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Universidad Pública de Navarra Departamento de Producción Agraria
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA 1er CURSO DE DIPLOMATURA EN ENFERMERÍA CURSO 2008-2009 GRUPO 1 CÓDIGO 48108
Prof. Dr. Antonio G. Pisabarro Catedrático de Microbiología
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MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
CÓDIGO 48108
PROFESORES DE LA ASIGNATURA
Prof. Dr. D. Antonio G. Pisabarro, Catedrático de Microbiología, Profesor responsa-ble del grupo 1
Teléfono: 948 169 107.
Tutorías: miércoles de 11 a 12 h en el despacho de la escuela de estudios sanita-rios.
E-mail: [email protected] (Indicar en el subject del mensaje MicroClini-ca)
Dra. Dña. María M. Peñas, Profesora Ayudante Doctor de Microbiología, responsable de la docencia práctica
Teléfono: 948 169 219
Tutorías: Es necesario pedir cita previa mediante un mensaje enviado a la direc-ción de e-mail.
E-mail: [email protected]
DESCRIPCIÓN DE LA ASIGNATURA
La asignatura de MICROBIOLOGÍA CLINICA (Código 48108) consta de 4.5 créditos (3.0 teóricos y 1.5 prácticos) englobados dentro de la materia troncal de Enfer-mería comunitaria 1. El objetivo de la misma es presentar al alumno los fundamentos de la microbiología que influyen en la actividad profesional de los diplomados en en-fermería que entran en contacto con pacientes de enfermedades infecciosas o especial-mente susceptibles a ellas. La asignatura se centra más que en el diagnóstico y trata-miento de las enfermedades infecciosas, en estudiar cómo se limita la difusión de los microorganismos evitando su transmisión y contagio.
En el Plan de Estudios de la Diplomatura en Enfermería existe una asignatura optativa titulada Descripción y Detección de Agentes Infecciosos enfocada en el estu-dio más detallado de los principales grupos de microorganismos patógenos de impor-tancia sanitaria.
EVALUACIÓN DE LA ASIGNATURA
• Para la evaluación de la asignatura se tendrán en cuenta la asistencia a clase teórica, y los exámenes.
• Durante el curso, habrá dos exámenes parciales para todos los alumnos que no serán liberatorios.
• El primero comprenderá los temas 1 a 4 (ambos inclusive) y el segundo los temas 5 a 9.
• Cada uno de los exámenes parciales contribuye con un 20% a la nota de la asignatu-ra. El examen final, se celebrará en las fechas publicadas oficialmente, comprende toda la asignatura y contribuye con un 60% a la nota de la asignatura.
• Las calificaciones de los exámenes parciales tendrán valor para las convocatorias ordinaria (junio) y extraordinaria (septiembre).
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• Para aprobar la asignatura es necesario haber realizado correctamente las prácticas de la misma y alcanzar una nota mínima de 5.0.
• El examen final de junio incluirá unas preguntas de prácticas cuya superación será condición necesaria para los alumnos repetidores de la asignatura que por estar en otros cursos no puedan asistir a las prácticas de laboratorio. Para el resto de los alumnos que se encuentran en primero, las preguntas de prácticas computarán en el examen como el resto de las preguntas del mismo.
• A aquellos alumnos que hayan conseguido una nota de 5.0 o superior, se les podrá sumar hasta un punto por la asistencia a las clases teóricas. Para los alumnos repeti-dores, se contabilizará la asistencia del curso anterior 07-08.
PROGRAMACIÓN
A continuación se indican las fechas previstas para las clases y los temas que se tratarán en ellas. Los números de los temas son los de este volumen de Notas de Microbiología Clínica.
Clases prácticas:
De lunes a jueves de 17:00 a 20:00 y los viernes de 9:00 a 12:00 en las semanas indica-das para cada grupo en la guía y los tablones de anuncios.
4 TEMAS DE TEORÍA
Tema 1.- Estructura de los microorganismos. Células procariotas y eucariotas.
Tama-ño y morfología de las bacterias. Observación microscópica de los microorganismos. Tinciones. Membrana bacteriana y peptidoglicano. Bacterias positivas y Gram-negativas. Ribosomas bacterianos. Elementos facultativos de la célula procariota. Cáp-sula y capas mucosas. Apéndices bacterianos: flagelos y fímbrias. Endosporas. Estruc-tura de los virus.
Tema 2.- Crecimiento y muerte de microorganismos. Concepto y expresión
matemáti-ca del crecimiento bacteriano. Concepto de muerte de un microorganismo. ¿Qué nece-sita un microorganismo para crecer?. Detección y medida del crecimiento. Ciclo de crecimiento de poblaciones. Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento. Multiplicación de los virus.
Tema 3.- Taxonomía microbiana. Principales grupos de Bacterias, Virus, Hongos y
Protozoos de importancia clínica.
Tema 4.- Genética microbiana. Elementos genéticos bacterianos. Transferencia
hori-zontal de material genético en microorganismos: transformación, conjugación y trans-ducción. Elementos genéticos de los virus. Expresión de la información genética.
Tema 5.- Interacción con los microorganismos. Concepto de flora normal.
Localiza-ción de la flora normal. InteracLocaliza-ción patogénica entre huésped y bacteria. postulados de Koch. Poder patogénico y virulencia. Factores determinantes de la acción patógena
Tema 6.- Dispersión de los microorganismos. Reservorios y fuentes de infección. El
contagio y su prevención. Vías y modos de transmisión microorganismos.
Tema 7.- Esterilización, desinfección y asepsia. Esterilización, desinfección,
descon-taminación y antisepsis. Desinfectantes y antisépticos. Evaluación de la actividad ger-micida. Desinfectantes de alta, media y baja actividad. Desinfección de endoscopios. Esterilización por calor. Esterilización por óxido de etileno.
Tema 8.- Control de microorganismos. Inhibición del crecimiento. Grupos de
antibi-óticos y quimioterápicos. Mecanismos de resistencia a antibiantibi-óticos. Cepas multirresis-tentes. Precauciones en el uso de antibióticos. Tratamiento de las infecciones virales. Tratamiento de enfermedades causadas por protozoos y por hongos.
Tema 9.- Defensa frente a microorganismos. Barreras a la entrada de organismos.
Respuesta inespecífica a la infección. Respuesta inmune específica. Antígenos y anti-cuerpos. Células de la respuesta inmune específica. Mecanismo de la respuesta inmune específica. Ejemplo del desarrollo y función del sistema inmune: el sistema inmune in-testinal. Reacciones de hipersensibilidad. Inmunodeficiencias. Enfermedades autoinmu-nes. Superantígenos. Inmunoterapia.
5 TEMAS DE LABORATORIO
La asistencia a las prácticas de laboratorio y la superación de esta parte del programa es imprescindible para poder aprobar la asignatura conjunta.
Práctica 1: Preparación de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios de cultivo. Esterilización.
Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de dife-rentes medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la im-portancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Además también se pretende que el alumno se familiarice con las técnicas empleadas en Micro-biología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en condicio-nes de esterilidad.
Práctica 2: Obtención de cultivos puros.
Con esta práctica se pretende estudiar las diferentes técnicas de aislamiento de un microorganismo a partir de una población mixta para obtener un culti-vo puro.
Práctica 3: Recuento del número de bacterias por mililitro de un cultivo líquido. El objetivo de esta práctica es dar a conocer al alumno otra de las técnicas de obtención de cultivo puros así como el aprendizaje para hacer diluciones y recuentos bacterianos.
Práctica 4: Cultivo de bacterias anaerobias.
El objetivo de esta práctica es conocer el fundamento y la técnica más co-múnmente empleada en el aislamiento de bacterias anaerobias.
Práctica 5: Observación de bacterias teñidas. Tinción Simple y Tinción de Gram. Con esta práctica se pretende familiarizar al alumno con el manejo del mi-croscopio óptico para la visualización de microorganismos. Se observarán preparaciones bacterianas bajo diferentes técnicas de tinción que permitan establecer diferencias morfológicas y estructurales entre y dentro de los mi-croorganismos.
Práctica 6: Transformación bacteriana por resistencia a ampicilina.
En esta práctica se hablará de los fenómenos de transformación, conjugación y transducción y se realizará un ensayo de transformación bacteriana por ad-quisición de plásmidos resistentes al antibiótico ampicilina.
Práctica 7: Antibiograma.
El objetivo de esta práctica es estudiar qué son los antibióticos y cómo se realiza la valoración de la actividad antimicrobiana de un compuesto quími-co (antibiótiquími-co) mediante la técnica de Kirby-Bauer.
Práctica 8: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano
El objetivo de esta práctica consiste en estudiar el efecto y la resistencia de un cultivo bacteriano a altas temperaturas.
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El objetivo de esta práctica consiste en visualizar la presencia de bacteriófa-gos a través de las consecuencias de su ciclo infeccioso sobre bacterias de Staphylococcus aureus.
Práctica 10: Observación de levaduras.
El objetivo de esta práctica es el cultivo de diferentes levaduras y la poste-rior identificación de las mismas de acuerdo a sus características morfológi-cas a través de su observación al microscopio.
Práctica 11: Tinción de esporas.
En esta práctica se estudiará el género Bacillus por su capacidad para la for-mación de endosporas y se procederá a la realización de la correspondiente tinción diferencial para poder visualizar al microscopio dichas estructuras.
Práctica 12: Tinción de cápsula.
En esta práctica se estudiarán las cápsulas bacterianas y se procederá a una tinción diferencial para la visualización de la misma al microscopio.
7 BIBLIOGRAFÍA:
1.- Pisabarro, A.G. 2003. Notas de clase de Microbiología Clínica. (Revisión 2006) 2.- de la Rosa, M. 1997. Microbiología: Enfermeria - Ciencias de la Salud. Conceptos y
Aplicaciones. Ed. Harcourt Brace.
3.- Stuart Walker, T. 1998. Microbiología. Ed. McGraw-Hill Interamericana.
4.- Ingraham, J.L. y C.A. Ingraham. 1998. Introducción a la Microbiología. Ed. Rever-té, S.A.
5.- García-Rodríguez, J.A. y J.J. Picazo. 1996. Microbiología Médica. Ed. Mosby
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TEMAS DE
TEORÍA
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Tema 1.- Estructura de los microorganismos. Células procariotas y eucariotas.
Tama-ño y morfología de las bacterias. Observación microscópica de los microorganismos. Tinciones. Membrana bacteriana y peptidoglicano. Bacterias positivas y Gram-negativas. Ribosomas bacterianos. Elementos facultativos de la célula procariota. Cáp-sula y capas mucosa. Apéndices bacterianos: flagelos y fímbrias. Endosporas. estruc-tura de los virus.
1.- INTRODUCCIÓN
Las enfermedades infecciosas, aunque están relativamente controladas en los países desarrollados, siguen siendo una de las principales causas de mortalidad en los países en desarrollo. A este hecho se une la aparición de nuevas enfermedades infecciosas desco-nocidas codesco-nocidas como enfermedades emergentes (SIDA, Legionelosis, Ébola, Sín-drome Respiratorio Agudo Severo o SARS, Gripe Aviar, etc.) y la reaparición de otras que habían sido controladas pero que surgen de nuevo presentado nuevas resistencias (Tuberculosis) conocidas como enfermedades re-emergentes. Por último, hay que se-ñalar la alta incidencia de las infecciones hospitalarias (infecciones nosocomiales) pro-ducidas por patógenos portadores de múltiples factores de resistencia y el aumento de los segmentos de población especialmente susceptibles a enfermedades infecciosas, para poder tener una imagen completa de la incidencia de la microbiología en la sanidad contemporánea.
Por otro lado, la interacción de los microorganismos que constituyen la flora (micro-biota) normal con nuestro cuerpo es esencial para el desarrollo correcto de nuestro sis-tema inmune y vascular. Así mismo, la actividad microbiana es también esencial para un correcto procesamiento y absorción de los alimentos a nivel intestinal.
LOS MICROORGANISMOS Y LA SALUD PÚBLICA
Las enfermedades infecciosas tienen una relevancia especial en la salud pública. Las infecciones víricas o bacterianas más frecuentes suelen pasar desapercibidas para la ad-ministración nacional de salud y sólo se tienen datos razonablemente fiables de las en-fermedades que, por sus especiales características, son de declaración obligatoria.
Entre las primeras (sin declaración obligatoria) debemos contabilizar no sólo las en-fermedades infecciosas comunes que o bien no están incluidas en brotes epidémicos o, si lo están, no requieren ser declaradas individualmente; sino que también hay que con-siderar, en conjunto, las infecciones producidas por lesiones que presentan normalmente un tratamiento fácil y pronóstico favorable.
La incidencia de las enfermedades infecciosas puede valorarse mediante el segui-miento de los brotes epidémicos de enfermedades transmitidas a través de los alimentos y cuya declaración sea obligatoria y mediante el seguimiento general de las enfermeda-des de declaración obligatoria que en 2003 supusieron más de 1.7 millones de casos en toda España (Datos del Boletín Epidemiológico Semanal del Instituto Carlos III) de los
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cuales la gripe (con cerca de 1,5 millones de casos en 20031) y la varicela (con más de 233.000 casos en 20032) son las de mayor incidencia.
2.- CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS.
Organismos eucarióticos son aquellos en cuyas células puede diferenciarse un nú-cleo que contiene el material genético separado de un citoplasma en el que se encuen-tran diferentes orgánulos celulares.
Los microorganismos eucarióticos más relevantes en clínica incluyen ciertos anima-les de pequeño tamaño productores de enfermedades parasitarias, protozoos y hongos unicelulares o pluricelulares.
Organismos procarióticos son aquellos en los que no existe la separación entre nú-cleo y citoplasma. Dentro de este grupo se incluyen las bacterias, a las que dedicaremos la mayor parte del curso.
Mención aparte merecen los virus, partículas inanimadas de material genético prote-gido por capas más o menos complejas de proteínas y lípidos. Carecen de actividad me-tabólica cuando se encuentran libres.
En general, las células procarióticas son más simples que las eucarioticas ya que es-tas contienen membranas internas que diferencian órganos celulares (aparato de Golgi, retículo endoplásmico, vacuolas, etc.) no presentes en las células procariotas. En estas el citoplasma es continuo y se encuentra lleno de ribosomas encargados de llevar a cabo la traducción del mensaje genético en proteínas.
Las células eucarióticas son el resultado de una simbiosis establecida hace muchos millones de años entre células procarióticas (que han dado lugar a las mitocondrias) y un núcleo eucariótico (el núcleo de nuestras células). A causa de esta simbiosis, ciertos agentes químicos que son activos frente a procariotas pueden resultar tóxicos para euca-riotas al actuar sobre sus mitocondrias. Estas simbiosis estables entre organismos de diferentes orígenes son relativamente frecuentes y se dan en organismos patógenos co-mo, por ejemplo, el Plasmodium productor de la malaria o paludismo.
3.- TAMAÑO Y MORFOLOGÍA DE LAS BACTERIAS.
La forma de las bacterias puede ser esférica (cocos), cilíndrica (bacilos), de coma (vibrios) o helicoidal (espirilos). La forma de las bacterias viene determinada princi-palmente por la estructura de su pared celular y es una de las características que sirven para identificarlas.
1 La acumulación de casos de una enfermedad puede variar en distintos años, así, la acumulación de casos
declarados de gripe en 2004 fue de poco más de medio millón de casos, un poco más de un tercio de los casos declarados en 2003 (datos de Boletín Epidemiológico Semanal 12: 292).
2 Incidencia declarada: 178.933 en 2003 y 233.934 en 2004. (Datos del Boletín Epidemiológico Nacional.
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Las bacterias pueden presentarse como células aisladas o formando grupos. Esta ca-racterística es también importante para poder identificarlas. En algunas casos la apari-ción de las bacterias formando agrupaciones no es una característica de estas in vivo sino un efecto de ciertas técnicas de tinción (como en el caso del género Staphylococcus que aparece formando racimos en preparaciones fijadas y teñidas; pero no en muestras vivas).
Las principales formas de agrupamiento de las bacterias son las que se observan en estreptococos y estreptobacilos (cadenas de cocos o de bacilos, respectivamente), esta-filococos (agrupaciones en forma de racimos de cocos), diplococos (parejas de cocos) sarcinas (agrupaciones en tétradas o en grupos de ocho cocos dispuestos en forma de cubo).
El tamaño de las células bacterianas es variable oscilando entre una micra (µm) de diámetro y varias decenas de longitud en las especies más grandes. En cualquier caso, su tamaño es más reducido que el de una célula eucariótica típica.
4.- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS MICROORGANISMOS.
Debido a su pequeño tamaño, la observación de los microorganismos ha de realizarse mediante el uso de microscopios.
En el caso de la mayoría de los microorganismos procarióticos, la observación mi-croscópica se limita a determinar la forma, el modo de agrupamiento, el movimiento y la presencia de algunos elementos extracelulares tales como las cápsulas. En el caso de microorganismos eucarióticos, la información que se obtiene de la observación micros-cópica es mucho mayor porque también lo es su diversidad morfológica y anatómica.
Una consideración especial requiere el método de tinción de Gram que permite cla-sificar la mayoría de las bacterias en uno de dos grandes grupos cuyas características anatómicas y fisiológicas son diferentes.
Las técnicas microscópicas más frecuentes de uso en microbiología son las de mi-croscopía óptica normal para observar células fijadas y teñidas, de contraste de fase para la observación de células vivas, de fluorescencia para observar células marcadas y de interferencia (Nomarski) para la observación de células vivas. En microscopía elec-trónica, se usan tanto microscopios de transmisión (MET) como microscopios de ba-rrido (MEB).
La resolución que se alcanza en microscopía óptica está en torno a 0,2 µm, en MET puede llegar a los 0,2 nm y en MEB entre 1 y 10 nm.
5.- TINCIONES.
Como se ha indicado en el apartado anterior, la observación microscópica de bacte-rias proporciona una cantidad limitada de información debido a la reducida variabilidad morfológica de estos organismos. La observación de microorganismos vivos (contraste de fase) permite obtener información relativa a su movilidad y a su tamaño. Sin
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go, la mayor parte de la información microscópica deriva del examen de muestras fija-das y teñifija-das.
La fijación consiste en la precipitación de las proteínas y desecación de las muestras mediante técnicas físicas o químicas. En la práctica, la fijación se suele realizar por ca-lor con lo que se consigue la desnaturalización y desecación al mismo tiempo que se adhiere la muestra al portaobjetos en el que se realizará la observación.
En la mayoría de los casos, la fijación se realiza en muestras que han sido extendidas sobre el portaobjetos produciendo lo que se denomina un frotis.
Una vez fijada, la muestra se somete a uno o varios procesos de tinción a fin de reve-lar la morfología del microorganismo y algunas de sus características estructurales. En algunos casos (como el ya citado de Staphylococcus) la fijación puede dar lugar a agru-paciones características de bacterias que permiten su identificación.
Para realizar la tinción es necesario usar colorantes específicos. Los colorantes se agrupan en básicos que tiñen especialmente bacterias ya que la membrana de estas suele tener una cierta carga eléctrica negativa (a este grupo pertenecen la safranina, fucsina básica, cristal violeta y azul de metileno); y ácidos más adecuados para teñir células animales en muestras de tejidos infectados. A este último grupo pertenecen la fucsina ácida, la eosina y el rojo Congo.
Para ciertos tipos de tinciones es necesario aumentar la afinidad del colorante por el microorganismo (o estructura) utilizando substancias que actúan como mordientes. Los mordientes también se utilizan para aumentar el grosor de ciertas estructuras como los flagelos de forma que puedan ser observados al microscopio cuando se tiñen adecuada-mente.
Los principales tipos de tinción que se usan en microbiología clínica son los siguien-tes:
TINCIÓN SIMPLE
Permite observar la forma, tamaño y agrupamiento de las bacterias usando un único colorante (normalmente básico).
TINCIÓN DIFERENCIAL
Permiten distinguir diferentes tipos de microorganismos en función de sus caracterís-ticas estructurales
Tinción de Gram: es un sistema de dos tinciones simples sucesivas, separadas por una fase de decoloración selectiva. Permite diferenciar las bacterias que retienen el pri-mer color (Gram-positivas) de las que no lo retienen (Gram-negativas). Esta diferencia en comportamiento refleja diferencias estructurales y fisiológicas entre ambos grupos de bacterias.
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Tinción de esporas (Wirtz-Conklin): ciertos tipos de bacterias producen esporas de resistencia cuya pared celular es característica. La tinción de esporas permite detectar este tipo de células lo que tiene utilidad en la identificación del microorganismo en es-tudio.
Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-alcohol resistencia): es un tipo especial de tinción que permite la identificación de microorganismos de los grupos Mycobacterium y No-cardia de gran relevancia clínica
Tinción de cápsulas: se trata de una tinción negativa usando tinta china que permite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.
Tinción de flagelos (Leifson): permite teñir flagelos usando un mordiente para in-crementar su grosor y hacerlos visibles al microscopio óptico.
6.- MEMBRANA BACTERIANA Y PEPTIDOGLICANO.
Las bacterias presentan una membrana interna que rodea el citoplasma bacteriano y presenta las características generales de las membranas plasmáticas. Hacia el exterior de la membrana interna, todas las bacterias (con excepción de los micoplasmas grupo de organismos al que pertenecen patógenos de los géneros Mycoplasma y Ureaplasma) presentan una pared celular formada por un polímero complejo denominado peptido-glicano. Algunos tipos de bacterias tienen una segunda membrana (membrana exter-na) que recubre la capa de peptidoglicano por su parte exterior. En las bacterias que tienen membrana externa (bacterias Gram-negativas), el espesor de la capa de pepti-doglicano es más reducido que en las que carecen de ella (bacterias Gram-positivas). Se denomina espacio periplásmico al comprendido entre las membranas interna y ex-terna en las bacterias Gram-negativas y al inmediatamente adyacente a la membrana interna en el caso de las bacterias Gram-positivas.
ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA INTERNA
La membrana interna está formada por una bicapa lipídica. En las bacterias los lípi-dos que forman esta membrana son generalmente fosfolípilípi-dos y no se encuentran estero-les (salvo en el caso de los micoplasmas). Esto diferencia claramente las membranas bacterianas de las de células eucarióticas que sí tienen esteroles en sus membranas
FUNCIONES DE LA MEMBRANA INTERNA
1.- Barrera de permeabilidad selectiva: La membrana lipídica que recubre las célu-las es impermeable a célu-las molécucélu-las cargadas y a los iones, mientras que es permeable a los compuestos orgánicos y moléculas neutras. Por ello es una barrera de permeabilidad que restringe el paso de los nutrientes al interior de la célula, y el de compuestos intra-celulares al exterior.
La entrada de compuestos polares a través de la membrana lipídica se consigue de varias maneras:
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a.- Poros a través de la membrana que permiten el paso selectivo de compuestos po-lares. Estos canales suelen estar dedicados a la entrada de solutos y su entrada está im-pulsada por la difusión libre a lo largo de un gradiente de concentración.
b.- Transportadores que recogen del exterior moléculas y las introducen al interior consumiendo energía en el proceso. La energía motriz en este caso es ATP.
c.- En el caso de ciertos iones intracelulares, éstos son transportados al exterior me-diante sistemas de proteínas transportadoras de forma que se generan gradientes trans-membranales. La energía que impulsa este transporte deriva de la oxidación de com-puestos reducidos (potencial redox).
d.- En el caso de los protones (H+) que se acumulan en el exterior de la célula esta-bleciéndose un gradiente a través de la membrana, la entrada de estos cationes puede realizarse a través de canales especializados de forma que la energía que se libera como consecuencia de la entrada de los protones (destrucción del gradiente) se emplea para la síntesis de ATP. Estos canales son conocidos como protón-ATPasas.
e.- En el caso de proteínas de membrana que han de exportarse al exterior de la célu-la, éstas tienen secuencias especiales en su extremo amino-terminal que las dirigen hacia la membrana y son procesadas (las secuencias especiales son eliminadas) cuando se produce el tránsito a través de la membrana celular.
Los sistemas de transporte activo a través de la membrana pueden clasificarse en tres grandes grupos: uniportadores que translocan un solo tipo de moléculas, simpor-tadores que translocan una molécula asociada a otra que se mueve a lo largo de un gra-diente de concentración, y antiportadores que son similares a los anteriores pero en los que la energía liberada por el transporte a favor de gradiente de concentración se utiliza para translocar otra molécula en dirección contraria.
2.- Soporte ordenado de sistemas enzimáticos: Gran cantidad de reacciones meta-bólicas han de llevarse a cabo por conjuntos de varias enzimas que funcionan en cadena de forma que los productos de la reacción catalizada por una enzima son substrato de la siguiente y así sucesivamente. Para que estas reacciones puedan funcionar eficientemen-te, es necesario que los constituyentes de estos sistemas multienzimáticos estén coloca-dos correctamente en el espacio de forma que la transferencia de substratos entre ellos sea la apropiada.
Las membranas biológicas son un buen soporte de sistemas enzimáticos de este tipo ya que en ellas pueden ordenarse en dos dimensiones los constituyentes de la cadena de enzimas. Sistemas enzimáticos de membrana son los responsables de la cadena respira-toria, los de síntesis de pared celular, los de generación de ATP mediante sistemas de protón-ATPasa, los de recepción y transmisión de señales al interior celular, etc.
En la membrana interna se encuentran los sistemas enzimáticos responsables de la síntesis de la propia membrana, los sistemas receptores de señales extracelulares (siste-mas de dos componentes formadas por un receptor de la señal y un transmisor de la se-ñal al interior celular), el sistema de transporte de electrones acoplado al transporte de protones que forma la cadena respiratoria, el sistema de protón ATP-asa responsable de
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la síntesis de ATP, el sistema enzimático responsable de las últimas etapas de la síntesis de la capa de peptidoglicano y los sistemas de transporte a través de membrana.
Debido a su naturaleza lipídica las propiedades de las membranas cambian con la temperatura pasando de una estructura de membrana fluida a temperaturas altas (simi-lares a las ambientales o a las del interior de los organismos donde viven) a una estruc-tura de membrana cristalina a temperaestruc-turas bajas (del entorno de 4ºC). La condición fluida o cristalina de una membrana afecta a su actividad y, por consiguiente, al metabo-lismo general de la célula.
La integridad de la membrana interna es vital para la célula: si la membrana se rompe el contenido celular se pierde. Incluso pequeños poros no controlados que se produzcan accidentalmente en la membrana pueden ser fatales ya que la generación de la energía celular es sólo posible cuando la membrana interna está íntegra.
Debido a sus especiales características, la membrana interna es diana para la acción de diferentes tipos de antibióticos tales como los inhibidores de la síntesis de peptido-glicano (antibióticos β-lactámicos, grupo al que pertenecen la penicilina y sus deriva-dos) o antibióticos formadores de poros que destruyen los gradientes transmembranales. La membrana interna está empujada por la presión de turgor contra la capa de pepti-doglicano.
ESTRUCTURA DEL PEPTIDOGLICANO
El peptidoglicano es una macromolécula que rodea completamente las células bacte-rianas proporcionándoles resistencia mecánica frente a la presión osmótica y confirién-doles la forma característica de los diferentes grupos bacterianos. La membrana interna por sí sola no es capaz de soportar la presión de turgor (debida a la presión osmótica) de la célula bacteriana. El elemento de resistencia mecánica de la célula es la capa de pep-tidoglicano.
La capa de peptidoglicano está formada por un polímero complejo denominado mu-reína que forma una macromolécula que recubre completamente la célula.
Estructuralmente está formado por cadenas glucosídicas en las que se repite una uni-dad elemental de N-acetil-glucosamina unida por un enlace glicosídico β1→4 a ácido N-acetil-murámico. Las unidades elementales están también unidas entre ellas median-te enlaces glicosídicos β1→4. Estas cadenas glucosídicas pueden ser de longitud varia-ble entre las diferentes especies bacterianas y entre diferentes momentos de la vida de la bacteria.
Las cadenas glucosídicas están orientadas de forma paralela y están unidas entre sí mediante puentes peptídicos formados por cadenas de aminoácidos que están unidos al resto de ácido N-acetil-murámico. La orientación de las cadenas glicosídicas no se co-noce con claridad todavía: en algunos modelos de peptidoglicano se propone que están orientadas de manera perpendicular al eje mayor de la bacteria, mientras que en otros se propone que se orientan de forma perpendicular a la superficie de la bacteria.
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Las cadenas peptídicas unidas al ácido N-acetil-murámico están formadas por ami-noácidos en los que se observa una alternancia de restos con configuración L y con con-figuración D. La presencia de D-aminoácidos en estas cadenas peptídicas es de la ma-yor importancia porque prácticamente no se encuentran aminoácidos de este tipo en otras estructuras celulares procarióticas y están ausentes en las estructuras eucarióticas.
La capa de peptidoglicano presenta un grosor variable según las especies bacterianas: aquéllas presentan una reacción Gram-positiva tienen una gruesa capa de peptidoglica-no, mientras que las Gram-negativas tienen una capa prácticamente monomolecular.
SÍNTESIS DE LA CAPA DE PEPTIDOGLICANO
El peptidoglicano se sintetiza por la acción de un conjunto de enzimas situadas en la membrana interna de la bacteria. La actividad de estas enzimas tiene que estar perfecta-mente regulada porque simultáneaperfecta-mente han de abrir nuevos sitios de crecimiento de la pared celular cuidando de que no se produzcan fallos en la contención de la presión os-mótica intracelular.
Existe una gran cantidad de antibióticos cuya actividad se debe a la inhibición selec-tiva de estas moléculas de síntesis de pared celular que provocan rápidamente el estalli-do (lisis) de la célula bacteriana. Algunos actúan en etapas tempranas de la síntesis (ci-closerina, vancomicina, bacitracina) mientras que otros, que contienen un núcleo quími-co quími-conocido quími-como anillo lactámiquími-co y, por ello, se denominan antibiótiquími-cos β-lactámicos de los que el ejemplo representativo es la penicilina, actúan en las etapas finales. Estos antibióticos sólo son efectivos cuando la célula está creciendo y, por con-siguiente, las proteínas de síntesis peptidoglicano son activas.
Dada la presencia de aminoácidos D en la capa de peptidoglicano, las enzimas res-ponsables de su síntesis han de tener sus centros activos diseñados de forma que puedan reconocer los aminoácidos de esta configuración. Los antibióticos que inhiben estas enzimas son totalmente selectivos para bacterias ya que la estructura del peptidoglicano no se encuentra en otro tipo de células.
Las proteínas responsables de las etapas finales de la síntesis de peptidoglicano se conocen como PBP's, del inglés Penicillin-Binding Proteins que hace referencia a su capacidad de unir penicilina.
FUNCIONES DEL PEPTIDOGLICANO
Protección osmótica: Las células bacterianas se encuentran en una situación de ries-go osmótico permanente: la alta concentración de los solutos intracelulares crea una gran presión osmótica que llevaría a las células a estallar si no contaran con una cubierta de protección.
En este sentido, las funciones de la capa de peptidoglicano son dos:
a.- preservar la integridad de la célula de manera que resista la presión de turgor b.- conferir una forma definida a la célula bacteriana
17 MEMBRANA EXTERNA
Ciertas bacterias presentan una segunda membrana (membrana externa) por el exte-rior de la capa de peptidoglicano. Estas bacterias presentan una respuesta especial a la tinción de Gram y se clasifican como Gram-negativas. La membrana externa presenta ciertas diferencias en su estructura con las membranas clásicas. Las más relevantes son la presencia de un lipopolisacárido en su cara exterior y la presencia de porinas.
El lipopolisacárido es una molécula compleja que proyecta hacia el exterior de la cé-lula cadenas de polisacárido: su importancia radica en que es altamente antigénico (pro-voca una fuerte respuesta inmune, endotoxina) siendo uno de los agentes que se apun-tan como responsables del llamado «shock endotóxico» producido cuando las células del sistema inmune entran en contacto con él.
La función del lipopolisacárido en las bacterias es la de incapacitar las defensas del huésped, proporcionar carga negativa a la superficie de la membrana y estabilizarla.
Las variantes de lipopolisacárido de diferentes cepas de una misma bacteria se pue-den distinguir usando métodos serológicos. El antígeno de lipopolisacárido se conoce como antígeno O.
En las bacterias Gram-positivas, carentes de membrana externa y, por tanto, de lipo-polisacárido, una función equivalente (en la estabilidad de la membrana y en proporcio-narle carga negativa) a la del lipopolisacárido la realizan los ácidos teicoicos.
En la membrana externa se encuentran las porinas que abren vías de entrada de solu-tos al interior celular. Las porinas son complejos de varias moléculas de proteína que forman un canal por el que pueden atravesar la membrana externa moléculas de hasta 1000 Da de tamaño molecular.
La membrana externa se encuentra unida al peptidoglicano a través de la proteína co-nocida como lipoproteína de Braun cuya parte lipídica se encuentra en la membrana y la proteica unida covalentemente a la mureína.
La membrana externa tiene unos puntos de contacto con la membrana interna que se denominan uniones de Bayer y que se supone son importantes en el transporte a través e la membrana.
ESPACIO PERIPLÁSMICO
En las bacterias Gram-negativas, el espacio comprendido entre las membranas inter-na y exterinter-na se denomiinter-na espacio periplásmico y comprende un volumen que rodea a la célula conteniendo gran cantidad de enzimas que permiten procesar los nutrientes para que puedan ser transportados al interior celular a través de la membrana interna. Otras enzimas importantes presentes en el espacio periplásmico son las β-lactamasas respon-sables de la destrucción de los antibióticos β-lactámicos y, por tanto, de la resistencia de ciertas bacterias a ellos.
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En las bacterias Gram-positivas no hay, en realidad, espacio periplásmico; pero se discute si la parte más interna del peptidoglicano puede desarrollar una función similar reteniendo mediante fuerzas electrostáticas moléculas de enzimas equivalentes a las periplásmicas de Gram-negativas.
7.- BACTERIAS GRAM-POSITIVAS Y GRAM-NEGATIVAS.
Como se ha indicado anteriormente, la mayoría de las bacterias pueden clasificarse en uno de dos grupos diferenciables por medio de la tinción de Gram. Las bacterias Gram-positivas y las Gram-negativas. Estructuralmente ambos grupos se diferencian porque las Gram-positivas carecen de membrana externa, tienen una gruesa capa de peptidoglicano y presentan ácidos teicoicos en su superficie, mientras que las Gram-negativas tienen membrana externa portadora de lipopolisacárido y una capa de pepti-doglicano más fina.
En general, las bacterias Gram-negativas suelen presentar mayores problemas de per-meabilidad a ciertos antibióticos que las Gram-positivas, debido a la doble membrana. Sin embargo, muchas bacterias Gram-positivas presentan otros mecanismos de resisten-cia (esporas) de los que carecen las Gram-negativas, y una mayor resistenresisten-cia a antisépti-cos.
Desde el punto de vista morfológico, las bacterias Gram-negativas suelen ser bacilos, comas (Vibrio) o espirilos, mientras que sólo en casos muy raros son cocos (Neisseria). Dentro de las bacterias Gram-positivas encontramos cocos y bacilos.
8.- RIBOSOMAS BACTERIANOS.
Los ribosomas, tanto los procarióticos como los eucarióticos, están formados por pro-teínas y ARN; sin embargo, ambos tipos de constituyentes ribosómicos son diferentes en procariotas y eucariotas de suerte que puede disponerse de inhibidores (antibióticos) específicos de ribosomas procarióticos que no afectan a los eucarióticos y viceversa.
9.- ELEMENTOS FACULTATIVOS DE LA CÉLULA PROCARIOTA.
Estas últimas cubiertas no están presentes en todos los microorganismos y, por con-siguiente, no pueden considerarse elementos estructurales esenciales, aunque confieren a los microorganismos que las poseen características biológicas particulares.
CÁPSULA Y CAPAS MUCOSA.
Muchas bacterias presentan en la parte exterior de sus paredes celulares otras capas que sirven de protección y les facilitan la colonización de ambientes intracorporales. Entre estas capas se encuentran cubiertas proteicas que forman una especie de coraza denominada genéricamente capa S, y se encuentran capas de naturaleza polisacarídica denominadas genéricamente cápsulas.
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La capa S está formada por proteínas y glicoproteínas y participa en la adhesión de las bacterias a superficies, la protección frente a la fagocitosis y actúa como barrera frente a enzimas o substancias que pudieran dañar a las bacterias que la poseen.
Las cápsulas están formadas por polisacáridos o polipéptidos y participan en la ad-hesión de las bacterias a superficies, retardan la desecación de las bacterias en ambien-tes secos y proporcionan protección frente a la fagocitosis. No solo las bacterias presen-tan cápsulas sino que también han sido descritas en algunos hongos unicelulares (Cryp-tococcus neoformans).
Una característica macroscópica fácilmente observable de los microorganismos con cápsula es que forman colonias de aspecto mucoso y liso.
Las diferentes variantes de cápsula de distintas cepas de una misma especie se pue-den ipue-dentificar mediante métodos serológicos. El antígeno capsular se conoce como an-tígeno K.
10.- APÉNDICES BACTERIANOS: FLAGELOS Y FÍMBRIAS.
Las bacterias pueden poseer una serie de apéndices celulares que desempeñan fun-ciones diversas:
FLAGELOS
La mayoría de las bacterias móviles lo son por la acción de los flagelos: estructuras proteicas cuyas características pueden ser fácilmente detectadas por medios serológicos lo que permite la identificación de microorganismos o distintas cepas de una misma especie con facilidad. El antígeno flagelar se conoce como antígeno H.
Las bacterias flageladas pueden tener entre uno y 20 flagelos por célula. Su composi-ción es proteica y su tamaño es de unos 20 nm de diámetro y de entre 5 y 20 µm de lon-gitud.
La función de los flagelos es proporcionar movimiento a las bacterias. Cuando este movimiento se dirige hacia, o en dirección opuesta, a un punto determinado se denomi-na tactismo, distinguiéndose los tipos de tactismo por el agente atrayente o repetlente (fototactismo, quimiotactismo, etc.).
Los flagelos pueden estar colocados alrededor de la célula (peritricos) o en los polos (polares o lofotricos). El tipo de localización de los flagelos se puede identificar estu-diando la forma del movimiento de la célula.
FIMBRIAS
Son pequeñas fibras de naturaleza proteica denominadas que se encuentran en la su-perficie de muchas especies de bacterias. (entre ellas muchas patógenas). Su número varía entre 100 y 1000 por bacteria y su tamaño entre 2 a 9 nm de diámetro y 1 a 5 µm
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de longitud. Estas estructuras son de gran importancia en la adhesión de la célula bacte-riana a las superficies que van a colonizar.
PELO F
Es un tipo especial de fimbria producido por bacterias capaces de transmitir su in-formación genética a otras mediante conjugación bacteriana. Cuando está presente hay sólo uno por célula. Su naturaleza es proteica. Su longitud llega a alcanzar las 10 µm.
PROLONGACIONES DE ADHESIÓN
Algunos tipos de microorganismos son portadores de prolongaciones con forma de ventosa que les permiten adherirse a las células animales que infectan. Esto ocurre, por ejemplo, en ciertos micoplasmas.
11.- MATERIAL DE RESERVA
Las bacterias acumulan materiales de reserva en forma de inclusiones de polihi-droxibutirato, polifosfato, gránulos de azufre, etc.
12.- ENDOSPORAS
Las endosporas (esporas) son formas de resistencia (a la temperatura, agentes quí-micos y físicos, desecación, etc.) que presentan algunas bacterias Gram-positivas (Baci-llus, Clostridium). La producción de una endospora por una bacteria es un proceso lento que requiere un tiempo considerable (horas). Se inicia como respuesta a condiciones ambientales adversas y culmina con la muerte de la célula madre de la endospora y la liberación de esta.
En las esporas el material citoplásmico se ha desecado al máximo y han acumulado ciertas moléculas (ácido dipicolínico) que les dotan de una gran termorresistencia. La pared celular de las esporas es de un tipo de peptidoglicano modificado.
La forma y posición de la endospora en la célula productora proporciona información sobre qué especie es. Por consiguiente, tiene valor taxonómico.
En general, puede decirse que las esporas son de forma esférica y suelen aparecer li-bres, aunque en ocasiones se pueden observar en el interior de las bacterias a las que deforman de una manera característica, lo que sirve para su identificación (Clostridium).
14.- ESTRUCTURA DE LOS VIRUS.
Los virus son un complejo grupo de estructuras que sólo desarrollan una actividad metabólica cuando se encuentran en el interior de una célula huésped. Por consiguiente, se trata de parásitos obligados que no tienen vida libre. Las partículas de virus libres metabólicamente inactivas se conocen como viriones.
Los virus están formados por una o varias moléculas de material genético (ADN o ARN, monocatenario o bicatenario) recubiertas de una capa de proteínas que forma la
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cápsida que, a su vez, puede estar recubierta por otras estructuras membranosas en cier-tos tipos de virus. La forma de los viriones viene determinada por la que adquiere la cápsida y, generalmente, adopta tres tipos: forma icosaédrica (por ejemplo, los adeno-virus), forma helicoidal (por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco) o alargada (por ejemplo, el virus Ébola). Dos excepciones a estas formas son algunos virus bacterianos (bacteriofagos) que tienen cápsulas complejas, y los rhabdovirus (virus de la rabia).
Algunos virus tienen unas estructuras en forma acicular denominadas peplómeros que les permiten adherirse a las células huésped que infectan.
15.- PRIONES
En ciertos tipos de enfermedades neurodegenerativas tales como el Alzehimer, Par-kinson, corea de Huntington y encefalopatías transmisibles tales la enfermedad de Creu-feldt-Jakob, el Insomnio Familiar Fatal, la encefalopatía bovina transmisible y el kuru) se observa la formación de depósitos de proteínas en el cerebro de los pacientes afecta-dos. Estos depósitos se conocen como amiloides34, y están formados por agregados de proteínas derivadas del tejido nervioso del paciente que se agregan por tener una estruc-tura terciaria (tridimensional) alterada (no nativa). Parece ser que la transición de la for-ma norfor-mal no ensamblable la proteína a la forfor-ma alterada patógena y ensamblable pare-ce estar provocada por la presencia de esta última que indupare-ce el cambio conformacional en las proteínas nativas.
Se denominan priones a estas proteínas infectivas producidas por un procesamiento anormal de algunas proteínas de la membrana de las células eucarióticas. Como conse-cuencia de dicho procesamiento anormal, los priones polimerizan en tejidos tales como el nervioso dando lugar a diferente patologías.
Existen varios tipos de priones cuya secuencia de aminoácidos no tiene relación entre sí. Es decir: lo característico del prión es que puede sufrir la alteración estructural para dar lugar al agregado amiloide, no la secuencia en sí del prión.
Un ejemplo de prión es la proteína PrP que en la forma nativa (PrPsen) no polimeriza y es sensible a proteasas y en la alterada (PrPres) polimeriza y es insensible. La presencia de PrPres induce el cambio de PrPsen a adoptar la forma PrPres y formar el amiloide. La proteína PrP es una glicoproteína de membrana codificada en nuestro cromosoma 20 y cuya función no está clara. La enfermedad de Creufeldt-Jakob es hereditaria y dominan-te, los afectados tienen una copia de los dos genes de PrP que codifica una forma varian-te en la que la substitución de un a minoácido da lugar al desarrollo de la enfermedad. La inyección de PrPres en animales sanos, también produce el desarrollo de la enferme-dad, a no ser que se trate de animales en los que se ha eliminado experimentalmente el gen PrP (ver los Postulados de Kock).
Inicialmente los priones eran considerados como virus de desarrollo extremadamente lento (lentivirus) puesto que las patologías que producían tardaban en manifestarse
3 Nature 437: 197-198
4 Existen algunas otras situaciones en las que se producen depósitos amiloides, tales como la formación
de fibrillas de β2-microglobulina en pacientes dializados. No jay que confundir esto con la patología
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chos años. En la actualidad, su naturaleza proteica está claramente aceptada por la co-munidad científica y deben ser estudiados independientemente de los virus.
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Tema 2.- Crecimiento y muerte de microorganismos. Concepto y expresión
matemáti-ca del crecimiento bacteriano. Concepto de muerte de un microorganismo. ¿Qué nece-sita un microorganismo para crecer?. Detección y medida del crecimiento. Ciclo de crecimiento de poblaciones. Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento. Multiplicación de los virus.
1.- CONCEPTO Y EXPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO BAC-TERIANO.
Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganis-mos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimicroorganis-mos al crecimiento de un único mi-croorganismo (ciclo celular) sino al demográfico de una población. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir tam-bién para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y será tratado al final de este capítulo.
Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria considerada de forma aislada. A lo largo del ciclo celular, tiene lugar la replicación del material de la bacteria, la síntesis de sus componentes celulares, el crecimiento para alcanzar un tama-ño doble del inicial y su división por bipartición de la bacteria para dar lugar a dos célu-las hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este.
El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos sus los individuos. Este crecimiento suele ser asincrónico puesto que cada microorga-nismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en una población se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN y elongándose, otras que están iniciando la división celular, etc.
En un crecimiento sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de man-tener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de bio-logía microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las pobla-ciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.
Las poblaciones de bacterias pueden crecer de una forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto nocivo (infecciones o intoxicaciones) de los microorganismos depende de su número en la ma-yoría de los casos, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir dichos efectos nocivos.
Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos la biomasa, número de células, cantidad de proteínas, de ADN, etc., evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicación en el laboratorio. Sin embargo, es útil porque permite estudiar el crecimiento microorganismos.
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Las bacterias crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el número de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de gene-ración (τ). De esta forma, podemos calcular el número de bacterias (N) al cabo de un número de generaciones (n) usando la ecuación siguiente:
N = N0 2n
siendo N0 el número de células en el momento actual. El número de generaciones se puede calcular de la siguiente forma:
n = t / τ donde t es el tiempo transcurrido.
Los tiempos de generación de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de τ de 20 min). Esto lleva a que una única célula (N0 = 1) cre-ciendo con un τ = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 células en 24 horas.
Si la bacteria crece en un medio líquido, las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente en la mayoría de los casos formando una sus-pensión de células libres.
Cuando una célula aislada comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula viva y aislada que se encuentra en un substrato y en condi-ciones ambientales adecuadas y produce una colonia en un breve lapso de tiempo. Una UFC también puede corresponder a más de una célula cuando éstas forman parte de grupos unidos fuertemente (estreptococos o diplococos, por ejemplo) ya que cada grupo formará una sola colonia.
Cuando algunos tipos de bacterias o de levaduras patógenas crecen sobre superficies forman biopelículas5 (biofilms) en los que las células se asocian entre sí mediante capas
de polisacáridos que forman una película que recubre la superficie sobre la que se en-cuentran las células. Los biofilms son importantes porque los microorganismos que los forman resultan más resistentes a antibióticos y al ataque de células del sistema inmune y, por consiguiente, las infecciones que producen son más difíciles de tratar. Además, dentro de los biofilms (que pueden estar formados por microorganismos de diferentes especies) se facilita la transferencia horizontal de genes entre lo que facilita la disper-sión de factores de virulencia6 o de resistencias a antibióticos7. La presencia de biopelí-culas es un problema serio en los implantes ortopédicos, catéteres, etc. El sarro de los dientes es un ejemplo de biofilm.
5 Cuando las bacterias crecen como unidades aisladas se habla de crecimiento planctónico para
diferen-ciarlo del crecimiento formando un biofilm
6 Se denominan factores de virulencia a las características de un microorganismo que le permiten causar
una enfermedad. Los factores pueden ser proteínas que faciliten el ataque al huésped, que permitan resis-tir la acción del sistema inmune, etc.
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La formación de biofilms es importante en la génesis de diferentes patologías. Se es-tán identificando genes que controlan el cambio de crecimiento libre (crecimiento planctónico) a crecimiento en forma de biofilm en distintos tipos de bacterias. Por ejemplo, se han identificado genes de este tipo en Pseudomnas aeruginosa que son res-ponsables del aumento de la cronicidad de las infecciones con este patógeno8. En otros microorganismos (tales como Streptococcus mutans) la formación de biofilms se ha asociado a la presencia de señales de quórum (ver el párrafo siguiente) de manera que bacterias competidoras de S. mutans son capaces de eliminr estas señales y reducir la formación de la biopelícula.
Algunas bacterias que comparten un mismo espacio físico pueden comunicase entre sí mediante lo que se denomina señales de quórum. Estas son moléculas simples excre-tadas por las células. Cuando el número de células aumenta, la concentración de la señal de quórum también lo hace. Las células tienen receptores para estas señales de quórum que reaccionan en función de la concentración de la señal. De esta forma, cuando la concentración de la señal de quórum es mayor, la respuesta es mayor. De esta forma, el comportamiento de una célula depende de que se encuentre sola o acompañada. Las señales de quórum pueden ser reconocidas por especies diferentes de las emisoras. También hay bacterias capaces de degradar las señales de quórum de otras especies para interferir su comunicación9. El estudio de las señales de quórum permite desarrollar productos que dificultan su formación. Por ejemplo, dentífricos con productos antica-rro10.
2.- CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO.
Desde el punto de vista microbiológico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. El fundamento de esta definición es que si un microorganismo ha perdido la capacidad de dividirse no podrá formar una colonia sobre un medio de cultivo y no será posible detectar su presencia por los métodos mi-crobiológicos tradicionales. Es decir: cuando no se produce aumento en el número de microorganismos no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca, por ejemplo, en liberación de toxinas.
Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las con-diciones físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.
3.- ¿QUÉ NECESITA UN MICROORGANISMO PARA CRECER?
8 J. Bacteriology 187: 1441-1454.
9 Por ejemplo, parece ser que Escherichia coli es capaz de interferir la señal de quórum que permite a la
bacteria patógena Vibrio cholerae calcular el tamaño de la población. Esto es importante porque cuando la población de V. Cholerae es grande, se inhibe la producción de la toxina colérica y el patógeno se desprende del intestino para buscar nuevos individuos que infectar. Por tanto, la acción de E. coli afecta la patogenicidad de V. Cholerae.
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El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El creci-miento explosivo de las bacterias produce un gran número a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de tiempo de incubación en las condiciones am-bientales adecuadas, se produce una colonia de individuos iguales.
Para crecer, un microorganismo necesita nutrientes que le aporten energía y elemen-tos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbo-no orgánico. Los microorganismos de importancia clínica son todos ellos heterotrofos.
La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente,
C4H7O2N
lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrede-dor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%) y debe estar disponible, normalmente, en forma de NH4 o de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; fósforo (3%) y debe estar en forma de PO43-, azufre que representa en torno al 1% y procede de aminoácidos sulfurados o de SO42-; y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.
La elaboración de medios de cultivo que permitan aislar microorganismos a fin de iniciar posteriores cultivos puro o axénicos requiere proporcionar los nutrientes antes citados y, en ciertos casos, algunos aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición quí-mica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.).
Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o bien sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmen-te agar).
En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferencia-les cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de mi-croorganismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caracte-rísticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia co-li), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microor-ganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño.
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4.- DETECCIÓN Y MEDIDA DEL CRECIMIENTO
Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los principales, se enumeran a continuación:
Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pe-queños de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la den-sidad de células sea del orden de 105 por ml.
Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspensión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensión y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parámetro de medida más fácil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de células debe ser del orden de 105 por ml.
Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número de viables contando el número de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una UFC. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadístico, es necesa-rio contar más de 300 UFC.
En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, éstos se pueden recolectar por filtración a través de una membrana (de 0.2 µm de tama-ño de poro) y posterior colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.
Medida del número de partículas usando contadores electrónicos de partículas. Es-tos sistemas no nos indican si las partículas corresponden a células vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamaño de las partículas.
Medida de parámetros bioquímicos tales como la cantidad de ADN, ARN, proteí-nas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen.
Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producen una disminución del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxígeno (utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción tales como el azul de metileno).
5.- CICLO DE CRECIMIENTO DE POBLACIONES.
En un cultivo bacteriano en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:
Fase lag o de adaptación: Durante la que los microorganismos adaptan su metabo-lismo a las nuevas condiciones ambientales (de abundancia de nutrientes) para poder iniciar el crecimiento exponencial.
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Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen los nutrien-tes del medio a velocidad máxima. La evolución del número de células durante esta fase se explica con el modelo matemático descrito anteriormente. Esta fase corresponde a la de infección y multiplicación dentro del organismo del agente infeccioso.
Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabo-lismo diferente al de la fase de exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia en el curso de las infecciones o intoxicaciones producidas por bacterias.
Los microorganismos entran en fase estacionaria bien porque se agota algún nutrien-te esencial del medio, porque los productos de desecho que han liberado durannutrien-te la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento mi-crobiano o por la presencia de competidores u otras células que limiten su crecimiento.
La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en muchos ambientes naturales.
Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del culti-vo.
Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los medios líquidos se presentan también en los sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, sólo se puede seguir utilizando unos sistemas de detección especiales siendo el más sencillo, la medida del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa.
6.- FACTORES FÍSICOS Y QUÍMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIEN-TO.
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Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecua-da. Si consideramos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la tempe-ratura de cultivo, podemos observar una tempetempe-ratura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la veloci-dad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. Por encima de esta temperatura óptima, la ve-locidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.
El aumento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se de-nomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bio-químicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar.
La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a la reducción de la velocidad de las reacciones bioquímicas y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celu-lar que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.
La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es lento y las células paran de crecer; aunque suelen morir. Sin embargo, cuando la tempe-ratura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío.
Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimien-to mínima, máxima y óptima.
Tipo de microorganismo Temperatura mínima Temperatura óptima Temperatura máxima Psicrófilo -5 +5 12 - 15 15 - 20 Psicrótrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35 Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47 Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90
Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Esto es importan-te desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimen-tos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir infec-ciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC).
Desde el punto de vista clínico, los microorganismos capaces de producir infecciones en pacientes son los mesófilos y algunos psicrótrofos ya que sus temperaturas óptimas de crecimiento coinciden con las corporales.
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Actividad de agua (aw): Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión
de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relati-va (HR).
El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de agua mucho menor que en el primero. conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua.
El agua es un substrato en muchas reacciones bioquímicas (proteasas y lipasas, por ejemplo). Cuando no hay agua disponible, estas reacciones se detienen y el metabolis-mo se para. Esta falta de agua también detiene muchas de las enzimas que podrían de-gradar las estructuras biológicas. Por ello, las células que no crecen por falta de agua no mueren rápidamente: los sistemas de degradación tampoco funcionan y no las degradan. Es decir: cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condi-ciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada.
La gran mayoría de los microorganismos requiere valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. Los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de mi-croorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw>0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw>0.80. Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con actividad de agua menor (más secos) de la que per-mite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir la co-lonización de substratos con baja actividad de agua (por ejemplo, alimentos como el queso o almíbares o la piel) por mohos (hongos filamentosos) mejor que por bacterias.
En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que
pue-den crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.
La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene im-portancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.
pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este rango muere.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6,0 a 8,0.
