es INH/RMP durante nueve meses, completado por EMB durante los primeros dos a tres meses. Si se desea que el tratamiento finalice en seis meses, se administra INH/RMP/PZA, con o sin adición de SM durante los primeros meses, especialmente si hay sospecha de resistencia a los fármacos. La quimioterapia moderna
debe lograr la curación en cerca del 95% de los enfermos con tratamiento inicial; a menudo los fracasos son el resultado de una pobre colaboración por parte del paciente. La etionamida, cicloserina y capreomicina están disponibles como fármaco de reserva para casos de intolerancia o resistencia (13).
Todos los fármacos se administran en una dosis única y simultánea ya que no sólo facilitan la adherencia y por lo tanto mejoran la eficiencia, sino que en general, proporcionan una mejor tolerancia, con menos efectos tóxicos. La única excepción a esta regla la constituye la asociación de RMP y PAS, que se administra distanciándolas al menos 8-11 horas (2).
Dentro de las cepas de bacilo de la TB, la proporción de mutantes resistentes a los antibióticos es muy elevada. Por ejemplo, es de 105 a 106 para INH, de 105 para SM y de 107 para la RMP. Las mutantes resistentes se seleccionan entonces fácilmente, al poner en
contacto concentraciones activas de un solo antibiótico con un gran número de bacilos. En los primeros tiempos de la quimioterapia, cuando los pacientes eran tratados únicamente con SM, la selección de este tipo era frecuente y ocasionó muchos fracasos. Las mutantes resistentes a un antibiótico dado son naturalmente sensibles a los otros antibióticos. Esta propiedad es aprovechada en la quimioterapia combinada de la TB (18).
Actualmente, la utilización de una quimioterapia combinada previene la selección de mutantes resistentes y conduce a la esterilización de las lesiones y a la ausencia casi total de recaídas. Pero para lograr eso, los antibióticos prescritos deben ser activos sobre la cepa del bacilo de la TB y no deben ser tóxicos para el humano (18).
Cada una de las drogas antituberculosas se ha diseñado para actuar y combatir la infección utilizando diversos mecanismos. Por ejemplo:
3.5.11.1 INH: posee una potente actividad bactericida frente a M. tuberculosis (CIM de 20 µg/ml), es activa por vía oral y presente acción bactericida, incluso frente a bacilos resistentes. Penetra en la micobacteria por difusión, además
de utilizar un mecanismo de transporte activo dependiente de oxígeno y puede perturbar varios procesos metabólicos de la micobacteria.
3.5.11.2 PZA: su actividad bactericida depende de la presencia de un amidasa bacterina, que la convierte en la forma activa, el ácido pirazinoico, que es altamente específico para M. tuberculosis, es activo incluso frente a cepas latentes y presenta un alto sinergismo con INH y RMP.
3.5.11.3 RMP: es micobactericida, presenta una CIM 0.1 a 0.2 µg/ml suele administrarse en combinación con otros fármacos de primera linea.
3.5.11.4 EMB: su mecanismo de acción no esta del todo claro; se ha postulado que interfiere el metabolismo del dimicolato de trehalosa, de los propios ácidos micólicos y de la biosíntesis de espermidina. Sin embargo, estudios más recientes indican como sus dianas principales la biosíntesis del AG y del lipoarabinomanano (LAM), constituyentes básicos de la pared protectora de la micobacteria. Tambien se ha mencionado que podría actuar como antimetabolito de algún elemento importante en la biosíntesis de proteínas y de ácidos nucleícos.
3.5.11.5 SM: es capaz de atravesar la membrana de M. tuberculosis y de unirse a la subunidad 30 S de los ribosomas, inhibiendo la síntesis proteíca de la micobacteria (8).
3.5.12. Resistencia al tratamiento antituberculoso provocada por mutaciones:
M. tuberculosis adquiere resistencia al tratamiento antituberculoso mediante mutaciones
que se producen en el cromosoma bacteriano. (21).
Las mutaciones responsables de resistencia medicamentosa se producen con una frecuencia baja, pero constante y esta frecuencia varía según el medicamento. Tales mutaciones se producen en ausencia de la droga: la exposición al medicamento no induce mutaciones, solamente permite la replicación de los mutantes ya presentes, mediante la destrucción de las bacterias fármaco sensibles que de otra manera competirían por los nutrientes. Claramente, la probabilidad de que se produzca una mutación que induzca una
resistencia medicamentosa, es directamente proporcional a la carga bacteriana. Toda población de M. tuberculosis superior a 109 bacilos inevitablemente contendrá algunos mutantes a los diversos medicamentos antituberculosos. Igualmente, los cultivos obtenidos para la realización de pruebas de sensibilidad contendrán tales mutantes. En relación a esto último, el objetivo de los pruebas de sensibilidad a medicamentos no es el de demostrar una ausencia de resistencia, sino que más bien mostrar que la cepa en estudio presenta una sensibilidad a los medicamentos similar a las de otras cepas que responden a la terapia in
vivo (2).
Clínicamente, la resistencia se divide en 2 tipos. La resistencia adquirida, que implica la aparición de resistencia durante el tratamiento; y la resistencia primaria cuando un paciente fue infectado inicialmente con una cepa resistente. Debido a que en algunos casos, es difícil estar seguro que el paciente no ha recibido ningún medicamento antituberculoso que pudiese haber seleccionado un mutante resistente, se utiliza preferencialmente el término resistencia inicial antes que el de resistencia primaria. La discriminación del nivel de resistencia inicial nos entrega un cuadro de los tipos de bacilos tuberculosos presentes en la comunidad y por tanto incluye en el diseño de los esquemas terapéuticos y las decisiones sobre la necesidad de efectuar pruebas de sensibilidad rutinarias (22).
3.5.13 Mecanismos moleculares de la emergente resistencia a algunas drogas:
El mecanismo de acción de la mayoría de los agentes antituberculosos han sido descritos y se está empezando a entender algunos de los mecanismos moleculares por los cuales M.
tuberculosis se convierte resistente (8).
M. tuberculosis es generalmente adquirido temprano en la vida con una infección aguda
y el desarrollo de una inmunidad, formación de granuloma y calcificación. Esto viene seguido por un período de latencia largo, que continúa hasta la reactivación en una proporción de los individuos. Esto significa, que las cepas individuales de M. tuberculosis tienen poca oportunidad de interactuar e intercambiar información genética con otra cepa. Por lo que la resistencia solo puede ocurrir a través de mutaciones cromosomales
provocadas, no por mutaciones por transposones sino por secuencias de inserción como la IS6110 que se ha asociado con la nueva resistencia emergente (8).
En base a la biología molecular, se han detectado las mutaciones que le confieren resistencia a la bacteria (tabla 2) y se ha descrito el mecanismo molecular de resistencia y los genes que han sido asociados con la resistencia a los agentes antituberculosos (8).
Tabla 2. Mecanismos moleculares de la resistencia a drogas anti-tuberculosas.
Tomado de: Voskuil MI, et al. Inhibition of Respiration by Nitric Oxide Induces a Mycobacterium tuberculosis Dormancy Program. Journal of Experimental Medicine. 2003, 198: 705-713.
3.5.13.1 Mecanismo molecular de la resistencia a INH:
La modificación del gen KatG, ya sea por deleciones totales o parciales, mutaciones puntuales o inserciones, lleva a la abolición o disminución de la actividad de la catalasa y por consiguiente altos niveles de resistencia a INH ya que la actividad de la catalasa es esencial para activar la droga (derivado de hidracina). Una deficiencia en la enzima produce altos niveles de resistencia y se ha encontrado que un 80% de cepas, son INH-resistentes. Alternativamente, los bajos niveles de resistencia pueden ser causados por mutaciones puntuales en la región reguladora del operón inhA, resultando en una sobreexpresión de inhA. Cepas con esta mutación tienen síntesis normal de ácido micólico pero niveles bajos de resistencia a la isoniacida (8).
DROGA MUTACIÓN GENÉTICA
Rifampicina RpoB
Isoniacida katC, inhA, oxyR, ahpC, furA
Estreptomicina Rrs, rpsL
Pirazinamida pncA, IS6110 inserción
Etambutol EmbB
3.5.13.2 Mecanismo molecular de la resistencia a la RMP:
La resistencia a RMP se debe a mutaciones en la subunidad beta de la ARN polimerasa codificada por el gen rpoB. Se incluyen mutaciones puntuales, deleciones o inserciones, casi todas las mutaciones ocurren en una región pequeña de menos de 100 pb, con menos de 5% de mutaciones fuera de esa región (8).
La RMP, descubierta en 1963 es la droga bactericida más poderosa en contra de la TB, es la más potente droga esterilizadora disponible y el componente clave en el tratamiento de la TB. El método de proporción, muy utilizado para la susceptibilidad a drogas de micobacterias requiere de muchas semanas de incubación para obtener resultados. Por lo que se han desarrollado nuevas técnicas para la detección rápida de la resistencia a este antibiótico, por medio del sistema radiométrico Bactec el cual tiene la ventaja de ser más rápido pero requiere del uso de radioisótopos y es de alto costo para llevarlo a cabo, sin embargo, representa un adelanto en la investigación de antibiótico-resistencia (23).
3.5.14 Tuberculosis Multiresistente:
El tratamiento inadecuado o incompleto de la TB favorece la aparición de cepas de M.
tuberculosis poliresistentes (resistentes a varios medicamentos, pero no a rifampicina e
isoniacida) y multidrogo resistentes (MDR, resistentes, cuando menos a rifampicina e isoniacida), las cuales son más difíciles de eliminar e inciden negativamente en el pronóstico clínico al prolongar el tratamiento e incrementar la probabilidad de fallo terapéutico, esto constituye un problema grave para la población en general y un factor de riesgo profesional para los trabajadores encargados de atención a la salud (24).
En años pasados se registraron más de 16 brotes de TB por cepas MDR, que causaron numerosas muertes en Estados Unidos, Francia, y varios países de África. Los afectados eran tanto personas inmunocomprometidas como inmunocompetentes. Ante este panorama, la OMS declaró que la tuberculosis debería ser declarada una emergencia global (4, 19).
La OMS estima que existen en el mundo cerca de 5 millones de personas infectadas con cepas de M. tuberculosis farmacorresistentes; que cada año, en el mundo, se diagnostican alrededor de 300 mil nuevos casos de TB-MDR y que de estos el 79% son resistentes a tres o mas medicamentos de primera línea (4).
La resistencia de M. tuberculosis a fármacos contra la TB es un fenómeno que se presenta en forma natural. La frecuencia de mutaciones en las micobacterias que confieren resistencia espontánea a medicamentos de primera línea es de 10-4-10-8 según el fármaco de que se trate (4).
Debido a que el número total de bacilos en una persona enferma aún con enfermedad cavitada avanzada no alcanza este número (1014), la aparición espontánea de un bacilo multiresistente ocurre muy rara vez. Sin embargo, cuando los fármacos se administran en forma inadecuada, puede haber niveles subletales circulantes de los mismos en los tejidos de los pacientes, lo cual ejerce una presión selectiva sobre las micobacterias, incrementando considerablemente la probabilidad de la aparición de bacterias MDR, por selección. Sin embargo, un alto porcentaje de pacientes portadores de cepas resistentes a medicamentos de primera línea, puede curarse mediante combinaciones de medicamentos antituberculosos de segunda línea de reserva (4).
En algunos de esos países seria mas acertado establecer un régimen estándar del tratamiento para casos de TB-MDR, orientado a la forma local más común de resistencia (25).
3.5.15 Productos naturales como fuente de nuevos medicamentos anti-TB:
Entre las fuentes potenciales de nuevos medicamentos existen dos que son especialmente promisorias: moléculas de origen sintético y productos naturales. Entre estos últimos las plantas han recibido especial atención, por parte de numerosos grupos de investigadores distribuidos en diversas regiones del mundo (14).
Por otro lado, los pueblos americanos han dado al mundo numerosos conocimientos sobre las propiedades curativas de plantas y otros recursos naturales en los que son especialmente ricos, principalmente debido a la biodiversidad de México, centro y sur América (14).
3.5.15.1 Investigaciones recientes:
El desarrollo de herramientas de genética molecular para el análisis de M. tuberculosis ha sido de vital importancia para su estudio in vivo ya que se han identificado los genes que aparentemente están involucrados en la adaptación de la micobacteria para habitar en los pulmones (14).
Se han realizado investigaciones sobre la patogénesis de la TB, en ratones, cobayos, conejos y primates no-humanos, se ha analizado la fisiología de M. tuberculosis directamente de tejidos obtenidos de humanos infectados, se ha descrito que los “factores de persistencia” están codificados en genes identificados, y que ofrecen sitios diana para el desarrollo de drogas con la posibilidad de reducir el tiempo de tratamiento (14).
Uno de las desventajas de la terapia actual es que toma muchísimo tiempo y se espera que los nuevos compuestos que se encuentren, reduzcan el tiempo de duración del régimen del tratamiento. Se necesita también que las drogas sean efectivas contra el número creciente de cepas resistentes y contra el bacilo que se encuentra en estado latente (25).
En Estados Unidos se creó un programa de tamizaje de drogas para el tratamiento de la TB, ya que se han detectado cepas resistentes a las drogas utilizadas contra M. tuberculosis. Por lo que encontrar nuevas drogas representa un gran reto. Este programa fue desarrollado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Instituto Nacional de Salud, y hasta el momento del reporte, se habían recopilado 50000 compuestos a los que se les realizaron varias pruebas para comprobar su actividad contra M. tuberculosis in vitro. Se consideraron activos en esta primera fase aquellos a los que se les detectó su actividad a una concentración de 6.25 μg/ml contra cultivos de la bacteria. En la siguiente etapa, se evaluó la citotoxicidad en cultivos para determinar la concentración inhibitoria (IC50), si el
