INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO FDI PT-10

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(1)UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA. INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO FDI PT-10 Evaluación y desarrollo de estrategias de control microbiológico para reducir los niveles de mortalidad en el cultivo del ostión del Norte Argopecten purpuratus. ELABORADO POR: DR. CLAUDIO D. MIRANDA MSc RODRIGO ROJAS A.. Enero 2004.

(2) RESUMEN EJECUTIVO. El presente informe presenta los resultados obtenidos durante el período Julio-Diciembre del año 2003, en que se realizaron bioensayos con larvas del ostión del Norte, Argopecten purpuratus, para determinar las capacidades patogénicas de algunas cepas bacterianas aisladas de los centros de cultivo analizados sospechosas de ser causantes de mortalidades larvales, y para determinar el efecto del uso de algunos agentes antimicrobianos de uso habitual en maricultura sobre la carga bacteriana y actividad larval. Además, en este período se realizaron actividades de difusión y transferencia tecnológica de los resultados obtenidos en el presente proyecto, tales como seminarios de presentación y discusión de resultados tanto a las empresas participantes en el proyecto como a otras empresas e instituciones relacionadas con el tema; elaboración de un manual de manejo sanitario en el cultivo, y un curso de capacitación a profesionales que trabajan en los centros de cultivo.. Se determinó una alta incidencia de bacterias con actividad patogénica sobre larvas del ostión asociadas a muestras de larvas de fondo, observándose un predominio importante de cepas pertenecientes a la especie Vibrio tubiashii. la actividad patogénica se evidenció preferentemente mediante la ocurrencia de distensión y/o destrucción del velo, desprendimiento de células ciliadas, aglutinación larval, y aparición de conchas vacías. La mayoría de las cepas patogénicas presentaron una alta susceptibilidad a los agentes antimicrobianos de uso frecuente en el cultivo de moluscos. Los tratamientos con los antimicrobianos oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimetoprim no redujeron significativamente la concentración viable de bacterias totales y Vibrio spp. presente en larvas de ostión, y se observó que sólo el antibiótico flumequina presenta un marcado efecto inhibitorio sobre la actividad larval.. Las actividades de difusión y transferencia tecnológica evidenciaron el gran interés e importancia que este sector le atribuye al manejo microbiológico para asegurar el éxito del cultivo del ostión del Norte, principalmente en su fase larval.. 1.

(3) MATERIALES Y MÉTODOS I. Actividades de Bioensayos con Larvas de Moluscos I.1 Bioensayos de Patogenicidad en Larvas de Moluscos Se ensayaron 40 cepas bacterianas predominantes aisladas desde diversas muestras de los centros de cultivo de ostión del Norte, Pesquera Camanchaca (15 cepas), Cultivos Marinos Internacionales (12 cepas) y Pesquera San José (13 cepas).. El cultivo exponencial (16-24 h de crecimiento), de la bacteria a ensayar se resuspendió en 10 mL de agua de mar microfiltrada y se inoculó aproximadamente 1 mL de esta suspensión en una concentración aproximada de 1 x 108 UFC/mL, a matraces con 200 mL de un cultivo larval de Argopecten purpuratus de 6-7 días por triplicado, en una concentración de 15-20 larvas por mL. De acuerdo a lo anterior los matraces con el cultivo larval contenían una concentración bacteriana final de 106 cel/mL. Además, se prepararon 3 matraces con el cultivo larval de A. purpuratus sin inoculación bacteriana para ser utilizados como controles. Los matraces se incubaron a 18ºC por 24 h y se evaluó el comportamiento larval a las 6, 12, 18 y 24 h, utilizando un microscopio óptico. Además, se recolectaron muestras de larvas a las 6, 12 y 24 horas para su procesamiento para análisis por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).. Se observó la población larval, utilizando magnificaciones de 0,8 y 1,2x, mientras que la conducta larval, alteraciones físicas y porcentajes de mortalidad se observaron utilizando magnificaciones de 20x y 40x. Además, se registró la presencia de cualquier síntoma patológico asociado al cuadro infeccioso, como desprendimiento del velo, aglutinación, necrosis larval y otros (Lodeiros et al., 1987; Sainz et al., 1998). Las muestras de larvas de ostión fueron fijadas con glutaraldehido al 2% y deshidratadas en concentraciones crecientes de etanol hasta 95%, luego fueron secadas en un aparato de punto crítico con CO2 líquido como medio intermediario, posteriormente las muestras se montaron en portamuestras de bronce con scotch doble y fueron cubiertas con oro en una sombreadora. Las muestras fueron analizadas al Microscopio Electrónico de Barrido y se fotografiaron. 2.

(4) La observación de procesos de necrosis larval se observaron tiñendo las muestras con una solución al 1% de azul de tripano (Sigma). Esta tinción permite diferenciar tejidos en proceso de necrotización y facilita la detección de anormalidades a este nivel.. I.2 Bioensayos para Evaluar el Efecto de Antibacterianos en Larvas de Moluscos. En esta actividad se determinó el efecto de los antibacterianos oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimethoprim sobre el cultivo larval del ostión del Norte. Se prepararon soluciones de cada antibacteriano en agua destilada y se inocularon, a estanques con 10 L de un cultivo larval de Argopecten purpuratus de 7 días en una concentración de 12 larvas por mL, para obtener una concentración final de 4 mg/L del antibacteriano. Además, se prepararon 3 estanques con el cultivo larval de A. purpuratus sin inoculación del agente antimicrobiano para ser utilizados como controles.. Los estanques se incubaron a 18ºC por 24 horas y se evaluó el comportamiento larval a las 0, 1, 3, 6 y 24 horas, utilizando un microscopio óptico. Se observó la población larval, utilizando magnificaciones de 40 y 100x, mientras que la conducta larval, alteraciones físicas y falta de movilidad se observó utilizando magnificaciones de 20x y 40x. Además, se determinaron las concentraciones viables de bacterias heterótrofas y Vibrio spp. presentes en larvas y agua del cultivo mediante la utilización de agar recuento en placa (Difco) y agar TCBS (Difco), respectivamente.. 3.

(5) RESULTADOS I. Actividades de Bioensayos con Larvas de Moluscos I.1 Bioensayos para Evaluar el Efecto de Antibacterianos en Larvas de Moluscos. La realización de bioensayos de patogenicidad en larvas de ostión de 40 cepas bacterianas aisladas de los centros de cultivo analizados permitió detectar una capacidad patogénica en un número significativo de cepas, especialmente aquellas provenientes de los centros de cultivo de las empresas Pesquera Camanchaca y Cultivos Marinos Internacionales (8 y 7 cepas, respectivamente) (Tabla 1-2), mientras que sólo 4 de las cepas aisladas de Pesquera San José presentaron actividad patogénica sobre el cultivo larval (Tabla 3).. Como se observa en la Tabla 4, la mayoría de las cepas bacterianas que presentaron actividad patogénica sobre el cultivo larval pertenecieron al género Vibrio (12 cepas), y la mayoría de estas cepas fueron identificadas como V. tubiashii. Lo anterior es particularmente importante para el centro de cultivo de Pesquera San José, ya que todas las cepas patogénicas detectadas fueron identificadas como V. tubiashii (Tabla 4).. Los ensayos de patogenicidad evidenciaron la aparición de diversos signos clínicos de patogenicidad producidos por estas cepas bacterianas, los que fueron claramente visibles sólo a las 24 horas de haber sido infectado el cultivo larval. Como se observa en la Figura 1, los cultivos larvales mostraron síntomas clínicos como distensión y destrucción del velo, desprendimiento de células ciliadas, aglutinación larval y aparición de conchas vacías. Además, varias cepas presentaron la capacidad para producir cuadros patológicos caracterizados por la aparición simultánea de varios de estos síntomas clínicos (Tabla 4).. 4.

(6) Tabla 1. Actividad Patogénica de Cepas Bacterianas Aisladas del Centro de Cultivo Compañía Pesquera Camanchaca. CEPA ESPECIE. ORIGEN. ACTIVIDAD PATOGÉNICA. A066 Vibrio harveyi. Larva de fondo de estanque. + (DV, CV). A072 Psychrobacter immobilis. Afluente del hatchery. -. A080 No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. A081 Vibrio splendidus. Larva de fondo de estanque. -. A085 No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. A097 Vibrio splendidus. Larva nadante. + (NA). A103 Burkholderia glumae. Efluente del hatchery. + (NA). A116 Vibrio tubiashii. Larva nadante. + (NA). A117 Aeromonas veronii. Larva nadante. + (NA). A153 Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. + (DV, A, CV). A159 Aeromonas veronii. Agua del Estanque de cultivo. -. A162 Chromobacterium violaceum. Larva de fondo de estanque. -. A163 Vibrio tubiashii. Larva nadante. -. A184 Brevundimonas vesicularis. Larva de fondo de estanque. + (NA). A192 Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. + (DV, A, NA, CV). DV: Desprendimiento del Velo; A: Aglutinamiento; NA: Nado Anormal; CV: Conchas Vacías. 5.

(7) Tabla 2. Actividad Patogénica de Cepas Bacterianas Aisladas del Centro de Cultivo Cultivos Marinos Internacionales. CEPA. ESPECIE. ORIGEN. ACTIVIDAD PATOGÉNICA. I043. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. + (DV, NA). I044. No Identificada. Larva de fondo de estanque. + (NA). I045. Vibrio mediterranei. Larva de fondo de estanque. + (NA). I057. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. + (DV, NA, CV). I076. Aeromonas veronii. Larva de fondo de estanque. -. I078. No Identificada. Larva nadante. + (DV, NA, CV). I080. No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. I138. Aeromonas caviae. Larva nadante. + (DV, A, NA, CV). I143. Aeromonas veronii. Larva de fondo de estanque. -. I144. No Identificada. Larva de fondo de estanque. + (NA). I159. Photobacterium leiognathi. Larva de fondo de estanque. -. I160. Vibrio sp.. Larva de fondo de estanque. -. DV: Desprendimiento del Velo; A: Aglutinamiento; NA: Nado Anormal; CV: Conchas Vacías. 6.

(8) Tabla 3. Actividad Patogénica de Cepas Bacterianas Aisladas de Centro de Cultivo Pesquera San José. CEPA. ESPECIE. ORIGEN. ACTIVIDAD PATOGÉNICA. SJ004. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. + (NA). SJ040. No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. SJ042. Vibrio campbelli. Larva de fondo de estanque. -. SJ060. Vibrio tubiashii. Larva nadante. + (NA). SJ063. No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. SJ075. Aeromonas schubertii. Larva nadante. -. SJ082. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. + (NA). SJ097. Vibrio sp.. Larva de fondo de estanque. -. SJ105. No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. SJ125. Vibrio tubiashii. Larva nadante. + (DV, NA, CV). SJ156. Vibrio splendidus. Larva de fondo de estanque. -. SJ181. Brevundimonas vesicularis. Ejemplar Adulto. -. SJ186. No Identificada. Larva de fondo de estanque. -. DV: Desprendimiento del Velo; A: Aglutinamiento; NA: Nado Anormal; CV: Conchas Vacías. 7.

(9) Tabla 4. Cepas Bacterianas Patógenas de Larvas de Ostión.. CEPA. ESPECIE. ORIGEN. EMPRESA. A066. Vibrio harveyi. Larva de fondo de estanque. Pesquera Camanchaca. A097. Vibrio splendidus. Larva nadante. Pesquera Camanchaca. A103. Burkholderia glumae. Efluente del hatchery. Pesquera Camanchaca. A116. Vibrio tubiashii. Larva nadante. Pesquera Camanchaca. A117. Aeromonas veronii. Larva nadante. Pesquera Camanchaca. A153. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. Pesquera Camanchaca. A184. Brevundimonas vesicularis. Larva de fondo de estanque. Pesquera Camanchaca. A192. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. Pesquera Camanchaca. I043. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. Cultivos Marinos Intern.. I044. No Identificada. Larva de fondo de estanque. Cultivos Marinos Intern.. I045. Vibrio mediterranei. Larva de fondo de estanque. Cultivos Marinos Intern.. I057. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. Cultivos Marinos Intern.. I078. No Identificada. Larva nadante. Cultivos Marinos Intern.. I138. Aeromonas caviae. Larva nadante. Cultivos Marinos Intern.. I144. No Identificada. Larva de fondo de estanque. Cultivos Marinos Intern.. SJ004. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. Pesquera San José. SJ060. Vibrio tubiashii. Larva nadante. Pesquera San José. SJ082. Vibrio tubiashii. Larva de fondo de estanque. Pesquera San José. SJ125. Vibrio tubiashii. Larva nadante. Pesquera San José. 8.

(10) La observación al Microscopio Electrónico de Barrido (MEB), de muestras de larvas de ostión infectadas con algunas cepas bacterianas patogénicas permitió observar en mayor detalle el proceso de infección bacteriana. Como se observa en la Fig. 2, la cepa A192 de V. tubiashii, aislada del centro de cultivo de Pesquera Camanchaca, presenta una gran capacidad de colonización de la superficie larval, mientras que las larvas infectadas con la cepa I138 de Aeromonas caviae, aislada de Cultivos Marinos Internacionales, presentaron una gran incidencia de desprendimiento del velo (Fig. 3).. La Fig. 4 muestra la glándula digestiva fuera de la larva casi completamente colonizada por la cepa no identificada I78 aislada de Cultivos Marinos Internacionales, mientras que la Fig. 5 evidencia el proceso de aglutinación larval, producido por la cepa de V. tubiashii, aislada de Pesquera San José.. Por otra parte, la utilización de la tinción azul de tripano demostró ser de gran utilidad para la identificación clara de larvas enfermas que presenten algún daño tisular, observándose una tinción diferencial de larvas con tejido necrotizado o conchas vacías (Fig. 6). La tinción con azul de tripano de cultivos larvales saludables no evidenció diferencias con las muestras no teñidas (Fig. 7). Sin embargo, la comparación de cultivos larvales teñidos y sin teñir infectados con una cepa patogénica demostró una significativa diferencia en la detección de anormalidades en la larva, como se evidencia en la Fig. 8.. 9.

(11) Velo Distendido. Velo Distendido. Velo Destruído. Conchas Vacías. Larvas Aglutinadas. Células Ciliadas Desprendidas. Figura 1. Sintomatología principal de actividad patogénica de bacterias ensayadas sobre el cultivo larval del ostión del Norte, Argopecten purpuratus.. 10.

(12) A. B. C. Figura 2. Larva infectada con cepa bacteriana A192 de Vibrio tubiashii procedente de Pesquera Camanchaca, al cabo de 24 horas de incubación. A: 1.000×; B: 5.000×; C: 7.500×.. 11.

(13) A. B. C. Figura 3. Larvas infectadas con cepa I138 de Aeromonas caviae procedente de Cultivos Marinos Internacionales, al cabo de 24 horas de incubación. Se observa la ocurrencia de larvas con el velo desprendido. A: 750×; B: 3.500×; C: Detalle de los cilios desprendidos (7.500×).. 12.

(14) A. B C. C. Figura 4. Larvas infectadas con cepa bacteriana no identificada I78, procedente de Cultivos Marinos Internacionales, al cabo de 24 horas de incubación. A: Glándula digestiva fuera de la larva (750×); B: Bacterias en glándula digestiva (5.000×); C: Película bacteriana sobre la larva (1.000×) 13.

(15) A. B. Figura 5. Larvas infectadas con la cepa SJ04 de Vibrio tubiashii, procedente de Pesquera San José, después de 24 h de incubación. A: Larvas aglutinadas (750×); B: Margen de la concha de la larva con una masa de materia orgánica con bacterias (5.000×).. 14.

(16) Larvas Muertas. Figura 6. Muestra de larvas de ostión del Norte, Argopecten purpuratus infectadas por 24 horas con la cepa A192 de Vibrio tubiashii teñidas con azul de tripano (Merck).. 15.

(17) A. B. Figura 7. Muestra de larvas de ostión no infectadas con bacterias. A: Muestra sin tinción, B: Muestra con tinción azul de tripano (Merck).. A. B. Figura 8. Muestra de larvas de ostión infectadas por 24 horas con la cepa I 138 de Aeromonas caviae, evidenciando una distensión del velo. A: Muestra sin tinción, B: Muestra con tinción azul de tripano (Merck).. 16.

(18) La Tabla 5 muestra los perfiles de susceptibilidad de las cepas patogénicas, determinadas de acuerdo a lo descrito en el Segundo Informe Técnico. En esta Tabla se evidencia que la mayoría de las cepas bacterianas con capacidades patogénicas para el cultivo larval del ostión, presenta susceptibilidad a la mayoría de los agentes antimicrobianos utilizados frecuentemente en el cultivo larval de moluscos en Chile, con la excepción del aminoglicósido estreptomicina, ya que sólo 3 cepas mostraron susceptibilidad a este antibiótico. Por otra parte, sólo 4 cepas exhibieron resistencia a la mezcla de los antibacterianos sulfametoxazol y trimethoprim, lo cual es esperable considerando que la mayoría de los centros de cultivo de moluscos utiliza la mezcla sulfadoxina y trimethoprim (DitralMR) en alguna fase del cultivo del ostión.. Otros antibacterianos, de creciente utilización en esta industria, como amoxicilina, florfenicol y flumequina evidenciaron una eficiencia del 100% sobre las cepas bacterianas patogénicas ensayadas (Tabla 5).. 17.

(19) Tabla 5. Perfil de Susceptibilidad a Agentes Antimicrobianos de las Cepas Patogénicas Aisladas de los Centros de Cultivo.. CEPA. AGENTE ANTIMICROBIANO* AML. S. CM. FFC. OT. OA. UB. SXT. A066. S. R. S. S. S. S. S. S. A097. S. I. S. S. S. S. S. R. A103. S. S. S. S. S. S. S. S. A116. S. R. S. S. R. S. S. S. A117. S. R. S. S. S. S. S. R. A153. S. R. S. S. S. S. S. S. A184. S. R. S. S. S. S. S. R. A192. S. R. S. S. S. S. S. S. I043. S. R. S. S. S. S. S. S. I044. S. R. S. S. S. S. S. S. I045. S. R. S. S. S. S. S. S. I057. S. R. S. S. S. S. S. S. I078. S. R. S. S. S. S. S. R. I138. S. R. S. S. S. S. S. S. I144. S. S. S. S. S. S. S. S. SJ004. S. R. S. S. S. S. S. S. SJ060. S. R. S. S. S. S. S. S. SJ082. S. R. S. S. S. S. S. S. SJ125. S. R. S. S. S. S. I. S. *AML: Amoxicilina; S: Estreptomicina; CM: Cloranfenicol; FFC: Florfenicol; OT: Oxitetraciclina; OA: Acido Oxolínico; UB: Flumequina; SXT: Sulfametoxazol Trimethoprim. 18.

(20) I.2 Bioensayos para Evaluar el Efecto de Antibacterianos en Larvas de Moluscos. La realización de bioensayos utilizando larvas de ostión para determinar el efecto del uso de 4 agentes antimicrobianos de uso frecuente en el cultivo de moluscos en Chile, como oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimethoprim sobre el contenido de bacterias totales y Vibrio spp. presente en las larvas ensayadas, evidenció que la administración de estos compuestos no contribuye a una disminución significativa en la carga bacteriana presente en las larvas, observándose que a las 24 horas la concentración de bacterias heterótrofas y Vibrio spp. en las larvas tratadas eran muy similares a aquellas presentes en los cultivos larvales no tratados (Tablas 6-7). Solo se observaron reducciones significativas en las concentraciones de Vibrio spp. presentes en las larvas tratadas con florfenicol y sulfadoxina trimethoprim al cabo de 3 horas de aplicado el tratamiento, pero a las 24 horas estos grupos de larvas presentaron niveles de vibrios muy similares al control (Tabla 7).. Por otra parte, la determinación de los niveles de bacterias heterótrofas totales presentes en el agua de los cultivos larvales control y tratados con los antibacterianos evidenció resultados similares a los observados en los análisis larvales (Tabla 8). La determinación de los niveles de vibrios en el agua de los cultivos larvales demostró diferencias importantes en relación a lo observado con las bacterias heterótrofas, puesto que a las 6 horas de aplicado el tratamiento con florfenicol y sulfadoxina trimethoprim no se detectó la presencia de Vibrio spp. en el agua, aunque a las 24 horas se pudieron detectar niveles de 2,30×102 y 1,75×102 UFC/mL, respectivamente, siendo estos niveles menores en 2 log a los observados en el control (Tabla 9).. 19.

(21) Tabla 6. Concentración viable de bacterias heterótrofas en larvas de ostión tratadas con antimicrobianos.. Agente Antimicrobiano. UFC de heterótrofos/g de larva Período de Incubación (horas) 0. 1. 3. 6. 24. Control. 2,17×107. 3,79×106. 8,12×106. 5,82×107. 1,83×107. Sulfadoxina + trimethoprim. 2,17×107. 5,31×106. 9,51×106. 2,02×107. 2,96×107. Flumequina. 2,17×107. 6,57×106. 8,90×106. 7,08×107. 3,86×107. Florfenicol. 2,17×107. 6,46×106. 1,23×107. 2,27×107. 9,79×106. Oxitetraciclina. 2,17×107. 1,07×107. 1,26×107. 1,15×107. 1,57×107. Tabla 7. Concentración viable de Vibrio spp. en larvas de ostión tratadas con antimicrobianos.. Agente Antimicrobiano. UFC de Vibrio spp./g de larva Período de Incubación (horas) 0. 1. 3. 6. 24. Control. 1,09×104. 1,10×103. 3,72×105. 4,78×105. 1,32×106. Sulfadoxina + trimethoprim. 1,09×104. 6,21×103. 0. 0. 1,07×105. Flumequina. 1,09×104. 1,70×104. 1,16×105. 3,18×105. 4,41×105. Florfenicol. 1,09×104. 0. 0. 3,23×103. 1,41×105. Oxitetraciclina. 1,09×104. 3,60×104. 1,07×105. 9,41×104. 4,78×106. 20.

(22) Tabla 8. Concentración viable de bacterias heterótrofas en agua del cultivo larval de ostión tratado con antimicrobianos.. Agente Antimicrobiano. UFC de heterótrofos/mL Período de Incubación (horas) 0. 1. 3. 6. 24. Control. 6,04×104. 5,70×103. 3,07×104. 7,89×104. 1,80×105. Sulfadoxina + trimethoprim. 6,04×104. 2,10×103. 1,51×104. 8,07×104. 6,42×104. Flumequina. 6,04×104. 8,00×102. 2,53×103. 1,90×104. 2,42×105. Florfenicol. 6,04×104. 2,22×103. 1,72×104. 1,56×105. 2,92×105. Oxitetraciclina. 6,04×104. 1,53×103. 2,01×104. 6,14×103. 9,19×104. Tabla 9. Concentración viable de Vibrio spp. en agua del cultivo larval de ostión tratado con antimicrobianos.. Agente Antimicrobiano. UFC de Vibrio spp./mL Período de Incubación (horas) 0. 1. 3. 6. 24. Control. 2,15×101. 0. 3,65×102. 9,10×103. 2,99×104. Sulfadoxina + trimethoprim. 2,15×101. 0. 0. 0. 1,75×102. Flumequina. 2,15×101. 0. 6,00×101. 3,82×103. 1,69×105. Florfenicol. 2,15×101. 0. 0. 0. 2,30×102. Oxitetraciclina. 2,15×101. 4,67×102. 0. 2,20×103. 6,03×103. 21.

(23) El análisis del efecto de la administración diaria de los antibacterianos oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimethoprim sobre el crecimiento larval evidenció que sólo el antibiótico flumequina produce una detención del crecimiento larval, la que ocurre alrededor de un tamaño de 130 micrones (Fig. 9), en contraposición a los otros antibacterianos, los que no produjeron un efecto inhibitorio en el crecimiento larval (Fig. 10).. La determinación del efecto de los antibacterianos oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimethoprim sobre el comportamiento larval así como la aparición de potenciales alteraciones físicas en el cultivo larval, demostró que sólo la flumequina produjo un efecto muy notorio de hiperactividad larval, en que las larvas tratadas presentaron un movimiento errático y acelerado en comparación al control (Tabla 10).. 22.

(24) Longitud de la concha (µm). 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 0. 3. 6. 9. 12. 15. Día de cultivo Control. Flumequina. Figura 9. Crecimiento larval de un cultivo no tratado (control) y tratado con. Longitud de la concha (µm). flumequina (4 µg/mL) en estanques de 5.000 L.. 170 150 130 110 90 70 0. 3. 6. 9. 12. 15. Día de cultivo Control. Florfenicol. Figura 10. Crecimiento larval de un cultivo no tratado (control) y tratado con florfenicol (4 µg/mL) en estanques de 5.000 L.. 23.

(25) Tabla 10. Efecto de los Agentes Antimicrobianos sobre la Actividad Larval.. Agente Antimicrobiano. Conducta. Control. Actividad larval normal. Sulfadoxina + trimethoprim. Levemente mas activas que el control. Flumequina. Hiperactividad larval. Florfenicol. Actividad larval normal. Oxitetraciclina. Levemente mas activas que el control. 24.

(26) II. Actividades de Transferencia Tecnológica II.1 Seminario de Presentación de Resultados a las Empresas Participantes. Se expusieron los resultados finales del proyecto a los gerentes de hatchery y otros profesionales pertenecientes a las empresas participantes en el proyecto, Pesquera Camanchaca, Cultivos Marinos Internacionales y Pesquera San José, en el salón de conferencias de la empresa Cultivos Marinos Internacionales en Caldera, el 17 de Octubre del 2003.. II.2 Elaboración de un Manual de Higiene. Se elaboró un Manual de Higiene del Cultivo de Moluscos, donde se describen las técnicas microbiológicas principales para monitorear y mantener los niveles microbianos aceptables en el cultivo de moluscos. Además, en el referido Manual se describen los parámetros bacterianos recomendados para mantener una buena calidad sanitaria en el cultivo, así como las estrategias recomendadas para un buen manejo sanitario del cultivo. El referido Manual de Higiene se adjunta al presente Informe Técnico.. II.3 Realización de un Curso de Capacitación a personal que labora en los centros de cultivo de moluscos. Se impartió el Curso de Capacitación Teórico-Práctico “Adiestramiento en el Manejo Sanitario del Cultivo Controlado de Moluscos”, a profesionales que se desempeñan en centros de cultivo de moluscos (Tabla 11), durante el período 12-15 de Enero del 2004, y cuyo programa se describe Anexo Formularios. Cabe hacer notar que aunque este Curso de Capacitación estaba propuesto sólo para profesionales de las 3 empresas participantes en el proyecto, se aceptó la participación de profesionales de otras empresas debido al alto interés exhibido en asistir al referido Curso, como se evidencia en la Lista de Asistencia (Anexo Formularios).. 25.

(27) Para poder evaluar el impacto del Curso de Capacitación se elaboró una encuesta de opinión (Anexo Formularios), la que se entregó a los participantes al final del Curso. Esta encuesta permitió dimensionar el grado de importancia que el personal profesional que labora en el centro de cultivo le asigna a la calidad sanitaria del cultivo larval del ostión del Norte para el éxito del proceso productivo (Fig. 11). Asimismo, esta encuesta permitió evidenciar el grado de interés que existe por implementar un laboratorio básico de microbiología en la mayoría de los centros de cultivo de moluscos, lo que fortalecería un buen monitoreo y control sanitario del cultivo, propiciando una disminución significativa en los niveles de mortalidad larval.. 26.

(28) Tabla 11. Listado de Participantes en el Curso de Capacitación. NOMBRE. EMPRESA. Alcayaga B., Pedro. Cultivos Marinos Internacionales S.A. (Caldera). Barraza B., Lorena. Pesquera San José S.A.. Contreras S., Adriel. Pesquera El Golfo S.A.. Cortez T., Segundo. Invertec Ostimar S.A.. García C., Nelson. Pesquera San José S.A.. González A., Carlos. Compañía Pesquera Camanchaca S.A.. Marín B., Yerko. Cultivos Marinos Internacionales S.A. (Guanaqueros). Ramos M., Paulina. Hidrocultivos S.A.. Sanhueza, Jorge. Inversiones Loanco S.A.. Solari C., Claudio. Compañía Pesquera Camanchaca S.A.. Valderrama O., Sergio. Cultivos Marinos Internacionales S.A. (Caldera). Yapur P., Paola. Cultivos Marinos Internacionales S.A. (Caldera). Total de Participantes. 12. 27.

(29) A. B 0%. 17%. 0%. 25%. 75%. 83%. A lta. Media. Baja. S/Op. Alta. Media. Baja. C. S/Op. D 8%. 0%. 0%. 42% 33%. 59%. Alta. Media. Baja. 58%. Alta. S/Op. 0%. Media. Baja. S/Op. E. 8%. 17%. 75%. Mu y p r o b a b le Po c o p r o b a le. Me d ia n a ma n te p r o b a b le S /O p. Figura 11. Resultados de la encuesta realizada al término del curso de capacitación. A: Importancia asignada al manejo microbiológico en su centro de cultivo de moluscos B: Relevancia que asigna a lo aprendido en el curso para su actividad productiva C: Aprendizaje de nuevas metodologías de manejo sanitario en el curso de capacitación D: Factibilidad de implementar en su centro algunas de las metodologías aprendidas E: Logro de mayor rendimiento en la producción de su cultivo al implementar las estrategias de manejo sanitario propuestas en el curso de capacitación 28.

(30) II.4 Seminario de Divulgación de Resultados a Empresas de Cultivo de Moluscos no Participantes en el Proyecto. Se desarrolló un Seminario de Difusión de los resultados obtenidos en el presente proyecto en el salón auditorio Shizou Akaboshi de la Facultad de Ciencias del Mar de la Universidad Católica del Norte, sede Coquimbo el 16 de Enero del 2004, en el cual el Dr. Claudio D. Miranda, Director del Proyecto FDI – CORFO PT-10, expuso los resultados obtenidos en el referido proyecto y se discutieron las implicaciones de la información generada y su consecuente aplicabilidad en otros centros de cultivo de moluscos no insertos en el proyecto.. En esta actividad se discutieron los parámetros de calidad sanitaria propuestos por los ejecutores del proyecto, así como las recomendaciones sugeridas para asegurar una buena condición sanitaria en el cultivo. Una de las conclusiones de mayor importancia que se establecieron en el seminario corresponde a la importancia de las condiciones microbiológicas en el cultivo larval del ostión del Norte para la obtención de niveles menores de mortalidad larval.. Durante esta actividad, además, se entregaron 27 copias del Manual de Higiene a las empresas participantes en esta actividad (Tabla 12).. 29.

(31) Tabla 12. Listado de Empresas de Cultivo de Moluscos Representados en el Seminario de Difusión de Resultados del Proyecto FDI – CORFO PT-10 y Receptores del Manual de Higiene. EMPRESA O INSTITUCIÓN. COPIAS ENTREGADAS. Asociación de Productores de Ostras y Ostiones de Chile. 2. Bahía Tongoy S.A.. 1. CORFO IV Región. 1. Compañía Pesquera Camanchaca S.A.. 3. Cultivos Carrizal Ltda.. 1. Cultivos Marinos Internacionales S.A.. 5. Hidrocultivos S.A.. 2. Inversiones Loando S.A.. 1. Invertec Ostimar S.A.. 1. Minera Chañar Blanco S.A.. 1. Ostramar S.A.. 1. Pescamar Ltda.. 1. Pesquera San José S.A.. 4. Sernapesca IV Región (2). 2. Universidad Católica del Norte. 1. Total de Copias del Manual de Higiene Entregadas. 27. 30.

(32) DISCUSIÓN La identificación de las cepas bacterianas con actividad patogénica así como la sintomatología observada en las larvas infectadas confirma el rol de patógenos secundarios de estos microorganismos. La alta incidencia de cepas pertenecientes a la especie Vibrio tubiashii, de reconocida capacidad como patógeno de moluscos (Hada et al., 1984), y cuyo nombre fué asignado en consideración al investigador que describió la necrosis bacilar en moluscos Tubiash et al., 1965; Tubiash et al., 1970), plantea la necesidad de considerar su monitoreo periódico en el cultivo larval del ostión del Norte. Una alternativa para implementar un sistema de identificación simple y rápido, capaz de ser realizado en el centro de cultivo, debería considerar la realización de las pruebas bioquímicas tales como fermentación de glucosa, susceptibilidad a O-129 (10 y 150 µg), producción de oxidasa e indol, y producción de arginina, lisina y ornitina descarboxilasa, de acuerdo a lo propuesto por Alsina & Blanch (1994a; 1994b). Otro aspecto importante a considerar se refiere a la necesidad de monitorear periódicamente el estado de salud larval, de manera de impedir el desarrollo de estos procesos patológico. Para ello se recomienda la utilización del colorante vital azul de tripano.. La realización de bioensayos con larvas de ostión tratadas con los antibacterianos oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimethoprim evidenció que la flumequina produce un efecto de hiperactividad larval, lo que sugiere que el uso de quinolonas en el cultivo larval no es adecuado por períodos largos y cercanos a ciertos tamaños en que las larvas requieren mayor energía para ciertos procesos, como formación del umbo. Además, el análisis de la carga bacteriana de las larvas tratadas con estos agentes no evidenció diferencia importantes en comparación a las larvas no tratadas, lo cual ha sido una tendencia recurrente en otras investigaciones realizadas por estos investigadores, lo que hace presumir que la adición de los antibacterianos en el estanque no es una buena forma de administrar el antibacteriano, pero ello se realizó de esa manera debido a que todos los centros de cultivo de moluscos que administran antibacterianos lo hacen de esa manera, y es por ello que se recomienda, a pesar de ser mas dificultosos, el uso de terapias mediante baños larvales.. 31.

(33) Estrategias de Manejo Sanitario del Cultivo Larval. •. Eliminación de vibrios de cultivos microalgales. •. Manejo del cultivo larval con niveles <102 UFC/mL de vibrios fermentadores de sacarosa y ausencia de cepas de V. tubiashii. •. Rotación en el uso de Antimicrobianos con mecanismos de acción distintos. •. Desove en condiciones de asepsia. •. Preparación, administración y posología adecuada de terapias con AAM. •. Privilegiar el uso de baños de Antimicrobianos. •. Uso de Agentes Antimicrobianos de amplio espectro. •. Definición de Puntos Críticos de Control del Sistema. •. Implementar un Laboratorio Básico de Microbiología. •. Desarrollar un Programa de Aseguramiento de la Calidad Sanitaria del Cultivo Larval. •. Uso del Manual de Higiene. •. Definir los Puntos Críticos de Control del Cultivo. 32.

(34) CONCLUSIONES •. Existe una importante incidencia de bacterias con capacidades patogénicas en el cultivo larval del ostión del Norte Argopecten purpuratus.. •. La gran mayoría de las cepas con capacidades patogénicas presentan una gran susceptibilidad a los agentes antimicrobianos de uso habitual en acuicultura.. •. La utilización de la tinción de azul de tripano del cultivo larval es de gran utilidad para la detección rápida y eficiente de larvas enfermas con daño tisular.. •. Se recomienda la detección periódica de la especie Vibrio tubiashii en el cultivo larval del ostión del Norte debido a su alta prevalencia y a la capacidad patogénica observada.. •. Los tratamientos con los antimicrobianos oxitetraciclina, florfenicol, flumequina y sulfadoxina trimetoprim no redujeron significativamente la concentración viable de bacterias totales y Vibrio spp. presente en larvas de ostión, y sólo el antibiótico flumequina presenta un marcado efecto inhibitorio sobre la actividad larval.. •. Las actividades de difusión y transferencia tecnológica evidenciaron el gran interés e importancia que este sector le atribuye al manejo microbiológico para asegurar el éxito del cultivo del ostión del Norte, principalmente en su fase larval.. •. Los centros de cultivo debieran implementar un laboratorio de microbiología básico que les permita controlar en forma independiente las condiciones sanitarias del cultivo y aplicar las metodologías y recomendaciones descritas en el Manual de Higiene.. •. Se recomienda la implementación de un programa de aseguramiento de la calidad Sanitaria y la definición de los Puntos Críticos de Control del centro de cultivo.. 33.

(35) REFERENCIAS. Alsina, M. & A.R. Blanch (1994a) A set of keys for biochemical identification of environmental Vibrio species. J. Appl. Bacteriol. 76: 79-85.. Alsina, M. & A.R. Blanch (1994b). Improvement and update of a set of keys for biochemical identification of Vibrio species. J. Appl. Bacteriol. 77: 719-721.. Hada, H. S., P. A. West, J. V. Lee, J. Stemmler, and R. R. Colwell. (1984). Vibrio tubiashii sp. nov., a pathogen of bivalve mollusks. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 1-4.. Lodeiros, C., Bolinches, J., Dopazo, C.P. & A.E. Toranzo. (1987). Bacillary necrosis in hatcheries of Ostrea edulis in Spain. Aquaculture. 65: 15-29.. Sainz, J.C., Maeda-Martinez, A.N. & F. Asencio. (1998). Experimental vibriosis induction with Vibrio alginolyticus of larvae of the Catarina scallop (Argopecten ventrcosus = circularis) (Sowerby II, 1842). Microb. Ecol. 35: 188-192.. Tubiash, H. S., P. E. Chanley, and E. Leifson. (1965). Bacillary necrosis, a disease of larval and juvenile bivalve mollusks. I. Etiology and epizootiology. J. Bacteriol. 90: 10361044.. Tubiash, H. S., R. R. Colwell, and R. Sakazaki. (1970). Marine vibrios associated with bacillary necrosis, a disease of larval and juvenile bivalve mollusks. J. Bacteriol. 103: 2721-2723.. 34.

(36) ANEXO FORMULARIOS. 35.

(37) Programa Curso de Capacitación “Adiestramiento en el Manejo Sanitario del Cultivo Controlado de Moluscos” Proyecto FDI – CORFO PT-10 Fecha: 12-15 Enero del 2004 Coordinadores: Dr. Claudio D. Miranda M.Sc. (C) Rodrigo Rojas A.. Día 1:. 09:00-09:15 Inscripción y entrega de materiales 09:15-09:30 Inauguración del Curso Teoría: 09:30-10:30 Conceptos Generales de Microbiología Fisiología de Microorganismos, Medios de Cultivo Control de MO: Agentes Químicos y Físicos Lab:. 11:00-13:00. Preparación de medios de cultivo Uso adecuado de equipos de lab (Autoclave, Horno Pasteur, Microscopio). Teoría: 15:00-15:30 Técnicas de Recuento Bacteriano Lab:. 15:30-18:00 Recolección de muestras para análisis microbiológico Técnicas de Subcultivo Bacteriano Transferencia de bacterias en condiciones asépticas Aislamiento Bacteriano Monitoreo del Cultivo Larval de ostión del Norte Monitoreo del Cultivo Microalgal Monitoreo del Sistema de Cultivo Recuento en Placa de Agar. Día 2: Teoría: 09:00-10:00 Identificación Bacteriana de Bacterias Acuáticas Lab:. 10:30-13:00 ID por técnicas tradicionales ID mediante Sistemas de Multi-inoculación Sistema API Sistema Biolog ID de vibrios de ambiente marino. Teoría: 15:00-16:00 Conceptos Generales de Terapia Antimicrobiana Agentes Antimicrobianos de uso habitual en Acuicultura Mecanismos de Acción de los Agentes Antimicrobianos Uso de Mezclas de Antimicrobianos Resistencia Bacteriana a Agentes Antimicrobianos Lab:. 16:00-18:00 Realización de Antibiogramas Determinación de CMI y CMB Preparación y Administración de Agentes Antimicrobianos en Acuicultura Recuento Bacteriano de Bacterias Resistentes Efecto del Uso de Antimicrobianos en Larvas de Ostión 36.

(38) Efecto de Antibacterianos sobre la Carga Microbiana en Larvas. Día 3: Teoría: 09:00-10:30 Condiciones Microbiológicas del Cultivo. HACCP Niveles Bacterianos de los Centros de Cultivo Estrategias de Monitoreo Microbiano en hatcheries Teoría: 11:00-13:00. Enfermedades Infecciosas en el Cultivo de Moluscos. Lab:. Efecto de Bacterias Patógenas sobre el Cultivo Larval Bioensayos de Patogenicidad en Larvas de ostión del Norte Administración de Antibióticos en el cultivo larval Observación al Microscopio con Azul de Tripano Diagnóstico Sanitario del Cultivo Larval Preparación de Muestras de Larvas y Microalgas para MEB. Día 4: Lab:. 15:00-18:00. 09:00-13:00 Lectura y Análisis de Resultados Recuento Viable en Placa de Agar Identificación Bacteriana Susceptibilidad a Antimicrobianos Microscopía Electrónica de Barrido. Teoría: 15:00-17:00 Consideraciones para el montaje de un Lab de Microbiología Discusión Final Entrega y de Encuestas Clausura del Curso y Entrega de Certificados. 37.

(39) ENCUESTA CURSO DE CAPACITACIÓN TEÓRICO-PRÁCTICO ADIESTRAMIENTO EN EL MANEJO SANITARIO DEL CULTIVO CONTROLADO DE MOLUSCOS 12-15 ENERO DEL 2004. NOMBRE: .......................................................................... EMPRESA: .................................................... II.. Describa la importancia que le asigna al manejo microbiológico en su centro de cultivo de moluscos. Marque con una X Alta. III.. Media. Baja. Sin opinión. Explique si considera de relevancia para su actividad productiva lo aprendido en este Curso. Marque con una X Alta. Media. Baja. 38. Sin opinión.

(40) IV.. Explique si en el Curso Ud. aprendió nuevas metodologías de manejo sanitario del cultivo. Marque con una X Alta. V.. Media. Baja. Sin opinión. Describa la factibilidad de implementar en su centro de cultivo algunas de las metodologías de control sanitario desarrolladas en el Curso. Marque con una X Alta. Media. Baja. 39. Sin opinión.

(41) VI.. De aplicar algunas de las estrategias de manejo aprendidas en el Curso, cree Ud., que ello producirá un mayor rendimiento en la producción del cultivo. Marque con una X Muy Probable. VII.. Medianamente Probable. Poco Probable. Sin opinión. Si usted cree que el Curso de Capacitación debería haber considerado algún otro aspecto asociado al manejo sanitario del cultivo, descríbalo. 40.

(42)