La proteína Rep de geminivirus reduce la sumoilación

La proteína Rep de geminivirus reduce la

sumoilación de PCNA

ssDNA

Replicación por

círculo rodante ReplicaciónDependiente de Recombinación Replicación dsDNA Movimiento del DNA ? ? Plasmodesmos Modificado de Hanley-Bowdoinet al. 2013

Geminivirus

Rep

Rep Rep

Rep: esencial en la replicación de los geminivirus

C G G AT G AA C G C C A TT A T A A T A T T (C1 )ATG ATG (V2 ) G CC TA CC G G CG TATA TATA IR Rep Rep

Maquinaria celular

Rep

_PCNA

Regulación del ciclo celular

p21

ciclinas, CDKs

Reparación del DNA

XPG

DNA polimerasas β, η, ι, κ, λ

Recombinación

Srs2

Replicación del DNA

Fen1

DNA polimerasa δ

DNA polimerasa ε

DNA ligasa I

Rep

PCNA: MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

Regulación del ciclo celular

p21

ciclinas, CDKs

Reparación del DNA

XPG

DNA polimerasas β, η, ι, κ, λ

Recombinación

Srs2

Replicación del DNA

Fen1 DNA polimerasa δ DNA polimerasa ε DNA ligasa I RFC

Ub

SUMO

Ub

Ub

PCNA

Proliferating Cell Nuclear Antigen

Rep

Rep interacciona con muchas proteínas de la planta

(Castillo et al. 2004)

PCNA

Proliferating Cell Nuclear Antigen

Rep

Rep interacciona con muchas proteínas de la planta

SCE

SUMO Conjugating Enzyme (Castillo et al., 2003; Bagewadiet al. 2004)

SUMOILACIÓN

SUMO

(small ubiquitin-like modifier)

Proteasa SCE1 S Proteína SCE1 Proteína E3 SAE1 SAE2 Interacción • Actividad • Localización Proteasa Degradación SUMO (100aa)

Sumoilación

Trabajo previo

¿Rep se sumoila?

SUMOILACIÓN

Trabajo previo

Trabajo previo

¿Rep altera la sumoilación de las proteínas de la planta?

¿General o específicamente?

SUMOILACIÓN

Trabajo previo

Rep altera la sumoilación de forma específica

SCE1 S

Rep S

PROTEÍNA

Trabajo previo

¿Rep altera la sumoilación de las proteínas de la planta?

¿General o específicamente?

SUMOILACIÓN

Trabajo previo

Rep altera la sumoilación de forma específica

SCE1 S

Rep S

PCNA

An ti -PC N A An ti -CA T

Trabajo previo

SUMOILACIÓN

¿Afecta Rep a la sumoilación de PCNA?

Ensayos de sumoilación en E. coli

Trabajo previo

SUMOILACIÓN

¿Afecta Rep a la sumoilación de PCNA?

An

ti

-PC

N

A

Ensayos de sumoilación en E. coli

¿Esa interferencia se debe a la interacción de

Rep con SCE1?

¿Qué lisinas se sumoilan?

1. Conservación

2. Localización

3. Dominio de sumoilación

1. Conservación

2. Localización

3. Dominio de sumoilación

Selección de lisinas:

falciparum que no contiene un residuo de lisina en la posición 164. Adicionalmente a estas lisinas, se seleccionaron otras tres situadas en el exterior del anillo: (i) la lisina 168 por su localización cercana a la lisina 164 y por estar conservado en todos los PCNAs de plantas, mamíferos y en la mayoría de los animales; (ii) la lisina 190 situada en la cara del lazo de PCNA en una posición muy cercana a K164 y conservada en todas las secuencias de plantas y animales, excepto en Anguilla japónica y (iii) la lisina 91, que forma parte de una secuencia consenso de sumoilación en C. elegans, se localiza en la cara del lazo y esta conservada en la secuencia de todos los PCNA de plantas y en algunos animales y microorganismos eucarióticos. En la figura 1.5 se muestran la posición que ocupan las lisinas seleccionadas en las estructura tridimensional de PCNA.

Construcción de mutantes y ensayos de sumoilación

Utilizando como molde el plásmido pET28b-SlPCNA (Sánchez-Durán

et al., 2011) se generaron mutantes puntuales en los residuos K164, K168 y

1. Conservación 2. Localización

3. Dominio de sumoilación

Selección de lisinas:

SlPCNA E1/E2/SUMO Rep -wt + + + + + + + - - - -

-K164A K164A_K168A K164A_K254A K254A

wt wt 37 50 75 An ti -PC N A 1. Conservación 2. Localización 3. Dominio de sumoilación

Selección de lisinas:

falciparum que no contiene un residuo de lisina en la posición 164. Adicionalmente a estas lisinas, se seleccionaron otras tres situadas en el exterior del anillo: (i) la lisina 168 por su localización cercana a la lisina 164 y por estar conservado en todos los PCNAs de plantas, mamíferos y en la mayoría de los animales; (ii) la lisina 190 situada en la cara del lazo de PCNA en una posición muy cercana a K164 y conservada en todas las

secuencias de plantas y animales, excepto en Anguilla japónica y (iii) la

lisina 91, que forma parte de una secuencia consenso de sumoilación en C.

elegans, se localiza en la cara del lazo y esta conservada en la secuencia de todos los PCNA de plantas y en algunos animales y microorganismos eucarióticos. En la figura 1.5 se muestran la posición que ocupan las lisinas seleccionadas en las estructura tridimensional de PCNA.

Construcción de mutantes y ensayos de sumoilación

Utilizando como molde el plásmido pET28b-SlPCNA (Sánchez-Durán

et al., 2011) se generaron mutantes puntuales en los residuos K164, K168 y

Las lisinas 164 y 254 se sumoilan

Evolución de los geminivirus

Alta tasa de recombinación Alta tasa de mutación

PCNA GG PCNA _Otros factores Reparación Síntesis de translesión Replicación Reparación libre de error PCNA GGSUMO PCNA _Translesion polymerase GG Polimerasas translesión Srs2 _{Inhibición de la} recombinación Lys 164 PCNA Ub UbUb Ub Ub

Interferencia de Rep en la sumoilación

Líneas futuras:

1.

Detección de la interferencia

in planta.

Agradecimientos

Harrold van den Burg Francesca Maio