UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo de
Apis mellifera sobre el crecimiento de Microsporum gypseum
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
BIÓLOGO MICROBIOLOGO
Autor: Br. Riveros Blanco, Reyshell Anabell Asesor: DR. Wilson Krugg, Juan Hector
Trujillo – Perú 2022
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I. PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En las disposiciones y cumplimiento que establece el Régimen de Grados y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y elevado criterio el presente informe de tesis titulado: Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo de Apis mellifera sobre el crecimiento de Microsporum gypseum
Con el cual pretendo optar el Título Profesional de Biólogo
Trujillo, 29 de noviembre del 2022
____________________________________________
Br. Riveros Blanco Reyshell Anabell
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II. DEL ASESOR
El que escribe, profesor asesor de la presente tesis para optar por el Título Profesional de Biólogo, certifica, que ha sido desarrollada en conformidad con los objetivos propuestos y el informe ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo al Br. Riveros Blanco Reyshell Anabell a continuar con los trámites correspondientes.
_____________________________________________
Dr. Wilson Krugg, Juan Hector
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III. JURADO DICTAMINADOR
______________________________________________________________
Ms.C. IVAN WILFREDO ANGULO CASTRO PRESIDENTE
____________________________________________________________
Dra. MANUELA NATIVIDAD LUJÁN VELÁSQUEZ SECRETARIO
_____________________________________________
Mblgo. GERARDO ALAYO ESPINOZA MIEMBRO
___________________________________________
Dr. JUAN HECTOR WILSON KRUGG MIEMBRO ASESOR
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IV. DEDICATORIA
A mis padres, por sus enseñanzas, por su comprensión y apoyo en mi trayectoria de vida, por ser mi motivación para cumplir todos mis objetivos.
A mi hermana por brindarme su atención, sus palabras y mensajes de aliento en los momentos de fragilidad.
A mi hermosa familia, por su apoyo incondicional en cada paso que he dado y sigo dando en mi día a día.
Riveros Blanco Reyshell Anabell
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INDICE
II. PRESENTACIÓN ...ii
III. DEL ASESOR ... iii
IV. JURADO DICTAMINADOR ... iv
V. DEDICATORIA ... v
VI. INDICE .………vi
VII. RESUMEN ... vii
VIII. ABSTRACT ... viii
1. INTRODUCCIÓN ... 1
REALIDAD PROBLEMÁTICA ... 1
JUSTIFICACIÓN Y RELEVANCIA ... 2
PROBLEMA ... 3
HIPOTESIS ... 3
2. MATERIAL Y MÉTODOS ... 4
2.1. Tipo de investigación ... 4
2.2. Población, muestra ... 4
2.3. Criterios de inclusión ... 4
2.4. Unidad de análisis ... 4
2.5. Procedimiento ... 4
2.6. Definición de variables ... 5
2.7. Consideraciones éticas y de rigor ... 6
3. RESULTADOS ... 7
4. DISCUSIÓN ... 9
5. CONCLUSIÓN ... 12
6. RECOMENDACIONES ... 13
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 14
ANEXOS ... 18
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V. RESUMEN
El objetivo del estudio fue evaluar el efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo (EEP) de Apis mellifera a concentraciones de 5%, 10% y 15% sobre el crecimiento de Microsporum gypseum con un diseño experimental de tipo estimulo creciente. Se recolectó el propóleo de las colmenas en la ciudad de Cajabamba, se trabajó con cultivo de M. gypseum proporcionado por el Laboratorio de Fitopatología del departamento académico de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo. Para la evaluación de la actividad del EEP, se utilizó el líquido obtenido de la destilación en un rotavapor, el cual fue adicionado en matraces que contenían Agar Sabouraud, se agregó la cantidad necesaria a fin de obtener las concentraciones deseadas, y se vertió en placas Petri. No se agregó EEP al matraz que fue usado para las placas control. Se sembró por puntura M. gypseum en el centro de cada placa. Se llevó a incubación a 25°C por 14 días. La lectura se realizó a partir del tercer día hasta el onceavo día post – siembra, se midió el radio de crecimiento de cada colonia y se comparó con el radio de crecimiento de las placas control. Los resultados mostraron que frente a diferentes concentraciones de EEP, no hay crecimiento de Microsporum gypseum, demostrando un posible efecto fungicida del EEP.
Palabras clave: extracto etanólico, propóleo, Microsporum gypseum, concentración.
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VI. ABSTRACT
The objective of the study was to evaluate the in vitro effect of the ethanolic extract of propolis (EEP) from Apis mellifera at concentrations of 5%, 10% and 15%
on the growth of Microsporum gypseum with an experimental design of increasing stimulus type. Propolis was collected from hives in the city of Cajabamba, working with culture of M. gypseum provided by the Phytopathology Laboratory of the academic department of Microbiology and Parasitology of the National University of Trujillo. For the evaluation of the EEP activity, the liquid obtained from the distillation in a rotary evaporator was used, which was added in flasks containing Sabouraud's Agar, the necessary amount was added in order to obtain the desired concentrations, and it was poured into plates. Petri. EEP was not added to the flask that was used for the control plates. M. gypseum was punctured in the center of each plate. It was incubated at 25°C for 14 days. The reading was made from the third day to the eleventh day post-seeding, the growth radius of each colony was measured and compared with the growth radius of the control plates. The results showed that against different concentrations of EEP, there is no growth of Microsporum gypseum, demonstrating a possible fungicidal effect of EEP.
Keywords: ethanolic extract, propolis, Microsporum gypseum, concentration.
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1. INTRODUCCIÓN
REALIDAD PROBLEMÁTICA
Microsporum spp es uno de los principales géneros de dermatofitos, aislado a nivel mundial, causante de micosis superficial, conocido como tiña. Son dermatofitos filamentosos, que invaden superficies queratinosas de animales, y seres humanos, puesto que están en contacto, esto conlleva a un problema que afecta a la salud pública
1-3.
Microsporum gypseum es una de las especies que pertenece a este género, un hongo geofílico, que afecta a animales domésticos especialmente a perros y gatos 4, además es causante de un 20% del total de casos de dermatofitosis en humanos con una prevalencia que varía dependiendo de diferentes factores como el área geográfica, el huésped y el ambiente. Además M. gypseum es el segundo causante de infecciones dermatofíticas en gatos con un 55% de casos, y 37.7% en perros; demostrando la mayor prevalencia en estos animales 6.
M. gypseum es transmitido a seres humanos, siendo los más susceptibles los niños y adolescentes 7, y en menores casos en adultos 8, ocasionando micosis superficial, principalmente tiña en el cuero cabelludo, piel y uñas 5,9. Países como Nigeria muestran un alto porcentaje de casos diagnosticados con tiña en la cabeza, teniendo como agentes causales a M. canis y M. gypseum. Las lesiones causadas por este hongo se presentan como lesiones eritematosas escamosas con pústulas en el interior o en los bordes, de manera que se puede parecer a otras dermatitis inflamatorias e infecciones secundarias teniendo como consecuencia un mal diagnóstico. Usualmente para el tratamiento de estas dermatosis hacen uso de corticoides tópicos y antibióticos que pueden afectar a la salud de los pacientes. También pueden presentarse otros patrones clínicos, como placa eritematosa de bordes bien definidos, característica de micosis, o lesiones atípicas, como placas con aspecto esclerodermiforme o costrosa 7.
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JUSTIFICACIÓN Y RELEVANCIA
Por otra parte, se ha demostrado que el uso de productos naturales como aceites esenciales, extractos etanólicos o extractos acuosos obtenidos de plantas y derivados de la actividad animal, son una alternativa para inhibir el crecimiento de diversos dermatofitos 13-15.
El propóleo es un producto natural, recolectado de diversas fuentes por las abejas melíferas (Apis mellifera), está formado por las resinas de diferentes plantas junto con ceras, aceites esenciales y polen 16 permitiendo la diversificación de dicho producto 17; así mismo cumple la función de protección ante diversos microorganismos como bacterias, hongos o parásitos 18.
Se ha demostrado que el propóleo tiene un gran potencial terapéutico y diversas propiedades biológicas tales como: antibacterianas, antifúngicas, antivíricas, antioxidantes, antiprotozoarias, anestésicas, antiinflamatorias, antitumorales, antisépticas, antimutagénicas, antihepatotóxicas y anticancerígenas 19-25. Sus componentes como los ácidos aromáticos, los ácidos diterpénicos y los compuestos fenólicos son los principales responsables de su actividad biológica 19,20,22,26,
encontrando en este último componente las principales sustancias que tienen actividad antifúngica 17,27. La composición química del propóleo depende de varios factores, como su origen botánico, origen geográfico y tiempo de recolección, así como también puede verse influenciada por diferentes zonas de temperatura en las regiones de recolección27. El extracto etanólico de propóleo tiene efectividad antifúngica contra diversos hongos, entre ellos algunos dermatofitos; además teniendo en cuenta que M. gypseum es una especie geofílico perteneciente a este grupo causante de enfermedades dermatofíticas, no se ha encontrado relación que demuestre el efecto de este extracto contra M. gypseum.
El objetivo del estudio fue evaluar el efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo (EEP) de Apis mellifera a concentraciones de 5%, 10% y 15% sobre el crecimiento de M. gypseum, con la finalidad de plantear su uso para un posible tratamiento de la micosis causada por este hongo, siendo una alternativa favorable, al ser un producto natural que no conlleva a consecuencias negativas como daños en la salud.
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PROBLEMA
¿Cuál es el efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo de Apis mellifera a concentraciones de 5%, 10% y 15% sobre el crecimiento de Microsporum gypseum?
HIPOTESIS
Concentraciones de 5%, 10% y 15% de extracto etanólico de propóleo de Apis mellifera inhibe el crecimiento in vitro de M. gypseum.
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2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Tipo de investigación Básica experimental 2.2. Población, muestra
Población: Propóleo de Apis mellifera procedente de la provincia de Cajabamba, Cajamarca.
Muestra: 150 g de propóleo de Apis mellifera procedente de la provincia de Cajabamba, Cajamarca.
2.3. Criterios de inclusión
Propóleo extraído de colmenas en buen estado.
2.4. Unidad de análisis
Cultivo de Microsporum gypseum -FPMG1 proporcionado por el Laboratorio de Fitopatología del departamento académico de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
2.5. Procedimiento
2.5.1. Recolección y transporte de Propóleo
Se realizó la recolección, con ayuda de una espátula de acero, raspando los marcos y cubre paneles de tres a cinco colmenas. El propóleo se almacenó en bolsas herméticas para conservar su estado, posteriormente se transportó al Laboratorio de Fitopatología del Departamento académico de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, para su procesamiento respectivo.
2.5.2. Preparación del extracto etanólico
Se retiraron las impurezas (restos de vegetales, restos de abejas muertas) que presentó el propóleo recolectado, luego se llevó a refrigeración a -4°C por 24h; acto seguido, utilizando un mortero, el propóleo se trituró hasta obtener pedazos pequeños 27.
A continuación, se agregaron 150g de propóleo triturado con 500ml de alcohol etílico al 96% en un frasco ámbar de vidrio, se dejó macerar por 24
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días a 37°C realizando agitación ocasional dos veces al día durante 10 a 15 minutos 32. Pasado el tiempo de maceración, se filtró con papel de filtro Whatman N° 40, y luego se realizó la filtración al vacío 33. Seguidamente se envió al Laboratorio Funcional de Farmacia y Bioquímica para que sea destilado en un rotaevaporador a presión reducida a 40°C por 1h 30’ 4, la muestra resultante estaba a una concentración de 1.07 g/mL. A partir de este destilado se prepararon las concentraciones de 5%, 10% y 15%.
2.5.3. Obtención de inóculo
A partir del cultivo puro de M. gypseum, este se subcultivó en tubos de ensayo que contenían agar Sabouraud y se incubó a 25°C por 14 días a fin de obtener un cultivo con esporas. Pasado este tiempo, a partir de este cultivo se procedió a sembrar en placas de Petri con medio agar Sabouraud, y se incubó a 25°C por 14 días.
2.5.4. Determinación de la actividad del extracto etanólico de propóleo El medio Agar Sabouraud se preparó en cuatro matraces, a tres de ellos se agregó EEP de manera que se obtuvo de 5%, 10% y 15% de concentración respectivamente en cada matraz, al cuarto matraz no se le agregó ninguna concentración de este extracto, ya que fue usado para el control; el contenido de cada matraz se sirvió en placas de Petri.
De los cultivos donde se obtuvo el inóculo, se procedió a sembrar por puntura en el centro de cada una de las placas anteriormente servidas, luego se incubaron a 25°C por 11 días.
Durante este tiempo, se midieron los diámetros de las colonias, posteriormente se calculó el radio y se compararon con las placas control, que no contienen extracto etanólico de propóleo, para determinar el crecimiento radial expresado en milímetros.
2.6. Definición de variables
Variable independiente: Concentraciones de 5%, 10%, y 15 % del extracto etanólico de propóleo de Apis mellifera.
Variable dependiente: Crecimiento de Microsporum gypseum.
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2.7. Consideraciones éticas y de rigor
Dado que no se trabajó con personas o animales, no se aplica condiciones de ética.
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3. RESULTADOS
Para la determinación del efecto del EEP sobre M. gypseum, se emplearon cuatro grupos compuestos por EEP de Cajabamba al 5%, 10%, 15%, y únicamente medio agar Sabouraud para un grupo control negativo, encontrándose los siguientes resultados:
Figura 01. Crecimiento radial (mm) de Microsporum gypseum frente a las concentraciones de 0%, 5%, 10% y 15% de extracto etanólico de propóleo (EEP) a los 11 días de evaluación en condiciones de laboratorio.
En la Figura 01 se observa el crecimiento radial promedio (mm) que presentó M.
gypseum a las concentraciones de 0% hasta el onceavo día, así mismo, se observa que no se presentó crecimiento a partir de las concentraciones de 5%, 10% y 15%.
0 2 4 6 8 10 12 14
0% 5% 10% 15%
Crecimiento radial (mm) de Microsporum gypseum
Concentraciones de extracto etanólico de propóleo
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Figura 02. Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo (EEP) de Apis mellifera sobre el crecimiento de Microsporum gypseum evaluado en agar Sabouraud a 25°C después de once días de incubación. (A) Crecimiento de M.
gypseum sin concentración de EEP (placa control). (B) M. gypseum + 5% de concentración de EEP. (C) M. gypseum + 10% de concentración de EEP. (D) M.
gypseum + 15% de concentración de EEP.
A
C D
B
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4. DISCUSIÓN
La dermatofitosis es causante de micosis superficial en humanos siendo los más susceptibles los niños y adolescentes, por ello, es transcendental indagar sobre alternativas naturales que ayuden a combatirlo.
El presente estudio tuvo como finalidad investigar el efecto in vitro de una alternativa natural, como lo es el extracto etanólico de propóleo de Cajabamba, a diferentes concentraciones, frente a uno de los microorganismos causante de dermatofitosis, Microsporum gypseum. Los resultados obtenidos en esta investigación demostraron un efecto fungicida del extracto etanólico de propóleo de Cajabamba, sobre dicho hongo dermatofito, al inhibir su crecimiento; este efecto antifúngico coincide con los resultados de los autores citados anteriormente, tales como, Siqueira et al. 28, Veiga et al. 29, Petruzzi et al. 30.
La composición del propóleo es compleja, destacando los compuestos terpenoides, ácidos grasos, flavonoides y sustancias fenólicas. Además, que estos últimos compuestos, son los principios activos responsables, en particular, de la actividad antifúngica del propóleo, según lo mencionan Veiga 29, Afrouzan 34, Al Naggar 35. Esta actividad se debe a que estos compuestos del EEP afectan la permeabilidad de la membrana citoplasmática del hongo, específicamente inhibiendo la síntesis de ergosterol, de esta manera, al momento de unirse la molécula poliénica al ergosterol, interfiere con las funciones vitales para las células fúngicas. Varios estudios han demostrado los efectos antifúngicos del propóleo, basándose en los compuestos que este contiene, Liu 36 demostró que EEP puede regular negativamente los genes presentes de la vía de biosíntesis de ergosterol, de modo que Fusarium graminearum, no pudo sintetizar ergosterol, lo que resultó en una disminución significativa en el crecimiento. Por otro lado, Xu et al 39 realizaron un ensayo in vitro de EEP frente a Penicillium notatum demostrando que el EEP puede afectar la respiración e interferir con el metabolismo energético de dicho microorganismo al reducir las actividades de la succinato deshidrogenasa (SDH) y la malato deshidrogenasa (MDH), inhibiendo su crecimiento. Sin embargo, los estudios sobre los hongos dermatofitos, específicamente Microsporum gypseum, son escasos.
Veiga et al. 29 realizaron ensayos de la actividad antifúngica in vitro del propóleo en especies de Trichophyton sp. Estas investigaciones encontraron que a una concentración del 10%, se
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antifúngica; se sugiere investigar este compuesto como un posible agente antifúngico para el tratamiento de dermatofitosis. Esta sugerencia, unida a nuestra experiencia con la actividad antifúngica del extracto etanólico de propóleo (Silva-Carvalho 17, Dantas 27, Siqueira et al. 28 Petruzzi et al. 30) sirvió de motivación para llevar a cabo la evaluación de las concentraciones propuestas.
Hasta la actualidad, no hay datos disponibles que demuestren la actividad del propóleo contra el crecimiento de M. gypseum. En esta investigación, el EEP fue de capaz de inhibir por completo dicho crecimiento (Fig. 02). Dogo 10 y Adesiji 11 observaron casos diagnosticados con tiña en la cabeza, teniendo como agente causa a M. gypseum. Soankasina et al. 12 describieron las características de lesiones observadas en la piel ocasionadas por M.
gypseum. Estas características refuerzan la idea de que el EEP puede ser eficaz para el tratamiento de la dermatofitosis, principalmente después de observar la eficacia del EEP para inhibir el crecimiento de M. gypseum.
Mutlu Sariguzel 19 y Siqueira 28 evaluaron la actividad antifúngica del EEP contra diferentes especies de Candida sp., demostrando en ambos estudios la efectividad de este extracto al inhibir completamente el crecimiento de estas levaduras. Petruzzi et al. 30 emplearon varios microorganismos, entre ellos Fusarium oxysporum, demostrando la efectividad del extracto etanólico del propóleo de abeja entre concentraciones de 200 – 3000 ppm, retrasando su crecimiento.
La efectividad del propóleo está relacionada, entre otros factores, con el área geográfica de donde se obtenga, resaltando la importancia tanto de la diversidad floral como del clima (Dantas 27, Afrouzan 34). Influyendo así mismo, en la cantidad de componentes que este pueda contener, dependiendo de la vegetación utilizada por las abejas melíferas. En la zona de Cajabamba, las especies de plantas utilizadas por las abejas para la formación de propóleo son los álamos (Populus sp.), tara (Tara sp.), y coníferas (Pinus sp. y Cupressus sp.). En un trabajo realizado por Al-Ani et al.37 donde el propóleo se recopiló de diversos orígenes geográficos europeos, se identificaron más de 100 sustancias en diferentes concentraciones, de los cuales predominaban los compuestos fenólicos y flavonoides.
Además, Al Naggar et al. 35 mostraron que el EEP canadiense de varias regiones contienen diferentes composiciones químicas entre los que se encuentran fenoles, ésteres y flavonoides. Todos los estudios mencionados anteriormente, así como el informe del
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estudio actual, confirman el efecto directo de la vegetación y el clima en la composición del propóleo y las actividades biológicas.
El tipo de extracción empleada en este estudio, la extracción etanólica, es efectiva debido al disolvente que permite una mayor extracción de los flavonoides presentes en el propóleo.
Sayyadi et al. 38 demostraron el mayor efecto del EEP en comparación con el extracto acuoso de propóleo (EAP).
Los resultados del estudio actual indican que el EEP representa una alternativa muy favorable para el tratamiento de dermatofitosis, específicamente para los casos causados por la especie M. gypseum. La evaluación del crecimiento durante los 11 días, en concentraciones de 5%, 10% y 15%, fue de 0. (Fig. 01)
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5. CONCLUSIÓN
Las concentraciones de 5%, 10% y 15% de extracto etanólico de propóleo de Apis mellifera inhiben el crecimiento in vitro de M. gypseum.
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6. RECOMENDACIONES
Se recomienda seguir con estudios sobre la propiedad antifúngica de los compuestos del extracto etanólico de propóleo, ya que mostró resultados favorables.
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7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
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Anexo 1. Colmenas donde se recolectó el propóleo, ubicado en el caserío de Ñuñumabamba, provincia de Cajabamba, departamento de Cajamarca.
Anexo 2. Recolección de propóleo en colmena con Apis mellifera por el método de raspado en diciembre 2020.
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Anexo 3. 200g de propóleo recolectado almacenado en bolsa hermética.
Anexo 4. Propóleo sin impurezas, separado en pedazos pequeños para su trituración
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.Anexo 5. Trituración de propóleo.
Anexo 6. Propóleo macerado con alcohol de 96° en frasco ámbar de vidrio durante por 24 días a 37°C.
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Anexo 7. Filtración del macerado de propóleo en papel Whatman N° 40.
Anexo 8. Filtración del propóleo por el método de filtración al vacío.
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Anexo 9. Extracto etanólico de propóleo obtenido después de retirar del rotavapor
Anexo 10. Obtención de inóculo de Microsporum gypseum. A. Cultivo de Microsporum gypseum -FPMG1. B. subcultivo de M. gypseum incubado a 25°C por 14 días. C y D. M.
gypseum sembrado en placas con agar Sabouraud incubado a 25°C por 14 días.
C
B D A
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Anexo 11. Determinación de la actividad del extracto etanólico de propóleo. A. Matraces con Agar Sabouraud para agregar extracto etanólico de propóleo. B. Microsporum gypseum sembrado por puntura en agar Sabouraud - placa control. C. M. gypseum sembrado por puntura en agar Sabouraud y extracto etanólico de propóleo al 5%. D. M. gypseum sembrado por puntura en agar Sabouraud y extracto etanólico de propóleo al 10%. E. D. M. gypseum sembrado por puntura en agar Sabouraud y extracto etanólico de propóleo al 15%.
C D E
A B
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Anexo 12. Crecimiento de Microsporum gypseum al onceavo día de evaluación a concentraciones 0%, 5%, 10% y 15% de extracto etanolico de propóleo incubadas a 25°C.
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Anexo 13. Crecimiento radial promedio de Microsporum gypseum a diferentes concentraciones de extracto etanólico de propóleo durante 11 días de evaluación.
Tiempo (días)
Crecimiento radial (mm) de Microsporum gypseum Concentraciones de extracto etanólico de propóleo (Control)
0.0 5% 10% 15%
3 2.75 0 0 0
4 4.01 0 0 0
5 5.1 0 0 0
6 6.77 0 0 0
7 8.28 0 0 0
8 9.06 0 0 0
9 11.06 0 0 0
10 12.41 0 0 0
11 13.71 0 0 0
