Bovine leukemia virus detection in Creole Colombian breeds using nested-PCR

ganado criollo colombiano mediante PCR-anidado

Darwin Yovanny Hernández-Herrera1†, Andrés Mauricio Posso-Terranova1, Javier Antonio Benavides1, Jaime Eduardo Muñoz-Flórez1, Guillermo Giovambattista2, y Luz Ángela Álvarez-Franco1*

1_{Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. A.A 237, Palmira, Valle del Cauca, Colombia.} 2_{Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de la Plata, A.A. 296,} Argentina.

*Autor para correspondencia: [email protected]; †[email protected]

Rec.: 19.05.11 Acept.: 23.12.11

Resumen

!" #$% & ' ( )+ ($ - / - -/ - --- -% -% -4/ -8< = = " > ? ?&B-"' D->E4&G> &H E'

%-"E>==J K "L ++env viral,

me--J H"> &=+ -%MJO>!O "G>D- "" )Q!O---->-8< virus fue de 26.7%, 23.3% y 16.7% respectivamente; no se encontró el virus en BON, SM y RS. En las razas foráneas la presencia fue de 83.3% para H y 6.7% para B. Se encontró dependencia altamente +L > &]> + +" JG & H" 4H E" "%4 %" > + 4 > ^J

Palabras clave: Diagnóstico molecular, ganado criollo, leucosis bovina enzoótica. Abstract

D+!#$"H "+%- ( )+ ($- /--/ - --- -% -% -4/ -8< = = "? ?`>%-" ' D--E4&G` %"E==j%

Hk-" `% +%%Hk-"LH + +env (provirus detection –

K-J<% +H ` wxJ H `%+% = H`>-%MJO!O >jGD- %` the same percentage (50%). In CAS, CCC and CQT the presence of virus was 26.7%, 23.3% y 16.7% respectively. On the other hand, no virus presence was found in BON, SM and RS. For the introduced breeds the presence of virus was 83.3% for H and 6.7% for B. The average of presence for Creole bovine `` % J%+%+L`H`% H`% ]"+J<% `` "%H" and in the northern part than the southwestern and central areas of the country.

Introducción

& G una enfermedad infecciosa producida por un retrovirus, el virus de la leucosis 4 H B ^ linfoide, los linfocitos B (Beyer et ál., 2002; #4et ál., 1999). Se caracteriza por " H " j H" "+?>‚ " número absoluto de linfocitos en la corriente +^H #

et ál., 1996).

G H" -viridae, posee una transcriptasa-reversa responsable de la síntesis de una copia de ADN a partir de ARN viral. El ADN formado (provirus) se integra al genoma del hospedero > B (Evermann, 1992).

"H^G"-&B/"" emaciación e infertilidad. El signo más evi-dente es el aumento bilateral más o menos si-"B ++HE] la exoftalmia puede considerarse como una "H ^L H " así como masas tumorales subcutáneas en diferentes localizaciones (linfoadenopatías) (Chamizo, 2005; Malatestinic, 2003; Shell et ál., 2004).

H "H "% -& ^ +BJ aumenta a partir de seis meses de edad del vacuno, con la mayor incidencia entre dos y /"> % %4 -%"& 2005).

+ "E -das en el diagnóstico de la enfermedad son: radioinmunoensayo (RIA), inmunodifusión en agar gel (IGDA) y ensayo inmunoenzimá-G‡J‡ˆ# LH > + L + +" J prueba no permite distinguir entre los 4 " >4 "H J ‡>G‡"E >") " costosa, más fácil de realizar y se pueden

analizar muchas muestras provenientes de leche y no de sangre (González et ál., 2001). D)B4 " ")H-dos o animales en estadios tempranos de la infección (Chamizo, 2005).

% E-cleídos (‘dot blot’) es altamente repetible y ‡ˆ#J resultados con ‘dot blot’ se obtienen en un E "E 4 ‡ˆ# (Chamizo, 2005).

%& -" -"-" de seis meses para evitar reacciones falsas positivas, causadas por la transferencia pasi-"+ B J ( ) -tectar el virus en animales inmunotolerantes, además, muestra una sensibilidad de 96% y L‰QO prueba de IGDA (Agresti et ál., 1993; Fechner

et ál.,1996).

)-variación de la secuencia nucleotídica de +" 4 inducir a errores en la hibridación de los oligonucleótidos utilizados como cebadores y disminuir consecuentemente, la sensibi-lidad (Marsolais et ál., 1994). Igualmente, en el proceso de extracción de ADN pueden &% 4H sensibilidad (Fechner et ál., 1996).

Según la Organización Mundial de Sa-nidad Animal (OIE, 2009) entre 1996 y 2004 en Colombia se presentaron 198 focos de la enfermedad, 1.083 casos y 39 muertes debi-J -" pues dependen de la región de muestreo de ">B +-&JG ^ ) de presencia varía entre el 3.9% y el 14.64% & B "H gel de agar (IGDA) (Aguilar et ál., 1989; Tru-)Š‹M‹j&Š‹‹QJ"^ &et ál. (2002) reportan una presencia del 37.5% en novillas y un 71.9% en vacas. En el departamento de Córdoba se encontró 21.5% de positivos utili-&BG‡ancur y Rodas, Œ!!M" 4+E

—principal zona lechera de Colombia—se reportó 45.28% de presencia (Alfonso et ál., Š‹‹MJˆ HL%et ál (1982) encontraron pre-valencias en ganado de leche de 24.9% para la región Andina, 14.4% para la región Caribe > ŠQJ O " ( JD&"B" -K?/&et ál (2008) hallaron 25% de presencia del virus.

Colombia es considerado uno de los paí-"E &+B> 4 + > % + EL ^( y Amazonas posee una raza bovina criolla (Bos taurus) adaptada, así: Romosinuano y -/- -E (zona norte); Chino Santandereano y Blanco ( )+ & "/ " medio; Hartón del Valle en el Valle del Río -j " > - / j4/ -" -4Ej -"E & B " ->E4&-? ^&-Correal, 1992J & ) &B, forman el ganado crio-llo colombiano (GCC) con una población de ŠMJŒŠ"4 !J!MO de la población total de bovinos del país (Martínez-Correal, 2010).

G) )H determinar la presencia del virus de la leucosis bovina & >B" "B" -J

Materiales y métodos

Se utilizaron muestras de sangre de 30 indi-viduos de cada raza de ganado criollo )+ ($ -% -%-/ ----4/ -8< - / - ? (SM), Romosinuano (RS), Hartón del Valle = &BE4&G > D- > & H E ==> %"EJ" fueron muestreados en los departamentos de E ^ --4E Cauca, Meta, Santander y Valle del Cauca durante el 2009, para un total de 240 + ! &B colombianas y 60 de las razas foráneas. El

"/ " ?/&et álŒ!!M‹!OL&> 0.01 de margen de error máximo absoluto. En el Valle del Cauca se muestrearon HV (seis LL>=Lj-% -8<>?" L -4E>? respectivamente. En las demás razas sólo " " LJG($ "4> Caldas, fue muestreado en el departamento del Cauca. El 90% de los machos muestrea-dos eran reproductores activos.

G #$ ] ) partir de muestras de sangre mediante el protocolo de Salting Out (Miller et ál., 1988). "#$ H+"& -ciones conocidas y visualizado mediante geles + !JMO/ " etidio (Hernández et ál., 2007). El ADN fue diluido a 10 ng/μl. En cada reacción de PCR se utilizaron testigos positivos y negativos " ‡ˆB la Universidad Nacional de Colombia; el ADN +] ) + metodología descrita por Klein et ál (1997).

A partir del ADN de los bovinos se ampli-L +" +

env &B-K

(Beier et ál., Œ!!ŠJ " &"L!’4-nía 100 ng de ADN, 1.25 mM de cada oligonu-cleótido (F-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA y R-AACAACAACCTCTGGGGAGGGT), 0.2 mM $<Šw"-ŒJQ"? MgCl₂>ŠD<4#$" JG segunda reacción de PCR se utilizó como ADN molde 3 μl del producto de PCR de la primera "L>"" de los otros reactivos con los oligonucleó-tidos F-CCCACA AGGGCGGCGCCGGT T T y R-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG. El LB ">-ralización inicial a 94 °C por 5 min, seguido por 40 ciclos de 94 °C por 30 seg, 57 °C por 30 seg y 72 °C por 1 min, para terminar con ]L“Œ”- Q"JG segunda reacción las condiciones fueron las ""]4" %

-dación se aumentó a 68 °C (Beier et ál.,2001). "L termociclador PTC-100® Teltier Thermal ‡(K#J "L se visualizaron en geles de agarosa al 1.2% / " E" DK-G• ˆ< ‡(K#J D 444bp indicó la presencia del provirus en un individuo (Beier et ál.,2001).

Para los análisis estadísticos se formaron los siguientes grupos: razas criollas (BON, CAS, CCC, ChS, CQT, HV, RS y SM), razas B " D- > G > & H E=>j " ) de presencia del virus para cada raza y sexo. "+ región de origen de la muestra así: Norte (CCC, -%>- G( ->?> (($-8<=>D-^J Se realizaron pruebas de chi-cuadrado (X²) para determinar la dependencia entre la presencia del virus y la raza, el sexo y el

origen de la muestra, utilizando el software SAS versión 9.1 (SAS, 2003).

Resultados y discusión

G " ) & de ganado criollo colombiano con utilización B " J 4 L " de sangre de bovinos.

En el Cuadro 1 se incluye la presencia del O &>] + JG ) H"> & HV y ChS (83.3% y 60%, respectivamente), G>D- "" ) presencia (50%), y la presencia del virus en CAS, CCC y CQT fue de 26.7%, 23.3% y 16.7% respectivamente.

$ &($ SM y RS. Dada la alta prevalencia de la

enfer-Cuadro 1. O & "

B >H EJ

Grupo raciala _{Razas Presencia}

(%) Por sexo Machos Hembras No. (%) No. (%) Criollas BON 0.0 8 0.0 22 0.0 CAS 26.7 6 3.3 24 23.3 CCC 23.3 3 3.3 27 20.0 ChS 60.0 5 16.6 25 43.3 CQT 16.7 5 0.0 25 16.7 HV 83.3 4 13.3 26 70.0 RS 0.0 7 0.0 23 0.0 SM 0.0 3 0.0 27 0.0 Promedio 26.7 4.6 21.7 B D- 50 0 0.0 30 50.0 G 50 11 20.0 19 30.0 Promedio 50 10.0 40.0 Foráneas B 6.7 1 3.3 29 3.3 H 83.3 0 0.0 30 83.3 Promedio 45.0 1.65 43.3 J- '( )+ ($- /--/- ----% ----%-4/-8<= =" >? ?JB"' D->E4&GJ– E-neas: Brahmán (B) y Holstein (H).

medad en Colombia, este hallazgo puede su-+ razas, por lo cual es necesario continuar con "> " L L los síntomas de la leucosis bovina enzoótica >" +B la enfermedad.

El promedio de presencia en las razas ŒJ“O > B " Q!OH" 4 " & =MJO "> 4J“OJG resultados concuerdan con los de Chamizo Œ!!Q4L "4]">

-+Bos taurus 4

en los Bos indicus>( )et ál (2000) 4 4 ‹J‰O Bos taurus y el 1.4% de los Bos indicus muestrea-dos eran positivos a la enfermedad, mientras 4" &H J

+ foráneos fue de 6.7% en B y 83.3% en H. De acuerdo con Chamizo (2005) en las razas de ganado de leche la presencia de la enferme-"> 4+ a la mayor exposición de estos animales a HH"+) " 4 + + entre otros.

mediante chi-cuadrado (X²) dio como 4 & wx — Œ!‹JŒj ˜ !J!!Š a lo reportado por Betancur y Rodas (2008) 4 razas cebuinas, europeas y cruzados con la H "JG 4 la presencia del virus en las razas BON, SM y RS, lo cual puede ser un indicador del buen ")> 4 hatos de donde provienen estas muestras o es-tar relacionado con una posible resistencia al virus, lo cual debe ser comprobado en futuros estudios realizados en un mayor número de hatos, en los cuales, además de la presencia del virus, se estudie la presencia de síntomas de la enfermedad.

"B" H +L ˜ !J!Q >]wx—!J!M‰Œj ˜!J!““Š4H"> %" 4

en los machos, tanto en las razas criollas (21.7% y 4.6%, respectivamente), como en las B"‰!O>Š!O -"- ŠJG / 4 ]""‹!O"% muestreados correspondían a reproductores J > Œ!!M4 4MJO de las hembras y el 31.4% de los machos fueron positivos a la enfermedad. Chamizo Œ!!Q 4H ") como rutinas de palpación, inseminación L> / %4 %" B"E 4"% a contagiarse.

y la región de origen de las muestras fue al-"+Lwx—JMMj˜!J!!ŠJ &" & Colombia (CCC, ChS y RS) tuvieron un 25% de presencia del virus, 13% en la región oriental ->?Q!O + G> K &($-8<=>D-33% de los individuos fueron positivos al Jˆ HL%et ál (1982) en ganado de leche encontraron prevalencias del 24.9% para la + J & G + la zona centro de Colombia, mostró un 50% ) las diferencias entre este valor y el reportado ˆ HL%et ál Š‹MŒ4 investigadores diagnostican la presencia de la enfermedad y no del virus.

En las muestras recolectadas en el orien-te colombiano, en SM no se observó presencia >- ) HŒJ“O "E4 ˆ HL%et ál (1982) para ganado de leche (15.3%) en esta misma zona del país.

En los animales de la región norte de Colombia se encontraron presencias de 0% ŒJO--->!O-%J( )

et ál (2000) en esta misma región, utilizando B"H ŠJQO " examinados. En el departamento de Córdoba se encontró un 21.5% de animales positivos &BG‡ >-Œ!!M" 4ˆ HL%et ál (1982) reportan prevalencias en ganado de leche del 14.4%. Con excepción de los animales

Ro-mosinuano, los valores de presencia del virus " 4 % )J

G=>D- ) del virus fue del 83.3% y del 50% respectiva-mente, en las muestras evaluadas. Utilizando -?/&et ál (2008) encontra-ron 25% de presencia del virus mediante la evaluación de un banco de ADN de diferentes razas, en muestras tomadas en el Valle del - "E)4 )J

Conclusiones

$ -zas BON, SM y RS. Dada la alta prevalencia G-"%&+ sugerir una posible resistencia de estas ra-& J razas como HV y ChS debe ser investigada con mayor detalle. Es necesario continuar "> " L en los cuales se evalúen las condiciones de ")"> ^"G >" +B la enfermedad.

Agradecimientos

A la Dirección Nacional de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia-Palmira #‡ L >Œ!!!!! y a los criadores de Ganado Criollo Colom-4 Colom-4; Colom-4;Colom-4; J Referencias + Jjˆ -Jj>&JŠ‹M‹J +G&% % ? ™4J < )+ ?B JD 4J – ? -naria y de Zootecnia. Medellín, 61 p.

Agresti, A.; Ponti, W.; Rocchi, M.; Meneveri, R.; Ma-rozzi, A.; Cavalleri, D.; Peri, E.; Poli, G.; Ginelli, E. 1993. Use polymerase chain reaction to diagnose bovine leukemia virus infection in calves at birth.

Am J Vet Res. 54 (3): 373-378.

Alfonso, R.; Almansa, J. E.; y Barrera, J. C. 1998. Prevalencia serológica y evaluación de los facto-res de riesgo de la leucosis bovina enzootica en

+E>DB> -%44 E-"JRev. Sic. Tech. Off. Int. Epiz. 17 (3): 723-732.

#JjkJj? 4 (Jj&"k žJŒ!!ŠJ‡LHHH

>-–#$4+JBerl

Münch Tieräztl Wschr 114: 252-256.

Betancur H., C.; Rodas G., J. 2008. Seroprevalencia del virus de la leucosis viral bovina en animales con trastornos reproductivos de Montería. Rev MVZ Córdoba, 13 (1): 1197-1204.

Beyer, J.; Köllner, B.; Teifke, J. P.; Starick, E.; Beier, #Jj"Jjˆ `DJjŸ ?JŒ!!ŒJ -H`%k" "> not only develop persistent B-cell lymphocytosis, but also persistent B-cell lymphopenia. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Healt 49 (6): 270-277. -%"& GJˆJ Œ!!QJ G&'

Revisión. Revista Electrónica de Veterinaria RE-DVET, Vol VI, No 7.

#-JjˆH >JJj%&J#Jj< -J-J 1996. Wild type p53 reduces the size of tumors >k" HJ

Cancer Lett. 101: 115-122.

#4 –Jj ˆJ =Jj =" J <Jj -chard, S. M.; Davis, W. C.; Kerkhofs, P.; Burny, A.; "Jj "JŠ‹‹‹Jk" Virus-induced persistent lymphocytosis in cattle does not correlate with increased ex vivo survival of B-lymphocytes. J. Virol. 73 (2): 1127-1137. G "žJŠ‹‹ŒJD +HJ

How far we have come in a decade. Vet. Med. 87: 246.

–% =Jj  + Jj ˆ Jj k Jj Mewes, G.; Ebner, D.; Beier, D. 1996. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application + H k" infection in naturally infected cattle. Zentralbl Veterinarmed B 43 (10): 621-630.

ˆ HL%‡JJjˆ+?J‡Jj>"J-JŠ‹MŒJ – H >B " ganado de leche en Colombia. Colombia: División de Disciplinas Pecuarias, ICA. 168 p.

González, E.T.; Oliva, G.A.; Valera, A.; Bonzo, E.; ?Jj>G% + & ' B +‡#G‡ -inoculados experimentalmente. Analecta Veteri-naria 21 (2): 12-20.

= E&#Jj?/&#Jj$JjJj> ?/&žJGJŒ!!“J- &" pato criollo colombiano en cuatro departamentos.

Acta Agronómica 56 (3): 141-145.

Klein, A.; Barsuk, R.; Dagan, S.; Nusbaum, O.; Shou-val, D.; Galun, E. 1997. Comparison of methods

for extraction of the nucleic acid from hemolytic "H -"LH%

#$4JJournal of Clinical Microbiology

35 (7): 1897-1899.

Malatestinic, A. 2003. Bilateral exophthalmos in a Holstein cow with lymphosarcoma. Can. Vet. J.

44 (8): 664-666.

Marsolais, G.; Dubuc, R.; Bergeron, J.; Morrey, J. D.; Kelly, E. J.; Jackson, M. K. 1994. Importan-ce of primer selection in the application of PCR technology to the diagnosis of bovine leukemia virus. J Vet Diagn Invest 6: 297-301.

Martínez-Correal, G. 1992. El ganado criollo co-" )+ ($J ‡ Colombiano Agropecuario (ICA), Villavicencio, ?-((?‡JG"ˆ Information. Organización de las Naciones Uni-das para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y Programa de la Naciones Unidas para el Medio Ambiente (UNEP). Pp. 27-35.

Martínez-Correal, G. 2010. Plan nacional de acción ") ">& +B" Colombia. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), Mi-nisterio de Agricultura y Desarrollo Rural. 180 p. Miller, S. A.; Dikes, D. D.; Polesky, H. F. 1988. A

simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 16 (3): 1215.

?/&#JjJj>?/&žJŒ!!MJ# la leucosis bovina utilizando reacción en cadena

de la polimerasa (PCR). Rev Colomb Cienc Pecu

21: 153-161.

Organización Mundial De Sanidad Animal (OIE) Disponible en: http://www.oie.int/esp/es_index. htm 13-07-2009.

( ) žJj $ ?Jj Jj 4-"Jj- &GJj? JJŒ!!!J y productividad en bovinos de la Costa Norte de Colombia. Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). 10 p.

"^ &$Jjˆ ˆJj Jj>ˆ"&-J 2002. Diagnostico epidemiológico referente a va-rias patologías de bovinos en tres haciendas de la D 4J<+ ? Veterinario) Facultad de Ciencias Agrarias, 4JJ

Ruiz, I. 1995. Avance de resultados Municipio de San žB?/JGH &% 4JD 4> JŒ‹J

SAS. 2003. Users guide for windows environment. 9.1 Ed, Cary, SAS Institute Inc.

Shell, A.; Heckert, H.; Muller, K. 2004. Case report: lymphosarcoma in a cow. Dtsch Tierarztl Wochens-chr 111 (1): 38-41.

< )JŠ‹M‹JG + %>J< )+-ción. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Medellín. 50 p.