Actividad antimicrobiana de extractos de la planta calaguala (Phlebodium pseudoaureum) sobre los microorganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Cándida albicans

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(1)UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL Facultad de Ciencias Químicas MODALIDAD: INVESTIGACIÓN. TEMA:. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS DE LA PLANTA CALAGUALA (Phlebodium pseudoaureum) SOBRE LOS MICROORGANISMOS Staphylococcus aureus, Escherichia coli Y Cándida albicans.. TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS. Autores: Saltos Burgos Carolina Lisbeth Tapia Castro Lainus Jerel. TUTOR: Q.F. María Auxiliadora Alarcón Perasso Mgs. GUAYAQUIL- ECUADOR. 2019.

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(12) I. AGRADECIMIENTO. Agradezco infinitamente en primer lugar a Dios por darme fuerza y valor para superar obstáculos, dificultades y poder culminar este triunfo en esta etapa de mi vida.. A mi madre Sulay Burgos Cali y a mi padre José Luis Saltos Aspiazu por brindarme la fuerza y la ayuda necesaria, con ese amor incondicional, en el trayecto de mi vida, corrigiendo mis faltas y celebrando mis triunfos, gracias por sus sabios consejos y su constante apoyo. A mis hermanas por brindarme su amor y lealtad incondicional a lo largo de mi vida.. A mi familia, gracias por siempre estar ahí, por permanecer siempre unida, en especial a mi abuelito Pedro Burgos y mi tío Edison Burgos, por superar las dificultades, con el amor y el cariño que los caracteriza.. A mí enamorado, André Rueda gracias por el apoyo para continuar y jamás renunciar, el amor, la paciencia incondicional que tanto lo caracteriza.. A mi tutora María Auxiliadora Alarcón Perasso Mgs por compartir conocimientos, su asesoramiento, su tiempo, su cariño, alegrías y constante dedicación en la realización de esta investigación.. Finalmente, a mi compañero y gran amigo de tesis Lainus Tapia, gracias por haber logrado nuestro objetivo principal con mucha perseverancia y dedicación. Y mis amigos incondicionales que siempre están conmigo, gracias.. Carolina Lisbeth Saltos Burgos.

(13) II. AGRADECIMIENTO. Agradezco a cada uno de los profesores que me brindaron su experiencia, su amistad, su paciencia a lo largo de mi vida estudiantil.. A la facultad de Ciencias Químicas por contribuir con mi formación profesional.. A mi tutora la Q.F. Ma. Auxiliadora Alarcón por la ayuda brindada, por el conocimiento científico brindado, por el tiempo, la paciencia prestada y su valiosa guía en la realización de este proyecto de titulación.. Finalmente, mi compañera y gran amiga de tesis Carolina Saltos, gracias por el apoyo, por el tiempo empleado, por cumplir nuestro objetivo principal con mucha perseverancia y dedicación.. Lainus Jerel Tapia Castro.

(14) III. DEDICATORIA. Se lo dedico primero a Dios, al creador de todas las cosas, el que me ha guiado en el transcurso de mi vida y permitirme, con su fuerza y amor, llegue a este momento tan especial en mi vida.. A mi madre y mi padre por ser ese pilar fundamental en mi vida, como también mis hermanas, mi abuelito y mi tío, por el apoyo incondicional.. A mi familia en general porque me brinda su apoyo incondicional, por compartir buenos y malos momentos, pero siempre unidos. Esto es por y para ustedes….. Carolina Lisbeth Saltos Burgos.

(15) IV. DEDICATORIA. Dedico este esfuerzo en primer lugar a Dios, por siempre estar presente en mi vida, por brindarme sabiduría y las fuerzas necesarias para superar cada etapa de ella.. A mis amados padres por ser un pilar fundamental para mí, por apoyarme en cada decisión, por su ayuda incondicional a lo largo de mi vida y de la mi carrera, formando parte de esta meta alcanzada.. A mi hermano por creer siempre en mí y darme esa motivación, esa seguridad, que entre tantas cosas me ayudo a alcanzar este objetivo.. A mis amigos y compañeros, con los cuales compartimos muchos momentos difíciles y siempre nos hemos apoyado en lo más posible.. Lainus Jerel Tapia Castro.

(16) V. INDICE GENERAL RESUMEN ....................................................................................................... XII ABSTRACT ..................................................................................................... XIII INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1 CAPÍTULO I: PROBLEMA .................................................................................. 3 Planteamiento del problema. .............................................................................. 3 Hipótesis............................................................................................................. 3 Justificación ........................................................................................................ 4 Objetivos ............................................................................................................ 5 CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO ...................................................................... 6 II.1 CALAGUALA ................................................................................................ 6 II.1.1 Hábitat .................................................................................................... 6 II.1.2 Propiedades medicinales ....................................................................... 7 II.1.3 Otros usos ................................................................................................. 8 II.1.4 Parte utilizada ........................................................................................ 8 II.1.5 Principios activos ................................................................................... 8 II.1.6 Composición química (rizoma) ............................................................... 9 II.1.7 Acción de la calaguala ........................................................................... 9 II.1.8 Usos medicinales tradicionales de la calaguala ................................... 10 II.2 Escherichia coli. ......................................................................................... 10 II.2.1 Taxonomía ........................................................................................... 10 II.2.2 Características ..................................................................................... 11 II.2.3 Síntomas .............................................................................................. 12 II.2.4 Fuentes y transmisión .......................................................................... 13 II.2.5 Prevención ........................................................................................ 14 II.3. Staphylococcus aureus ............................................................................. 14 II.3.1 Taxonomía ........................................................................................ 15 II.3.2 Características .................................................................................. 15 II.3.3 Morfología ......................................................................................... 16 II.3.4 Otras Características ........................................................................ 16.

(17) VI. II.3.5 Epidemiologia ................................................................................... 17 II.3.6 Diagnóstico ....................................................................................... 17 II.3.7 Tratamiento ....................................................................................... 18 II.4 Cándida albicans..................................................................................... 18 II.4.1 Morfología. ........................................................................................ 19 II.4.2 Clasificación taxonómica .................................................................. 19 II.4.3 Epidemiología. .................................................................................. 20 II.4.4 Formas clínicas. ................................................................................ 20 II.4.4.1 Bucal. ............................................................................................. 20 II.4.4.2 Intertriginosa. ................................................................................. 21 II.4.4.3 Vulvovaginitis. ................................................................................ 21 II.4.4.4 Balanitis. ........................................................................................ 21 II.4.4.5 Candidiasis por el pañal. ................................................................ 21 II.4.6 Onicomicosis y perionixis. ................................................................. 22 II.4.7 Esofagitis. ......................................................................................... 22 II.4.8 Endocarditis. ..................................................................................... 22 II.4.9 Tracto urinario. .................................................................................. 22 II.4.10 Sistema nervioso central. ................................................................ 23 II.4.11 Peritonitis. ....................................................................................... 23 II.4.12 Ocular. ............................................................................................ 23 II.4.13 Tratamientos. .................................................................................. 23 II.5 Antibiograma ........................................................................................ 24 II.5.1 Discos para antibiograma ................................................................. 24 II.5.2 Método por difusión en agar ............................................................. 24 II.5.3 CMI (Concentración Inhibitoria Mínima) ............................................ 25 II.5.4 Extracto ............................................................................................. 28 II.5.5 Obtención de extractos ..................................................................... 29.

(18) VII. CAPITULO III. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................... 30 III.1 Tipo de investigación .......................................................................... 30 III.2 Diseño de la investigación...................................................................... 30 III.3 Lugar de la investigación........................................................................ 31 III.4 Período de la investigación. ................................................................... 31 III.5 Recursos empleados. ............................................................................ 31 III.5.1 Talento humano. .............................................................................. 31 III.5.2 Muestra ............................................................................................ 31 III.6 Metodología ........................................................................................... 32 III.7 Recolección y selección del material vegetal. ........................................ 32 III.8 Comprobación taxonómica..................................................................... 33 III.9 Secado y trituración del material vegetal................................................ 34 III.10 Factores de estudio. ............................................................................. 34 Equipos ......................................................................................................... 34 Materiales ..................................................................................................... 35 Reactivos ...................................................................................................... 35 III.11 Obtención de los extractos ................................................................... 36 III.11.1 Extracto alcohólico ......................................................................... 36 III.11.2 Extracto acuoso ............................................................................. 36 III.12 Análisis microbiológico ......................................................................... 36 III.12.1 Dilución de la cepa en caldo cerebro corazón: dilución de 0.5 MacFarland ................................................................................................ 37 III.12.2. Preparación. de. solución. Caldo. cerebro. corazón. al. 0.5. MacFarland. ............................................................................................... 38 CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................ 40 IV.1 Resultados: Extracto alcohólico ............................................................. 40 IV. 2 Resultados: Extracto acuoso ................................................................ 41 IV. 3 Discusión .............................................................................................. 43 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. .................................................. 44 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 46 ANEXOS .......................................................................................................... 49.

(19) VIII. ÍNDICE DE TABLAS TABLA I Equipos utilizados en el análisis microbiológico ............................. 34 TABLA II Materiales usados en el laboratorio de Microbiología ................... 35 TABLA III Reactivos que se utilizaron en el análisis microbiológico ............. 35 TABLA IV Resultados del Extracto Alcohólico.............................................. 40 TABLA V Resultados del Extracto Acuoso ................................................... 42.

(20) IX. ÍNDICE DE GRÁFICOS. Gráfico 1 Resultado de la actividad antimicrobiana del extracto alcohólico ........ 41 Gráfico 2 Halo de inhibición del extracto acuoso ................................................. 42.

(21) X. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Antibiograma ..................................................................................................25 Figura 2 Diámetro de halos de inhibición...................................................................27 Figura 3 Interpretación de las pruebas de sensibilidad según el CLSI ...................27 Figura 4 Clasificación taxonómica de la planta Phlebodium pseudoaureum .......33.

(22) XI. ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1 Preparación de la muestra .................................................................... 49 Anexo 2 Preparación del extracto alcohólico ....................................................... 49 Anexo 3 Cepas patrón ......................................................................................... 50 Anexo 4 Primera prueba del análisis microbiológico con las diferentes concentraciones del extracto alcohólico ............................................................... 52 Anexo 5 Preparación de cajas petri para el análisis microbiológico .................... 52 Anexo 6 Preparación de las diluciones de los extractos de las cepas control ..... 53 Anexo 7 Resultados de ensayos con el extracto alcohólico ................................ 54 Anexo 8 Discos control ........................................................................................ 55 Anexo 9 Preparación del Extracto Acuoso .......................................................... 56 Anexo 10 Diluciones del extracto acuoso para el análisis microbiológico ........... 56 Anexo 11 Resultados de los ensayos en el extracto acuoso ............................... 57.

(23) XII. FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA. UNIDAD DE TITULACIÓN. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS DE LA PLANTA CALAGUALA (Phlebodium. pseudoaureum). SOBRE. LOS. MICROORGANISMOS. Staphylococcus aureus, Escherichia coli Y Cándida albicans. Autores: Carolina Lisbeth Saltos Burgos Lainus Jerel Tapia Castro Tutor: Q. F María Auxiliadora Alarcón Perasso Mgs RESUMEN. El presente estudio logró analizar la actividad antibacteriana y antimicótica del extracto alcohólico y acuoso, obtenido por maceración del rizoma de la planta calaguala. (Phlebodium. pseudoaureum).. Se. comparó. contra. antibióticos. seleccionados, utilizando un grupo de cepas control para el estudio en común: Staphylococcus aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231”. Analizándose por el método de difusión en placa se postula la hipótesis de que el rizoma de la planta calaguala (Phlebodium pseudoaureum) contiene metabolitos secundarios, que presentan una actividad antibacteriana y antimicótica. El presente estudio demostró la actividad antibacteriana de la planta calaguala (Phlebodium pseudoaureum) en extracto alcohólico, que se determinó por el método de difusión con un rango de sensibilidad aceptable frente al microorganismo S. aureus y C. albicans según la norma CLSI que sirve de guía para el estudio.. Palabras claves: Staphylococcus aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231, CLSI, antibacteriana..

(24) XIII. FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA. UNIDAD DE TITULACIÓN ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF EXTRACTS FROM THE PLANT CALAGUALA (Phlebodium pseudoaureum) on the microorganisms Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. Authors: Carolina Lisbeth Saltos Burgos Lainus Jerel Tapia Castro Tutor: Dra. María Auxiliadora Alarcón Perasso M. Sc. ABSTRACT. The present study analysed the antibacterial and antifungal activity of the alcoholic and aqueous extract, obtained by maceration of the rhizome of the calaguala plant (Phlebodium pseudoaureum). It was compared against selected antibiotics, using a group of control strains for the common study: Staphylococcus aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC 10231 ". Analyzing by the method of diffusion in plaque the hypothesis was postulated that the rhizome of the plant calaguala (Phlebodium pseudoaureum) contains secondary metabolites, with antibacterial and antifungal activity. The present study showed the antibacterial activity of the plant calaguala (Phlebodium pseudoaureum) in alcoholic extract, which was determined by the diffusion method with an acceptable range of sensitivity against the microorganism S. aureus and C. albicans according to the standard CLSI wed as an guide for the study.. Key words: Staphylococcus aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC 10231, CLSI, antibacterial..

(25) INTRODUCCIÓN. Desde hace muchos años, el ser humano ha recurrido a prácticas naturales en busca de una curación para sus afecciones, conociendo que existen especies vegetales, que han demostrado una gran actividad medicinal. Así mismo existen un gran número de plantas que han sido utilizados por el hombre como alimento, sombra y armas. Desde los pueblos primitivos hasta los más modernos, le han atribuido un poder mágico a cierto grupo de especies, reforzado con los mitos, concediéndole una intervención directa en la vida del ser humano y sobre todo en su destino.. La exuberante biodiversidad vegetal que forma parte de la historia, pero sobre todo la cultura de los pueblos indígenas, su uso, y la aplicación de estos productos como remedios para la variedad de estas enfermedades constituye un conocimiento que ha sido transmitido de generación a generación.. Aproximadamente la décima parte de especies de plantas del planeta determina que nuestro país se encuentre dentro de los países considerados totalmente como mega diverso. Muchas plantas son utilizadas con fines terapéuticos, por su uso ancestral, aunque no se puede condicionar la sabiduría habitual, ya que es necesario la aprobación científica de ciertas propiedades de las plantas medicinales para descartar cualquier tipo de toxicidad.. Debido a un gran número de plantas con propiedades medicinales dentro de nuestro país, que no se han logrado estudiar de manera correcta, es necesario realizar la evaluación de la actividad antimicrobiana y antimicótica de los extractos de calaguala, ya que es muy reducido la información obtenida de esta especie de nuestro país. Como se conoce, el tipo de suelo, clima, temperatura, etc. pueden estimular una modificación de los componentes químicos de cada especie.. 1.

(26) Mediante el presente trabajo de investigación, se pretende valorar por medio de ensayos, la actividad antimicrobiana de esta especie, aportando datos importantes a nivel científico, garantizando la seguridad y eficacia en el uso de esta planta.. 2.

(27) CAPÍTULO I: PROBLEMA. Planteamiento del problema.. ¿Presentarán los rizomas de la calaguala metabolitos secundarios con un potencial de actividad antibacteriana y antimicótica?. Hipótesis. Los rizomas de la calaguala contienen metabolitos secundarios que representan un potencial de actividad antibacteriana y antimicótica.. 3.

(28) Justificación. En la actualidad, la creciente y alarmante resistencia de los microrganismos a los fármacos existente, nos obliga a buscar alternativas efectivas para contrarrestar las futuras enfermedades.. El uso de la medicina natural ha crecido con el pasar de los años, llegando a elaborar productos farmacéuticos que pueden disminuir dolencias a un gran grupo de personas, aunque otras no han podido resolver su enfermedad.. La calaguala es una de las plantas que ha ayudado a solucionar numerosos problemas de salud, siendo aplicada en la medicina ancestral.. Para demostrar los beneficios que esta posee, se evalúa mediante la demostración de su actividad antimicrobiana verificando así, la veracidad de su actividad en la medicina ancestral.. 4.

(29) Objetivos. Objetivo General . Evaluar la actividad antimicrobiana y antimicótica del extracto acuoso y alcohólico de la planta calaguala sobre lo microorganismos S. aureus, E. Coli y C. albicans.. Objetivos Específicos. . Analizar la actividad antimicrobiana y antimicótica del extracto acuoso de la planta calaguala sobre los microorganismos S. aureus, E. Coli y C. albicans.. . Analizar la actividad antimicrobiana y antimicótica del extracto alcohólico de la planta calaguala sobre lo microorganismos S. aureus, E. Coli y C. albicans.. . Comparar el poder antibacteriano y antimicótico de los extractos acuoso y alcohólico de la planta Calaguala sobre lo microorganismos S. aureus, E. Coli y C. albicans.. 5.

(30) CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO. II.1 CALAGUALA. Phlebodium pseudoaureum (L.) John Smith (Polypodium leucotomos Poir) (P. decumanum Willd.) (P. Calaguala) Phlebodium aureum.. II.1.1 Hábitat. La calaguala integra en la familia de las Polipodiáceas es una planta que no crece en la tierra, y si lo hace es muy raro. Florece en la corteza y ramas de otros vegetales o en rocas, está constituido de un rizoma rastrero y escamoso, algo delgado que posee un sabor entre agridulce, inodoro del que salen hojas densas, glabras verdes sobre tallos azul café (Caceres, 2016).. Las hojas son elípticas entre 30 a 120 cm de largo y aproximadamente 20 a 40 cm de ancho. La calaguala es procedente de Centroamérica y su superficie se puede extender desde México a Sudamérica. El hábitat favorito por la calaguala son los bosques y zonas montañosas, donde suele crecer sobre las rocas. Se afirma que la calaguala prospera en tierras cálidas y profundas. Se indica igualmente que crece en forma indómita en los árboles de " encino" americano (no debe confundirse con la encina europea) (Perez , 2011).. La calaguala contiene en su composición una sustancia similar a una goma, y en menor cantidad, una resina roja, amarga y acre. También, se observa una cantidad considerable de polisacáridos, un colorante, y en menor proporción ácido málico, en mayor proporción sal, cal y ácido silícico (Perez , 2011).. Igualmente, entre los principales compuestos químicos de la calaguala se encuentran los glicósidos de la saponina basados en polipodosapogenina, la 6.

(31) osaldina (compuesto dulce), ecdisteroides polipodinas A y B, derivados de floroglucina, además de otras sustancias como el aceite esencial, aceite fijo, tanino, etc (Perez , 2011). Esta planta no tiene contacto con el suelo, crece sobre la espesura o también sobre rocas, se alimenta de lo que encuentra en entorno. Según la medicina ancestral, ayuda en enfermedades en las que se encuentra comprometido el sistema inmunológico como la psoriasis y el mal del pinto o vitíligo. Tiene nutrientes que depura la sangre. Está indicada para combatir problemas del corazón y vías pulmonares o respiratorias muy afectadas con padecimientos asmáticos, tos, bronquitis, etc. (Mendoza A. , 2016).. Es de gran utilidad tomarla cuando la piel ya está muy envejecida y pierde elasticidad, depura el torrente sanguíneo y alimenta la piel, es un antioxidante que limpia la apariencia cutánea.. De acuerdo a la práctica ancestral, depura la sangre eliminando el colesterol, ayudando a tener una mayor oxigenación. Es una planta pectoral, alivia y evita el dolor de angina de pecho. Cuando el corazón está espástico o cuando los músculos se esclerosan y reducen poco a poco sus funciones motoras, las venas estrechan el paso a la circulación de la sangre, que se dificulta. Esta planta ayuda a contrarrestar este proceso.. II.1.2 Propiedades medicinales. A la calaguala se le otorga la capacidad de avivar los linfocitos que combaten las infecciones, lo que la hace muy eficaz para prevenir o calmar infecciones en personas con el sistema inmunológico deprimido.. También se la emplea como antiespasmódico y sudorífico en afecciones respiratorias de tipo alérgico, como bronquitis con espasmos, y en procesos gripales.. 7.

(32) Además, se la atribuye una propiedad diurética y antirreumática, para disminuir el ácido úrico y reducir la inflamación en artritis reumatoide y gota. Así mismo es eficiente para tratar el herpes zoster.. II.1.3 Otros usos. Con regularidad la calaguala es empleada en alteraciones cutáneas, asociadas a crisis nerviosas y estrés. Regula la activación celular en la piel y disminuye la aparición de células muertas y la descamación. Es un medicamento natural que combate la psoriasis y el vitíligo (despigmentación parcial de la piel).. También se ha ensayado como renovador de la piel, después de terapias con radioterapia y, por su acción similar a la de los corticoides, para aliviar reacciones alérgicas como urticarias, eccemas atópicos y dermatosis.. II.1.4 Parte utilizada. El rizoma es la parte principal mientras que las hojas son partes secundarias. El rizoma posee un sabor agradable (por la presencia de osladina), ligeramente agrio, y de bajo aroma. El extracto de los rizomas y las hojas del helecho ha sido usado de manera tradicional por los nativos oriundos de Honduras como un remedio contra varias enfermedades incluyendo diferentes afecciones cutáneas (Mendoza M. V., 2017).. II.1.5 Principios activos. . Saponinas. . Calagualina formada por un cetosteroide.. . Aceite esencial.. . Ácido málico.. . Mucílagos. 8.

(33) . Taninos.. . Resinas.. Minerales: . Hierro. . Potasio. . Calcio. . Azúcares:. . Pentosas. . Colorante amarillo. . Fermentos amilolíticos. . Almidón. II.1.6 Composición química (rizoma). Esteroides:. ecdisterona,. ecdisonas (una. de. ellas conocida. como. polipodoaureína). Saponinas: calagualina (heterósido compuesto por glucosa, fructosa y una aglicona triterpénica), polipodinas A y B Otros: mucílago (desoxihexosa), oleorresina, nitrato de potasio, osladina y almidón.. II.1.7 Acción de la calaguala. La acción más resaltable atribuida a la calaguala es combatir con cierta eficacia la psoriasis y las dermatosis atróficas. Es una planta que en realidad es un inmunorregulador o regulador del sistema defensivo, con lo cual se le supone útil para todas aquellas enfermedades llamadas autoinmunes. Se usaba antiguamente como antiinflamatorio en enfermedades cutáneas. Actualmente se investiga su acción en el vitíligo (despigmentación de la piel) y su acción antioxidante, así como sus mecanismos de acción en procesos tumorales y en otros trastornos (Alonso, 2018).. 9.

(34) II.1.8 Usos medicinales tradicionales de la calaguala. . Diurética.. . Antivírica.. . Colagoga.. . Febrífuga.. . Diaforética.. . Tranquilizante.. . Antipsoriásica.. . Antiespasmódica.. . Inmunosupresora.. . Laxante.. . Expectorante.. . Antitumoral.. II.2 Escherichia coli.. Es un bacilo corto, Gram negativo, con una sola cadena espiral de ADN, anaerobio facultativo, móvil con flagelos perítricos, tiene información genética en los plásmidos, que son responsables de la producción de toxinas y de la resistencia a los antimicrobianos. La mayoría de las bacterias pertenecientes a la especie E. coli, forman parte de la microflora normal del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente, encontrándose habitualmente en sus heces (Romero Cabello, 2007).. II.2.1 Taxonomía. Reino: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Gammaproteobacteria 10.

(35) Orden: Enterobacteriales Familia: Enterobacteriaceae Género: Escherichia Especie: E. coli. II.2.2 Características. E. coli se singulariza por ser un bacilo Gram negativo, no esporulante, fabricante de indol a partir de triptófano, no utiliza el citrato como fuente de carbono y no produce acetoína. Además, es fermentadora de glucosa y la lactosa con producción de gas (Canet, 2016).. Como toda bacteria Gram negativa, la cubierta de E. coli está compuesta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre estas, un espacio periplásmico integrado por péptido-glucano. Esta última le da a la bacteria su forma y rigidez, que le permite resistir presiones osmóticas ambientales que pueden ser elevadas (Canet, 2016).. E. coli es una bacteria láctica y micrococacea, su óptimo de desarrollo se encuentra en el entorno de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (alrededor de 35 a 43 ºC). La temperatura límite de crecimiento se sitúa cerca de 7 ºC, lo que indica que un manejo eficiente de la cadena de frío en las industrias alimentarias es importante para reducir en lo máximo posible el crecimiento de E. coli en los alimentos. La congelación tiene un menor efecto sobre la población de E. coli en el alimento, no garantiza la destrucción de un número suficiente de bacterias viables para asegurar su inocuidad. Sin embargo, E. coli es sensible a temperaturas mayores a 70 ºC, a partir de la cual son fácilmente eliminadas; por ello, es muy importante la pasteurización de alimentos como la leche, zumos, etc., para garantizar su eliminación (Canet, 2016).. 11.

(36) Además de la temperatura, el pH y la actividad de agua pueden influir en la proliferación de E. coli. Las condiciones óptimas de desarrollo para estos parámetros son de 7,2 y 0,99 respectivamente. El desarrollo de E. coli se detiene a pH extremos (inferiores a 3,8, o superiores a 9,5), y valores de aw inferiores a 0,94. Por ello, el grado de acidez de un alimento puede constituir un factor de protección y garantizar su seguridad (Canet, 2016).. E. coli presenta múltiples características, y constituye el taxón bacteriano mejor estudiado, aunque el conocimiento de las cepas salvajes es aún parcial. Parece, que las facultades de adaptación de esta bacteria son poco comunes, debido a la adquisición de nuevos genotipos a partir de plásmidos, bacteriófagos, y otros elementos que transmiten su material genético. Además, su conocida capacidad de ubicuidad favorece la aparición reiterada de cepas con nuevas propiedades, incluyendo capacidades patógenas no fácilmente reconocibles (Canet, 2016).. II.2.3 Síntomas. Entre los síntomas de la enfermedad causada por E. coli productora de toxina Shiga destacan los calambres abdominales y la diarrea, que puede progresar en algunos casos a diarrea sanguinolenta (colitis hemorrágica). También puede haber fiebre y vómitos. El periodo de incubación varía entre tres y ocho días, con una mediana de tres a cuatro días. La mayoría de los pacientes se recuperan en el término de diez días, pero en un pequeño porcentaje de los casos (especialmente niños pequeños y ancianos) la infección puede conducir a una enfermedad potencialmente mortal, como el síndrome hemolítico urémico (SHU). El SHU se caracteriza por una insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica y trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) (OMS, 2018).. Se estima que hasta un 10% de los pacientes con infección por E. coli productora de toxina Shiga pueden desarrollar síndrome hemolítico urémico, con una tasa de letalidad de 3%-5%. Globalmente, el SHU es la causa más común de insuficiencia renal aguda en los niños de corta edad. Pueden aparecer también 12.

(37) complicaciones neurológicas (como convulsiones, accidente cerebrovascular y coma) en el 25% de los pacientes con SHU, así como secuelas renales crónicas, generalmente leves, en aproximadamente un 50% de los supervivientes.. Las personas que sufren diarrea sanguinolenta o calambres abdominales intensos deben buscar atención médica. Los antibióticos no deben formar parte del tratamiento de los pacientes con enfermedad por E. coli productora de toxina Shiga, y posiblemente aumentan el riesgo de SHU posteriormente.. II.2.4 Fuentes y transmisión La mayor parte de la información disponible sobre E. coli productora de toxina Shiga guarda relación con el serotipo O157: H7, pues es el más fácil de distinguir bioquímicamente de otras cepas de E. coli. El reservorio de este patógeno es principalmente el ganado bovino. También se consideran reservorios importantes otros rumiantes, como ovejas, cabras y ciervos, y se ha detectado la infección en otros mamíferos (como cerdos, caballos, conejos, perros y gatos) y aves (como pollos y pavos) (OMS, 2018).. E. coli O157: H7 se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne picada cruda o poco cocida y leche cruda. La contaminación fecal del agua y de otros alimentos, así como la contaminación cruzada durante la preparación de estos (con carne de vacuno y otros productos cárnicos, superficies y utensilios de cocina contaminados), también es causa de infecciones. Ejemplos de alimentos implicados en brotes de E. coli O157: H7 son las hamburguesas poco cocidas, el salami curado, la sidra fresca no pasteurizada, el yogur y el queso elaborado con leche cruda (OMS, 2018).. Un número creciente de brotes se asocian al consumo de frutas y verduras (como las coles de Bruselas, las espinacas, la lechuga, las ensaladas de col y de otro tipo) contaminadas por el contacto con las heces de animales domésticos o salvajes en algún momento durante su cultivo o manipulación. También se ha aislado E. coli productora de toxina Shiga en masas de agua (estanques y arroyos),. 13.

(38) pozos y abrevaderos, y se ha observado que puede sobrevivir durante meses en el estiércol y en los sedimentos de recipientes de agua. Se ha informado de casos de transmisión por el agua, tanto por agua de bebida contaminada como por aguas de recreo (OMS, 2018).. Los contactos de persona a persona son una forma de transmisión importante por vía oral-fecal. Se ha informado de un estado de portador asintomático, en el que la persona no muestra signos clínicos de la enfermedad, pero puede infectar a otros. La excreción de E. coli productora de toxina Shiga dura aproximadamente una semana o menos en los adultos, pero puede prolongarse más en los niños. Se ha observado que otro factor de riesgo importante de infección por E. coli productora de toxina Shiga son las visitas a granjas y otros lugares donde el público en general puede entrar en contacto directo con el ganado (OMS, 2018).. II.2.5 Prevención. Para prevenir la infección hay que aplicar medidas de control en todas las etapas de la cadena alimentaria, desde la producción agropecuaria en la granja hasta la elaboración, fabricación y preparación de los alimentos en las cocinas tanto de establecimientos comerciales como de los hogares (OMS, 2018). II.3. Staphylococcus aureus. El patógeno humano Staphylococcus aureus se caracteriza por ser uno de los microorganismos más importantes, produciendo infecciones de heridas quirúrgicas, de prótesis y otras a nivel nosocomial, como también se destaca en la comunidad y nivel hospitalario. Las infecciones por S. aureus son muy continuas en la comunidad, a menudo son agudas, piogénicas, y superficiales, así mismo puede producir infecciones profundas con menor frecuencia como osteomielitis, endocarditis aguda y neumonía (Seija, 2006).. El S. aureus es causante de varias infecciones producidas por toxinas como el síndrome de piel escaldada, la intoxicación alimentaria, y el síndrome del shock 14.

(39) toxico. El integrante de la flora normal de la piel, Staphylococcus epidermidis, produce infecciones crecientes de piel, colonizando cuerpos extraños, así mismo es causa de infecciones profundas en huéspedes inmunocomprometidos. En la mujer joven se encuentra una infección urinaria baja que es causada por el Staphylococcus saprophyticus (Seija, 2006).. II.3.1 Taxonomía. Reino: Prokaryotae Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Bacillales Familia: Straphilococcaceae Género: Staphilococcus Especie: S. aureus. II.3.2 Características. El género S. aureus está formado por cocos Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5 μm. Son bacterias sin movilidad, no esporuladas, no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo, son anaerobias facultativas (Garcia, 2014).. Los estafilococos producen catalasa (enzima capaz de desdoblar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre); característica que se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa negativos. Los estafilococos fueron clasificados inicialmente en un género común en la familia Micrococacea además de los géneros Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus (Garcia, 2014).. 15.

(40) II.3.3 Morfología. Se observa asociación en racimos irregulares (similar a un racimo de uvas) carecen flagelos, no producen esporas y rara vez pueden tener capsula. Tienen una forma esférica y un diámetro de alrededor de una micra (Andres, 2016).. Para obtener una morfología macroscópica debemos obtener un aislamiento de la cepa a estudiar en la caja de Petri, ya que se observa las características de las colonias. Cuando se incuban los cultivos por 24 a 48 horas en temperatura ambiente, se va a observar la producción del pigmento satisfactoria. El Staphylococcus aureus en medios no selectivos presentas colonias de 1 a 3 mm de diámetro, levemente convexas, elevadas, de bordes enteros y respectivamente pigmentadas con un color que puede varias de crema a amarillo (Seija, 2006).. En agar nutritivo chocolate, soya tripticasa y sangre, se ven colonias blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa. Algunas cepas producen un pigmento carotenoide que les da un color dorado (Seija, 2006).. II.3.4 Otras Características.  Colonias convexas, brillantes y lisas.  Adquirir un Endo pigmento en donde se lo conoce como aureus dando color amarillo naranja a blanco porcelana color dorado.  Fermenta maltosa, lactosa y glucosa.  El crecimiento se encuentra dentro de un rango de temperatura de 65 a 50º C siendo óptimo entre 30 a 40º C. 16.

(41) II.3.5 Epidemiologia. Durante varias décadas se han reportado un gran número de brotes epidémicos de S. aureus a nivel mundial, sobre todo en los hospitales, centros de atención y clínicas. Estas infecciones por S. aureus resultan reemergentes debido a que la bacteria se ha tornado resistente a diversos antibióticos con los que normalmente se les trata. Actualmente, estos brotes se dividen como infecciones nosocomiales e infecciones adquiridas en la comunidad (Garcia, 2014).. Las infecciones por S. aureus se clasifican en 3 subgrupos: adquiridas en hospitales (nosocomiales), adquiridas en la comunidad y hospitales (no nosocomial) e infecciones iniciales en el proceso de la enfermedad. Un estudio realizado en Carolina del Norte entre finales del 2000 y finales del 2001, identificaron 504 infecciones al torrente sanguíneo de las cuales el 35% fueron nosocomiales, 28% adquiridas en la comunidad y 37% asociados en la comunidad de inicio (Garcia, 2014).. II.3.6 Diagnóstico. Los datos clínicos y epidemiológicos son fundamentales para orientar el diagnóstico microbiológico, así como la sospecha del agente etiológico causante de la infección, por lo que se requiere del aislamiento y la identificación de S. aureus a partir de muestras clínicas. Entre dichas muestras se encuentra la sangre, tejidos, líquidos normalmente estériles, aspirados de abscesos, las cuales al ser teñidas con la tinción de Gram permiten observar la forma y agrupación, así como una respuesta inflamatoria con la presencia de leucocitos polimorfonucleares (Garcia, 2014).. 17.

(42) II.3.7 Tratamiento. Se ha tratado de combinar la vancomicina con la rifampicina, ácido fusídico o fosfomicina, aunque en los ensayos clínicos aleatorios no se ha demostrado la ventaja de dichas combinaciones sobre la vancomicina sola. Estos antibióticos no deben prescribirse solos porque seleccionan mutantes resistentes, pero pueden ser útiles cuando se combinan con la vancomicina para el tratamiento de las infecciones óseas, articulares, endocarditis o meningitis, gracias a su mayor distribución tisular.. Las cepas SARM (S. aureus resistente a meticilina) son, a menudo, resistentes a los aminoglucósidos, quinolonas, clindamicina y macrólidos. Además, no siempre la demostración de sensibilidad in vitro frente a estos antimicrobianos lleva aparejados buenos resultados terapéuticos. La asociación de vancomicina con gentamicina, si la cepa SARM es sensible a ésta, podría emplearse en casos de endocarditis infecciosa sobre prótesis valvulares (Camarena & Sanchez , 2011).. El tratamiento de elección para la infección por S. aureus es la penicilina, pero en la mayoría de los países, la resistencia a la penicilina es muy común y la terapia de primera línea es más una penicilina penicilinasa-resistente (por ejemplo, oxacilina o flucloxacilina). El uso de la terapia de combinación con gentamicina es controvertido debido al riesgo de daño a los riñones. La duración del tratamiento depende del sitio de la infección y la gravedad (Newsmedical, 2012).. II.4 Cándida albicans.. Son agentes patógenos que se encuentran en todas partes, es decir su distribución geográfica es universal como por ejemplo en los vegetales, suelo, aguas, aire en ciertos alimentos y son parte de la biota natural de la piel y membranas mucosas en los humanos y otros mamíferos (Vasquez & Sobel, 2011).. 18.

(43) II.4.1 Morfología.. Es un hongo con forma alargadas de seudohifas, ya que es dimorfo, y blastoconidios, fermentadores de azúcares. Las células son unicelulares, redonda u ovaladas, de crecimiento rápido, sus colonias cremosas o pastosas.. II.4.2 Clasificación taxonómica. Reino: Fungi División: Deuteromycota Clase: Blastomycetes Familia: Cryptococcaceae Género: Cándida Especie: albicans. Estos microorganismos se los ha clasificado como Levaduras del Phylum ascomycotina, del género Cándida, de las cuales hay más de 150 especies identificadas. De las más reportadas como patógenas tenemos unas 17 especies, siendo la más típica causante de enfermedades agudas y crónicas, la Cándida albicans sobre todo el serotipo B. (Vasquez & Sobel, 2011). Le sigue la Cándida tropicalis y la Cándida parapsilosis que están entre el 15% y el 30% de más frecuentes en las enfermedades y entre las menos presentes tenemos a las Cándidas krusei y la dubliniensis que constituyen menos del 1% de los casos clínicos más frecuentes (Vasquez & Sobel, 2011).. La especie Cándida se la puede reconocer porque se presenta como una levadura mitospórica de forma alargada y algo redondeado, llegando a medir entre 2x6 o 3x9 um. Su reproducción es por gemación y al ser una levadura forma las hifas (Vasquez & Sobel, 2011).. 19.

(44) II.4.3 Epidemiología.. Producen la enfermedad llamada Candidiasis, siendo los casos de tipo superficial las más comunes o típicas, tiene relación con problemas en la hidratación y cambios en el pH de la piel, boca, faringe y otros tejidos superficiales (Rojas & Bonifaz, 2016).. Es de fácil tratamiento y que por lo general no son causantes de la muerte de los pacientes, no así los casos de tipos sistémicas que son invasivas que pueden ser agudas o crónicas y que si pueden causar la muerte del paciente (Rojas & Bonifaz, 2016).. Todo esto se relaciona con que el sistema inmune se encuentra reprimido en estos pacientes, por lo que se llega a observar en pacientes que tienen el VIH avanzado hasta en el 1% (Rojas & Bonifaz, 2016).. Así también se ha demostrado que no existe relación con la edad, raza o sexo, salvo que se trate de la Candidiasis urogenital que es más frecuente en las mujeres que en los hombres, pero sí existe una relación directa con el tipo de actividad o trabajo que se esté realizando porque las condiciones pueden favorecer su desarrollo ya que son oportunistas (Rojas & Bonifaz, 2016).. II.4.4 Formas clínicas. II.4.4.1 Bucal.. La más común es la pseudomembranosa que se presenta en los neonatos y ancianos, se lo encuentra por lo general presente en lengua, carrillo y paladar en una capa blanca, adherente y membranosa causante de dolor, pérdida del sentido del gusto y ardor entre otros síntomas (Suscal-Espinoza & Vite-Cano, 2018).. Se observa la estomatitis hipertrófica que es frecuente en aquellas personas que usan dentadura postiza siendo algunos de los síntomas: la lengua fisurada, 20.

(45) gingivitis y algunas hemorragias en las encías (Suscal-Espinoza & Vite-Cano, 2018).. II.4.4.2 Intertriginosa.. Está presente en los pliegues de tejido epitelial que cuelgan en los individuos obesos, se lo identifica porque presenta descamaciones finas, fisuras, pústulas o vesículas (Lung & Shu, 2016).. II.4.4.3 Vulvovaginitis.. Se manifiesta en los ciclos menstruales y en el embarazo por lo que se presenta en el 75% de las mujeres en edad reproductiva, produciendo eritema intenso en la vulva y la mucosa vaginal que se pueden extender hasta el periné, los síntomas son: prurito, sensación urente, disuria y dispareunia. Los pacientes VIH positivo son los que más frecuentemente vuelven a recaer (Lung & Shu, 2016).. II.4.4.4 Balanitis. Se presenta de forma asintomática en algunos pacientes que aún no se han circuncidado, manifestándose la existencia de pápulas muy localizadas, el glande se presenta eritematoso y con dolor que pueden llegar a ser crónicos ( (Lung & Shu, 2016).. II.4.4.5 Candidiasis por el pañal.. Se produce debido a que no hay un cambio de pañal a tiempo y la piel en contacto con la orina producen unas placas eritematosas, con presencia de descamación, pápulas y pústulas que en algunos casos se combina con la presencia de bacterias (Husein, 2012).. 21.

(46) II.4.6 Onicomicosis y perionixis.. Es una infección que se presenta en la uña del pie, en donde el ataque por Cándida se combina con otros hongos, produciendo edema, dolor y exudado. II.4.7 Esofagitis.. Es muy común en pacientes que padecen del VIH y los síntomas son: náuseas, disfagia, vómitos, hematemesis y dolor retroesternal. También puede presentarse asintomática y se lo diagnostica por medio de una endoscopia en donde se comprueba las lesiones porque aparece una forma de empedrado.. La Candidiasis es común en pacientes que son VIH positivos en donde suelen estar atacando los diversos órganos como por ejemplo los intestinos en donde por medio del análisis de las heces se encuentran colonias de levaduras superior al 70%, produciendo diarreas, fiebres, etc. También atacan la región pulmonar causando cuadros muy severos de bronquitis y neumonías, esta última puede causar hasta la muerte del paciente (Cervera, Gurguí, & Lumbreras, 2011).. II.4.8 Endocarditis. Se manifiesta generalmente en pacientes que reciben nutrición parenteral debido a la infección de las válvulas cardíacas o si el paciente ha sido operado a corazón abierto. También se presenta en individuos que son drogodependientes por vía venosa en donde se puede presentar una endocarditis fúngica (Cervera, Gurguí, & Lumbreras, 2011).. II.4.9 Tracto urinario. Hay mayor riesgo de padecer esta infección por el uso de sondas urinarias y el porcentaje de infección llega al 11% de los casos en que las Cándidas estén presentes, los síntomas más frecuentes son: fiebre, dolor en el flanco, anuria hasta el fallo renal. En las mujeres la vaginitis se la relaciona con la presencia de las. 22.

(47) Cándidas (Pineda-Murillo, Cortez-Figueroa, Uribarren-Berrueta, & CastanonOlivares, 2017).. II.4.10 Sistema nervioso central.. Su afectación es directamente a las meninges y al parénquima produciéndose unos microabscesos en ambas partes en donde la autopsia revela que la muerte se debió a un aumento de la tensión intracraneal y baja de glucosa (Peman & Zaragoza, 2012).. II.4.11 Peritonitis. Se presenta por lo general en pacientes que se someten a diálisis peritoneal continua ambulatoria y en aquellos que se le ha practicado una cirugía al intestino. Esta peritonitis es causada en la mayoría de las veces por la Cándida albicans (Peman & Zaragoza, 2012).. II.4.12 Ocular.. Se manifiesta en pacientes que han sido sometidos a cirugías y los que sufren de endoftalmitis, los síntomas son: dolor ocular, visión borrosa, etc. Pueden producir hasta la ceguera (Peman & Zaragoza, 2012).. II.4.13 Tratamientos.. Los tratamientos pueden ser de tipo tópico. En muchos casos la simple aplicación de ciertos productos van a producir un alivio o mejora en el paciente hasta la cura total como es el caso de la aplicación del vinagre blanco diluido, la solución saturada de bicarbonato de sodio, el colorante violeta de genciana, algunos fármacos como la Nistina, Imidazoles como el Ketoconazol, Clotrimazol y el Econazol (Peman & Zaragoza, 2012).. 23.

(48) Otros casos requerirán de tratamientos sistémicos por medio de: Terbinafina, Itraconazol, Fluconazol, Anfotericina B, Campofunginas, Voriconazol, Posaconazol, etc. Todos estos fármacos se deben de usar a través de un control realizado por un especialista debido a que los compuestos azólicos pueden originar infecciones más severas y resistentes como es el caso de Candidas krusei y Candidas glabrata (Peman & Zaragoza, 2012).. II.5 Antibiograma. El antibiograma microbiológicamente es la prueba para determinar la susceptibilidad (sensibilidad, intermedio o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. En el laboratorio de microbiología son utilizadas las técnicas del antibiograma que en general estudia la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos de interés (Aguila, 2016).. En un ensayo de actividad antimicrobiana de extractos vegetales, se debe seleccionar. los. microorganismos. a. utilizar,. y. escoger. antimicrobianos. estandarizados como controles positivos (Rodriguez, 2016).. II.5.1 Discos para antibiograma. Los discos para antibiograma tienen la concentración que otorga una correlación necesaria con la concentración mínima inhibitoria, dado el antibiótico, según los resultados estandarizados de resistencia o susceptibilidad.. Cada tubo de discos para antibiograma contiene 50 discos. Al momento de usarlos en cada ensayo se deben almacenar a una temperatura de 2 y 8 ºC. Los discos que se utilizan a largo plazo, deben almacenarse a -20ºC (Aguila, 2016).. II.5.2 Método por difusión en agar. Basado en el método Kirby- Bauer en el antibiograma disco placa que determina la sensibilidad del microorganismo al antimicrobiano. Se ubican en la 24.

(49) superficie de agar en una placa de Petri ya solidificado los discos de papel filtros saturado con concentraciones conocidas de los agentes microbianos. El periodo de incubación es de 18-24 horas; los antimicrobianos se difunden en el agar, y los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenidas por el método de dilución se la determina en microorganismos en crecimiento. Si la concentración del antimicrobiano es efectiva, se forma un halo de inhibición alrededor del disco. Para interpretar la CMI de una cepa, se mide el diámetro, expresado en mm del halo de la zona de inhibición. Por lo tanto, la lectura se interpreta mediante una tabla de ese fármaco, se verifica y se reporta si el microorganismo es (S) sensible, (I) intermedio (R) resistente al antimicrobiano (Rodriguez, 2016). Figura 1 Antibiograma. TSA: Agar de tríptico soya TSB: Caldo tripticasa soya SS: Sales biliares. Fuente: (Aguila, 2016) II.5.3 CMI (Concentración Inhibitoria Mínima). Es la base para medir la sensibilidad bacteriana a un antibiótico o también es la capacidad del antimicrobiano para inhibir el crecimiento de las bacterias (Aguila, 2016). 25.

(50) Hay diferentes métodos cualitativos para categorizar una cierta cepa microbiana en función de su sensibilidad frente al antibiótico en estudio (Aguila, 2016). La lectura de los halos de inhibición permite categorizar el resultado como sensible, intermedio y resistente para un determinado antimicrobiano (Aguila, 2016).  Sensible: Cuando un aislamiento microbiano es inhibido in vitro por una concentración de un antimicrobiano lo que permite producir una alta probabilidad para un efecto terapéutico exitoso (Aguila, 2016).  Intermedio: Cuando un aislamiento microbiano es inhibido parcialmente in vitro por una concentración de un antimicrobiano que sugiere un efecto terapéutico imprevisible (Aguila, 2016).  Resistente: Cuando un aislamiento microbiano no es inhibido in vitro por una concentración dada de un antimicrobiano, lo que se asocia con una alta probabilidad de efecto terapéutico nulo o muy reducido (Aguila, 2016).. 26.

(51) Interpretación de los halos de inhibición en el antibiograma. Figura 2 Diámetro de halos de inhibición. Fuente: (Estrella, 2016).. Figura 3 Interpretación de las pruebas de sensibilidad según el CLSI. Fuente: (Estrella, 2016). 27.

(52) II.5.4 Extracto. Se denomina extracto a las preparaciones que tienen una consistencia liquida, semisólidas y solidas que se pueden obtener de los tejidos vegetales o tejidos animales en condiciones secas (Castillo & Martinez , 2016).. Los extractos pueden ser de diversas naturalezas, siendo llamados extractos ajustados a los que se encuentra dentro de un rango de tolerancia aceptable siendo relacionado al metabolito con la actividad terapéutica conocida (Castillo & Martinez , 2016).. Mientras que los extractos conocidos como estandarizados se los obtiene por el ajuste del extracto con reactivos inertes, los extractos cuantificados son conocidos por el ajuste a un rango definido de constituyentes (Castillo & Martinez , 2016). Generalmente los extractos se preparan aplicando varios métodos apropiados, usualmente se ha de usar etanol u otro tipo de solventes adecuados. La droga obtenida de origen vegetal o animal debe pasar primeramente por un tratamiento preliminar, inactivación de las enzimas, una molienda o también trituración, eliminando materias indeseadas antes de la extracción (Castillo & Martinez , 2016).. Para la preparación de los diferentes extractos de los tejidos vegetales o animales en contacto con solventes orgánico, estos deben de cumplir con las normas vigentes en la farmacopea. En la situación que se presenten los extractos que sean de naturaleza densas y secos se debería de eliminar el solvente orgánico por evaporación, se puede usar solvente recuperado o reciclado, pero el procedimiento de recuperación ha de ser controlado para que el solvente cumpla los patrones apropiados antes de ser nuevamente usado o para la mezcla con otros materiales usualmente aceptados (Castillo & Martinez , 2016).. 28.

(53) En las extracciones donde se utiliza un solvente conocido se conduce a las proporciones típicas de un constituyente caracterizado en la materia extraíble. Pero durante el proceso de estandarización y cuantificación, se pueden aplicar procedimientos de purificación para incrementar estas proporciones en relación al valor esperado; a estos extractos se los conoce como “refinados” (Castillo & Martinez , 2016).. II.5.5 Obtención de extractos. Todas las plantas contienen mezclas de compuestos llamados bioactivos como los lípidos, grasas, fitoquímicos, fragancias, pigmentos y sabores que son útiles a nivel de la agroindustria alimentaria y no alimentaria, en la industria farmacéutica y en la industria cosmética (Geankopolis, 1999).. Para lograr separar estos compuestos (solutos) de la fase sólida, generalmente se pone en contacto con una fase líquida; ambas fases entran en contacto íntimo con los solutos los cuales se difunden desde el sólido a la fase líquida, lo que permite una separación de los componentes fuera su estructura natural original (Geankopolis, 1999).. Los extractos son una mezcla de soluciones fitoquímicas de plantas terapéuticas los cuales se obtienen por medio del método de maceración, filtración, usando diferentes solventes (agua destilada, alcohol, etc.), a partir de material seco (Alvarez & Bague, 2012).. La trituración del vegetal se realiza con el fin de reducir las partículas que al empapar la muestra triturada con el disolvente inicia el proceso de maceración durante un tiempo determinado. La filtración tiene como objetivo separar el residuo que queda y obtener la solución clarificada (Castillo & Martinez , 2016).. 29.

(54) CAPITULO III. MATERIALES Y MÉTODOS. III.1 Tipo de investigación. De acuerdo a las características y al alcance de los resultados, es un estudio de tipo:.  Experimental: Debido a la introducción y manipulación de los extractos para la determinación del efecto antibacteriano, ya que se cuenta con un grupo control positivo, un grupo control negativo y grupo experimental del extracto acuoso y alcohólico de los rizomas de la calaguala en diferentes concentraciones.  Transversal: Debido a que el estudio se realizó en un determinado tiempo, ya que las variables fueron observadas en un solo momento después de trascurrir un corto periodo de tiempo con una aproximación de 72 horas después de realizado el cultivo.  In vitro: Debido a que la investigación se lleva a cabo en medios de cultivo que sirven para el desarrollo de las bacterias y se manipulo de manera intencional las condiciones de la investigación.  Analítico: Debido a que nos permite analizar los diferentes componentes que presentan los extractos y como estos influyen en la acción antibacteriana.. III.2 Diseño de la investigación.. La investigación de este trabajo es experimental, se realizó con medios de cultivos, cepas biológicamente activas y la especie botánica con actividad 30.

(55) terapéutica. Para la recolección de datos, se anotaron los datos obtenidos a través de una medición de los halos de inhibición obtenidos en cultivos realizados utilizando diferentes concentraciones.. III.3 Lugar de la investigación.. La investigación se realizó en: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas en la Universidad de Guayaquil.. III.4 Período de la investigación. El trabajo se lo realizó de octubre a enero del 2019. III.5 Recursos empleados.. III.5.1 Talento humano.  Investigadores: Saltos Burgos Carolina Lisbeth, Tapia Castro Lainus Jerel.  Tutora: Q.F. Alarcón Perasso María Auxiliadora, Mgs.. III.5.2 Muestra. Calaguala (Phlebodium pseudoaureum) (Rizoma): Actividad antimicótica y antibacteriana.. 31.

(56) III.6 Metodología Técnica procedimental. En este trabajo se evalúa la actividad antimicótica y antibacteriana de la planta calaguala contra la presencia de E. coli, S. aureus y C. albicans.. III.7 Recolección y selección del material vegetal. La recolección de la planta se realizó en el mercado Florida de la ciudad de Guayaquil. Se seleccionó los rizomas a los cuales se le practicaron los análisis.. 32.

(57) III.8 Comprobación taxonómica. Figura 4 Clasificación taxonómica de la planta Phlebodium pseudoaureum. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019). 33.

(58) III.9 Secado y trituración del material vegetal. En un kilogramo del rizoma de la planta calaguala, se seleccionó los rizomas en mejores condiciones, se los llevó a lavar con agua de la llave y jabón para quitar cualquier residuo no deseado.. Una vez seleccionado el material, se picó finamente, se envolvió en papel periódico y se procedió a secar al ambiente por el lapso de 5 días.. Posterior a esto, se trituró el material vegetal desecado y se procedió con el análisis.. III.10 Factores de estudio.. Los factores de estudio de esta investigación fueron: Preparación de los extractos alcohólicos y extractos acuosos de la Calaguala. Equipos TABLA I Equipos utilizados en el análisis microbiológico. Equipos. Descripción. Estufa. Memmert. Autoclave. Memmert. Incubadora. Memmert. Mini Vortex. WWR Scientific products. Desimetro. Densimat. Refrigeradora. Durex. Mechero de Bunsen. ------------------------. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019). 34.

(59) Materiales. TABLA II Materiales usados en el laboratorio de Microbiología Materiales. Asa. Probeta. Hisopo. Gradilla. Alcohol. Cajas Petri. Algodón. Pipeta automática. Tubos de ensayo Puntas para pipeta automática. Pipetas serológicas. (amarilla y azul). Vasos de precipitación. ---------------------------------. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019) Reactivos TABLA III Reactivos que se utilizaron en el análisis microbiológico Reactivos Cepas ATCC Discos Blancos Disco Fluconazol Agar Müller Hinton Disco Gentamicina Disco Ciprofloxacina Caldo cerebro corazón. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019).. 35.

(60) III.11 Obtención de los extractos. III.11.1 Extracto alcohólico Se pesó 30 gramos del rizoma triturado en un matraz esterilizado añadiendo 120 ml alcohol 50:50; al día siguiente, se observó la absorción total del alcohol, adicionando luego 60 ml más de alcohol, con un total de 180 ml de alcohol 50:50. Se le procedió a cubrir con papel aluminio, y se maceró por un tiempo de 8 días homogenizando todos los días hasta el 8vo día; a continuación se procedió a filtrar colocando en botellas de vidrio, las mismas que fueron transportadas al laboratorio de Microbiología para posterior análisis.. III.11.2 Extracto acuoso Se pesó 30 gramos del rizoma triturado en un matraz esterilizado al cual se le adiciono de agua llevada a ebullición y luego entibiada, se procedió a envolver en papel aluminio, manteniéndolo por 24 horas con homogenizaciones continuas.. A continuación, se procedió a filtrar colocando en botellas de vidrio para posterior análisis microbiológico.. PRECAUCIÓN: Es importante resaltar que el extracto acuoso tiene un tiempo de vida útil de 24 horas después de haber sido procesado.. III.12 Análisis microbiológico. La. prueba. de. sensibilidad. tiene. como. objetivo. conocer. si. los. microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos y sirven para elegir de forma óptima el tratamiento antibacteriano y anti fúngico.. 36.

(61) Cepas Control Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Cándida Albicans ATCC 10231. Es importante destacar que las cepas fueron donadas por el Laboratorio Clínico de la Clínica Alcívar.. Para su reactivación las cepas fueron incubadas en agar Mueller Hinton.. Extracto Alcohólico y Acuoso. Para el presente trabajo de investigación del extracto al 100%, se procedió a trabajar además las diluciones al 70 y 40%.. III.12.1 Dilución de la cepa en caldo cerebro corazón: dilución de 0.5 MacFarland. En un tubo de ensayo agregar 5 ml de la solución caldo cerebro corazón posteriorment e inocular con el asa la cepa control. Llevándolo al tubo de ensayo y rotar contra las paredes del mismo para remover el exceso del inoculo agitando. 37. Homogenizándolo en el mini vortex de muestras en la solución de MacFarland cerebro corazón ajustando la escala de 0.5 mediante el equipo Densimat..

(62) III.12.2 Preparación de solución Caldo cerebro corazón al 0.5 MacFarland.. Extracto Alcohólico: Método por difusión. 1. Se preparó el agar Mueller Hinton precautelando que se adicione en la caja Petri con la cantidad suficiente de agar que alcance los 4 mm de espesor, para una correcta reacción antimicrobiana.. 2. Posterior a esto se procedió a embeber los discos blancos con el extracto alcohólico al 100%, para obtener la concentración necesaria. 3. Luego se procede a preparar las cepas control en 3 tubos S.aureus, E. coli, C. albicans usando el Caldo cerebro corazón hasta obtener una concentración de 0.5 de MacFarland.. 4. Inocular uniformemente las cepas control sobre la superficie del agar en la caja Petri. Se colocan los discos blancos embebidos del extracto alcohólico y los discos control, sobre la superficie del agar y presionar sutilmente para que los discos tengan un toque uniforme.. 5. Los discos se colocan conservando la distancia según norma establecida CLSI (Clinical Laboratoy Standards Institute), basado en el trabajo de Kirby Bauer.. 38.

(63) 6. Por lo tanto, son 3 cajas Petri control y 3 cajas Petri para los discos embebidos para cada extracto. Es importante recalcar que el trabajo se realizó por triplicado con sus diferentes concentraciones. 7. Incubar las cajas a 37ºC +- 2ºC y leer las cajas después de 24 horas.. Extracto Acuoso: Método por difusión. 1. Se preparó el agar Mueller Hinton precautelando que se adicione en la caja Petri la cantidad suficiente de agar que alcance los 4 mm de espesor, para una correcta reacción antimicrobiana.. 2. Posterior a esto se procedió a embeber los discos blancos con el extracto acuoso al 100%, y sus diluciones del 70 y 40%.. 3. Luego se procedió a preparar las cepas control en 3 tubos S. aureus, E. Coli, C. albicans usando el Caldo cerebro corazón en una concentración de 0.5 de MacFarland.. 4. Inocular uniformemente las cepas control sobre la superficie del agar en la caja Petri, en lo cual se colocan los discos blancos embebidos del extracto acuoso con sus diversas concentraciones como también los discos control. Presionar sutilmente para que los discos tengan un toque uniforme.. 5. Los discos se colocan conservando la distancia según la norma establecida por la CLSI (Clinical Laboratoy Standards Institute, basado en el trabajo de Kirby Bauer.. 6. Por lo tanto, son 3 cajas Petri control y 9 cajas Petri para los discos embebidos con el extracto acuoso por triplicado.. 7. Incubar las cajas a 37ºC +- 2ºC y leer las cajas después de 24 horas. 39.

(64) CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.. IV.1 Resultados: Extracto alcohólico. Se pudo observar que de las diluciones realizadas al 40% - 70% y 100% del extracto alcohólico, solamente la concentración del 100% presentó sensibilidad frente a los microorganismos S. aureus y C. Albicans (Tabla IV y grafico 1).. El antibiótico disco control que se utilizó fue Ciprofloxacina para S. aureus, Gentamicina. para. E.. coli. y. Fluconazol. para. C.. albicans.. TABLA IV Resultados del Extracto Alcohólico. Cepa. Discos. testeada. control. Staphylococ. Ciproflox. cus aureus. acina. Echerichia. Gentamic. coli. ina. Candida. Fluconaz. albicans. ol. Concentraci ón del disco control. Halo de inhibición del disco control. Discos con el extracto. Halos de inhibición. 5 µg. 15 mm. -. 12 mm. 30 µg. 15 mm. -. 6 mm. 25 µg. 10 mm. -. 8 mm. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019) Halos de inhibición Según los criterios que han sido emitidos por la Sociedad Latinoamérica de Fitomedicina en el documento que dice “Técnicas de Comprobación de la Actividad Terapéutica las Plantas Medicinales”, se indica que, si el halo es mayor a 9 mm, el resultado es positivo, es decir es susceptible. 40.

(65) Si el halo es menor a 9, de entre 6 – 9 mm se considera que la actividad es intermedia o susceptible dependiendo de las concentraciones de los extractos.. Si el halo es inferior a 6 mm se considera negativo o llamado también resistente; todos estos valores se aplican solamente para los extractos de origen vegetal (Morales & Dentone, 2017). Gráfico 1 Resultado de la actividad antimicrobiana del extracto alcohólico. Resultado de la actividad antimicrobiana del extracto alcoholico. 12. 12. milimetros. 10 8. 8 6. 6 4 2 0 STAPHYLOCOCCUS AUREUS. ESCHERICHIA COLI. CANDIDA ALBICANS. Halo de inhibicion. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019) IV. 2 Resultados: Extracto acuoso. El resultado obtenido del extracto acuoso, frente a los diferentes microorganismos analizados demostró ser resistente a todos ellos. Nota: El antibiótico disco control que se utilizó fue Ciprofloxacina para S. aureus, Gentamicina para E. coli y Fluconazol para C. albicans.. 41.

(66) TABLA V Resultados del Extracto Acuoso. Cepas. Discos. testeadas. control. Staphylococcus. Ciproflo. aureus. xacina. E. coli. Gentami cina. Candida. Flucona. albicans. zol. Halo de. Concentraci. inhibición. ón del disco. del disco. control. control. Halos de. Discos del extracto. 5 µg. 15 mm. -. 30 µg. 15 mm. -. 25 µg. 10 mm. -. inhibición 40. 70. 100. %. %. %. 6. 6. 6. mm mm 6. mm mm 6. Halo de inhibición de diferentes concentraciones del extracto acuoso. 6. mm. 5 4 3. 2 1 0 Staphylococcus aureus. Escherichia coli. Candida albicans. Porcentaje 40%. 70%. 100%. Elaborado por: (Saltos & Tapia, 2019). 42. 6. mm mm. Gráfico 2 Halo de inhibición del extracto acuoso. 7. 6. mm 6 mm 6 mm.