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ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
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Análisis de la Presencia de Organismos
Genéticamente Modificados en Muestras de
Alimentos
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Índice
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Introducción 3
Componentes, estructura y replicación del ADN 3
Principios de la PCR 9
Instrumentación y componentes para la PCR 12
Diseño de cebadores para la PCR 18
PCR especializada 22
La PCR en la práctica 24
Introducción
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos, la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica. Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.
Componentes, estructura y replicación del ADN
Componentes. Una molécula de ADN consta de dos cadenas en hélice,
complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de ácido fosfórico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases púricas y pirimidínicas, lo que constituye una estructura helicoidal dextrógira, y lleva la información genética codificada en la secuencia de las bases. En las células eucarióticas, la mayor parte del ADN se encuentra en el núcleo y se conoce como ADN cromosómico. Está separado del resto de la célula (citoplasma) por una membrana de dos capas (membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN extracromosómico en las mitocondrias y cloroplastos.
Los elementos estructurales del ADN, llamados nucleótidos, son los siguientes:
• dATP, desoxiadenosina-trifosfato;
• dGTP, desoxiguanosina-trifosfato;
• dTTP, desoxitimidina-trifosfato;
Para mayor facilidad, estos cuatro nucleótidos se denominan dNTP (por las siglas en inglés de desoxinucleósido-trifosfato). Un nucleótido está formado por tres grandes partes: una base púrica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidínica (citosina, C, o timina, T), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se muestra en la figura 1, una base púrica o pirimidínica está unida a un anillo de pentosa por un enlace N-glucosídico, y un grupo fosfato está unido al átomo de carbono 5' del azúcar por un enlace diéster. En el ácido ribonucleico, ARN, la timina está sustituida por el uracilo (U) y la molécula de desoxirribosa por la ribosa.
Figura 1. Componentes de los nucleótidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Estructura. La figura 2 indica cómo forman los nucleótidos una cadena de ADN. El
ADN se forma uniendo los nucleótidos entre el grupo fosfato de un nucleótido (que se sitúa en el átomo de C nº 5 de la molécula de azúcar) y el hidroxilo del átomo de C nº 3 de la molécula de azúcar del nucleótido anterior. Para efectuar este enlace, se separa un grupo difosfato, con liberación de energía. Los nuevos nucleótidos se añaden siempre en el extremo 3’ de la cadena. Como se indica en la figura 3, el ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se aparean entre sí de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre
Nucleótido azúcar+ fosfato
Desoxiadenosina - trifosfato = dATP
Desoxiguanosina - trifosfato = dGTP
Desoxicitidina - trifosfato : dCTP
se une con T mediante dos puentes de hidrógeno, y C siempre se une con G mediante tres puentes de hidrógeno. De esta manera, las dos cadenas son mutuamente complementarias y una de las cadenas puede servir de ADN molde para formar la otra.
Figura 2. Formación de una cadena de ADN a partir de los distintos nucleótidos
(imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Las bases forman un núcleo hidrófobo dentro de la doble hélice. Los azúcares y los grupos fosfato (en su forma aniónica) constituyen la capa hidrófila exterior de la molécula. En condiciones fisiológicas, la hélice de ADN bicatenario es más estable que una hélice de ADN monocatenario.
E
xtre
m
o 5’
E
xtre
m
Figura 3. Estructura del ADN de una célula (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Genoma= total de todos los cromosomas
Fragmento de cromosoma
Gen
Pares de bases de los nucleótidos
Cromosoma
Esqueleto de azúcar y fosfato
Puente de hidrógeno
Replicación. El ADN contiene toda la información genética que define la estructura y la función de un organismo. Hay tres procesos diferentes encargados de la transmisión de la información genética:
• replicación;
• transcripción;
• traducción.
Durante la replicación, un ácido nucleico bicatenario se duplica para formar copias idénticas. Con este proceso se perpetúa la información genética. Durante la
transcripción, un segmento de ADN que constituye un gen se lee y se transcribe en una secuencia monocatenaria de ARN. El ARN pasa del núcleo al citoplasma. Finalmente, durante la traducción, la secuencia de ARN se traduce a una secuencia de aminoácidos que forman una proteína (Alberts et al., 1983).
La replicación del ADN es el proceso en que se basa la amplificación por PCR, y se va a describir en detalle.
Durante la replicación, la molécula de ADN se desenrolla y cada cadena se convierte en un ADN molde para la síntesis de una cadena complementaria nueva. Cada molécula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una copia exacta de la molécula madre.
Figura 4. La horquilla de replicación.
Hebra original Hebra nueva Cebador de ARN
Hebra adelantada
Las flechas indican la dirección de la replicación del ADN
Fragmento de Okazaki Hebra
Para desenrollar la doble hélice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A continuación, una primasa (parte de un agregado de proteínas denominado primosoma) une un pequeño cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la síntesis. Este cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de una molécula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres para unirlos mediante puentes de hidrógeno a los dNTP complementarios situados en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace fosfodiéster covalente al nucleótido anterior de la propia hebra nueva. La energía conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucleótido a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero es la ADN polimerasa III la que se encarga de la síntesis progresiva de nuevas hebras de ADN. La ADN polimerasa actúa solo desde el extremo 5’ hacia el 3’. Como una de las hebras de la doble hélice tiene el sentido 5’-3’ y la otra el 3’-5’, la ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5’-3’ (hebra retrasada) a tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La síntesis de las nuevas copias de la hebra 5’-3’ se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra adelantada, puede avanzar directamente con la síntesis, desde el extremo 5' al 3', según se va desenrollando la hélice. La ADN polimerasa no puede empezar la síntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la presencia de un cebador con un grupo 3’OH libre al que pueda unir un dNTP.
Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:
• desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario;
• unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN diana;
• extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.
Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR. La figura 5 ilustra las tres fases principales del proceso de amplificación por PCR.
Figura 5. Fases de la amplificación por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
30-40 ciclos de 3 fases
Fase 1: desnaturalización
Fase 2: unión
Cebadores directos e inversos
Fase 3: extensión
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se expresa con la siguiente ecuación:
(2n-2n)x (1)
donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo ciclo con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original. Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces,
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se haya conseguido.
En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres fases de la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión) (Sambrook et al., 1989).
gen deseado
ADN plantilla
1er ciclo
2° ciclo
3er ciclo 4° ciclo
35° ciclo
68000 millones de ejemplares 4 8 16 32
ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares
Desnaturalización del ADN molde
Durante la desnaturalización, la hebra doble se funde, abriéndose para dar ADN monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimáticas (es decir, la extensión de un ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el aumento de la temperatura, lo que se denomina desnaturalización. Para obtener la desnaturalización del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96°C. De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el número de bases desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN bicatenario se convierte en monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario ha pasado a monocatenario se denomina temperatura de fusión, Tf. El proceso de
desnaturalización depende del tipo de disolvente, de la concentración salina y del pH utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusión desciende al bajar la concentración salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgánicos como el formaldehído. El valor de la Tf también se puede ver afectado por la concentración de G/C y T/A.
La Tf de una estructura de ADN que contiene una elevada proporción de G/C es más
alta que la de un ADN más rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene aproximadamente un 60 % de G/C y una Tf de unos 94 °C, mientras que
Pneumococcus tiene aproximadamente un 40 % de G/C y una Tf de unos 85 °C.
Anillamiento del cebador
La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una temperatura inferior (generalmente, entre 55 y 65 ºC). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una molécula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y es continua la formación y la ruptura de puentes de hidrógeno entre el cebador monocatenario y el ADN molde también monocatenaria. Los enlaces más estables duran un poco más (los cebadores que se corresponden exactamente con el ADN molde) y es en ese pequeño fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde. Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace iónico entre el ADN molde y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe.
Extensión del cebador
inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 ºC. Cuando los cebadores se han extendido unas cuantas bases, ejercen una atracción iónica más fuerte sobre el ADN molde, lo que reduce la probabilidad de que se invierta el proceso. Los cebadores que no se corresponden exactamente se vuelven a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan lugar a la extensión del fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al cebador en el extremo 3’ (la polimerasa añade dNTP desde 5’ hacia 3’, leyendo el ADN molde desde 3’ hacia 5’). La duración del tiempo necesario para las fases de extensión del cebador puede aumentar si es larga la región de ADN que se va a amplificar; sin embargo, en la mayoría de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min para conseguir una extensión completa.
Instrumentación y componentes para la PCR
Instrumentos
El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances: a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivación a
temperaturas elevadas; así pues, es posible que una alícuota inicial de polimerasa se mantenga a lo largo de muchos ciclos del protocolo;
b) el desarrollo de baños termostatizados que pueden subir y bajar rápidamente su temperatura de forma automatizada y programada; se denominan termocicladores o máquinas de PCR.
Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR.
Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de los ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y extensión del cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclos descritos en los párrafos siguientes.
ADN diana
En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al menos un ejemplar intacto del gen diana. Si el número de ejemplares del gen diana es mayor, también lo será la probabilidad de que tenga éxito la amplificación del ADN. Cualquier alteración, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la amplificación por PCR. El tamaño de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y unas cuantas kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la PCR está entre 0,05 y 1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la secuencia diana. Aunque las muestras no tienen que estar muy purificadas, sí es necesario eliminar algunos contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes quelantes de Mg2+ o los detergentes, para evitar que inhiban el proceso de
amplificación.
Cebadores
Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los cebadores no deben tener tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni
Fase 1 :
Desnaturalización de la ADN
Un « ciclo »
Minutos
Te
mp
eratu
ra
(
°C)
Fase 3 : Extensión del cebador
motivos repetidos, ya que podrían hibridarse de forma inadecuada con el ADN molde. Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas, a fin de prevenir la formación de estructuras secundarias del cebador, que impedirían su hibridación con el ADN molde. También deben evitarse las secuencias complementarias de otros cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridación entre cebadores o la formación de dímeros de cebadores (esto es especialmente importante en relación con el extremo 3’ del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo 3’ del cebador tenga gran proporción de bases G y C para aumentar la hibridación del extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10 kb en longitud. Normalmente se observa una importante reducción del rendimiento cuando los cebadores se encuentran a más de unos 3 kb de distancia entre sí. La concentración usual de oligonucleótidos para la PCR es de 1 µM. Esto resulta suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. La presencia de oligonucleótidos a una concentración superior puede provocar la amplificación no deseada de secuencias distintas de la diana. Por el contrario, la PCR no es eficaz si la concentración del cebador es limitante.
ADN polimerasa
Cuadro 1. Características de algunas ADN polimerasas utilizadas para la PCR.
Taq/
AmpliTaq Vent
Deep-
Vent Pfu Tth UITma
Fuente Thermus aquaticus Thermo-coccus litoralis
Pyrococcus
GB-D Pyrococcus furiosus Thermus thermophilus Thermotoga maritima
Aplicación
Taq: natural AmpliTaq: para ingeniería genética Para ingeniería genética Para ingeniería genética Natural Para ingeniería genética Para ingeniería genética
T½ de actividad
a 95 ºC (min) 40 1380 400 >120 20 > 50a
Actividad exonucleásica
de 5’ a 3’ Sí No No No Sí No
Actividad exonucleásica
de 3’ a 5’ No Sí Sí Sí No Sí
Procesividad 50-60 ? 7 ? 30-40 ?
Velocidad de extensión
(nt/s) 75 ? >80 60 >33 ?
Extremos de ADN
resultantes 3’A
> 95 % romos
> 95 %
romos ? 3’A Romos
PM en kDa 94 ? ? 92 94 70
ADN polimerasa Taq/AmpliTaq. Como ya se ha indicado, esta enzima se aisló de
ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los cebadores. Por tanto, la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien habría que utilizar cebadores modificados químicamente.
ADN polimerasa AmpliTaqGold. Esta enzima consiste en una ADN polimerasa
AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo puede activarse durante un periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el programa del termociclador debe incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de 92 – 95 ºC. En caso de PCR con liberación gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubación, pero deben efectuarse al menos 10 ciclos más que con la PCR clásica.
Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR
Además de los reactivos que participan directamente en la reacción, la PCR necesita un tampón adecuado, cuya composición depende del tipo y de las características de la enzima utilizada. La mayoría de los proveedores proporcionan normalmente un tampón 10x para utilizarlo con la enzima respectiva. El tampón de reacción más común utilizado con la ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene:
• Tris 10 mM, pH 8,3
• KCl 50 mM
• MgCl2 1,5-2,5 mM.
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de MgCl2 en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la
concentración óptima se determina empíricamente (Innis y Gelfand, 1990). Los iones Mg2+:
• forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la incorporación de estos;
• estimulan la actividad polimerásica;
• aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la
Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o
incluso nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se
acumulen productos inespecíficos (errores de cebado). Es importante evitar que en la solución de ADN molde haya una concentración elevada de agentes quelantes, como el EDTA, o de grupos iónicos con carga negativa, como el fosfato. En la bibliografía actual se encuentran discusiones sobre diversos tampones y suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la formamida, el glicerol, la espermidina y los detergentes no iónicos, utilizados para aumentar la especificidad o el rendimiento de la reacción (Roux, 1995). Efectivamente, algunas ADN polimerasas alcanzan su nivel óptimo de actividad solo en presencia de tales suplementos (Rolfs et al., 1992).
Desoxirribonucleósido-trifosfatos
Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libres (dNTP). La concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y 200 µM, y los cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para minimizar los errores de incorporación (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que suministran dNTP de elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de los dNTP o bien como mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP (generalmente 100 mM) se deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para garantizar que el pH de la reacción final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin embargo, ahora se suministran muchas soluciones madre de dNTP con el pH ya ajustado.
Número de ciclos y efecto de meseta
El número de ciclos de amplificación necesarios para producir una banda visible en un gel depende mucho de la concentración inicial del ADN diana. A fin de amplificar 50 moléculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para amplificar 3x105 moléculas hasta la misma concentración es suficiente con entre 20 y
reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores o dNTP: lo primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibición por el producto final (formación de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de productos inespecíficos, competencia por la unión con el cebador mediante nueva hibridación del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se obtiene el producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequeña muestra (1
µl) del producto amplificado, la cual se mezclará y volverá a amplificar durante 20 o 30 ciclos en una nueva mezcla de reacción, en lugar de prolongar la tanda haciendo más ciclos. En algunos casos en que es limitante la concentración del ADN molde, esta nueva amplificación puede proporcionar un buen producto, mientras que la extensión de los ciclos a más de 40 no lo hace.
Diseño de cebadores para la PCR
Es posible que el parámetro más crítico para tener éxito con la PCR sea el diseño de los cebadores. A igualdad de todos los demás factores, un cebador mal diseñado puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador determina varios aspectos, como la posición y la longitud del producto, su temperatura de fusión y finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseñado puede hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificación inespecífica o a la formación de dímeros de cebador, lo que puede llegar a competir con la formación de producto hasta suprimirla. El objetivo de la presente nota de aplicación es dar normas que deben seguirse en el diseño de cebadores para la PCR. En otras publicaciones puede encontrarse un tratamiento más completo de este tema (Dieffenbach et al., 1995).
Selección del cebador
Al diseñar cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre ellas cabe destacar:
• la longitud del cebador;
• la temperatura de fusión (Tf); • la especificidad;
• las secuencias complementarias del cebador;
• la secuencia del extremo 3’.
En las secciones siguientes se habla de cada uno de estos elementos críticos.
Longitud del cebador
Dado que la especificidad, la temperatura y el tiempo de hibridación dependen en parte de la longitud del cebador, este parámetro es crítico para que tenga éxito la PCR. En general, los oligonucleótidos que tienen entre 18 y 24 bases presentan una especificidad extrema de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea óptima. La longitud del cebador también influye en la eficacia de la hibridación. En general, cuanto más largo sea el cebador, menos eficaz será la hibridación. Al cebarse menos ADNs moldes en cada fase, esto puede hacer que disminuya de forma significativa la cantidad de producto amplificado. No obstante, los cebadores tampoco deben ser demasiado cortos, salvo que la aplicación lo exija específicamente. Como se comenta más abajo, el objetivo debe ser diseñar un cebador con una temperatura de anillamiento de al menos 50 ºC.
La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es una de las «cajas negras» de la PCR. Una regla empírica general es utilizar una temperatura de hibridación inferior en 5 ºC a la temperatura de fusión. Con frecuencia es posible que la temperatura de hibridación determinada de esta forma no sea óptima y haya que efectuar experimentos de tanteo para determinar la verdadera temperatura óptima. La manera más fácil de hacerlo es con un termociclador de gradiente.
Temperatura de fusión (Tf)
Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se añaden a una PCR en relación con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotídicos deben diseñarse de forma que tengan temperaturas de fusión similares. Si los cebadores no se ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificación será menos eficaz o incluso podrá no
darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf más elevada funcionará mal a
temperaturas más bajas y es posible que el cebador con la Tf más baja no trabaje a
temperaturas más elevadas. La forma más precisa de calcular las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos es utilizar cálculos termodinámicos del vecino más próximo con la fórmula:
donde H es la entalpía y S es la entropía de la formación de la hélice, R es la constante molar de los gases y c es la concentración de los cebadores.
La forma más fácil de hacerlo es con paquetes de programas informáticos de diseños de cebadores que existen en el mercado (Sharrocks, 1994). Afortunadamente, con la fórmula siguiente puede calcularse una buena aproximación de trabajo de este valor (válido generalmente para oligonucleótidos de entre 18 y 24 bases):
Tf = 2(A+T) + 4(G+C) (3)
donde A, T, G y C son las bases púricas y pirimidínicas.
El cuadro 2 muestra los valores correspondientes a cebadores de diversas longitudes que se han calculado mediante esta ecuación (denominada fórmula de Wallace) y suponiendo un contenido de GC del 50 % (Suggs et al., 1981).
Cuadro 2. Cálculo de la longitud de los cebadores con la ecuación de Wallace.
Longitud del cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C) Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
4 12°C 22 66°C
6 18°C 24 72°C
8 24°C 26 78°C
10 30°C 28 84°C
12 36°C 30 90°C
14 42°C 32 96°C
16 48°C 34 102°C
18 54°C 36 108°C
20 66°C 38 114°C
conseguir una PCR más eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR tenga éxito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto
puede calcularse con la fórmula siguiente:
Tf =81,5 + 16,6 (log10 [K+] + 0,41 (% G+C)-675/longitud (4)
Especificidad
Como ya se ha indicado, la especificidad del cebador depende al menos parcialmente de su longitud. Es evidente que hay muchos más oligonucleótidos distintos con 24 bases que con 15. Dicho esto, los cebadores han de elegirse de forma que tengan una secuencia única dentro del ADN molde que debe amplificarse. Un cebador diseñado con una secuencia muy repetitiva dará como resultado un borrón al amplificar ADN genómico. Sin embargo, el mismo cebador puede dar una sola banda si se amplifica un solo clon de una genoteca. Como la ADN polimerasa Taq es activa en una amplia banda de temperaturas, la extensión del cebador se producirá a las temperaturas inferiores de hibridación. Si la temperatura es demasiado baja, podrá darse un cebado inespecífico, que podrá ser extendido por la polimerasa si hay una corta homología en el extremo 3’. En general, los mejores resultados se obtienen con una temperatura de fusión de 55 a 72 ºC (lo que corresponde a una longitud del cebador de entre 18 y 24 bases, según la regla de Wallace).
Secuencias complementarias del cebador
Contenido de G/C y tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G)
La composición de bases de los cebadores debe ser de entre un 45 y un 55 % de GC. La secuencia del cebador debe elegirse de forma que no haya tramos de poli-G ni poli-C que puedan favorecer la hibridación inespecífica. También deben evitarse los tramos de poli-A y poli-T, ya que pueden «respirar» y abrir tramos del complejo cebador-ADN molde, lo que puede reducir la eficacia de la amplificación. También deben evitarse los tramos de polipirimidina (T, C) y polipurina (A, G). Lo ideal es que el cebador tenga una mezcla casi aleatoria de nucleótidos, un contenido de GC del 50 % y una longitud aproximada de 20 bases. De esta manera, la Tf estará en la
banda de 56 – 62 ºC (Dieffenbach et al., 1995).
Secuencia del extremo 3’
Se ha visto claramente que la posición terminal 3' de los cebadores de la PCR es fundamental para evitar errores de cebado. Ya se ha explorado el problema de las homologías de cebadores en estas regiones. Otra variable importante es la inclusión de un residuo de G o C en el extremo 3’ de los cebadores. Este «cepo de GC» contribuye a que sea correcta la unión en el extremo 3’, debido a la mayor fortaleza del puente de hidrógeno de los residuos de G/C. Esto también ayuda a mejorar la eficacia de la reacción por minimizar las eventuales aberturas que pudiera haber.
PCR especializada
Además de la amplificación de una secuencia diana de ADN por los procedimientos normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos especializados de PCR para aplicaciones específicas.
PCR anidada
cebadores anidados se efectúa haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto de cebadores y después otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de cebadores respecto a una región interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. Así pues, el fragmento más largo producido en la primera ronda de PCR se utiliza como ADN molde para la segunda PCR. El método de PCR anidada puede aumentar espectacularmente la sensibilidad y la especificidad de la amplificación del ADN. Mejora particularmente la especificidad porque esta técnica elimina casi siempre los eventuales productos de amplificación inespecíficos que perturban el proceso. Esto se debe a que tras la primera ronda de PCR es poco probable que los eventuales productos inespecíficos sean suficientemente complementarios de los cebadores anidados y puedan servir de ADN molde para la amplificación posterior, y así lo que se amplifica preferentemente es la secuencia diana. No obstante, un inconveniente de esta extrema sensibilidad es el mayor riesgo de contaminación, y deben extremarse las precauciones cuando se realiza esta PCR, sobre todo en un laboratorio de diagnóstico.
PCR Múltiplex
Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para amplificar una secuencia específica, la PCR Múltiplex utiliza múltiples pares de cebadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente. La presencia de muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de cebadores y la discriminación de la amplificación de fragmentos más largos de ADN (Atlas y Bey, 1994).
Para este tipo de amplificación por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de hibridación similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se favorece la amplificación de la diana más corta respecto a la más larga, lo que implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte, los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que reduce la competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más largos de ADN durante la PCR Múltiplex.
La PCR en la práctica
Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a fuentes diversas, como las siguientes:
• mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados;
• contaminación cruzada entre muestras;
• productos de amplificaciones anteriores por PCR.
Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras tratadas (Roth et al., 1997).
Métodos físicos de prevención
Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminación, debe disponerse
de zonas de trabajo separadas físicamente de la forma siguiente: 1. Zona de preparación de muestras
Esta sala consiste de una zona en que se efectúan todas las fases previas a la amplificación del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificación del ADN).
2. Sala de disposición de la PCR
Esta sala «limpia» se dedica a los procesos de preparación de la PCR en sí (p. ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.).
3. Zona post-PCR
Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes:
• Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y suministros).
• Los reactivos y demás material deben etiquetarse con el nombre del contenido y la fecha de preparación.
• Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares pre-PCR.
• Deben utilizarse tubos de reacción para PCR desechables, libres de desoxirribonucleasa y de ribonucleasa.
• Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formación de aerosoles, y los juegos de pipetas serán exclusivos (se utilizarán solo para la PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo.
• Siempre que sea posible, prepárese la PCR en una campana extractora dotada de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes desechables que se utilizarán exclusivamente para la PCR.
• Las mesas y estantes se lavarán periódicamente con lejía al 10 %, seguida de etanol al 70 %.
Manipulación de las muestras
• Utilícense técnicas estériles y llévense puestos guantes recientes siempre que se trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones que contengan ADN molde.
• Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre materiales de vidrio, de plástico y pipetas nuevos o esterilizados.
• Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa.
• Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCR que solo se utilizarán con este fin, y dichos reactivos se almacenarán en pequeñas cantidades.
Métodos bioquímicos de prevención
Uracil-ADN glucosilasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede
amplificar una sola molécula más de mil millones de veces. Así, es posible amplificar una cantidad incluso minúscula de un contaminante, lo que daría lugar a un falso positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por PCR (contaminación por arrastre). Por tanto, se han elaborado métodos para evitar esta contaminación.
Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificación por la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (ADN) (Longo et al., 1990). El U-ADN contaminante de la muestra se eliminará tratando las mezclas de PCR posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificación por PCR y descomponiendo después los polinucleótidos pirimidínicos a temperatura elevada (95 ºC) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalización inicial) (véase la figura 8).
Figura 8. Reacción de la uracil-ADN glucosilasa.
Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con dUTP en lugar de con dTTP.
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que contengan dU en aplicaciones posteriores:
A=Adenina U=Uracilo G=Guanina
Calor
─►
pH alcalino
Uracil-ADN
─►
• los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes para la técnica del didesoxi;
• los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se transforman en hospedadores bacterianos UNG-;
• un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I, Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;
• no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni sobre la interacción del ADN con proteínas.
Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros métodos bioquímicos se basan en el
tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con una enzima de restricción que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe efectuarse la reacción, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la eficacia de la amplificación por PCR.
Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos (dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra). La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:
• se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos para una serie de análisis;
• disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes;
• pueden pipetearse volúmenes mayores;
• hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.
nuclear varía según los organismos, la concentración de ADN debe mantenerse constante (generalmente 10 ng/µl). El cuadro 3 muestra una comparación del
tamaño del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la transformación vegetal, así como el número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de ADN.
Cuadro 3. Comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales y
número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de ADN.
Muestra Tamaño del genoma
Ejemplares de genoma en 1 µg ADN
Ejemplares de genoma en
1 ng ADN
Maíz 5 x 109 pb 1,85 x 105 185
Soja 1,55 x 109 pb 5,98 x 105 598
Tabaco 3,8 x 109 pb 2,43 x 105 245
Arroz 4 x 108 pb 2,31 x 106 2310
Por ejemplo, en un plásmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de interés es el 25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maíz (5 x 109
pb) representa alrededor del 0,00002 % del ADN aportado. Hace falta aproximadamente un millón de veces más ADN del genoma del maíz para mantener el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN molde inicial para obtener una señal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la práctica es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran un número de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del número de ciclos, ya que entonces podría incrementarse la amplificación inespecífica.
Controles
fuente de contaminación. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los siguientes:
1. contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores;
2. contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN diana de una muestra a otra;
3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores;
4. degradación de productos por reacciones de descontaminación.
Mientras que las tres primeras formas de contaminación producen falsos positivos, el último tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminación, observada en primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibición de las PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminación con el método UNG favorece la formación de complejos con los cebadores.
Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles más utilizados para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificación de ácido nucleico.
Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR.
Control Método Contaminación de los reactivos con
el ADN diana
Control negativo de la PCR sin ADN molde (solo mezcla maestra)
Especificidad de la reacción Controles para detectar productos secundarios e inespecíficos
Desarrollo y sensibilidad de la reacción
Controles positivos y negativos para verificar que se cumplen las condiciones y
rendimientos buscados
Integridad de la mezcla de PCR PCR con control positivo de ADN
Controles positivos
preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana estudiado.
Controles negativos
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