UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Efecto in vitro de Streptomyces spp. nativas aisladas de suelo agrícola de Solanum tuberosum en el crecimiento de
Rhizoctonia solani
Tesis para optar el Título Profesional de Biólogo-Microbiólogo
Autores
:Br. Aguilar Iparraguirre, Cristopher Robert
Br. Santamaría Esteves, Jherson Rodolfo
Asesor: Dr. Wilson Krugg, Juan Héctor
Trujillo - Perú 2022
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i
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
Dr. Carlos Alberto Vásquez Boyer
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Juan Amaro Villacorta Vásquez VICE-RECTOR ACADÉMICO
Lic. Haydee Marisol Carranza Castañeda SECRETARIA GENERAL
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ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
Dr. Heber Max Robles Castillo
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Manuela Luján Velásquez
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
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iii
DEL ASESOR
El que suscribe, Dr. Juan Héctor Wilson Krugg, asesor de la tesis titulada: "Efecto in vitro de Streptomyces spp. nativas aisladas de suelo agrícola de Solanum tuberosum en el crecimiento de Rhizoctonia solani"
CERTIFICA
Que, la investigación ha sido ejecutada en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo observaciones y sugerencias alcanzadas. Por lo que, autorizo al Bachiller Aguilar Iparraguirre Cristopher Robert y al Bachiller Santamaría Esteves Jherson Rodolfo, continuar con los procedimientos correspondientes según sus fines.
Trujillo, julio del 2022
Dr. Juan Héctor Wilson Krugg
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iv
PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio, la presente tesis: "Efecto in vitro de Streptomyces spp. nativas aisladas de suelo agrícola de Solanum tuberosum en el crecimiento de Rhizoctonia solani", con el objetivo de obtener el Título Profesional de Biólogo - Microbiólogo.
Esperando que el presente trabajo sea de su aprobación.
Trujillo, julio del 2022
Br. Aguilar Iparraguirre Cristopher Robert Br. Santamaría Esteves Jherson Rodolfo
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MIEMBROS DEL JURADO
Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez PRESIDENTE
Mblgo. Gerardo Alayo Espinoza SECRETARIO
Ms.C. Anibal Quintana Diaz MIEMBRO
Dr. Juan Héctor Wilson Krugg MIEMBRO ASESOR
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado examinador, declaran que el presente Informe de Tesis titulado: Efecto in vitro de Streptomyces spp. nativas aisladas de suelo agrícola de Solanum tuberosum en el crecimiento de Rhizoctonia solani, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez PRESIDENTE
Mblgo. Gerardo Alayo Espinoza SECRETARIO
Ms.C. Anibal Quintana Diaz MIEMBRO
Dr. Juan Héctor Wilson Krugg MIEMBRO ASESOR
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DEDICATORIA
De: Cristopher Robert Aguilar Iparraguirre
Gracias por guiarme, acompañarme, darme la sabiduría y capacidades para culminar esta etapa con satisfacción.
A Robert y Aurea, por su amor, sacrificio, consideración y soporte en esta etapa de mi vida, sin ellos esto no hubiera sido posible.
A mis hermanos, sobrinos y amigos por todo su apoyo. En especial a Sarita, por el cariño incondicional y todos los consejos que han aportado en mi formación como ser humano. A
Robert, porque a pesar de la distancia siempre estás conmigo, hermano.
Una dedicatoria especial a Santi y Salo, muy pronto estaremos juntos en casa.
“El amor es lo único que somos capaces de percibir que trasciende las dimensiones del tiempo y del espacio.”
En honor a Albert Schatz (Experiment Eleven).
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DEDICATORIA
De: Jherson Rodolfo Santamaría Esteves
A mi familia y seres queridos, especialmente a mi madre, por su apoyo incondicional en todo momento; sin ella, no hubiese llegado hasta aquí.
A ti, Juancho; sé que, desde el cielo, celebras con un balón de baloncesto este triunfo.
A mi querido profesor Willy Arias, por su cariño, estima y enseñanzas.
Finalmente, a mi yo del futuro, por si se le olvida que en sus
inicios la ciencia estuvo presente.
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AGRADECIMIENTO
A nuestro asesor y amigo Dr. Juan Héctor Wilson Krugg, por ser pieza fundamental en la elaboración, ejecución y supervisión del presente proyecto, por su compromiso y confianza
en nosotros, además de sus invaluables consejos para nuestra formación profesional y personal.
Al docente Ms. C. Guillermo Juan Cox Trigoso, por su amistad, tiempo, esfuerzo y apoyo brindado durante la realización de esta tesis.
A todas las personas que de alguna u otra manera han aportado en beneficio para el desarrollo y culminación de esta tesis.
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RESUMEN
El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto in vitro de Streptomyces spp. nativas aisladas de suelo agrícola de Solanum tuberosum en el crecimiento de Rhizoctonia solani. Se aislaron 30 actinomicetos del suelo agrícola de S. tuberosum. De estos, 19 (63.3%) presentaron características morfológicas similares al género Streptomyces. Asimismo, fue evaluada la capacidad antagonista de estos actinomicetos mediante el ensayo de cultivo dual en medio CZY. Además, se seleccionaron en base a su actividad antifúngica para ser caracterizados morfológica y bioquímicamente. El aislado PG03 presentó la mayor actividad antagonista, inhibiendo el 80,40 % del crecimiento de R. solani. El alineamiento de las secuencias de nucleótidos del ARNr 16S de los actinomicetos seleccionados, mediante el cotejo con las secuencias del gen del ARNr 16S reportadas en el GenBank, evidenciaron que el aislado PG03 está estrechamente relacionado con Streptomyces argenteolus (99.90% de identidad), el aislado PB01 con S. aurantiacus (99.59% de identidad), el aislado ALLAC01 con Streptomyces sp.
(100% de identidad) y el aislado PB10 con S. prunicolor (99.79% de identidad). En conclusión, S. argenteolus y S. aurantiacus aislados de suelo agrícola de S. tuberosum inhibieron el crecimiento de R. solani, en un 80.40 y 61.98 %, respectivamente, demostrando su posible aplicación en el control biológico de hongos fitopatógenos.
Palabras clave: Streptomyces, antagonismo, control biológico, hongos fitopatógenos, Solanum tuberosum, rizosfera.
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ABSTRACT
The objective of this research was to determine the in vitro effect of native Streptomyces spp.
isolated from agricultural soil of Solanum tuberosum on the growth of Rhizoctonia solani.
Thirty actinomycetes were isolated from agricultural soil of S. tuberosum. Of these, 19 (63.3%) showed morphological characteristics similar to the genus Streptomyces. The antagonistic ability of these actinomycetes was also evaluated using the dual culture assay on CZY medium.
In addition, they were selected on the basis of their antifungal activity to be characterized morphologically and biochemically. Isolate PG03 exhibited the highest antagonistic activity, inhibiting 80.40 % of R. solani growth. Alignment of the 16S rRNA nucleotide sequences of the selected actinomycetes, by matching with the 16S rRNA gene sequences reported in GenBank, evidenced that isolate PG03 is closely related to Streptomyces argenteolus (99. 90%
identity), isolate PB01 with S. aurantiacus (99.59% identity), isolate ALLAC01 with Streptomyces sp. (100% identity) and isolate PB10 with S. prunicolor (99.79% identity). In conclusion, S. argenteolus and S. aurantiacus isolated from agricultural soil of S. tuberosum inhibited the growth of R. solani by 80.40 and 61.98 %, respectively, demonstrating their possible application in the biological control of phytopathogenic fungi.
Key words: Streptomyces, antagonism, biological control, phytopathogenic fungi, Solanum tuberosum, rhizosphere.
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ÍNDICE
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ... i
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ... ii
DEL ASESOR ... iii
PRESENTACIÓN ... iv
MIEMBROS DEL JURADO ... v
APROBACIÓN ... vi
DEDICATORIA ... vii
DEDICATORIA ... viii
AGRADECIMIENTO ... ix
RESUMEN ... x
ABSTRACT ... xi
ÍNDICE ... xii
I. INTRODUCCIÓN ... 1
II. MATERIAL Y MÉTODOS ... 4
1. Material de estudio ... 4
2. Procedimiento ... 4
2.1. Recolección de suelo agrícola de Solanum tuberosum. ... 4
2.2. Aislamiento de actinomicetos. ... 4
2.3. Curva de crecimiento micelial de Rhizoctonia solani FP01. ... 5
2.4. Evaluación de la antibiosis de actinomicetos aislados de suelo agrícola sobre Rhizoctonia solani. ... 5
2.5. Caracterización morfológica y bioquímica de actinomicetos seleccionados. ... 6
2.6. Caracterización molecular de actinomicetos seleccionados mediante amplificación por PCR y secuenciamiento del gen ARNr 16S. ... 6
2.7. Análisis estadístico.... 7
III. RESULTADOS ... 8
IV. DISCUSIÓN... 29
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xiii
V. CONCLUSIONES ... 34
VI. RECOMENDACIONES ... 35
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 36
VIII. ANEXOS ... 42
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I. INTRODUCCIÓN
Solanum tuberosum “papa” es a nivel mundial uno de los cultivos más importantes, aumentando su producción de 330,780,260 a 370,436,581 toneladas entre 2009 y 2019. En Perú, el cultivo de S. tuberosum es uno de los más importantes, con una producción que alcanzó un nivel récord en el 2020 de 5,467,041 toneladas, mayor en un 1,42% a la alcanzada en el año 2019 1.
Entre los patógenos más importantes que afectan los cultivos de S. tuberosum destaca Rhizoctonia solani, que crece como micelio vegetativo o esclerocios y se divide en 14 grupos de anastomosis 2, siendo el grupo de anastomosis 3 el más frecuentemente asociado con S.
tuberosum 3.
R. solani es el agente causal de la costra negra y de lesiones necróticas del tallo en cultivos de S. tuberosum, ocasionando pérdidas por infecciones de brotes, estolones y raíces, principalmente al inicio de la temporada, afectando el tamaño y número del tubérculo 4,5. Además, este patógeno puede infectar fácilmente y causar un daño más severo en estas estructuras debido a la falta de peridermo, ocasionando necrosis, que se manifiesta como lesiones alargadas hundidas de color marrón. Asimismo, la infección severa del tubérculo y otras partes subterráneas de la planta pueden dar lugar a grietas, malformaciones, picaduras, descamación y piel de elefante 6.
La costra negra se desarrolla durante la senescencia de la planta y está asociada con la formación de esclerocios en los tubérculos de la progenie y su malformación. Según un estudio realizado en Nueva Zelanda, las enfermedades en S. tuberosum causadas por R. solani, son probablemente responsables de pérdidas anuales de hasta 75 millones de dólares 4,5. Esto puede estar relacionado con la dificultad de controlar a este patógeno, debido a que posee un amplio rango de hospederos y una alta tasa de supervivencia en el suelo y material vegetal 7.
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El cultivo de S. tuberosum es una de las actividades agrícolas que hace uso de una elevada cantidad de agroquímicos, ya que frecuentemente está comprometido al ataque de plagas y fitopatógenos, las cuales pueden aumentar en condiciones de alta humedad. La mayoría de estas sustancias son dañinas para el ser humano, los cultivos y el medio 8.
Muchas especies de actinomicetos, principalmente los del género Streptomyces, se conocen por su capacidad de producir moléculas bioactivas con efecto antagonista contra fitopatógenos fúngicos y bacterianos; además, pueden ser utilizados como biofertilizantes, desempeñando un destacado rol en el desarrollo de crecimiento vegetal, protección de cultivos y la degradación de polímeros orgánicos insolubles a través de la producción de enzimas líticas 9,10.
El género Streptomyces comprende bacterias filamentosas e incluye más de 500 especies, frecuentemente encontradas en suelo y agua 11. Es el más predominante entre las actinobacterias del suelo 12 y representa el 50% de su población total 13. Son más competitivos que otros microbios, mejorando la fijación biológica del nitrógeno, la solubilización del fósforo y zinc, el control biológico de plagas y el crecimiento de brotes y raíces 11,14,15. Se han realizado muchos estudios sobre los mecanismos utilizados por las actinobacterias para inhibir a patógenos del suelo, incluyendo la antibiosis, producción de enzimas degradativas, competencia por nutrientes y producción de óxido nitroso 11.
Varios estudios han demostrado el efecto de Streptomyces sobre diferentes fitopatógenos; en uno de ellos se evaluaron seis Streptomyces nativos aislados del parque nacional Suthep-Pui de Tailandia; demostrando una inhibición entre 75.7 y 81.0 % del crecimiento de Fusarium oxysporum FoC4 16. En cuanto a S. philanthi RM-1-138, inhibió el crecimiento de R. solani y Magnaporthe oryzae en 89.22 y 88.73 %, respectivamente 17.
Por otro lado, de 167 actinomicetos aislados se determinó que el antagonista más efectivo contra R. solani fue Streptomyces sp. N2 cuyo diámetro de inhibición fue 26,85 ± 1,35 mm.
Posteriormente se purificó el antifúngico N2, cuyo efecto se demostró frente a R. solani y otros hongos fitopatógenos, obteniendo porcentajes de inhibición que van desde 48.65 hasta 78.07%, siendo este último, el porcentaje de inhibición en R. solani 18. Así mismo, al evaluar 130 estreptomicetos aislados, los que presentaron mayor efecto, Streptomyces sp. ALP07R y
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Streptomyces sp. SLF27R, inhibieron 87.0 y 72.4 % el crecimiento de Sclerotinia sclerotiorum FW431 y R. solani FW408, respectivamente 19.
Por lo general Streptomyces spp. utilizan la antibiosis como mecanismo de acción frente a los fitopatógenos, donde los metabolitos más secretados han sido blasticidina-S (S.
griseochromogenes), kasugamicina (S. kasugaensis), oligomicina A (S. diastatochromogenes), rapamicina (S. hygroscopicus) y algunos pirroles 20. Diferentes estudios han demostrado el efecto antagonista de Streptomyces spp. nativas sobre R. solani. Entre los que destacan S.
aurantiogriseus VSMGT1014 21, S. vinaceusdrappus S5MW2 22 y Streptomyces sp. CACIS- 1.16CA 23.
El cultivo de Solanum tuberosum es propenso a agentes que limitan la eficiencia, producción y calidad del cultivo, como la utilización irracional de agroquímicos, destrucción del suelo agrícola, baja calidad de tubérculos y la existencia de organismos fitopatógenos. Rhizoctonia solani es causante de grandes pérdidas económicas a nivel agrícola, siendo difícil su control por su amplio rango de hospederos y alta tasa de supervivencia de esclerocios en el suelo y material vegetal. Estudios previos han demostrado que especies nativas de Streptomyces aisladas del suelo, tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de varios hongos fitopatógenos, por tal razón la finalidad de la presente tesis fue determinar el efecto in vitro de Streptomyces spp. nativas aisladas de suelo agrícola de Solanum tuberosum en el crecimiento de Rhizoctonia solani, ya que esto podría considerarse como una alternativa para reducir la utilización de agroquímicos que estimulan un impacto negativo al ambiente y que inducen la aparición de resistencia.
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II. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Material de estudio
- 2.25 Kg de suelo agrícola de Solanum tuberosum procedente de los caseríos Allacday, Pachín Bajo y Pampa Grande, Otuzco, La Libertad, en junio del 2021.
- 01 cultivo puro de Rhizoctonia solani FP01 brindado por el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Trujillo.
2. Procedimiento
2.1. Recolección de suelo agrícola de Solanum tuberosum.
Se seleccionaron 3 campos de cultivo de Solanum tuberosum del caserío Allacday (C1:
7°55'49.7"S 78°31'29.8"W; C2: 7°55'52.2"S 78°31'38.1"W; C3: 7°55'44.3"S 78°31'48.6"W) ubicado a 3307 m.s.n.m, 3 campos de cultivo del caserío Pachín Bajo (C1: 7°52'59.6"S 78°37'37.2"W; C2: 7°53'05"S 78°37'52"W; C3: 7°53'06"S 78°37'40"W) ubicado a 3450 m.s.n.m, y 3 campos de cultivo pertenecientes al caserío Pampa Grande (C1: 7°54'55"S 78°36'53"W; C2: 7°54'34"S 78°37'09"W; C3: 7°54'59"S 78°36'54"W) a 2960 m.s.n.m, ubicados en la provincia de Otuzco (ANEXO 1, 2), La Libertad, en agosto del 2021. Se realizó un muestreo dirigido, por cada campo de cultivo se eligieron 5 puntos de muestreo, de cada punto de muestreo se recolectaron 50 g de suelo agrícola adyacente a la raíz, a una profundidad de 10 cm (ANEXO 3). Las muestras de cada caserío fueron mezcladas, tamizadas y posteriormente, transferidas a bolsas de polietileno etiquetadas, para luego ser transportadas hasta el laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Trujillo, donde fueron almacenadas a 4 °C hasta su análisis 24. Adicionalmente, se realizó la caracterización fisicoquímica de las muestras de suelo agrícola perteneciente a cada caserío, para la determinación de pH, textura, contenido total de nitrógeno, etc. 25 (ANEXO 4-6).
2.2. Aislamiento de actinomicetos.
A partir de cada muestra homogenizada, se mezclaron 10 g de suelo con 90 mL de solución salina estéril (0.85%). Posterior a ello, fueron realizadas diluciones seriadas hasta llegar a 10-4, de cada dilución se sembró por superficie 100 µL en placas con agar
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almidón sales inorgánicas (medio ISP 4) por duplicado, este medio fue suplementado con nistatina (50 µg/mL) y ácido nalidíxico (25 µg/mL) 26. Las placas se incubaron durante 7 a 14 días a 25 ± 0.1 ºC. A partir de las colonias que crecieron en medio ISP 4 se seleccionaron aquellas colonias que macroscópicamente fueron glabrosas o calcáreas, aterciopeladas, plegadas, adheridas fuertemente al agar, con micelio aéreo y vegetativo (ANEXO 7); estas fueron transferidas y purificadas en Agar avena (medio ISP 3) 27. Posteriormente, los cultivos puros de actinomicetos fueron codificados (ANEXO 8). Además, se realizó la técnica de microcultivo donde se seleccionaron aquellas colonias que presentaron cadena de esporas Gram-positivas rectas (R), flexibles (F), bucles abiertos (RA) o espirales (S) 28 para posteriormente realizar el ensayo de cultivo dual.
2.3. Curva de crecimiento micelial de Rhizoctonia solani FP01.
Se subcultivó a Rhizoctonia solani FP01 en tubos con medio agar papa dextrosa inclinado (APD), a partir del cultivo puro brindado por el Laboratorio de Fitopatología.
Los tubos fueron incubados durante 7 días a 25 ± 0.1 ºC.
Posteriormente, se sembró un disco de agar-micelio de R. solani FP01 (6 mm) al centro de 10 placas con agar extracto de levadura Czapek (CZY) y se incubaron a 25 ± 0.1 °C.
Diariamente se realizaron cuatro mediciones al radio del micelio, durante 7 días, seguidamente se calculó la tasa de crecimiento 19 (ANEXO 9-10).
2.4. Evaluación de la antibiosis de actinomicetos aislados de suelo agrícola sobre Rhizoctonia solani.
Para evaluar la capacidad antagonista de los actinomicetos se utilizó el ensayo de cultivo dual en medio CZY. La suspensión de esporas (108 UFC/mL) de cada actinomiceto se obtuvo a partir de cultivos purificados en ISP 3 (modificado de Kunova A, et al., 2016) 19. Se distribuyeron uniformemente 10 μL de cada suspensión de esporas a lo largo de una línea de 40 mm en el extremo de placas con medio CZY y fueron incubadas a 25 ± 0.1 °C durante 4 días, para permitir la producción de compuestos bioactivos. Posteriormente al tiempo de incubación, se sembró un disco de agar-micelio de R. solani FP01 (6 mm) a 22.5 mm de distancia. El ensayo se realizó por triplicado y las placas inoculadas únicamente con R. solani FP01 se utilizaron como control. La
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incubación de estas placas fue a 25 ± 0.1 °C y la capacidad antagonista se evaluó a los 2 días después de la inoculación del fitopatógeno (ANEXO 11), siendo expresada por el porcentaje de inhibición del crecimiento en la placa problema en comparación con la placa control, calculado por: [ (R1 - R2) / R1] x 100, aquí R1 es el crecimiento radial de la colonia de R. solani FP01 en placa control y R2 es el crecimiento radial de la colonia de R. solani FP01 en la placa problema 19. Luego, se seleccionaron a los 8 actinomicetos de mayor antagonismo para estudios posteriores.
2.5. Caracterización morfológica y bioquímica de actinomicetos seleccionados.
Los actinomicetos seleccionados fueron identificados a nivel de género a través de un enfoque polifásico, que incluyó características culturales, morfológicas y bioquímicas
29. Las características morfológicas y culturales de los aislados se determinaron como se describe en el International Streptomyces Project (ISP) 30,31. La morfología del cultivo maduro, color de masa aérea, color de micelio sustrato se observaron en 4 medios ISP (ISP 2 - ISP 5) 32 (ANEXO 12-29). Además, las estructuras micromorfológicas de los aislados seleccionados se estudiaron utilizando la técnica de microcultivo 29. En cuanto a la caracterización bioquímica, se evaluó la utilización de diferentes fuentes de carbono en medio ISP 9 (Medio de utilización de carbono) con la adición de uno de los siguientes azúcares, D-glucosa (control positivo), L-arabinosa, sacarosa, D-xilosa, L-inositol, D-manitol, D-fructosa, L-ramnosa, rafinosa, celulosa y en ausencia de una fuente de carbono (control negativo) (ANEXO 30). Además, se determinó la producción de pigmentos melanoides en medio ISP 7 (ANEXO 31-33) y la capacidad enzimática mediante la degradación de almidón, caseína, celulosa y Tween 80 al 1% 28,30,33.
2.6. Caracterización molecular de actinomicetos seleccionados mediante amplificación por PCR y secuenciamiento del gen ARNr 16S.
Los actinomicetos aislados que demostraron una potencial actividad antifúngica fueron sometidos a una evaluación adicional mediante el estudio del gen ARNr 16S.
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Las muestras se procesaron y se extrajo el ADN de forma directa con el kit de extracción y purificación de ácidos nucleicos “InnuPREP DNA Kit” (Analytik Jena) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
La identificación molecular se realizó mediante PCR dirigida a la región variable del gen ARNr 16S mediante los primers 27F (5’AGTTTGATCATGCTCAG 3′) y 1492R (5’ TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3′) 34 o 518F y 800R. Los productos obtenidos se secuenciaron mediante Electroforesis Capilar por la empresa MacroGen Co., y la identificación de las secuencias consensos fueron comparadas con las secuencias que se encuentran depositadas en el NCBI, a través del algoritmo BLAST.
2.7. Análisis estadístico.
La información obtenida se procesó estadísticamente (p<0,05) mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA), utilizando la aplicación IBM SPSS Statistics versión 26. Las diferencias significativas de la capacidad antagonista de los diferentes aislados se basaron en la prueba de especificidad de Tukey (Prueba de HSD Tukey) (ANEXO 34-35).
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III. RESULTADOS
Las colonias de actinomicetos aislados presentan aspecto plegado, aterciopelado, pulverulento o adheridas fuertemente al agar, con micelios aéreos y sustratos de diferentes colores, además, algunas evidencian la producción de pigmento (Figura 1-3).
De 19 actinomicetos aislados, el aislado PG03 presentó la mayor actividad antagonista, inhibiendo el 80,40 % del crecimiento de Rhizoctonia solani (Figura 4). Mientras que en la figura 5, se muestra el cultivo dual del actinomiceto PG03 frente a Rhizoctonia solani FP01 en medio extracto de levadura Czapek.
Las colonias de los actinomicetos con mayor porcentaje de inhibición, presentaron aspecto más rugoso, fuertemente adherido al agar en el medio ISP 2 y cadenas de esporas flexibles (F) (Tabla 1).
El aislado PG03 presentó micelio aéreo entre blanco y diferentes tonalidades de gris, mientras que el color del micelio sustrato fue variable, además, exhibió presencia de porosidades y exudaciones (Figura 6-9). Así mismo, la tinción Gram y microcultivo evidenciaron cadenas de esporas largas, flexibles y de bucle abierto (Figura 10).
En cuanto a la utilización de diferentes fuentes de carbono, se observó que el aislado PB01 y PB10 fueron los que más destacaron, degradando todas a excepción de sacarosa y celulosa (Tabla 2). Respecto a la producción de pigmentos melanoides, solo el aislado PG03 mostró evidencia positiva (Figura 11). Por otro lado, en la figura 12, se detalla que el porcentaje de actividad enzimática en relación a la caseína no fue significativo. Además, se evidencia la degradación de almidón y Tween 80 del aislado PG03 y PB01 (Figura 13).
Las secuencias de los 4 actinomicetos seleccionados se analizaron mediante el algoritmo BLAST, mostrando que los actinomicetos PG03, PB01, ALLAC01 y PB10 están estrechamente relacionados a Streptomyces argenteolus, S. aurantiacus, Streptomyces sp.
y S. prunicolor, respectivamente (Tabla 3-6).
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Figura 1. Actinomicetos aislados de suelo agrícola de Solanum tuberosum, incubados a 25 ± 0.1ºC en medio ISP 4 durante 14 días. A. Aislado PG03. B. Aislado PB01. C. Aislado ALLAC01. D. Aislado PB10. E. Aislado PB03. F. Aislado ALLAC04. G. Aislado ALLAC03. H. Aislado PB12.
*PG: Pampa Grande; PB: Pachín Bajo; ALLAC: Allacday.
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Figura 2. Actinomicetos aislados de suelo agrícola de Solanum tuberosum, incubados a 25 ± 0.1ºC en medio ISP 4 durante 14 días. I. Aislado PB11. J. Aislado ALLAC02. K. Aislado PB09. L. Aislado PB19. M. Aislado PB05. N. Aislado PB02. O. Aislado PG05. P. Aislado PB08.
*PG: Pampa Grande; PB: Pachín Bajo; ALLAC: Allacday.
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Figura 3. Actinomicetos aislados de suelo agrícola de Solanum tuberosum, incubados a 25 ± 0.1ºC en medio ISP 4 durante 14 días. Q. Aislado ALLAC06. R. Aislado PG04. S. Aislado PG06.
*PG: Pampa Grande; ALLAC: Allacday.
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Figura 4. Porcentajes de inhibición del crecimiento de Rhizoctonia solani FP01 frente a actinomicetos aislados de suelo agrícola de Solanum tuberosum.
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Figura 5. Cultivo dual en medio extracto de levadura Czapek a 25 ± 0.1 ºC a los 2 días de evaluación. A.
Rhizoctonia solani FP01 en placa control. B. Inhibición del crecimiento de Rhizoctonia solani FP01 (Rs) por el actinomiceto PG03.
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Características morfológicas de actinomicetos incubados a 25 ± 0.1 ºC durante 2 semanas. Nombres de colores tomados del ISCC-NBS colour system.
Tabla 1. Características morfológicas de actinomicetos aislados de suelo agrícola de Solanum tuberosum.
Características Medio Actinomicetos
PG03 PB01 ALLAC01 PB10 PB03 ALLAC04 ALLAC03 PB12
Micelio aéreo
ISP 2 Gris claro Blanco rosáceo
Verde amarillo pálido
Blanco amarillento
Verde amarillo grisáceo
Amarillo
verdoso claro Blanco Blanco grisáceo
ISP 3 Gris
verdoso
Naranja claro
Amarillo
verdoso pálido Beige Verde amarillo grisáceo
Amarillo verdoso grisáceo
Amarillo verdoso grisáceo
Gris claro
ISP 4
Verde amarillo grisáceo
Blanco rosáceo
Verde amarillo
pálido Blanco Verde amarillo grisáceo
Verde
amarillo claro Blanco Gris oliva claro
ISP 5 Blanco
Rosa amarillento
pálido
Verde amarillo pálido
Blanco amarillento
Verde amarillo grisáceo
Amarillo verdoso grisáceo
Blanco Gris
Micelio sustrato
ISP 2 Beige Rojo
intenso
Amarillo
verdoso pálido Beige
Amarillo anaranjado
claro
Amarillo anaranjado
intenso
Oliva grisáceo Oliva grisáceo
ISP 3 Gris
verdoso
Naranja rojizo intenso
Verde amarillo
pálido Beige Gris verdoso Beige Oliva grisáceo
claro Gris oliva ISP 4
Amarillo verdoso grisáceo
Naranja rojizo intenso
Amarillo verdoso grisáceo
Beige
Amarillo anaranjado
moderado
Amarillo
moderado Oliva moderado Gris oliva
ISP 5 Beige
Naranja rojizo moderado
Amarillo
verdoso pálido Beige Amarillo grisáceo
Amarillo anaranjado
claro
Oliva grisáceo
Gris amarillento
Morfología de
cadena de esporas
Rectas (R) + + + + - + + +
Espirales simples
(S) - - - -
Flexibles (F) + + + + + + - -
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15 Bucles abiertos
(RA) + - - - -
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Figura 6. Aislado PG03 en medio ISP 2 durante 14 días a 25 °C. A. Micelio aéreo gris claro. B. Micelio sustrato beige. C. Colonias de aspecto pulverulento adheridas fuertemente al agar. D. Colonia con presencia de exudados.
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Figura 7. Aislado PG03 en medio ISP 3 durante 14 días a 25 °C. A. Micelio aéreo gris verdoso. B. Micelio sustrato gris verdoso. C. Colonias de aspecto pulverulento. D. Colonia con presencia de porosidades y exudados.
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Figura 8. Aislado PG03 en medio ISP 4 durante 14 días a 25 °C. A. Micelio aéreo verde amarillo grisáceo.
B. Micelio sustrato amarillo verdoso grisáceo. C. Colonias de aspecto aterciopelado con bordes irregulares.
D. Presencia de hendidura central.
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Figura 9. Aislado PG03 en medio ISP 5 durante 14 días a 25 °C. A. Micelio aéreo blanco. B. Micelio sustrato beige. C. Colonia de aspecto filamentoso con bordes irregulares y hendidura central elevada.
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Figura 10. A. Microcultivo de aislado PG03 a 400 aumentos, presencia de cadena de esporas rectas (R), flexibles (F) y bucles abiertos (RA). B. Tinción Gram de PG-03, presencia de cadena de esporas Gram positivas rectas (R) y flexibles (F).
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Tabla 2. Uso de fuentes de carbono y producción de pigmentos melanoides por actinomicetos aislados de suelo agrícola de Solanum tuberosum.
Fuente de carbono
Crecimiento de actinomicetos
PG03 PB01 ALLAC01 PB10
L-arabinosa + + + +
Sacarosa - - - -
D-xilosa + + + +
I-inositol - ++ - +
D-manitol ++ ++ + +
D-fructosa + + + +
Ramnosa - ++ + +
Rafinosa - ++ - +
Celulosa - - - -
Pigmentos
melanoides* + - - -
++: Abundante crecimiento, +: Ligero crecimiento, -: No crecimiento.
*Se evidencia producción (+) o no (-) de pigmentos melanoides.
PG: Pampa Grande; PB: Pachín Bajo; ALLAC: Allacday.
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Figura 11. A. Medio ISP 7 no inoculado (Control del medio). B. Aislado PG03 en medio ISP 7 incubado durante 7 días a 25 ± 0.1 ºC. C. Parte reversa de medio ISP 7 donde se evidencia el color anaranjado amarillo intenso como producto de formación de pigmentos melanoides (reacción positiva).
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Figura 12. Actividad enzimática de los actinomicetos PG03, PB01, ALLAC01 y PB10.
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Figura 13. A. Actividad amilolítica de PG03 y PB01 en medio base con almidón 1%. B. Halo alrededor de PG03 y PB01 en medio base con caseína 1%. C. Actividad celulolítica negativa en ambos actinomicetos. D. Capacidad de lipolítica positiva (traslucidez alrededor de colonia) en ambos actinomicetos. E. Crecimiento de aislados PG03 y PB01 en medio base con tirosina 1%.
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Tabla 3. Comparación de secuencia del gen ARNr 16S del aislado PG03 entre Streptomyces spp.
Especies Cepa Similitud
(%) Puntaje total
Número de acceso GenBank
Streptomyces argenteolus MG56 99.90 1792 MN382155
Streptomyces sp. HBUM206355 99.90 1792 MT540269
Streptomyces sp. GS10 99.90 1792 MN826315
Streptomyces sp. gb1(2016) 99.90 1792 MK053664
Streptomyces sp. AV05 99.90 1792 MK5595621
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Tabla 4. Comparación de secuencia del gen ARNr 16S del aislado PB01 entre Streptomyces spp.
Especies Cepa Similitud
(%) Puntaje total
Número de acceso GenBank Streptomyces aurantiacus QMA67 99.59 1772 MT525239 Streptomyces aurantiacus YNF21 99.59 1772 MT071182 Streptomyces aurantiacus QT304 99.59 1772 MT043760
Streptomyces sp. Q8 99.59 1772 MH286178
Streptomyces aurantiacus CMAA 1527 99.59 1772 MH241026
Streptomyces dioscori A217 99.59 1772 NR165766
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Tabla 5. Comparación de secuencia del gen ARNr 16S del aislado ALLAC01 entre Streptomyces spp.
Especies Cepa Similitud
(%) Puntaje total
Número de acceso GenBank
Streptomyces sp. WAC00303 100.00 3352 CP096281
Streptomyces sp. HDN19801 100.00 601 OM802607
Streptomyces mauvecolor B21 100.00 601 ON3613176
Streptomyces sp. 2YHDJ2 100.00 601 ON351063
Streptomyces sp. YHBJ12 100.00 601 ON351059
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Tabla 6. Comparación de secuencia del gen ARNr 16S del aislado PB10 entre Streptomyces spp.
Especies Cepa Similitud
(%) Puntaje total
Número de acceso GenBank Streptomyces prunicolor QT306 99.79 1738 MT043758
Streptomyces sp. RGM_2808 99.79 1738 MN503240
Streptomyces sp. MUCH02 99.79 1738 KU179012
Streptomyces prunicolor INA01236 99.79 1738 ON231552
Streptomyces sp. LaPpAH233 99.79 1738 KJ889172
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IV. DISCUSIÓN
Se aislaron 30 actinomicetos del suelo agrícola de Solanum tuberosum. De estos, 19 (63.3%) presentaron características morfológicas similares al género Streptomyces. De acuerdo con la serie de colores del micelio aéreo establecida en el volumen V del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 31, la mayoría de nuestros aislados se agruparon en la serie blanca. Respecto al color de micelio sustrato, el más predominante fue beige, seguido del color blanco (Tabla 1).
Algunos estudios han reportado actividades antagonistas en relación al porcentaje de inhibir el crecimiento de R. solani. En el estudio realizado por Kunova A, et al. 19, evaluaron 130 estreptomicetos y demostraron que Streptomyces sp. SLF27R fue el aislado que presentó la mayor capacidad antagonista, inhibiendo 72.4% el crecimiento de R.
solani FW408. Así mismo, reportaron que Streptomyces spp. DEF1AK y DEF147AK mostraron una capacidad significativa para inhibir el crecimiento de R. solani; sin embargo, DEF147AK mostró una actividad de biocontrol in vitro consistentemente mayor, alrededor del 65% de inhibición 35. Cabe mencionar que, en comparación con nuestros resultados, el aislado PG03 (Figura 4) obtuvo un porcentaje de inhibición mayor (80.40%) a estas especies. Sin embargo, en la evaluación de S. philanthi RM-1-138 en medio agar GYM, se evidenció que este inhibió 89.22% el crecimiento de R. solani PTRRC-9 17. Estos resultados mostraron mayor porcentaje de inhibición que el aislado PG03 en nuestra investigación, lo que podría deberse a los diferentes componentes que presenta cada medio de cultivo.
Por otro lado, S. aurantiogriseus VSMGT1014 21 y Streptomyces sp. N2 18, evidenciaron una inhibición de 30.0 ± 0.2 y 26.85 ± 1.35 mm, contra R. solani, mayores a la que presentan nuestros aislados PG03 y PB01 con zonas de inhibición de 19.55 y 15.05 mm, respectivamente.
Es necesario resaltar que la bioactividad de una cepa no está relacionada con un único mecanismo, y es probable que diferentes metabolitos, enzimas o compuestos orgánicos
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volátiles contribuyan a la actividad antifúngica 36. El ensayo in vitro realizado con el aislado PG03 sugiere que este aislado bloquea el crecimiento del hongo con moléculas antifúngicas específicas (Figura 5). Sin embargo, es probable que la inhibición del crecimiento del hongo pueda ser el resultado de un efecto sinérgico entre metabolitos y diferentes enzimas líticas 37.
Dentro de los metabolitos con efecto antagonista contra R. solani, se han reportado guanidilfungina A y metil guanidilfungina A 38, eicosano y ftalato de dibutilo 39, antifungalmycin N2 40, estreptotricina D, E y F 41 y fungicromina 42. No obstante, se ha reportado que algunos pigmentos de Streptomyces spp. son los causantes de la capacidad antimicrobiana, como roseoflavina 43 y actinorrodina 44, por lo que es posible que el pigmento azul violáceo intenso liberado por el aislado PB10 (ANEXO 17), esté relacionado con la producción de algún compuesto antimicrobiano.
Los actinomicetos presentaron diferentes características en los 4 medios ISP (ISP 2, ISP 3, ISP4 e ISP 5), en relación a los colores del micelio aéreo y sustrato, y morfologías variadas; esto se debe a las distintas fuentes de carbono y nitrógeno que constituye al medio de cultivo, por lo que el desarrollo y la morfología dependerá de ello 45. Por ejemplo, en el medio ISP2 todos los aislados mostraron un aspecto más rugoso y fuertemente adherido al agar en comparación con los otros medios.
Los 4 aislados evaluados fueron capaces de asimilar glucosa, L-arabinosa, D-xilosa, D- manitol y D-fructosa, a excepción de sacarosa y celulosa, sin embargo el resto de fuentes de carbono fueron degradadas solo por algunos aislados (Tabla 2), nuestros resultados se asemejan a los obtenidos por Caro Castro JJ, 2016 y Mateo Tuesta CE, 2017; donde evidenciaron que los aislados AND 12, AND 30 y AND 24, respectivamente, presentaron una buena capacidad degradativa de glucosa, sacarosa y manitol, a excepción de la degradación de celulosa 46,47. Es probable que algunos aislados puedan degradar una fuente de carbono y otros no, por la naturaleza de las muestras, ya que provienen de diferentes localidades, tipos de suelo y factores fisicoquímicos propios de cada área
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estudiada. Estos factores influyen sustancialmente en el desarrollo de los microorganismos 48.
Respecto a la capacidad de producir enzimas extracelulares, todos los aislados degradaron la tirosina y mostraron actividad amilolítica, proteolítica y lipolítica destacando el aislado PB01, con porcentajes de actividad enzimática de 65.54, 10.84 y 74.02%, respectivamente. Sin embargo, ninguno mostró actividad celulolítica (Figura 12).
Nuestros resultados se asemejan parcialmente con lo demostrado por Mateo Tuesta CE, 2017, donde el aislado AND 12 presentó una mayor actividad amilolítica (68.8%), proteolítica (47.1%), lipolítica (79.4%) y fue la única con actividad celulolítica (75%) 47. Mientras que Chumpitaz A, et al., 2020 reportaron que todas las cepas evaluadas mostraron actividad amilolítica, sin embargo, sólo el 50% mostraron actividad celulolítica y los actinomicetos CAB9-CU4 y CAB10-J2 fueron los que presentaron la mejor actividad amilolítica y celulolítica, respectivamente 49. Asimismo, Caro Castro JJ, 2016, informa resultados similares para el aislado APW 2 como mejor productor de amilasas (84.2%) y los aislados APW 9 y APW15 como mejores productores de celulasas (90,0%)
46. Por otro lado, Gutierrez Espinoza CA, 2017, reportó que la cepa HAA-6 presentó la mayor actividad amilolítica (77.9%) y la cepa HAA-21, la mayor actividad proteolítica (75,4%). Los actinomicetos HAA-3, HAA-6 y HAA-11 destacaron en su capacidad actividad lipolítica con porcentajes del 42.1, 66.0 y 61.9, respectivamente 50. Esto demuestra que los actinomicetos poseen la capacidad de secretar una variada gama de enzimas liticas en condiciones naturales, desempeñando de esta manera
un importante rol en el proceso de biocontrol 51, ya que son capaces de degradar paredes celulares y componentes de la membrana celular, tanto fúngicas como bacterianas 52.
Es importante mencionar que el microcultivo permitió complementar los resultados de la caracterización morfológica y bioquímica. Además, la comparación de estos aislados con las características morfológicas de las especies de Streptomyces descritas en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 31 sugiere que los aislados (PG03, PB01, ALLAC01 y PB10) pertenecen al género Streptomyces, lo que también se confirmó mediante secuenciación, obteniéndose secuencias de 973, 971, 325 y 946 pares de bases (pb) del gen ARNr 16S, respectivamente.
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El alineamiento de las secuencias de nucleótidos del ARNr 16S de los 4 aislados mediante el cotejo con secuencias del gen del ARNr 16S reportadas en el GenBank, evidenciaron que el aislado PG03 está estrechamente relacionado con Streptomyces argenteolus (99.90% de identidad), el aislado PB01 fue identificado como S. aurantiacus (99.59% de identidad), mientras que el aislado ALLAC01 se relacionó con Streptomyces sp. (100%
de identidad) y el aislado PB10 fue identificado como S. prunicolor (99.79% de identidad) (Tabla 3-6).
El resultado de la identificación molecular se comparó de acuerdo a las descripciones brindadas en el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. De acuerdo a las características morfológicas y bioquímicas del aislado PG03, el perfil que se ajusta mejor a dicho aislado es S. argenteolus, ya que presenta micelio aéreo perteneciente a la serie gris, cadenas de esporas Gram positivas pertenecientes a la sección Spirales, además, utiliza la D-glucosa, L-arabinosa, D-xilosa, D-manitol y D-fructosa, con una variación en la producción de pigmentos, lo que hace presumible que sea esta especie. De la misma manera, el aislado PB01 tiene características morfológicas similares a la cepa tipo filogenéticamente relacionada S. aurantiacus y PB10 con S. prunicolor 31. Referente al aislado ALLAC01, no se logró discriminar la especie debido al elevado porcentaje de identidad (100%) entre diferentes especies de Streptomyces, por lo que solo se confirma que pertenece a este género bacteriano.
En cuanto a S. argenteolus, no hay literatura científica que demuestre su capacidad antifúngica; sin embargo, ha sido reportado como productor de asparenomicina C, antibiótico carbapenémico 53. Por tanto, se debería hacer mayor énfasis en su potencial como agente de biocontrol debido a su alto porcentaje de actividad antagonista contra R.
solani, demostrada en esta investigación. Sobre S. aurantiacus, se sabe que es un importante productor de compuestos antimicrobianos como la pamamicina-621 con actividad antibacteriana y antifúngica contra un estrecho espectro de bacterias Gram positivas y hongos filamentosos 54,55, lo que explicaría el efecto antagónico positivo sobre R. solani en esta investigación. Además, produce aurantimicina A, antibiótico que ha demostrado una alta bioactividad contra bacterias grampositivas, gramnegativas y
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algunos hongos no son susceptibles a este antibiótico 56,57. Respecto a S. prunicolor, ha sido reportado como productor de naftogeranina A, antimicrobiano de tipo naftoquinona con actividad antibacteriana y antifúngica. Además del compuesto pironetina, agente antifúngico, antitumoral y regulador del crecimiento vegetal 58.
Respecto a la identificación de Streptomyces spp., la mayoría de estudios se centran en la integración de características morfológicas y moleculares. A pesar de que el secuenciamiento y análisis del gen ARNr 16S son un criterio importante en la taxonomía microbiana, la compleja biología de los actinomicetos hace que el uso del gen ARNr 16S por sí solo como marcador molecular no sea suficiente para lograr la discriminación de especies. Lo que hace necesario analizar otros marcadores moleculares que permitan esclarecer las relaciones filogenéticas entre los actinomicetos aislados y de esta manera asegurar un resultado preciso en la designación de especie.
Por otro lado, se conoce que este género bacteriano es un enorme reservorio de moléculas bioactivas de gran interés en el campo de la agricultura y medicina y debido a la gran necesidad de nuevos compuestos antimicrobianos, el estudio de las actinobacterias se ha incrementado, convirtiéndose en un área de investigación dinámico y significativo, ya que la posible aplicación de estas podría contribuir en el control de fitopatógenos, en mejorar la producción y calidad de cultivos; por consiguiente, en reducir la polución del ambiente y el deterioro de campos de cultivo de S. tuberosum.
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V. CONCLUSIONES
Se aislaron e identificaron a Streptomyces argenteolus, S. aurantiacus, Streptomyces sp. y S. prunicolor, a partir de suelos agrícolas de Solanum tuberosum de los caseríos Allacday, Pachín Bajo y Pampa Grande, ubicados en Otuzco, La Libertad.
Streptomyces argenteolus y S. aurantiacus inhibieron el crecimiento R. solani FP01 en un 80.40 y 61.98 %, respectivamente.
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VI. RECOMENDACIONES
Debido a la presencia de hongos saprófitos en el suelo, se debe tener precaución al momento de aislar actinomicetos, ya que son susceptibles a contaminarse, para ello se sugiere añadir antimicrobianos de amplio espectro al medio de cultivo.
Aunque el mecanismo antagonista más probable fue la producción de metabolitos antifúngicos, éstos, no fueron purificados ni identificados en cuanto a su estructura química. Por lo tanto, a fin de evaluar con precisión su actividad antagónica y el mecanismo de acción, es necesario adicionar este tipo de pruebas en futuras investigaciones.
A pesar del potencial biocontrol de los aislados PG03 y PB01 es necesario evaluar su actividad contra diferentes de hongos y bacterias fitopatógenos, además realizar ensayos en condiciones de invernadero, de campo y evaluar su fitotoxicidad.
Se debe establecer un protocolo estandarizado para realizar los ensayos de cultivo dual (posición y distancia entre actinomicetos, inóculo del patógeno, el momento de la evaluación tras el inóculo del patógeno y el medio de cultivo), para simplificar la comparación de resultados entre los estudios.
Determinar la curva de crecimiento de cada actinomiceto a evaluar, con el objetivo de determinar la tasa especifica de crecimiento y conocer el tiempo en que se da la producción de compuestos bioactivos.
Realizar pruebas fisiológicas, así como analizar otros marcadores moleculares aparte del ARNr 16S, para esclarecer las relaciones filogenéticas entre los actinomicetos aislados y de esta manera asegurar un resultado preciso en la designación de especie.
Se sugiere una continua investigación en el género Streptomyces, ya que es un enorme reservorio de moléculas bioactivas, de gran interés en el campo de la agricultura y medicina.
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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