Espectroscopia Raman en fluidos
biológicos extracelulares
Por
M. C. Adrián Eugenio Villanueva Luna
Tesis sometida como requisito parcial para
obtener el grado de
Doctor en Ciencias en la
especialidad de Óptica
en el Instituto Nacional
de Astrofísica, Óptica y Electrónica.
Supervisada por:
Dr. Jorge Castro Ramos
©INAOE 2013
Derechos Reservados
El autor otorga al INAOE el permiso de reproducir y distribuir copias de esta tesis en su totalidad o en partes.
En la entrega del premio nobel Raman estaba en completa
abstinencia de alcohol, y se le pregunto porque razón no estaba
tomando el respondió:
"Señor, usted ha visto el efecto Raman en alcohol, por favor no
trate de ver el efecto del alcohol en Raman."
Chandrasekhara Venkata Raman
“Recuerden niños, la diferencia entre perder el tiempo y hacer
ciencia es escribirlo”
Adam Savage
“Cuando me examino a mí mismo y mis métodos de
pensamiento, llego a la conclusión de que el don de la fantasía
ha significado más para mí que cualquier otro talento para el
pensamiento abstracto y positivo”
A mi madre Rosa del Carmen Luna Vela y a mi padre
Nicolás Villanueva García
por su apoyo en todo momento a lo
Agradecimientos
Le agradezco a mi hermano y mis hermanas, Armando, María del Carmen, Martha Edith, Verónica y Aracely Guadalupe por su apoyo moral en todo momento. A mi asesor el Dr. Jorge Castro Ramos por dejarme desarrollar este proyecto, sus valiosas discusiones que le aportaron a este trabajo, además de su paciencia en la forma de analizar los resultados obtenidos en cada experimento. Al Dr. Sergio Vázquez y Montiel por creer en este proyecto cuando se le presento la propuesta. A Carlos Ortiz Lima sin su ayuda no se habrían obtenido tan buenos dibujos para esta tesis, además de sus valiosos consejos en la estructura y presentación de esta tesis. A Daniel Sánchez Lucero por sus valiosas discusiones que me hacían reflexionar en el desarrollo de los experimentos y por su valiosa ayuda en la realización de la etapa xy del arreglo experimental utilizado para los experimentos de mapas. A José Gabriel Aguilar Soto por sus discusiones sobre este trabajo. Al Dr. Aarón Flores Gil por toda su motivación y asesoría para el desarrollo de este trabajo. A los voluntarios de los experimento realizados para este trabajo de tesis sin su ayuda no hubiera sido posible alcanzar el objetivo y las metas trazadas para llevar a cabo este trabajo. Al Dr. Michael D. Morris por darme la oportunidad de realizar una estancia en su laboratorio en la universidad de Michigan, sus conversaciones educativas que me sirvieron mucho para aprender más sobre espectroscopia Raman. Al Dr. Francis Esmonde-White por su asesoría y consejos en todo momento de mi estancia en el laboratorio Morris. A la Dra. Karen Esmonde-White por su ayuda y consejos en el trabajo realizado en mi estancia. A los miembros del grupo Morris Katherine, Alex, Mekhala, Gurjit, John, Bo, Ingeborg y Peizhi, por toda su ayuda en los trámites administrativos que tuve que realizar. A los miembros del grupo de óptica Biomédica de INAOE por sus preguntas en los seminarios sobre el trabajo de tesis. Al Dr. Agustín Alvarado Santiago por su ayuda en la realización de los Phantoms de PDMS. Al Dr. Francisco Renero Carrillo por su ayuda en la caracterización de los Phantoms de PDMS. A los sinodales por sus valiosos comentarios para la mejoría de la tesis presentada. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por haberme brindado la beca de doctorado y su apoyo con una beca mixta para realizar mi estancia. A la Fundación Pablo García por haber creído en mi proyecto y haberme brindado una beca a crédito a lo largo de mis estudios de doctorado. Al Instituto Nacional de Astrofísica Óptica y Electrónica por haberme dejado utilizar sus instalaciones para el desarrollo de mi tesis doctoral. A Liliana Perea por haber enviado los artículos que se necesitaron a lo largo de este trabajo de tesis doctoral. Finalmente a las secretarias de la coordinación de óptica, Paty y Eicela sin su ayuda en los tramites de compras y viáticos esto no hubiera sido posible.
Resumen
En este trabajo se hizo un estudio de la espectroscopia Raman en fluidos extracelulares, específicamente en fluidos intersticiales que se encuentran entre el dedo índice y el dedo pulgar con el fin de identificar las líneas espectrales de la glucosa, colesterol y triglicéridos. Conjuntamente los resultados muestran la dependencia entre la fluorescencia del espectro Raman con el color de la piel, un parámetro que se tiene que considerar cuando se hacen experimentos in vivo. Además se evaluaron los lugares del cuerpo donde se reportan en la literatura que se encuentran una gran cantidad de fluido intersticial y en el cual se tomaron los espectros Raman, dicha evaluación se hizo haciendo mapas de la piel y midiendo la estructura de la superficie usando tomografía óptica coherente. Adicionalmente se hicieron simuladores de tejido sintéticos mejor conocidos como phantoms, usando polidimetilsiloxano como base mezclados con lípidos sintéticos y glucosa, con el objetivo de ver el comportamiento de los espectros Raman en dicha mezcla. Otra de las variables evaluadas fue el tipo de sangre de la muestra para observar si se tenía una influencia adicional en el espectro Raman obtenido. Para ver la influencia mencionada se hizo un análisis de componentes principales, el cual muestra que se tiene una pequeña variación con el tipo de sangre. También se evaluó la regeneración del colágeno con la intención de ver si se tiene una influencia en el espectro Raman que se quiere obtener. Igualmente se presenta una evaluación de diferentes configuraciones geométricas de punta de prueba para mejorar la colección de la señal en el experimento. Esto se logró haciendo simulaciones de la razón entre fluorescencia y señal Raman usando NIRFAST, para corroborar los resultados se hicieron experimentos haciendo simuladores de tejidos con base de gelatina y se utilizó un tubo de silicona en el cual se le hizo pasar glucosa liquida. Para medir el rendimiento de la geometría óptima se comparó con otras geometrías propuestas haciendo una evaluación global de la intensidad de la banda espectral de la silicona. Los resultados encontrados en este trabajo de tesis muestran que se tiene un gran potencial para hacer la cuantificación de las líneas espectrales de los lípidos y la glucosa en la sangre.
Abstract
In this work, extracellular fluids, specifically interstitial fluids found in between the index and thumb finger, were examined using Raman spectroscopy in order to identify spectral lines of glucose, cholesterol and triglycerides. in vivo Raman imaging measurements of skin at body sites reported in the literature to contain large amount of interstitial fluid were correlated with
surface structural information obtained using optical coherence tomography.
Polydimethylsiloxane tissue phantoms with imbedded lipids and glucose were used to obtain reference spectra of glucose-lipid mixtures in tissue. Principal component analysis of the Raman imaging data showed that there were small variations in Raman signal with sample blood type. The correlation of collagen and water content were evaluated to determine the influence of skin hydration on the Raman data. A fiber optic probe for through the skin measurements was developed by first optimizing the fiber geometry using Nirfast simulations. Fiber geometries were then compared experimentally by making an overall assessment of the spectral band intensity of silicone to verify the optimum configuration. Using the optimized geometry, the ratio of fluorescence and Raman Nirfast simulations were corroborated with Raman probe measurements of gelatin phantoms containing glucose solution filled silicone tubes. In conclusion, the results show that Raman spectroscopy has great potential for the quantification of lipids and blood glucose. Results show dependence between Raman fluorescence and skin color. This needs to be considered with in vivo experiments.
Índice general
Índice general
Dedicatoria ... B Agradecimientos ... C Resumen ... I Abstract ... II Lista de figuras ... III Lista de tablas ... VI
Capitulo 1. Introducción ... 1
1.1 Objetivos y Metas de la tesis ... 4
1.2 Estructura de la tesis ... 4
Capitulo 2. La piel ... 6
2.1 Introducción ... 6
2.2. Estructura general histológica ... 6
2.2.1. Epidermis ... 7
2.2.2 Dermis ... 8
2.2.3 Tejido subcutáneo ... 9
2.3 Lípidos ... 10
2.4. El fluido intersticial ... 10
2.5. Glucosa ... 12
2.6. Colesterol ... 13
2.7. Triglicéridos ... 14
Capitulo 3. Espectroscopia Raman ... 16
3.1. Introducción ... 16
3.2. Descripción del efecto Raman... 17
3.3. Ruidos en espectroscopia Raman ... 21
3.3.1 Ruido de disparo (Shot noise) ... 21
3.3.1. Ruido generado por la muestra ... 22
3.3.2. Ruido generado por la instrumentación ... 22
3.3.3. Ruido computacional ... 22
3.3.4. Ruido generado por fuentes externas ... 22
3.4. Vibraciones moleculares ... 24
4.1. Tomografía óptica coherente... 29
4.2. Análisis de componentes principales (PCA) ... 30
4.3. NIRFAST ... 31
4.3.1. Aproximación de la difusión ... 32
4.3.2. Implementación en elementos finitos ... 33
4.4. Arreglo experimental y componentes utilizadas ... 34
4.4.1. Espectrómetro QE65000 ... 34
4.4.2. Componentes del espectrómetro QE65000 ... 35
4.4.2.1. Diseño con filtraje eficiente ... 36
4.4.2.2. Láser 785 nm ... 37
4.5. Arreglo experimental ... 38
Capitulo 5. Método de procesado ... 39
5.1 Reducción de ruido usando wavelets ... 39
5.1.1. Wavelets ... 39
5.1.2. Wavelets discretas ... 41
5.1.2.1. Transformada inversa a partir de los coeficientes ... 41
5.1.3. Wavelets symlets ... 43
5.1.4. Descripción del método ... 44
5.2. Método adaptivo MimMax. ... 47
5.2.1. Ajuste polinomial modificado ... 47
5.2.2. Ajuste adaptable ... 47
5.2.3. Ajuste Polinomial en forma restringida ... 49
5.2.4. Ajuste polinómico MimMax ... 49
Capitulo 6. Resultados ... 51
6.1. Efectos del color de piel en los espectros Raman ... 51
6.2. Mapas Raman de la piel ... 52
6.2.1. Mapeo de punto a punto ... 53
6.2.2. Escaneo de línea ... 53
6.2.3. Iluminación global... 54
6.2.4. Datos obtenidos ... 55
6.3. Imágenes OCT de la piel ... 61
6.4. Efectos del colágeno en el espectro Raman ... 64
Índice general
6.6. Simulaciones con tejido sintético ... 70
6.7. Espectros Raman de fluidos intersticiales ... 74
6.8. Diferentes geometrías de puntas de prueba Raman ... 78
6.8.1. Simulaciones usando NIRFAST ... 80
6.8.2. Evaluación experimental de las puntas de prueba Raman ... 84
Capitulo 7. Conclusiones y trabajo a futuro ... 92
Capitulo 8. Referencias ... 95
Apendice A: Lista de publicaciones ... 100
Apéndice B: ANSI Z136.1-2007 ... 101
Apéndice C: Programas escritos para esta tesis ... 103
Índice de figuras
Figura 1 Capas de la piel[31]. ... 7Figura 2 Iso-forma D y L de la glucosa. ... 12
Figura 3 Estructura Molecular del colesterol. ... 13
Figura 4 Estructura molecular de los triglicéridos... 15
Figura 5 Se ilustra el experimento realizado por C.V Raman. ... 18
Figura 6 Diagrama de Jablonski ... 19
Figura 7 Espectro Raman del sulfuro, mostrando los cambios Stokes y anti-stokes. ... 20
Figura 8 Tipos de ruidos. ... 23
Figura 9 Se muestra las bandas Raman y la fluorescencia de Fondo. ... 24
Figura 10 Se muestra la molécula del etileno planar. ... 25
Figura 11 Diagrama esquemático del sistema que se tiene en el laboratorio. ... 30
Figura 12 Secuencia usada en NIRFAST para el modelo directo. ... 34
Figura 13 Componentes del espectrómetro Raman QE65000. ... 35
Figura 14 Diagrama de la punta de prueba ... 37
Figura 15 Arreglo experimental empleado en esta tesis ... 38
Figura 16 Espectro wavelet resultante de escalar la wavelet madre en dominio del tiempo ... 40
Figura 17 Wavelet Symlet 6, (izquierda) función de escala y (derecha) función Wavelet ... 43
Figura 18 Descomposición de multi-resolución. ... 45
Figura 19 Ejemplo de un espectro descompuesto en multi-resolución... 45
Figura 20 Descomposición de la señal usando wavelets. ... 46
Figura 21 Espectro Raman sin ruido. ... 46
Figura 22 Espectro de la muestra con adición de fondo Gaussiano con diferentes proporciones F/S. El contorno del espectro original visible se presenta en una proporción de 10, mientras que el otro espectro tiene una proporción de fluorescencia de 100. ... 48
Figura 23 Se muestran los residuos de los espectros normalizados restando el ajuste del espectro original. ... 48
Figura 24 Se muestra el espectro del polinomio sin restricciones (ajuste de quinto orden) y el restringido
(ajusto de quinto orden restringido) que se ajustan para remover la fluorescencia. ... 49
Figura 25 Ejemplo de la forma del ajuste MimMax en un espectro con fluorescencia de fondo gaussiano. ... 50
Figura 26 Se muestran los distintos colores de piel de los voluntarios de este experimento. ... 51
Figura 27 Se muestra la fluorescencia del espectro Raman obtenidos de los voluntarios. ... 52
Figura 28 Arreglo óptico básico de una punta de prueba, donde D es el diámetro de la fibra de excitación, FC es la distancia focal de la lente colimadora, FF es la distancia focal de la lente que da la distancia focal de la punta de prueba y S es la mancha que genera el láser. ... 55
Figura 29 Arreglo experimental empleado para hacer los mapas de la piel... 56
Figura 30 Imagen de la interface desarrolla en LabVIEW para realizar los mapas de la piel. ... 56
Figura 31Concepto de cómo se realizaron los mapas. ... 57
Figura 32 Esquema de espectros que se encuentran dentro del mapa. ... 57
Figura 33 Mapa espectros Raman de la palma de la mano. ... 58
Figura 34 Mapa de espectros Raman del dorso de la mano. ... 59
Figura 35 Mapa de espectros de Raman de la piel con similares características. ... 59
Figura 36 Mapa de espectros Raman de los cambios por las cicatrices. ... 60
Figura 37 Mapa de espectros Raman de los cambios por los lunares. ... 60
Figura 38 Se muestran los diferentes colores de piel de los voluntarios para este experimento. ... 61
Figura 39 Imágenes de cuatro voluntarios dos mujeres (V6 y V9) y dos hombres. ... 62
Figura 40 Se muestras las imágenes OCT de dos voluntarios de todas las áreas que se están midiendo en este experimento. ... 62
Figura 41 Imágenes OCT del voluntario 1 al 5 se muestran todas las áreas donde se midió... 63
Figura 42 Imágenes OCT del voluntario 6 al 10 se muestran todas las áreas donde se midió. ... 63
Figura 43 Imagen OCT (arriba) y (abajo) la transformada de Fourier del área señalada con la flecha. ... 63
Figura 44 Se muestras los cambios del colágeno a 507 cm-1. ... 64
Figura 45 Se muestra las variaciones del colágeno a 937 cm-1. ... 65
Figura 46Se muestran las variaciones espectrales de dos bandas del colágeno (1330 y 1345 cm-1). ... 65
Figura 47 Se muestra la línea espectral más intensa relacionada con el colágeno, la cual se encuentra en 1635 cm-1... 66
Figura 48 Se muestran las bandas de hemoglobina (grises) y las de fibrina (amarillo) de los voluntarios con O+. ... 68
Figura 49 Se muestran las variaciones de estos espectros normalizados a 1002 cm-1. ... 69
Figura 50 Se muestra las distribución de la muestras usando la componente principal 1 y la 2. ... 69
Figura 51 Se muestra una gráfica Biplot donde se ilustran las contribuciones de cada una de las variables. ... 70
Figura 52 Metodología de fabricación de tejidos sintéticos de PDMS (a) medición de los componentes, (b) mezclar los componentes, (c) extracción de burbujas en la cámara sónica y (d) verter de mezcla en un recipiente para la generación del tejido sintético de PDMS. ... 71
Figura 53 Se muestra el espectro Raman de los componentes utilizados para realizar los tejidos sintéticos ... 72
Figura 54 Perfil Y de 3 tejidos sintéticos. (a) tejido sintético 2, (b) tejido sintético 4 y (c) tejido sintético 6. ... 73
Índice general
Figura 56 Espectros Raman del tejido sintético 3(F3), tejido sintético 4(F4), tejido sintético 5(F5) y tejido
sintético 6(F6). ... 74
Figura 57 Espectros Raman de fluidos intersticiales ... 75
Figura 58 Espectros Raman de fluidos intersticiales, en donde se muestran 3 bandas importantes de glucosa, colesterol y triglicéridos. ... 76
Figura 59 Espectros Raman de fluidos intersticiales y colesterol. ... 76
Figura 60 Espectros Raman de fluidos intersticiales y glucosa. ... 77
Figura 61 Espectros Raman de fluidos intersticiales y triglicéridos. ... 77
Figura 62 (derecha) Espectro Raman de la glucosa Solida y (izquierda) espectro Raman de la glucosa liquida. ... 79
Figura 63 Espectro Raman de la banda más representativa de la silicona. ... 79
Figura 64 Cilindro generado para realizar simulación. En este cilindro se muestran 3 capas pero solo se utilizaron dos. ... 80
Figura 65 Se muestra la variación del coeficiente de esparcimiento y absorción con respecto a la profundidad. (Izquierda) variación del coeficiente de absorción (0.012, 0.042 and 0.082 mm-1) con un coeficiente de esparcimiento de 3.5 mm-1. (Derecha) variación del coeficiente de esparcimiento con respecto a la profundidad (0.7, 1.9 and 3.5 mm-1) coeficiente de absorción de 0.012 mm-1... 81
Figura 66 Modelos de absorción (izquierda) y (derecha) esparcimiento. También la fuente en distintas posiciones (parte superior) de origen en 2.5 mm ejes, (centro) y origen mm (abajo) Fuente de +5 mm. ... 82
Figura 67 Se muestra las configuraciones más eficientes teniendo la fuente de iluminación en eje a +2.5 y 5 mm, a una profundidad de 1 mm. ... 83
Figura 68 Se muestran las geometrías propuestas para ser comparadas con la de mayor eficiencia. Esta comparación se hará de manera experimental... 84
Figura 69 Se muestra la imagen espectral de las fibras 50 de las diez ramas diferentes, el orden es rama 1 en inferior y 10 en la parte superior. Esta imagen muestra el perfil espectral de fibras iluminado por una fuente de luz blanca. ... 85
Figura 70 Se muestran los diferentes perfiles espaciales de las ramas de fibras que se utilizan para este experimento... 85
Figura 71 En esta figura se muestra la distancia entre el borde del contenedor y gelatina. La figura de la parte superior derecha muestra la montura utilizada para probar las configuraciones propuestas y las ramas de fibra. La figura de la gelatina con el tubo de silicona y las dimensiones del tubo de silicona se muestran en la parte inferior. ... 86
Figura 72 Se muestra fibras antes y después de la limpieza con metanol... 87
Figura 73 (Izquierda) Muestra el tejido sintético hecho con gelatina utilizando intralípido II. (Centro) Tejido sintético liquido hecho con agua e intralípido II, y (derecha) se muestra el montaje experimental para medir el espectro de la fibra usando luz blanca. ... 87
Figura 74 Se muestra el perfil de intensidad de del espectro de la fibra iluminando con luz blanca de cada rama. (Izquierda), el primer conjunto de datos que se tomaron y (derecha) los que se tomaron de forma sistemática del perfil de intensidad... 88
Figura 75 Graficas obtenidas en el experimento. ... 89
Figura 76 Se muestra la gráfica de las variaciones de cada una de las configuraciones... 90
Figura 77 Se muestran las cuatro configuraciones con la mejor eficiencia en las pruebas experimentales realizadas. ... 91
Índice de tablas
Tabla 1 Vibraciones moleculares del colesterol. ... 25
Tabla 2 Vibraciones moleculares de la glucosa. ... 26
Tabla 3 Vibraciones moleculares de los triglicéridos. ... 27
Tabla 4 Vibraciones moleculares del colágeno. ... 27
Tabla 5 Vibraciones moleculares de la hemoglobina y la fibrina. ... 28
Tabla 6 Se muestran la distribución del tipo de sangre en la población hispana. ... 67
Tabla 7 Muestra las concentraciones de los fantoms que se fabricaron. ... 72
Capítulo 1: Introducción
Capitulo 1.
Introducción
El aumento de peso y la falta de actividad física han hecho que los últimos años se incremente (el número) de personas con triglicéridos y colesterol elevado. Otro de los problemas de salud que va en aumento es la diabetes, la Organización Mundial de la Salud (World Health Organization, WHO por sus siglas en inglés), muestra las estadísticas en el año 2000, a nivel mundial había 171 millones de pacientes y se proyecta que para 2030 habrá 366 millones de personas con diabetes. En el caso de México, de acuerdo a la OMS, es el tercero en América después de Estados Unidos y Brasil con una cifra de 2,179,000 (2000) y una proyección de 6,130,000 (2030)1 . Las últimas estadísticas presentadas por el sector salud en abril de 2012 muestran que México ocupa el séptimo lugar a nivel mundial por el número de enfermos con de diabetes2.Para el caso de la Diabetes es fácil determinar las cifras de individuos que padecen dicha enfermedad, pero en el caso de aquellos que padecen elevación del colesterol es más complicado, porque no todos los que tienen el colesterol elevado saben que están padeciendo este problema y por lo tanto no se someten a una prueba para medir los lípidos, además no es común que cuando visiten al médico se tenga un aparato que les determine si su colesterol esta elevado. La cifras que proporciona la OMS no son el número de personas que la padecen sino un porcentaje de personas que están en riesgo de tener el colesterol elevado. Otra cifra que se puede encontrar en las estadísticas de la OMS es el promedio de colesterol en cada país. Las estadísticas encontradas están en edades mayores a los 25, entre los años de 1980 a 2008. En México la prevalencia de colesterol elevado en la sangre es de 50.7 % y el colesterol promedio en la población es de 4.9 mM donde el máximo normal es de 5.2 mM3.
La capacidad del médico para diagnosticar la enfermedad se ve reforzada por la disponibilidad de información objetiva oportuna, y cuantitativa. Los sucesivos avances en la tecnología biomédica han favorecido obtener la información que se necesita.
Novedosas aplicaciones biomédicas de la espectroscopia óptica, tales como la de fluorescencia [1], reflectancia [2] y Raman [3], puede proporcionar información sobre la composición del tejido a nivel molecular. De estas técnicas, la espectroscopia Raman puede proporcionar información detallada sobre la mayoría de la composición química del tejido en estudio debido a que la progresión de la enfermedad se acompaña de intercambio químico, la espectroscopia Raman puede proporcionar al médico información valiosa para el diagnóstico de la enfermedad. La espectroscopia Raman es una técnica óptica que, recopila la información de las muestras de estudio, por medio de fibras ópticas, las cuales a su vez, fácilmente se pueden adaptar en el instrumental común utilizado por los médicos, como: los catéteres, endoscopios y agujas, según
1
http://www.who.int/diabetes/facts/world_figures/en/index.html 2
[http://www2.esmas.com/salud/417176/mexico-septimo-lugar-diabetes-mundo/]. 3http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_prevalence/en/
sea necesario. La espectroscopia de Raman es versátil, y también puede adecuarse para realizar la toma de espectros directamente in vivo, y además obtener la información en tiempo real [4].
Las aplicaciones diagnósticas de la espectroscopia Raman actualmente bajo investigación son muy diversas. Por ejemplo, la espectroscopia de Raman se puede utilizar para controlar analitos en sangre de forma no invasiva [5]. Se puede utilizar para realizar diagnóstico de tejido in vivo mínimamente invasiva en tiempo real, cuando existe una alta incidencia de prueba falsas positivas que conduce a biopsia, como en el cáncer de mama [6,7].
Uno de los métodos para detectar glucosa en la sangre fue desarrollado en la universidad Syracuse por el Dr. Chaiken, su instrumento consiste en medir en la yema de los dedos usando luz de excitación infrarroja en la que se colecta esparcimiento Raman, Rayleigh y Mie además de la fluorescencia. Debido a que la yema de los dedos es altamente vascularizada es una buena zona para recolectar información de la sangre. Pero las manos y los dedos en particular son altamente idiosincrásicos que requieren aparatos específicos para permitir una cuidadosa y metódica espectroscópica de sondeo. El aparato incluye medios para la colocación precisa y reproducible de los tejidos en relación con la abertura óptica que disponen los medios adecuados para aplicar y mantener la presión que mantiene el tejido superficial inmóvil durante los experimentos. La materia blanda; por ejemplo, la piel se extruye en la abertura en respuesta a cualquier presión aplicada, por ejemplo, para mantener el tejido en registro con el sistema óptico, por lo que la posición, el área de contacto, la presión, y la fuerza se mide continuamente y es almacenada para producir retroalimentación para aplicar una fuerza de accionamiento y para discernir la conformidad del sujeto de prueba. El cumplimiento afecta fuertemente a la fiabilidad de la medición y los factores humanos deben ser adecuadamente gestionados en el caso de palpación in vivo. El aparato produce observaciones y mediciones reproducibles que permiten palpación consistente de los tejidos de una amplia gama de tipos de piel [8–12].
Otra de las alternativas en la literatura es la medición de glucosa in vivo usando espectroscopia Raman de mejoramiento de superficie conocida como SERS (por sus siglas en inglés Surface Enhanced Raman Spectroscopy). El grupo de la universidad de Northwestern del Dr. Van Duyne ha realizado mucho del trabajo reportado en la literatura. Este método consiste en una técnica óptica altamente específica y sensible adecuada para la detección directa de la glucosa. El efecto SERS es altamente dependiente de la distancia focal, con lo que las moléculas de glucosa que están dentro de unos pocos nanómetros o absorbido a una superficie SERS-activa. Este sensor, se realiza con una monocapa auto-ensamblada (SAM) que facilita las interacciones reversibles entre moléculas de glucosa y la superficie. La cantidad de glucosa cerca de la superficie es proporcional a su concentración en el medio ambiente circundante [13–18].
Uno de los laboratorios que lleva más tiempo trabajando en la detección de glucosa es el George Harrison el cual estaba dirigido por el Dr. Feld. Uno de los principales obstáculos que han enfrentado es que la luz del infrarrojo cercano penetra sólo la mitad de un milímetro por debajo de la piel, por lo que mide la cantidad de glucosa en el líquido que baña las células de la piel
Capítulo 1: Introducción
(conocida como líquido intersticial), no la cantidad en la sangre. Para superar esto, el equipo produjo un algoritmo que relaciona las dos concentraciones, lo que les permite predecir los niveles de glucosa en sangre a partir de la concentración de glucosa en el líquido intersticial. Sin embargo, esta calibración se hace más difícil inmediatamente después de que el paciente come o bebe algo azucarado, porque la glucosa en la sangre se eleva rápidamente, mientras que se requieren cinco a 10 minutos a ver un aumento correspondiente en los niveles de glucosa en fluido intersticial. Por lo tanto, las mediciones de líquido intersticial no dan una idea exacta de lo que está sucediendo en el torrente sanguíneo. Para abordar este tiempo de retraso, Barman y Kong desarrollado un nuevo método de calibración, llamado corrección de concentración dinámica (DCC), que incorpora la velocidad a la que la glucosa se difunde desde la sangre hacia el líquido intersticial. En un estudio de 10 voluntarios sanos, los investigadores utilizaron espectroscopia Raman calibrada con DCC para aumentar significativamente la precisión de las mediciones de glucosa en la sangre obteniendo una mejora promedio del 15 por ciento y hasta un 30 por ciento en algunos pacientes [5,19–24].
Para el caso del colesterol la mayoría de las investigaciones en espectroscopia Raman se hace con muestras in vitro y para la detección de ateroesclerosis [25,26]. En uno de los trabajos reportados por Van de Poll et al. 2003 evalúa la sensibilidad y especificidad de la espectroscopia Raman para la detección de colesterol o calcificación en la arteria coronaria humana y muestras de aorta in vitro, utilizando un punta de prueba Raman desarrollada para aplicaciones in vivo[27].
De los pocos estudios que hay para triglicéridos Chan et al 2005, estudia lipoproteínas individuales ricas en triglicéridos (TGRL) extraída de sangre de voluntarios humanos combinando pinzas ópticas y microespectroscopia Raman. Con la cual se obtiene información sobre su composición y además se obtuvo la firma espectral Raman de las lipoproteínas individualmente atrapadas de muy baja densidad, una subclase de TGRL, que desempeñan un papel importante en la enfermedad cardiovascular, exhibe picos distintos asociados con las vibraciones moleculares de los ácidos grasos, proteínas, lípidos, y reordenamientos de los lípidos [28].
Lo anterior mencionado resume los trabajos más importantes reportados en la literatura para la detección de glucosa, colesterol y triglicéridos.Como se puede ver los métodos para estudiar la concentración de la glucosa son bastante estudiados y hay varias propuestas en la espectroscopia Raman para realizarla. En el caso del colesterol su estudio in vivo no es tan estudiado, su enfoque principal es hacia la detección de ateroesclerosis. Y en el caso de los triglicéridos se hace in vitro aislando las partículas derivadas de los triglicéridos.
1.1
Objetivos y Metas de la tesis
El objetivo principal de este trabajo de tesis, consiste en obtener espectros Raman en fluidos biológicos extracelulares in vivo entre el dedo índice y el pulgar y determinar las bandas espectrales de la glucosa, el colesterol y triglicéridos.
Para llevar a cabo el objetivo se requiere de cumplir con las siguientes metas:
o Evaluar el efecto en el espectro Raman de la coloración de la piel.
o Evaluar el efecto del tipo de sangre en el espectro Raman.
o Generar tejidos sintéticos con lípidos y glucosa para evaluar cómo influye la mezcla de las sustancias en el espectro Raman.
o Evaluar los espectros Raman generados en los fluidos intersticiales para la identificación de la glucosa, colesterol y triglicéridos.
o Diseñar una punta de prueba con múltiples fibras para la mejor colección de los espectros Raman.
1.2
Estructura de la tesis
En el capítulo 2 se describen las diferentes capas que conforman la piel. En la primera sección se da una definición de la piel humana. En la segunda sección se detallan las diferentes capas que la conforman y su función principal. En la tercera sección, se definen los lípidos, fluidos intersticiales, glucosa, colesterol y triglicéridos. En el capítulo 3 se define la espectroscopia Raman y los fundamentos principales en el que se basa esta técnica. Además se describen los diferentes tipos de “ruidos” por efectos ópticos que se presentan al obtener el espectro Raman de interés. Finalmente, se detallan las vibraciones moleculares utilizadas para el desarrollo de este trabajo de tesis. En el capítulo 4 se puntualizan otros métodos ópticos y matemáticos alternos a la espectroscopia Raman que se utilizaron adicionalmente para llevar a cabo el trabajo de tesis, tales como: la tomografía óptica coherente, el análisis de componentes principales (PCA, por sus sigla en Inglés), y la descripción del software NIRFAST que fue utilizado para diseñar geometrías de puntas de prueba Raman. Después se describe detalladamente el arreglo experimental utilizado; es decir, cada uno de los componentes que constituyen el espectrómetro Raman, tales como: el modulo láser, la punta de prueba, la resolución espectral del equipo, etc. En el capítulo 5 se detalla el método de procesado se abordan un par de problemas encontrados en la espectroscopia Raman, los cuales son el ruido de disparo y la fluorescencia de fondo. Existen muchos métodos para removerlos pero en esta tesis se hace una propuesta de método de remoción de ruido, y se utiliza uno reportado en la literatura para sustraer la fluorescencia debido a que el comportamiento es similar a los que se obtienen en los espectros de esta tesis. En la primera sección se describe el método de reducción de ruido utilizando wavelets de tipo Symlets
Capítulo 1: Introducción
y en la segunda sección se describe el método para sustraer fluorescencia denominado MimMax. En el capítulo 6 se presenta los experimentos realizados y los resultados que se obtuvieron en este trabajo. Está dividido en el estudio del efecto del color de la piel en los espectros Raman, la realización de mapas de la piel, imágenes OCT para ver la zona que se está midiendo, los experimentos que se realizaron con tejidos sintéticos (phantoms) hechos con PDMS, la influencia del tipo de sangre en el diagnóstico, los espectros de los fluidos intersticiales y finalmente el diseño de una punta de prueba con mayor eficiencia que la que se tiene en el laboratorio. Finalmente en el capítulo 7 se puntualizan las conclusiones logradas en este trabajo de tesis y el trabajo a futuro.
Capitulo 2.
La piel
2.1
Introducción
La piel es uno de los objetivos bajo estudio en esta tesis, debido a que se tomarán espectros en diferentes partes de ella, tales como: encima de la palma, en medio del pulgar y el dedo índice, encima y abajo del pulgar. Por tal motivo es importante dar una breve descripción de ella y de las sustancias que se quieren medir. En este capítulo se describen las diferentes capas que conforman la piel, en la primera sección se da una definición de la piel humana. En la sección dos se describen las diferentes capas que la conforman y su función principal, en la sección tres se define los lípidos, fluidos intersticiales, glucosa, colesterol y triglicéridos.
La piel es el mayor órgano del cuerpo humano. Ocupa aproximadamente 2 m², y su espesor varía entre los 0.5 mm (en los párpados) a los 4 mm (en el talón). Su peso aproximado es de 5 kg. Actúa como barrera protectora que aísla al organismo del medio que lo rodea, protegiéndolo y contribuyendo a mantener íntegras sus estructuras, al tiempo que actúa como sistema de comunicación con el entorno [29].
Las tres capas principales desde la superficie son:
La epidermis, La dermis y
El tejido subcutáneo.
De la piel dependen ciertas estructuras llamados anexos cutáneos que son los vellos, las uñas, las glándulas sebáceas y las sudoríparas. En la piel del ser humano, sobretodo la del varón se produce más secreción sebácea que la que tiene la mujer. Esto es debido a la mayor cantidad de andrógenos (hormona sexual masculina) que produce el varón. Como consecuencia, la piel masculina es más gruesa y grasa que la femenina [1].
2.2.
Estructura general histológica
La piel está compuesta de:
Corpúsculos de Meissner (Georg Meissner): Presentes en el tacto de piel sin vellos, palmas, plantas, yema de los dedos, labios, punta de la lengua [30].
Capítulo 2: La piel
Corpúsculos de Paccini: que dan la sensación de presión. Corpúsculos de Ruffini: que registran el calor.
Corpúsculos de Merckel: que registran al tacto superficial.
Existen dos tipos de piel:
Piel blanda: la piel blanda es aquella que se encuentra principalmente en los párpados y las zonas genitales.
Piel gruesa: la piel gruesa se localiza en la piel labial, plantar y palmar, además ésta se caracteriza por tener un estrato corneo muy desarrollado, a comparación del resto de la piel.
Mientras que en corrientes médicas, como la histoanatomía y dermatología se estudia en 3 estratos:
Epidermis. Dermis.
Tejido subcutáneo
Cada una de las capas tiene funciones y componentes diferentes que se interrelacionan.
Figura 1 Capas de la piel[31].
2.2.1. Epidermis
La epidermis es la capa externa de la piel. El espesor de la epidermis varía en diferentes tipos de piel. Es la más fina en los párpados a 0.05 mm y la más gruesa en las palmas y plantas de los pies
a 1.5 mm. La epidermis se compone en su mayoría por queratinocitos, que se encuentran segmentados en el estrato corneo, además de un factor importante que son los melanocitos o también llamados como los pigmentocitos, que dan la pigmentación a la piel y que se encuentran justamente sobre el estrato germinativo. En la piel se pueden apreciar bajo cortes histológicos células de Langerhans y linfocitos, que se encargan de dar protección inmunológica, además de hallar a los mecanorreceptocitos o células de Merckel [31].
La epidermis también contiene melanocitos que producen melanina (el pigmento de la piel). Se divide en 5 capas [31]:
Estrato germinativo se compone de una capa de células cilíndricas bajas u ovales, su citosol demuestra la presencia de tonofibrillas, además que las células de dicho estrato se relaciona por la unión desmosómica, además de anclarse a la membrana basal por uniones hemidesmosómicas.
Estrato espinoso se conforma por células con forma poligonal, los núcleos son redondos y el citosol es de características basofílicas. Tiene un mayor contenido de tonofibrillas que las del estrato germinativo. Las prolongaciones del citosol se asemejan a espinas, por lo que también reciben células espinosas, justamente porque las tonofibrillas son más numerosas en dichas prolongaciones dando la forma de espinas.
Estrato granuloso se compone de 3 a 5 capas de células aplanadas, el citosol contiene gránulos basófilos denominados gránulos de queratohialina. La queratohialina es una sustancia precursora de la queratina. Cuando los queratinocitos llegan a la última capa de este estrato las células epidérmicas mueren y al morir vierten su contenido al espacio interceular.
Estrato lúcido se distingue por tener una zona muy delgada de características eosinófilas. Los núcleos comienzan a degenerar en las células externas del estrato granuloso y desaparecen en el estrato lúcido.
Estrato córneo de células planas queratinizadas anucleadas, también llamadas células córneas. Esta capa se distingue como la más gruesa y eosinófila. El estrato córneo está formado por hileras aplanadas y muertas que son los corneocitos. Los corneocitos están compuestos mayormente por queratina. Todos los días se eliminan capas de corneocitos. Estrato disyunto es la continua descamación de las células córneas.
Las células que migran desde el estrato germinativo tardan en descamarse alrededor de 4 semanas. Esto depende de la raza y género, así como también de la especie cuando se estudia en animales.
2.2.2 Dermis
La dermis también varía en espesor dependiendo de la localización de la piel. Se trata de 0.3 mm en los párpados y 3 mm en la parte trasera. La dermis es una capa profunda de tejido conjuntivo
Capítulo 2: La piel
en la cual se tienen la peculiaridad de la abundancia de las fibras de colágeno y elásticas que se disponen de forma paralela y que le dan a la piel la consistencia y elasticidad característica del órgano. Histológicamente se divide en 2 capas [31]:
Estrato papilar. Compuesto por tejido conectivo laxo, fibras de colágeno tipo III, y asas capilares.
Estrato reticular: compuesto por tejido conectivo denso, fibras de colágeno tipo I, fibras elásticas, en donde se encuentran microscópicamente mastocitos, reticulocitos y macrófagos. En su porción inferior se observa una capa de músculo liso que conforma al músculo piloerector. En la piel facial existe musculatura de tipo estriado en donde hay fijación de los músculos de la mímica en la dermis.
En la dermis se hallan los siguientes componentes [32]:
Folículo piloso. Músculo piloerector.
Terminaciones nerviosas aferentes (que llevan información). Glándulas sebáceas.
Vasos sanguíneos y linfáticos.
La dermis es 20-30 veces más gruesa que la epidermis. En ella se encuentran los anexos cutáneos, que son de dos tipos: córneos (vellos y uñas) glandulares (glándulas sebáceas y sudoríparas).
2.2.3 Tejido subcutáneo
Es un estrato de la piel que está compuesto de tejido conjuntivo lazo y adiposo, lo cual le da funciones a la piel de regulación térmica y de movimiento a través del cuerpo como el que se ve cuando estiramos la piel de nuestro antebrazo hacia arriba, si no tuviera estos tipos de tejidos sería imposible moverla [31].
Los componentes propios que integran al tejido subcutáneo son:
Ligamentos cutáneos. Nervios cutáneos. Grasa.
2.3
Lípidos
Los lípidos son un conjunto de moléculas orgánicas, la mayoría biomoléculas, compuestas principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno, que tienen como característica principal el ser hidrofóbicas o insolubles en agua y sí en disolventes orgánicos como la bencina, el alcohol, el benceno y el cloroformo. En el uso coloquial, a los lípidos se les llama incorrectamente grasas, aunque las grasas son sólo un tipo de lípidos procedentes de animales. Los lípidos cumplen funciones diversas en los organismos vivientes, entre ellas la de reserva energética (triglicéridos), la estructural (fosfolípidos de las bicapas) y la reguladora (esteroides) [33].
2.4.
El fluido intersticial
El fluido intersticial (o fluido tisular) es una solución que baña y rodea a las células de los animales multicelulares. Es el componente principal del fluido extracelular, que también incluye plasma y el líquido transcelular. El fluido intersticial se encuentra en los espacios intersticiales, también conocidos como los espacios de los tejidos. En promedio, una persona tiene alrededor de 11 litros de líquido intersticial, el cual proporciona a las células del cuerpo con nutrientes y un medio de eliminación de residuos [34].
Producción y eliminación
Plasma y el líquido intersticial son muy similares. Plasma, el componente principal de la sangre, se comunica libremente con el fluido intersticial a través de los poros y hendiduras intercelulares en el endotelio capilar.
Formación de fluido de tejido
La presión hidrostática es generada por la fuerza sistólica del corazón. Se empuja el agua fuera de los capilares. El potencial de agua se crea debido a la capacidad de los solutos pequeños para pasar a través de las paredes de los capilares. Esta acumulación de solutos induce ósmosis. El agua pasa de una alta concentración (de agua) fuera de los vasos a una baja concentración en el interior de los vasos, en un intento de alcanzar un equilibrio. La presión osmótica conduce de nuevo el agua en los vasos. Debido a que la sangre en los capilares está fluyendo constantemente, equilibrio nunca se alcanza. El equilibrio entre las dos fuerzas difiere en diferentes puntos de los capilares. En el extremo de un vaso arterial, la presión hidrostática es mayor que la presión osmótica, por lo que favorece el movimiento neto de agua y otros solutos
Capítulo 2: La piel
que son pasados en el fluido del tejido. En el extremo venoso, la presión osmótica es mayor, por lo que el movimiento neto favorece sustancias que se pasa de nuevo en el capilar. Esta diferencia es creada por la dirección del flujo de la sangre y el desequilibrio de solutos creados por el movimiento neto de agua favorece el fluido del tejido.
La eliminación del fluido tisular
Para evitar una acumulación de fluido de tejido que rodea a las células en el tejido, el sistema linfático juega un papel en el transporte de líquido de los tejidos. Líquido tisular puede pasar a los vasos linfáticos circundantes, y, finalmente, termina por reunirse con la sangre.
A veces, la eliminación de líquido de los tejidos no funciona correctamente, y hay una acumulación. Esto causa hinchazón, y puede verse a menudo alrededor de los pies y los tobillos.
Composición
El fluido intersticial consiste en un disolvente de agua que contiene aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, coenzimas, hormonas, neurotransmisores, sales, así como los productos de desecho de las células. La composición de fluido de los tejidos depende de los intercambios entre las células en el tejido biológico y la sangre. Esto significa que el fluido tisular tiene una composición diferente en diferentes tejidos y en diferentes áreas del cuerpo. No todos los contenidos de la sangre pasan en el tejido, lo que significa que el fluido de los tejidos y la sangre no son los mismos. Los glóbulos rojos, plaquetas y las proteínas plasmáticas no pueden pasar a través de las paredes de los capilares. La mezcla resultante que pasa a través es, en esencia plasma de la sangre sin las proteínas del plasma. Fluido de los tejidos también contiene algunos tipos de células blancas de la sangre, que ayudan a combatir las infecciones.
La linfa se considera una parte del fluido intersticial. El sistema linfático devuelve proteína y el exceso de líquido intersticial a la circulación. La composición iónica del líquido intersticial y el plasma sanguíneo variar debido al efecto de Gibbs-Donnan. Esto provoca una ligera diferencia en la concentración de cationes y aniones entre los dos compartimientos de fluido.
Función fisiológica
El fluido intersticial baña las células de los tejidos. Esto proporciona un medio de entrega de los materiales a las células, la comunicación intercelular, así como la eliminación de desechos metabólicos.
Debido a que se requiere más detalle de lo que vamos a medir en esta tesis por tal motivo aquí se presenta una descripción breve de las sustancias que se quieren medir.
2.5.
Glucosa
La glucosa, es un monosacárido el cual es el carbohidrato central en la fisiología humana. El nombre viene de la palabra griega “glykys” (γλυκυ´ς ), que significa "dulce". Hay dos isómeros ópticos de la glucosa, glucosa D-y L- (Fig. 2), y ambas son ópticamente activas con la quiralidad opuesta. Sin embargo, sólo la glucosa D- está involucrada en el metabolismo humano. La imagen de espejo de la molécula, glucosa L-, está presente en los alimentos, pero no puede ser utilizado por las células [35]. En lo sucesivo, el término "glucosa" significará su iso-forma biológico activo (iso-forma D-). La glucosa es la forma de transporte de hidratos de carbono, y combustible importante para avivar la energía metabólica en todas las células humanas. La glucosa está participando en una gran cantidad de reacciones bioquímicas en el perfil metabólico modulando tanto en forma fisiológica y en la patología. La glucosa tiene papel crítico en la producción de proteínas y en el metabolismo lipídico. De acuerdo con el metabolismo de la glucosa teóricamente está involucrada en los procesos de envejecimiento. El nivel de glucosa en sangre es un parámetro de un alto valor predictivo en trastornos tales como diabetes mellitus, enfermedad coronaria y la hipertensión arterial.
Figura 2 Iso-forma D y L de la glucosa.
Las concentraciones de glucosa en el organismo humano
Concentración de glucosa en plasma es el resultado del equilibrio entre la glucosa que entra en la circulación y la eliminación de glucosa de la circulación.
El nivel de glucosa en sangre normal en humanos es de aproximadamente 4 mM ( 72 mg/dL)
El cuerpo, en funcionamiento normal, restaura el nivel de azúcar en la sangre a un intervalo de aproximadamente 4.55 a 6.11 mM (82 a 110 mg/dL)
Poco después de comer el nivel de glucosa en la sangre puede aumentar temporalmente hasta 7.77 mM (140 mg/dL) [36].
Capítulo 2: La piel
2.6.
Colesterol
Colesterol, del griego chole-(bilis) y stereos (sólido), seguido por la química sufijo-ol para un alcohol, es una sustancia química orgánica clasificado como un esteroide cerosa de grasa. Es un componente estructural esencial de las membranas celulares y se requiere para establecer la permeabilidad de la membrana y fluidez.
Además de su importancia dentro de las células, el colesterol también sirve como un precursor para la biosíntesis de las hormonas esteroides, ácidos biliares, y de vitamina D [37]. El colesterol es el principal esterol sintetizado por animales; en los vertebrados que se forma predominantemente en el hígado. Pequeñas cantidades se sintetizan en otros organismos celulares (eucariotas), tales como plantas y hongos. Es casi completamente ausente entre los procariotas (es decir, bacterias).
Aunque el colesterol es importante y necesario para la salud humana, los niveles altos de colesterol en la sangre se han asociado a los daños a las arterias y las enfermedades cardiovasculares.
El colesterol es necesario para construir y mantener las membranas, además modula la fluidez de la membrana en el rango de temperaturas fisiológicas. El grupo hidroxilo del colesterol interactúa con los grupos de cabeza polares de los fosfolípidos de la membrana y esfingolípidos, mientras que los esteroides voluminosos y la cadena de hidrocarburo se insertan en la membrana, junto con la no polar de ácidos grasos de cadena de los otros lípidos. A través de la interacción con los fosfolípidos las cadenas de ácidos grasos, hacen que el empaque del colesterol de la membrana aumente, lo que reduce la fluidez de la membrana. En este papel estructural, el colesterol reduce la permeabilidad de la membrana plasmática a los solutos neutros, los protones (iones de hidrógeno positivos) y los iones de sodio.
Dentro de la membrana celular, el colesterol también funciona en el transporte intracelular, la señalización celular y la conducción nerviosa.
El nivel en sangre de colesterol total debe ser: <200 mg/dL (<5.178 mM) de colesterol en sangre normal, 200-239 mg/dL límite alto (5.178-6.18 mM),> 240 mg/dL de colesterol alto [56] Sin embargo, como los métodos de prueba actuales determinan el colesterol LDL ("malo") y HDL ("colesterol bueno") por separado, esta visión simplista se ha convertido en algo obsoleto. El nivel de LDL deseable se considera que es menos de 100 mg/dL (2.6 mM) [58], aunque un límite superior más nuevo de 70 mg/dL (1.8 mM) puede ser considerada de mayor riesgo en individuos basado en algunos de los ensayos mencionados anteriormente. Es de destacar que los valores típicos de LDL para niños antes de estrías grasas comienzan a desarrollar es de 35 mg/dL.
2.7.
Triglicéridos
Un triglicérido (TG, triacilgliceroles, TAG, o triacilglicérido) es un éster derivado de glicerol y tres ácidos grasos [38]. Hay muchos triglicéridos, dependiendo de la fuente de aceite, algunos son altamente insaturado, otros menos.
Compuestos saturados que están "saturados" con hidrógeno - todas los huecos donde los átomos de hidrógeno se podrían unir a átomos de carbono están ocupadas. Compuestos insaturados que tienen dobles enlaces (C = C) entre átomos de carbono, reduciendo el número de lugares en los que átomos de hidrógeno pueden unirse a átomos de carbono. Compuestos saturados que tienen enlaces sencillos (CC) entre los átomos de carbono, y el otro enlace está unido a átomos de hidrógeno (por ejemplo, = CH-CH =,-CH2-CH2-, etc.)
Los triglicéridos son un mecanismo para almacenar calorías no utilizadas, y su alta concentración en sangre se correlaciona con el consumo de almidón y otros alimentos altos en carbohidratos. Los triglicéridos son un componente principal de los aceites de la piel humana. [39]
En el cuerpo humano, los niveles altos de triglicéridos en la sangre se han relacionado con la aterosclerosis y, por extensión, el riesgo de enfermedad cardíaca y accidente cerebrovascular. Sin embargo, el impacto relativo negativo del aumento del nivel de triglicéridos en comparación con el de LDL: HDL relaciones es aún desconocido. El riesgo puede ser parcialmente explicada por una fuerte relación inversa entre el nivel de triglicéridos y HDL-colesterol.
La American Heart Association ha establecido directrices para los niveles de triglicéridos:
Rango normal, de bajo riesgo <150 mg/dL (<1.70 mM)
Ligeramente arriba de lo normal 151-199 mg/dL( 1.70-2.25 mM) Cierto riesgo 200-499 mg/dL (2,26-5,65 mM)
Capítulo 2: La piel
Muy alto, alto riesgo > 500 mg/dL (> 5.65 mM)
Figura 4 Estructura molecular de los triglicéridos.
En este capítulo se describió las capas de la piel, se detallan las diferentes capas que conforman la piel y su función principal, luego se definieron los lípidos, fluidos intersticiales, glucosa, colesterol y triglicéridos.
Capitulo 3.
Espectroscopia Raman
3.1.
Introducción
La espectroscopia Raman es ampliamente utilizada en estudios biológicos. Esta técnica posee ciertas características que son sustentables en el estudio de la piel invitro e in vivo, además de proveer información detallada acerca de la composición y estructura molecular en la piel, también, debido a que las vibraciones moleculares son directamente influenciadas por el microambiente de los grupos funcionales, el espectro vibracional provee información de las interacciones moleculares. Por lo tanto, este tipo de información se puede obtener de manera completamente no invasiva tal que el espectro Raman puede ser tomado directamente de la piel [40]. En este capítulo se define la espectroscopia Raman y el efecto en el que se basa esta técnica. En la sección cuatro se describen los diferentes ruidos que se presentan al obtener el espectro Raman de interés.
La Espectroscopia Raman es una técnica fotónica de alta resolución que proporciona en pocos segundos información química y estructural de casi cualquier material ya sea compuesto orgánico o inorgánico permitiendo así su identificación. La espectroscopia Raman está basada en el fenómeno de esparcimiento inelástico [41]. Esta es una de las técnicas más usadas en química en la identificación de moléculas. En esta técnica se usa una fuente monocromática de radiación para producir esparcimiento elástico e inelástico en una muestra.
La radiación incidente interactúa con la materia y polariza (cambios de energía) los orbitales de las moléculas o átomos de la muestra, esta radiación crea un nuevo estado llamado estado virtual. Como este nivel de energía no es un estado estable, se re-emite un fotón rápidamente. En este proceso se presentan dos tipos de esparcimiento, esparcimiento elástico conocida como esparcimiento Rayleigh y esparcimiento inelástico conocido como esparcimiento Raman. El proceso más probable es el esparcimiento Rayleigh y no cambia la energía de la radiación re-emitida. Una pequeña parte de la radiación re-emitida a diferente energía es debido al esparcimiento inelástico, dicha radiación es conocida como esparcimiento Raman. En este caso, el proceso de esparcimiento induce movimiento molecular y, consecuentemente, se puede presentar un intercambio de energía de fotón a molécula o átomo y viceversa. El esparcimiento Raman es un proceso débil y solo 1 de 106 fotones incidentes son esparcidos de forma inelástica [41].
Capítulo 3: Espectroscopia Raman
3.2.
Descripción del efecto Raman
El fenómeno conocido como efecto Raman fue descrito por el físico Hindu Chandrasekhara Venkata Raman en el año 1928, lo que lo llevo a la obtención del premio Nobel de física en 1930. Este científico dio nombre al fenómeno inelástico de esparcimiento de la luz que permite el estudio de rotaciones y vibraciones moleculares. Sus estudios sobre este fenómeno se inspiraron en los trabajos realizados anteriormente por Rayleigh. A diferencia de Rayleigh que afirmaba que el color azul del mar no es más que el azul del cielo visto en reflexión, Raman realizó un experimento sencillo con el que pudo demostrar que el color azul del agua procedía de un fenómeno propio, posteriormente explicado como el esparcimiento de la luz debido a su interacción con las moléculas del agua. En 1923, mientras estudiaba el esparcimiento de la luz en el agua y en alcoholes purificados, uno de sus alumnos observó un cambio de color en un rayo de luz solar al ser filtrada y transmitida. El y su equipo no fueron capaces de eliminar este efecto y por tanto sospecharon que el fenómeno era una propiedad característica de la sustancia. Tras realizar diversos estudios durante los cinco años siguientes, Raman y su discípulo Krishnan, publicaron el famoso artículo en la revista Nature en 1928, en el que describieron este nuevo tipo de radiación secundaria [42]. En el cual describen su experimento de la siguiente forma: “El nuevo tipo de esparcimiento de la luz descubierta por nosotros, naturalmente, requiere iluminación muy potente para su observación. En nuestros experimentos, un haz de luz del sol es convergido sucesivamente por un objetivo de telescopio de 18 cm de apertura y 230 cm de longitud focal, y por una segunda lente de 5 cm de longitud focal. En el foco de la segunda lente se colocó el material de esparcimiento, que es o bien un líquido (cuidadosamente purificado por destilación repetida a vacío) o su vapor libre de polvo. Para detectar la presencia de la radiación modificada esparcida se usan filtros. Un filtro de color azul-violeta, cuando se combina con un filtro amarillo-verde y se coloca en la luz incidente, se extingue por completo el camino de la luz a través del líquido o vapor. La reaparición sucede cuando el filtro amarillo se transfiere a un lugar entre ella y el ojo del observador lo cual prueba la existencia de una radiación esparcida modificada”.
Figura 5 Se ilustra el experimento realizado por C.V Raman.
El análisis mediante espectroscopia Raman se basa en hacer incidir un haz de luz monocromática de frecuencia υ0 sobre una muestra cuyas características moleculares se desean determinar, y examinar la luz esparcida por dicha muestra. La mayor parte de la luz esparcida presenta la misma frecuencia que la luz incidente pero una fracción muy pequeña presenta un cambio en frecuencia, resultado de la interacción de la luz con la materia. La luz que mantiene la misma frecuencia υ0 que la luz incidente se conoce como esparcimiento Rayleigh y no aporta ninguna información sobre la composición de la muestra analizada. La luz esparcida que presenta frecuencias distintas a la de la radiación incidente, es la que proporciona información sobre la composición molecular de la muestra y es la que se conoce como esparcimiento Raman. Las nuevas frecuencias, +υr y –υr, son las frecuencias Raman, características de la naturaleza química y el estado físico de la muestra e independientes de la radiación incidente [43]. Las variaciones de frecuencia observadas en el fenómeno de esparcimiento Raman, son equivalentes a variaciones de energía. Los iones y átomos enlazados químicamente para formar moléculas y redes cristalinas, están sometidos a constantes movimientos vibracionales y rotacionales; estas oscilaciones se realizan a frecuencias bien determinadas en función de la masa de las partículas que intervienen y del comportamiento dinámico de los enlaces existentes. A cada uno de los movimientos vibracionales y rotacionales de la molécula le corresponderá un valor determinado de la energía molecular. Un diagrama energético en el que cada estado de energía se representa por una línea horizontal se muestra en la figura 2 y se conoce como el diagrama de Jablonski [44].
Capítulo 3: Espectroscopia Raman
Figura 6 Diagrama de Jablonski
De la figura 6 pueden distinguirse los siguientes casos [44]:
Las variaciones de frecuencia observadas en el fenómeno de esparcimiento Raman, son equivalentes a variaciones de energía. Los iones y átomos enlazados químicamente para formar moléculas y redes cristalinas, están sometidos a constantes movimientos vibracionales y rotacionales; estas oscilaciones se realizan a frecuencias bien determinadas en función de la masa de las partículas que intervienen y del comportamiento dinámico de los enlaces existentes. A cada uno de los movimientos vibracionales y rotacionales de la molécula le corresponderá un valor determinado de la energía molecular. Un diagrama energético en el que cada estado de energía se representa por una línea horizontal
si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón esparcido a la misma frecuencia que el fotón incidente, se dice que el choque es elástico ya que ni el fotón ni la molécula sufren variaciones en su estado energético; la molécula vuelve al mismo nivel de energía que tenía antes del choque y el fotón esparcido tiene la misma frecuencia υ0 que el incidente, dando lugar al esparcimiento Rayleigh;
si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón esparcido a una frecuencia distinta de la incidente, se dice que el choque es inelástico (existe transferencia de energía entre la molécula y el fotón); en este caso pueden darse dos fenómenos:
si el fotón esparcido tiene una frecuencia menor a la del incidente, se produce una transferencia de energía del fotón a la molécula que, después de saltar al estado de
energía no permitido, vuelve a uno permitido mayor al que tenía inicialmente; el fotón es esparcido con frecuencia υ0 -υr y se produce el esparcimiento Raman Stokes;
si el fotón esparcido tiene una frecuencia mayor a la del incidente, se produce una transferencia de energía de la molécula al fotón; esto significa que la molécula, inicialmente antes del choque no se encontraba en su estado vibracional fundamental sino en uno de mayor energía y después del choque pasa a este estado; el fotón es esparcido con frecuencia υ0 +υr y se produce el esparcimiento Raman anti-Stokes.
Cada material tendrá un conjunto de valores υr característicos de su estructura poliatómica y de la naturaleza de los enlaces químicos que la forman.
El espectro Raman está formado por una banda principal o Rayleigh y dos series de bandas secundarias correspondientes a las bandas Raman Stokes y anti-Stokes, situadas simétricamente a ambos lados de la banda Rayleigh esto se muestra en la figura 7.
Figura 7 Espectro Raman del sulfuro, mostrando los cambios Stokes y anti-stokes.
Es importante resaltar que el desplazamiento de las longitudes de onda Raman respecto a la longitud de onda incidente υ0 es independiente de esta última y por ello suele tomarse este desplazamiento como abscisa para representar los espectros Raman, situando el centro de la banda Rayleigh como origen del eje. De tal forma en el eje de abscisas en realidad aparecerá la diferencia entre la longitud de onda Raman y la de excitación del láser,
1 7
0 1
1 1
( ) *10 , (3.1)
( ) ( )
R cm
nm nm
donde ΔR es el desplazamiento Raman en cm-1, λ0 es la longitud de onda de excitación en nm, y λ1 es la longitud de onda del espectro Raman en nm.
Capítulo 3: Espectroscopia Raman
En ocasiones, debido a la naturaleza química del material que se analiza, unido al efecto Raman se produce un efecto de fluorescencia que puede llegar a enmascarar las bandas Raman; en estos casos, podría resultar de interés medir el espectro anti-Stokes ya que a estas frecuencias, aunque el efecto Raman es más débil, también lo es el efecto de la fluorescencia y pueden observarse bandas Raman en la parte anti-Stokes del espectro, que se encuentran enmascaradas en la parte Stokes [45].
3.3.
Ruidos en espectroscopia Raman
El "ruido" es la información indeseada debido a la electrónica del instrumento, la respuesta sin conexión lógica y eventos aleatorios. De tal manera que el ruido es tan solo un nombre que le adjudicamos a aquellas señales que no nos interesan.
Uno de los problemas inherentes a la adquisición de cualquier señal es el ruido presente en la medición. En el caso de la obtención de espectros Raman los ruidos más habituales pueden ser clasificados en cinco grupos diferentes: ruido de disparo, ruido generado por la muestra, ruido generado por la instrumentación, ruido computacional y ruido generado por fuentes externas [46].
3.3.1 Ruido de disparo (Shot noise)
Ruido de disparo es una fuente de ruido inevitable en la medición de espectros Raman. Es un tipo de ruido electrónico que tiene lugar cuando el número finito de partículas que transportan energía, tales como los electrones en un circuito electrónico o los fotones en un dispositivo óptico, es suficientemente pequeño para dar lugar a la aparición de fluctuaciones estadísticas apreciables en una medición [47].
El nivel de este ruido es mayor cuanto el valor promedio de la intensidad de corriente eléctrica o de la intensidad luminosa es más grande, según se trate de un dispositivo electrónico u óptico. Sin embargo, en tanto que el nivel de señal crece más rápidamente cuanto mayor es su nivel promedio, a menudo el ruido de disparo sólo supone un problema cuando se trabaja con intensidades de corriente o intensidades luminosas bajas.
El ruido de disparo en los dispositivos electrónicos consiste en fluctuaciones aleatorias de la corriente eléctrica a través de un conductor, causadas por el hecho de que la corriente se transporta en cargas discretas (electrones). Esto no sólo ocurre en las uniones p-n, sino en cualquier conductor, incluso en las situaciones en que la carga no esté bien localizada [48].
