Transporte de nanomateriales en medios complejos

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(1)TRANSPORTE DE NANOMATERIALES EN MEDIOS COMPLEJOS. LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENT DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA D.C 2013.

(2) TRANSPORTE DE NANOMATERIALES EN MEDIOS COMPLEJOS. LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO Trabajo de grado para optar al título de Master en Ingeniería Química. Director PhD WATSON LAWRENCE VARGAS Ingeniero Químico. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA D.C 2013.

(3) A mis padres Bertulfo y Graciela por el apoyo y la confianza depositada, A mi hermano Julián por guiarme y aconsejarme, A mi tía Esperanza por siempre estar ahí en los momentos que más la necesite, A ti amor por tu compañía y apoyo incondicional, y a mis amigos por ofrecerme una amistad sincera. Gracias Totales. iii.

(4) RESUMEN. Los potenciales beneficios de la nanotecnología son inmensos, como también lo son sus peligros. Los nanomateriales se desarrollan por sus propiedades radicalmente nuevas que conllevan resultados completamente novedosos y algunas veces impensados. Mientras existe un amplio consenso de que la nanotecnología alberga una promesa en cuanto a su aplicación en materiales, medicina y energía, también hay grandes dudas sobre las implicaciones biológicas, medioambientales y de seguridad. Se han determinado algunos vacíos de conocimiento que deben de abordarse como determinar la cinética y mecanismo de transporte de las nanopartículas en el cuerpo humano y caracterización, así como la estandarización de los procesos de síntesis de las nanopartículas y protocolos de las pruebas de transporte. El objetivo principal de este trabajo consiste en exponer lo avances realizados en cuanto al diseño de equipos para difusión de nanomateriales en medios biológicos, diseño de cámaras de decelularización de órganos y tejidos, así como también protocolos para el estudio del transporte de nanomateriales en medios biológicos. En este trabajo se presentan pruebas de difusión de nanopartículas de SiO2 en piel normal y decelularizada, donde se observa una mayor difusión en tejidos decelularizados que en tejidos sin decelularizar. Para determinar la presencia de las nanopartículas en el tejido, se sintetizaron exitosamente nanopartículas de SiO2 con tamaños de 45nm y378 nm marcadas con un fluorocromo, para su detección por microscopía confocal. Se presenta la penetración en piel de cerdo de nanopartículas de SiO 2 funcionalizadas con fluoresceína sódica con diámetro de 45nm. Se determina que aproximadamente una concentración de 0,68 ppm de nanopartículas de 45nm de SiO 2 atravesó piel normal a las 48h, mientras que a las 6h se determina una concentración de 5,97 ppm de nanopartículas de SiO2 en piel de cerdo decelularizada. De igual forma se presenta penetración de NPs de SiO2 de 378 nm en piel de cerdo normal pero en el transcurso de 200 h no se determinó presencia de nanopartículas en el recipiente receptor. En cuanto a las pruebas de penetración de NPs realizadas en membrana de agar con los dos tamaños (45nm y 378nm) las nanopartículas de menor tamaño atraviesan la membrana más rápido que las nanopartículas grandes, ya que se encuentra una. iv.

(5) concentración apreciable de 6,43 ppm en el recipiente receptor a las 3 horas, mientras que con las nanopartículas de mayor tamaño se determina una concentración de 0,62 ppm hasta las 8 horas.. v.

(6) OBJETIVOS General. Estudiar el fenómeno de transporte de nano-partículas en medios complejos. prototipo. y. tejidos. decelularizados. mediante. ensayos. experimentales in vitro.. Específicos. Síntesis y caracterización de nanopartículas modificadas con marcadores fluorescentes. Implementación y estandarización del protocolo para decelularización de tejidos. Realizar pruebas in vitro para observar el transporte de las nanopartículas en tejidos artificiales prototipo. Realizar pruebas in vitro para observar el transporte de las nanopartículas en tejidos biológicos decelularizados. Realizar pruebas in vitro para observar el transporte de las nanopartículas en tejidos biológicos.. vi.

(7) AGRADECIMIENTOS. Mis más completos agradecimientos a mi asesor de tesis PhD Watson L. Vargas, al grupo de microelectrónica de la Universidad de los Andes CMUA que facilitó las instalaciones de Sala limpia y capacitación para el manejo de los equipos, al profesor PhD Federico Brown y a su grupo de investigación EVODEVO en Ciencias Biológicas por la facilitación de sus equipos y laboratorio para los análisis de histología.. vii.

(8) CONTENIDO 1.. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1. 2.. FUNDAMENTOS TEÓRICOS .......................................................................... 3 1.1. NANOMATERIALES .................................................................................. 4 1.1.1. Nanopartículas..................................................................................... 4 1.1.2. Nanotubos de Carbono. ....................................................................... 4 1.1.3. Fullerenos. ........................................................................................... 5 1.2. NANOMEDICINA ....................................................................................... 6 1.3. RIESGOS POTENCIALES DE LOS NANOMATERIALES ......................... 6 1.4. MECANISMOS DE TRANSPORTE DE NANOMATERIALES ................... 7 1.5. EFECTO DE LAS NANOPARTÍCULAS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO 9 1.6. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR CONTACTO DERMICO .... 11 1.7. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR INGESTION: ..................... 15 1.8. MODELOS UTILIZADOS EN EL TRANSPORTE DE NANOPARTÍCULAS: 18 1.8.1. Distribución de agentes anti cancerígenos. ....................................... 18 1.8.2. Modelamiento de la distribución de nanopartículas en esferas tumorales multicelulares................................................................................. 19 1.8.3. Transporte de nanopartículas de oro en piel e intestinos de ratas. ... 21. 3.. TEORIA,. DISEÑO,. METODOLOGÍA. Y. PROTOCOLOS. DE. EXPERIMENTACION ............................................................................................ 29 3.1. TEORIA DE EXPERIMENTACION .......................................................... 29 3.1.1.. Decelularización .................................................................................... 29. 3.1.1.1. 3.1.1.1.1.. Métodos de Decelularización ............................................................. 29 Métodos Físicos: ............................................................................ 30 viii.

(9) 3.1.1.1.2.. Métodos Enzimáticos ..................................................................... 31. 3.1.1.1.3.. Métodos Químicos ......................................................................... 32. 3.1.1.2. 3.1.2.. Antibióticos para preservación de la matriz extracelular .................... 33 Tipo de estudios toxicológicos .............................................................. 33. 3.1.2.1.. In vivo: ............................................................................................... 33. 3.1.2.2.. In vitro: ............................................................................................... 35. 3.1.2.3.. Celda de difusión de Franz ................................................................ 36. 3.2. DISEÑO DE EQUIPOS ............................................................................ 37 3.2.1.. Diseño de Celda de Difusión................................................................. 37. 3.2.2.. Diseño de Mini-Celdas de Difusión. ...................................................... 39. 3.2.3.. Diseño de Sistema para decelularización de tejidos ............................. 40. 3.3. PROTOCOLOS DE EXPERIMENTACIÓN .............................................. 42 3.3.1.. Protocolo para pruebas en Celda de Difusión de Franz ....................... 42. 3.3.2.. Protocolo para decelularización de órganos ......................................... 43. 3.3.3.. Protocolo para decelularización de piel................................................. 44. 3.3.4.. Protocolo para histología de los tejidos ................................................ 46. 3.3.5.. Protocolo para fabricación de láminas de histología ............................. 49. 3.3.6.. Protocolo elaboración de membranas en agar ..................................... 50. 3.4. SÍNTESIS. DE. NANOPARTÍCULAS. CON. MARCADORES. FLUORESCENTES. .......................................................................................... 50 3.5. CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTICULAS ....................................... 51 3.6. ELABORACION DE CURVA DE CALIBRACION PARA DETERMINACION DE CONCENTRACION DE NANOPARTÍCULAS ............................................. 52 3.7. FABRICACIÓN DE SISTEMA MICROFLUÍDICO QUE MIMETIZA LA INTERFACE ALVEOLO-CAPILAR. ................................................................... 53 3.7.1.. Diseño de las máscaras. ....................................................................... 54 ix.

(10) 4.. 3.7.2.. Fabricación de los moldes. ................................................................... 55. 3.7.3.. Soft Lithography .................................................................................... 56. 3.7.4.. Fabricación de la Membrana Porosa. ................................................... 57. RESULTADOS ............................................................................................... 58 4.1. DECELULARIZACIÓN DE CORAZÓN. ................................................... 58 4.2. DECELULARIZACIÓN DE PIEL .............................................................. 63 4.3. SINTESIS DE NANOPARTICULAS ......................................................... 65 4.4. PENETRACION DE NANOPARTICULAS EN TEJIDOS .......................... 70 4.4.1.. Curva de calibración de nanopartículas ................................................ 70. 4.4.2.. Penetración de Nanopartículas en medio prototipo (Agar). .................. 72. 4.4.3.. Penetración de Nanopartículas en piel de cerdo. ................................. 75. 4.4.4.. Penetración de nanopartículas en piel de cerdo decelularizada y piel. normal 75 4.5. FABRICACIÓNSISTEMA. MICROFLUIDICO. QUE. SIMULA. LA. INTERFACE ALVEOLO-CAPILAR .................................................................... 79. 5.. 4.5.1.. Caracterización Óptica .......................................................................... 79. 4.5.2.. Caracterización Morfológica por perfilometría. ...................................... 80. CONCLUSIONES .......................................................................................... 84. PERSPECTIVAS ................................................................................................... 86 REFERENCIAS ..................................................................................................... 87. x.

(11) LISTA DE TABLAS. Tabla 1. Agentes activos de protección solar que se encuentran en tres diferentes productos comerciales de protección solar. .......................................................... 11 Tabla 2. Nanoalimentos registrados en U.S.A....................................................... 16 Tabla 3. Soluciones de NPs para calibración. ....................................................... 53 Tabla 4. Composición porcentual de las nanopartículas. ...................................... 68. xi.

(12) LISTA DE FIGURAS. Figura 1 Áreas de aplicación de la nanotecnología.. ............................................... 3 Figura 2. Estructura del Nanotubo de carbono. ....................................................... 4 Figura 3. . Estructura del Fullereno. ........................................................................ 5 Figura 4. Proceso ADME de las nanopartículas en el cuerpo. ................................ 8 Figura 5. Deposición de Partículas inhaladas en diferentes partes del sistema respiratorio. ............................................................................................................. 9 Figura 6. Deposición de partículas en diferentes regiones del sistema respiratorio. .............................................................................................................................. 10 Figura 7. Representación esquemática de la toxicidad inducida por nanopartículas de ZnO.. ................................................................................................................ 12 Figura 8. Posibles mecanismos de toxicidad inducidos por nanopartículas de Plata . ............................................................................................................................. 15 Figura 9. Nanomateriales usados en productos de consumo................................ 18 Figura 10. Proceso de decelularización de un hígado de rata. ............................. 29 Figura 11. Métodos de Decelularización de Órganos y Tejidos. ........................... 30 Figura 12. Imágenes de un ensayo en vivo en una rata. ....................................... 34 Figura 13. Celda de Difusión de Franz Estática .................................................... 36 Figura 14. Celda de Difusión de Franz de Flujo. .................................................. 37 Figura 15. Celda de difusión de Franz diseñada ................................................... 38 Figura 16. Celda de difusión fabricada. ................................................................. 39 Figura 17. Mini-celda de difusión........................................................................... 39 Figura 18. Componentes de sistema de decelularización. .................................... 40 Figura 19. Sistema de decelularización utilizado................................................... 41 Figura 20. Cámara de decelularización. ................................................................ 41 Figura 21. Montaje Celda de Difusión. .................................................................. 43 Figura 22. Separación de la dermis. ..................................................................... 45 Figura 23. Decelularización de Piel en el Shaker. ................................................. 45 Figura 24. Deshidrataciones sucesivas en Etanol. ................................................ 46 Figura 25. Impregnación del tejido en Xileno. ....................................................... 46 xii.

(13) Figura 26. Tejidos embebidos en parafina ............................................................ 47 Figura 27. Microtomo Leica ................................................................................... 47 Figura 28. Estante para portaobjetos. ................................................................... 49 Figura 29. Baño de portaobjetos en solución adhesiva. ........................................ 49 Figura 30. Membrana en agar. .............................................................................. 50 Figura 31. Montaje para síntesis de nanopartículas de SiO2................................. 51 Figura 32. Sistema microfluídico diseñado. ........................................................... 54 Figura 33. Máscaras sistema microfluídico. .......................................................... 54 Figura 34. Láminas después de ataque con FeCl3 ................................................ 56 Figura 35. Laminillas después del ataque con HF ................................................. 56 Figura 36. Fabricación de membrana porosa suspendida. ................................... 57 Figura 37. Decelularización de corazón de Gallina. .............................................. 58 Figura 38. Corazón de gallina decelularizado. ...................................................... 59 Figura 39. Lote de 6 corazones decelularizados. .................................................. 59 Figura 40. Corte Longitudinal de un corazón nativo 10X. ...................................... 60 Figura 41. Corte Longitudinal de un corazón nativo 40X. ...................................... 61 Figura 42. H&E Corte transversal de corazón nativo 10X. .................................... 61 Figura 43. Corte transversal de corazón nativo 40X. ............................................ 62 Figura 44. H&E Corte longitudinal de corazón decelularizado 40X. ..................... 62 Figura 45. H&E Corte transversal de corazón decelularizado. 40X....................... 63 Figura 46. Proceso de decelularización ................................................................ 63 Figura 47. Piel de cerdo nativa 10X. ..................................................................... 64 Figura 48. Piel de cerdo nativa 40X. ..................................................................... 64 Figura 49. Piel de cerdo decelularizada 40X. ........................................................ 65 Figura 50. Imágenes SEM de nanopartículas sintetizadas, diámetro aprox 45,3 nm. .............................................................................................................................. 65 Figura 51. Imágenes SEM de nanopartículas sintetizadas, diámetro aprox 378 nm .............................................................................................................................. 66 Figura 52. EDX que registra presencia de Silicio y Oxígeno en las nanopartículas sintetizadas. .......................................................................................................... 67 Figura 53. Emisión de Fluorescencia de las nanopartículas expuestas a luz UV.. 68 xiii.

(14) Figura 54. Aglomeraciones de NP´s acumuladas en la membrana de agar. ........ 73 Figura 55. Imagen de microscopia confocal donde se evidencia acumulación de NP´s en células epiteliales. ................................................................................... 76 Figura 56. Imagen de microscopía confocal después de exposición a NP´s . ...... 77 Figura 57. Imagen de microscopia confocal de piel decelularizada. ..................... 77 Figura 58. Imágenes de penetración de NP´s de 378 nm. .................................... 78 Figura 59. Imágenes de Microscopía Óptica de los moldes en vidrio para el sistema microfluídico. ............................................................................................ 79 Figura 60. Imágenes de Microscopía Óptica de los canales en PDMS del sistema microfluídico. ......................................................................................................... 80 Figura 61.Láminas a) superior y b) inferior. ........................................................... 80 Figura 62. Membrana porosa fabricada. ............................................................... 82 Figura 63. Imagen de microscopia óptica de la membrana fabricada. .................. 82 Figura 64. Ensamble sistema microfluidico. .......................................................... 83. xiv.

(15) LISTA DE GRAFICAS. Gráfica 1. Histograma distribución de tamaño de nanopartículas con diámetro promedio de 45,3 nm. ........................................................................................... 66 Gráfica 2. Histograma distribución de tamaño de nanopartículas con diámetro promedio de 378 nm. ............................................................................................ 67 Gráfica 3. Espectros de absorción de las nanopartículas. .................................... 69 Gráfica 4. Distribución de tamaño de la solución de NPs (43,5nm). ..................... 69 Gráfica 5. Distribución de tamaño de la solución de NPs (378 nm) ...................... 70 Gráfica 6. Espectros de absorción a diferentes concentraciones de NPs ............. 71 Gráfica 7. Curva calibración NPs 43nm ................................................................ 71 Gráfica 8. Curva Calibración NPs 378 nm. ............................................................ 72 Gráfica 9. Perfil de concentración de NP de SiO2 (43,5nm) en la solución receptora a lo largo del tiempo. ............................................................................................. 73 Gráfica 10. Perfil de concentración de NP de SiO2 (378 nm) en la solución receptora a lo largo del tiempo. ............................................................................. 74 Gráfica 11. Perfil de concentración de NPs de 45 nm (azul) y 378nm (rojo). ........ 74 Gráfica 12. Perfil de concentración de NP de SiO2 (43,5 nm) en la solución receptora a lo largo del tiempo. ............................................................................. 75 Gráfica 13. Perfil de concentración de NPs de 45,3nm en piel decelularizada y normal. .................................................................................................................. 76 Gráfica 14. Perfil Canal Superior. .......................................................................... 81 Gráfica 15. Perfil Canal Inferior. ............................................................................ 81 Gráfica 16. Perfil membrana porosa. ..................................................................... 82. xv.

(16) 1. INTRODUCCIÓN. La nanotecnología, es un campo relativamente nuevo de investigación y elaboración de materiales industriales con base en la creación de nuevas clases de estructuras moleculares originales, muestra rápidos avances que prometen cambiar radicalmente o afectar muchas áreas de la ciencia y la tecnología. Además, ofrece innumerables posibilidades para el progreso humano, mediante la creación de varios tipos de nanomateriales aplicables en revolucionarios tratamientos médicos [1-4], en la investigación agrícola [5] y métodos de diagnóstico de inocuidad alimentaria [5-8], en procedimientos de restauración ambiental [9, 10], aplicaciones energéticas como el revestimiento de células solares [11, 12], incluso en productos cotidianos de gran volumen como los cosméticos [13, 14], tejidos repelentes de la suciedad [15] y pintura auto-lavable [15]. No obstante, es esencial y urgente evaluar no sólo los beneficios, sino también los posibles riesgos que plantean las nanopartículas y acordar medidas efectivas mediante criterios reguladores adecuados. Debido a esto muchos investigadores [6, 13, 16-32] han analizado la citotoxicidad de micro y nanopartículas en los sistemas biológicos, observando grandes daños en la mayoría de los órganos del cuerpo humano, esto debido a su facilidad para transportarse hacia el cuerpo mediante cuatro diferentes mecanismos (inhalación, ingestión,. contacto. dérmico. y. exposición. iatrogénica. por. inyección. de. nanomateriales), a su reactividad , tamaño y propiedades novedosas diferentes a las de sus macromoléculas, a su facilidad de translación a todo el cuerpo humano mediante el sistema circulatorio y linfático[33-37]. Algunos estudios realizados [16-26, 36, 38-42] respecto al efecto de las nanopartículas en el cuerpo mostraron efectos como estrés oxidativo, generación de especies reactivas de oxígeno, aumento de la concentración de Ca+ en la célula, peroxidación lipídica, daño de la función mitocondrial, daño en la membrana celular y daño en el ADN generando finalmente muerte celular. Todos estos estudios se han realizado experimentalmente mediantes ensayos in vitro e in vivo. 1.

(17) El Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks (SCENIHR) con el fin de evaluar los riesgos potenciales de los nanomateriales para la salud humana identificó algunos vacíos de conocimiento que deben de abordarse, algunas de sus recomendaciones son: determinar la cinética y mecanismo. de. transporte. de. las. nanopartículas. y. su. caracterización,. estandarización de los procesos de síntesis de las nanopartículas analizadas y evaluación de la medida en que se pueden extrapolar los datos de toxicología de estudios in vitro a estudios in vivo[34]. En este trabajo se presentan diseños de sistemas, equipos y protocolos necesarios para realizar estudios del transporte de nanomateriales en medios biológicos, esto incluye diseño de celda de difusión para efectuar pruebas de penetración dérmica de nanomateriales, así como el protocolo para la realización de pruebas en esta, diseño de un sistema de decelularización de órganos y su protocolo; este sistema se utilizara para realizar el transporte de nanomateriales en órganos decelularizados mediante perfusión, también se presenta el diseño de un sistema microfluídico que simula la interface alveolo-capilar para realizar transporte de nanopartículas tanto por vía respiratoria tanto como por vía circulatoria. Este último dispositivo se diseña con el ánimo de realizar pruebas en un dispositivo que pueda simular condiciones de ensayos in vivo sin realizar experimentaciones en animales.. 2.

(18) 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS La nanotecnología se considera como una nueva tecnología que involucra la manipulación. de. materiales. a. nivel. molecular. o. de. una. escala. de. aproximadamente 1 a 100 nanómetros[33, 34, 43] (milésimas de millón de metro), para crear nuevas estructuras moleculares conocidas como nanomateriales, las cuales poseen características únicas y nuevas diferentes a las de los materiales originales de las que se derivan[35].. La nanotecnología ofrece inconmensurables. posibilidades para el desarrollo. humano mediante la creación de gran variedad de nanomateriales aplicables en revolucionarios tratamientos médicos[1-4, 44], aplicaciones energéticas en la elaboración de celdas solares[11, 12, 45], productos cosméticos[13, 14, 26], alimenticios[5, 7],electrónicos[15, 35], industria agrícola[5, 44], de comunicaciones y en purificación de agua[9, 10], etc. En la Figura 1 podemos observar algunas de las áreas de aplicación de los nanomateriales.. Figura 1Áreas de aplicación de la nanotecnología. Fuente: Nanoposts (2007). Government Policy and Innitiatives in Nanotechnology Worldwide 2007. Canadá.. 3.

(19) Debido al amplio rango de aplicaciones, es de gran importancia evaluar no solo los beneficios, sino también los riesgos potenciales que pueden presentar los nanomateriales. 1.1. NANOMATERIALES 1.1.1. Nanopartículas. Una nanopartícula se considera como una partícula que cuenta con una o más de sus dimensiones en el rango de 100 nm o menos y un rango de átomos entre 10 2 y 108[46, 47]. 1.1.2. Nanotubos de Carbono. Los nanotubos de carbono son láminas de grafito enrolladas en forma de cilindro, cerrados en sus extremos con anillos pentagonales, los nanotubos de carbono poseen diámetros de aproximadamente 1 a 2 nm y longitud que puede oscilar hasta centímetros, lo que los hace efectivamente una estructura unidimensional llamados nanocables [48-51]. Los nanotubos se consideran también una forma alotrópica del carbono, donde sus carbonos se encuentran unidos de forma covalente.. Figura 2. Estructura del Nanotubo de carbono. Fuente: Handbook of Nanoscience, Engineering, and Technology.. 4.

(20) 1.1.3. Fullerenos. Los fullerenos son nanoestructuras compuestas por carbono que presentan organización estructural esférica, con un diámetro de 1 a 2 nm [51]. El fullereno más conocido es el buckminsterfulereno, el cual está compuesto por 60 átomos de carbono con una conformación esférica similar a la de un balón de fútbol, constituido por 20 hexágonos y 12 pentágonos[52]. En cada intersección del fullereno se encuentra un átomo de carbono, estos átomos se encuentran interconectados formando una molécula cíclica unida por débiles fuerzas de Vander Waals.. Figura 3. . Estructura del Fullereno. Fuente: Shatkin, Jo. Nanotechnology: Health and Environmental Risks.. Las nanopartículas muestran gran diversidad estructural, cada estructura exhiben sus propias características individuales, tales como tubos, puntos, hilos, fibras y cápsulas[1, 53, 54]. Todos estos materiales a nanoescala tienen propiedades físicas, químicas, ópticas, eléctricas, catalíticas y mecánicas sustancialmente diferentes a las de sus contrapartes correspondientes de tamaño macro [16]. En consecuencia, es razonable suponer que estas desviaciones en las propiedades también pueden conducir a un comportamiento diferente en el cuerpo. Además, no sólo la dosis expresada como masa, sino también el tamaño de partícula, número de partículas, superficie y otras características (como la carga, forma, etc.) determinan las interacciones biológicas de estas nanopartículas. De hecho, varios estudios sugieren que estas nanopartículas tienen perfil de toxicidad diferente en comparación con las partículas más grandes [17, 38].. 5.

(21) 1.2. NANOMEDICINA La nanomedicina consiste en la aplicación de la nanotecnología para el diagnóstico, prevención y tratamiento de afecciones de la salud. Gran parte de los desarrollos en nanomedicina se encuentran enfocados a enfermedades de mayor intensidad en países desarrollados, como son enfermedades cardiovasculares, el cáncer y el VIH.. 1.3. RIESGOS POTENCIALES DE LOS NANOMATERIALES. Los potenciales beneficios de la nanotecnología son inmensos, como también lo son sus peligros. Los nanomateriales se desarrollan por sus propiedades radicalmente nuevas que conllevan resultados completamente novedosos y algunas veces impensados. Mientras existe un amplio consenso de que la nanotecnología alberga una promesa en cuanto a su aplicación en materiales, medicina y energía, también hay grandes dudas sobre las implicancias biológicas, medioambientales y de seguridad.. Las preocupaciones por los efectos nocivos de las nanopartículas y los nanomateriales se deben principalmente a[33]:. El transporte de nanomateriales al medio ambiente se facilita, debido a su gran área superficial, estructura cristalina, y reactividad. Al ingresar en los sistemas de los seres vivos, las nanopartículas son difíciles de controlar y pueden causar daños al interferir en sus procesos biológicos. Las partículas ultrafinas presentan un comportamiento biológico y movilidad diferente a las macromoléculas, a primera vista se puede apreciar que es más probable que las nanopartículas sean absorbidas y llevados hacia el interior de las células más fácilmente que partículas más grandes, esto debido a su pequeño tamaño.. 6.

(22) Debido al tamaño casi invisible de las nanopartículas, estas pueden ser distribuidas accidentalmente a los seres vivos a través del aire, el suelo y el agua, causando daños en un principio a plantas y animales, mientras que con el transcurso del tiempo se convierten en un peligro para los seres humanos. También debido al amplio uso de los nanomateriales en productos comerciales es más difícil contener y controlar a las nanopartículas de su propagación en el medio.. 1.4. MECANISMOS DE TRANSPORTE DE NANOMATERIALES. Para entender los efectos tóxicos potenciales que pueden presentar los nanomateriales es de gran importancia conocer las diferentes rutas de exposición mediante las cuales estos pueden ingresar a los seres vivos. Los nanomateriales pueden ingresar por cuatro diferentes mecanismos como son: inhalación a través del tracto respiratorio, ingestión a través del tracto digestivo, por la piel a través del contacto dérmico y exposición iatrogénica por inyección de nanomateriales en la corriente sanguínea[33-37].. Una vez en el cuerpo los nanomateriales se pueden redistribuir a organismos y tejidos a través de la circulación sanguínea o por la migración de células. Este desplazamiento se debe a la posibilidad que tiene las nanopartículas de incorporarse en las células, cruzar sus membranas celulares y a moverse dentro de éstas. En algunos estudios [18] se ha observado el traspaso de los nanomateriales a través de la barrera hemato-encefálica, lo cual puede abrir grandes posibilidades terapéuticas, pero al mismo tiempo implica mayores preocupaciones debido a que se puede presentar con mayor facilidad el traspaso de sustancias tóxicas de la sangre directamente a los tejidos del cerebro. Así mismo también se ha determinado que nanopartículas ultrafinas pueden ingresar al cerebro por medio del Nervus Olfactorius[19] después de la deposición en la mucosa olfativa de la nariz, seguido de inhalación.. 7.

(23) Figura 4. Proceso ADME de las nanopartículas en el cuerpo. Las líneas de color negro representan rutas confirmadas de las nanopartículas, las líneas discontinuas representan las rutas hipotéticas.Fuente: Werner I. Hagens, et al. What do we (need to) know about the kinetic properties of nanoparticles in the body?. En la Figura. 4, se observa de forma esquemática el ciclo de vida potencial de las nanopartículas en el cuerpo humano. Esta figura muestra una visión general de los procesos ADME (adsorción, distribución, metabolismo y excreción) en el cuerpo. En este esquema se puede observar que las nanopartículas pueden ser distribuidas a un mismo órgano por varias rutas de exposición. Por ejemplo, las nanopartículas que se encuentran en el tracto gastrointestinal pudieron ingresar mediante productos ingeridos, pero por otro lado, también pueden llegar al tracto gastrointestinal a través de una ruta indirecta, como el ingreso de las nanopartículas a través las vías respiratorias o la piel, donde posteriormente estas son absorbidas por el sistema circulatorio. A partir de ahí, las partículas pueden ser distribuidas en el hígado, tomada por los hepatocitos y excretadas en la bilis hacia al tracto gastrointestinal. Los órganos principales de exposición a nanomateriales se pueden describir como[37]: Órganos de recepción: piel, tracto gastro-intestinal y el tracto respiratorio. Órganos secundarios: Sistema nerviosos central, sistema cardiovascular, sistema inmune, hígado, riñones, placenta. 8.

(24) 1.5. EFECTO DE LAS NANOPARTÍCULAS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO. La presencia de nanopartículas en los pulmones puede llegar a causar neumoconiosis (inflamación pulmonar) que es una enfermedad pulmonar causada por la exposición a partículas de polvo con dimensiones nanométricas de diámetro, un tipo de neumoconiosis causada por la exposición e inhalación de nanopartículas de SiO2 es la silicosis, la cual es caracterizada por una fibrosis progresiva de los pulmones. En algunos estudios realizados se observó que las nanopartículas podían atravesar las paredes alveolares ingresando de estar forma en la corriente sanguínea y ser transportada a los demás órganos del cuerpo. También se observan daños en los vasos sanguíneos y producción de coágulos de sangre [20, 21]. Otros nanomateriales como los nanotubos de carbono pueden generar cáncer de pulmón o mesioteloma similar a la producida por los asbestos. En pruebas realizadas a ratas y ratones sometidas a nanotubos de carbono de una sola pared se presentaron granulomas. epiteloidales e inflamaciones. intersticiales [39, 40]. Uno de los mecanismos de mayor importancia de ingreso de las nanopartículas al cuerpo humano es mediante los pulmones, donde la deposición de partículas inhaladas es determinada por procesos de difusión, la deposición de las nanopartículas se puede presentar en tres diferentes zonas: zona naso-faríngea, la zona traqueo-bronquial y la zona alveolar.. Figura 5. Deposición de Partículas inhaladas en diferentes partes del sistema respiratorio. Fuente: Nanoparticle Tecnology Handbook.. 9.

(25) En la Figura 5 se observa que cerca del 90% de partículas inhalas de dimensión de 1 nm se depositan en la zona naso-faríngea , un 10% en la zona traqueo bronquial y ninguna en la zona alveolar; mientras que, partículas de dimensiones entre 5-10 nm se depositan en las tres zonas con porcentajes entre 20 y 30%, partículas con dimensiones de 20 nm se depositan un 50% en la región alveolar y un 10 a 20% en la regiones naso-faríngeas y traqueo-bronquial respectivamente. Como se pudo observar en la gráfica dependiendo del tamaño de la partícula la deposición toma lugar en diferentes partes del tracto respiratorio, Schmid [37] nos presenta la distribución de las nanopartículas en el sistema respiratorio, esta se puede observar en la Figura 6.. Figura 6. Deposición de partículas en diferentes regiones del sistema respiratorio. Fuente: G. Schmid. Nanotechnology: Assessment and Perspectives.. En el 2004, Lam et al [22] reporto que una suspensión de nanotubos de carbono causa lesiones inusuales en pulmones de ratones interfiriendo con la absorción de oxígeno, este hallazgo fue confirmado por Warheit [40] en el mismo año quien descubrió que las células inmunes se acumulan alrededor de los nanotubos, generando el bloqueo los bronquios en los pulmones de los roedores y haciendo que se sofoquen. Posteriormente Oberdörster [19] encontró que las nanopartículas se acumulan en las fosas nasales, pulmones y cerebro de las ratas. También. 10.

(26) documento el fenómeno de stress oxidativo que se presentó en el cerebro de un pez expuesto a nanopartículas por 48 horas [23]. 1.6. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR CONTACTO DERMICO. En la actualidad, más de 20 países en todo el mundo fabrican y comercializan diferentes variedades de productos de consumo basados en nanotecnología de cosméticos, los cuales forman una las categorías más grandes. Debido al tamaño extremadamente pequeño de las nanopartículas (generalmente inferior a 50nm) que se utilizan existe la preocupación de que estas puedan interactuar directamente con macromoléculas como el ADN.. Nanopartículas como ZnO y TiO2 son utilizadas ampliamente en bloqueadores solares (Ver Tabla 1 [35]) y cosméticos como sombras, polvos y labiales. Tabla 1. Agentes activos de protección solar que se encuentran en tres diferentes productos comerciales de protección solar. Bloqueador Solar 1. Bloqueador Solar 2. Bloqueador Solar 3. 4-Mebenzylidinecamphor, 6%. 4-Mebenzylidinecamphor, 6%. Octylmethoxycinnamate (OMC), 7.5%. Parsol 1789, 2%. Parsol 1789, 2%. Oxybenzone, 5%. Mexoryl SX, 1%. Mexoryl SX, 2%. 2-PBSA, 2.3%. Titanium dioxide, 3.2%. Titanium dioxide, 5%. Titanium dioxide, 4.5%. Pure melanin Vegetable Extracts Fuente: Serpone et al. Inorganic and organic UV filters: Their role and efficacy insunscreens and suncare products.. Las nanopartículas utilizadas para bloqueadores solares se han revestido con otros materiales como siliconas, ácidos grasos o circonio para facilitar la dispersión de las nanopartículas y evitar su aglomeración. La presencia de estas capas, hace que las células y los tejidos estén expuestos principalmente a las moléculas orgánicas del exterior en lugar de los núcleos de ZnO y TiO 2. La presencia y la naturaleza de los revestimientos (que no son fácilmente identificables en las formulaciones de los productos comerciales debido a la necesidad de mantener los secretos comerciales) pueden afectar la manera en 11.

(27) que las nanopartículas reaccionan con la piel. Las preguntas han surgido recientemente si el pequeño tamaño de ZnO o nanopartículas de TiO 2 utilizados en cremas solares les permitirá penetrar accidentalmente en la piel generando daños a las células y finalmente al ADN.. Sin embargo, el trabajo realizado por Sharma et al[24], en el cual células epidérmicas humanas A431 se sometieron a nanopartículas de ZnO, se determinó que nanopartículas de ZnO incluso a bajas concentraciones poseen un potencial genotóxico en las células epidérmicas, el cual pude ser medido a través de la peroxidación lipídica y el stress oxidativo (Figura 7).. Debido al fenómeno de stress oxidativo generado por las nanopartículas que alteran el entorno reductor presente en la célula, se genera el desbalance de su estado normal redox causando efectos tóxicos por la producción de peróxidos y radicales libres, que dañan a todos los componentes de la célula, incluyendo proteínas, lípidos y el ADN.. Figura 7. Representación esquemática de la toxicidad inducida por nanopartículas de ZnO. Fuente: Sharma et al. DNA damaging potential of zinc oxide nanoparticles in human epidermal cells.. 12.

(28) Otros trabajos realizados de gran importancia es el de Dunford et al [25] donde demostró que cuando una plásmido de ADN fue expuesto a estimulación por luz solar, los rayos UVA y UVB en presencia de nanopartículas de TiO 2, se presenta la generación de radicales hidroxilo acelerando así la ruptura de cadenas de ADN. Serpone et al [26] también describe los efectos nocivos de TiO2 en el ADN. Ellos han probado la formación de radicales hidroxilo producidos por la irradiación de nanopartículas de TiO2 extraído de productos de protección solar, estos estudios se realizaron tanto in vitro e in vivo. Los autores verificaron al TiO2 como el iniciador de las reacciones nocivas, como las rupturas de cadenas de ADN a través de la generación de radicales libres. Sin embargo, la metodología del estudio no está descrita, y por lo tanto los resultados no pueden ser reproducidos o analizados.. En 2002, Uchino et al [41] examinó la generación de radicales hidroxilo por los rayos UVA en distintas estructuras de TiO2. Ellos encontraron que la irradiación UVA en TiO2 anatasa (estructura octaédrica) se genera gran cantidad de radicales hidroxilo, mientras que la forma de rutilo (estructura tetraédrica) presenta una menor generación de estos. La evaluación de la citotoxicidad del radical hidroxilo se puso a prueba en células de ovario de hámster chino, donde se observó la sensibilidad de estas células a la cantidad de radicales hidroxilos formados en el primer experimento.. Recientemente Hidaka et al [42] estudió el daño al ADN producido por TiO2 y ZnO después de la exposición a rayos UV. Los autores observaron como el radical hidroxilo ataca a la ribosa, la desoxiadenosina, guanosina, citidina y nucleótidos después de 30 minutos de irradiación. Esta reacción resulta en la rápida degeneración del componente de los nucleótidos del ADN-desoxiadenosina '5'monofosfato, monofosfato de guanosina, citidina monofosfato y en presencia de TiO2 y ZnO UV irradiados.. 13.

(29) A pesar de los estudios realizados en los que se observa que nanopartículas de TiO2 y ZnO son potencialmente tóxicas para el ADN por la formación de ROS (especies de oxígeno reactivo), muchos investigadores creen que esto sólo debe ser visto como una preocupación legítima de toxicidad si se presentan indicios de que nanopartículas de TiO2 y ZnO son capaces de penetrar la epidermis. Si las partículas nanométricas utilizadas en los protectores solares aplicados en la piel llegan a penetran en la dermis, se puede presentar la absorción sistémica de estas partículas con potenciales efectos inflamatorios y cancerígenos. Varios autores han propuesto que las nanopartículas de aplicación tópica puede llegar a la dermis y, finalmente, incorporarse sistemáticamente [55].. Aunque se han presentado estudios como el de Tan et al [13] donde se mostró un aumento del nivel de titanio en la epidermis y la dermis después del uso de protectores solares, otros estudios realizados como los de Schulz et al [27] y Gamer et al [28] han demostrado que nanopartículas de TiO2 y ZnO son incapaces de penetrar en la epidermis Estos experimentos no tuvieron en cuenta el movimiento de la piel, la carga de la partícula, las aberturas foliculares y la edad de la piel analizada.. Tinkle et al[56] mostró que la penetración de micropartículas (500-1000 nm) a través de la epidermis se produjo después de la aplicación de un movimiento de flexión. Otros estudios realizados por Rouse et al[57] y Oberdörster [23] mostraron la penetración del fullereno C60 a través de la piel después de flexión mecánica. Esto llega a sugerir que se presenta mayor absorción de las nanopartículas en pliegues de la piel mientras se presenta movimiento podría que en el de una piel plana.. Kohli y Alpar [58] han informado de la penetración de partículas de látex con carga negativa (50 y 500 nm), mientras que partículas con carga positiva o neutras no fueron capaces de penetrar la epidermis.. 14.

(30) Debido a esto se llegó a la conclusión de que también la carga de las nanopartículas es uno de los factores importantes en el proceso de absorción transdérmica. Esto nos lleva a concluir que la piel es permeable a los nanomateriales que presentan diferentes propiedades físico-químicas (tamaño, forma, carga, materiales).. Otro tipo de nanopartículas usadas ampliamente son las nanopartículas de plata, las cuales se utilizan en pinturas, cosméticos, bloqueadores solares y aplicaciones médicas. En un estudio realizado por Ahamed et al[29] se pudo observar la citotoxicidad de las nanopartículas donde se presenta la generación de ROS, estrés oxidativo, daño en el ADN y apoptosis; estos efectos se pueden observar en la Figura 8. En otro estudio in vitro realizado por Larese et al [30] se muestra la absorción de las nanopartículas de plata en piel dañada y piel sana, donde se presenta una absorción baja pero detectable en el estudio realizado.. Figura 8. Posibles mecanismos de toxicidad inducidos por nanopartículas de Plata Fuente: Ahamed, Silver nanoparticle applications and human health.. 1.7. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR INGESTION: El tracto gastro-intestinal representa un importante punto de ingreso de las nanopartículas al cuerpo, debido a que algunos productos alimenticios llegan a contener nanopartículas [6]. Por ejemplo, en el sector de la alimentación hay 15.

(31) múltiples aplicaciones potenciales (Tabla 2), en la agricultura (utilización de nanosensores para la detección de patógenos en animales y vegetales), en el procesamiento de alimentos (en nanocápsulas para mejorar el sabor), en el envase. de. alimentos. (nanoarcillas. y. nanopelículas. usados. como. barreras materiales para prevenir su deterioro y la absorción de oxígeno) y los suplementos dietéticos (nanoencapsulación de nutrientes para mejorar la absorción, la estabilidad o la ejecución selectiva)[5, 7]. Tabla 2. Nanoalimentos registrados en U.S.A Producto. Nanotea™. Canola. Nanoceuticals™ Slim. Active Oil® Detalles. Nanomicelas. Nanotecnologia de. Cocoa. con. ball-milling. nanoencapsulado. fitosteroles. mayor liberaciónde. cual. para. fitonutrientes. aportar. inhibir. la adsorción. Compañía. País. de. Maternal Water. Nanosupplements. Plata. 51. nanocoloidal. nanosuplementos. Shake Chocolate. para. y. selenio.. saboriza exceso. el sin. (nanominerales,. de. nanospray. azucar. 3. colesterol.. etc.. Shemen. Shenzhen Become. RBC Life Sciences®,. La Posta del. Industries. Industry & Trade. Inc. Águila®,. Ltd.. Co., Ltd. China. de. vitamina B12, omega. del. Israel. diferentes. USA. Argentina. nanoencapsulado,. Varias. USA. elaboración Fuente: The Project on Emerging Nanotechnologies which was established in April 2005 as a partnership between the Woodrow Wilson International Center for Scholars and the Pew Charitable Trusts. Fuente: www.nanotechproject.org/inventories/consumer.. El ingreso de las nanopartículas al tracto gastro-intestinal puede presentarse por una vía diferente a la ingestión, a través del sistema respiratorio debido a que las partículas inhaladas son excretadas mediante la escalera mucociliar e ingeridas posteriormente en el tracto gastrointestinal, esta vía se observa en la Figura 4.. En un estudio realizado por Sonavane et al [31] se analizó la permeabilidad de nanopartículas de oro a través de piel e intestino de ratas, donde se observó una mayor permeabilidad en el intestino que en la piel de las ratas; demostrado que las nanopartículas de oro puede ser utilizadas como un medio eficaz de transporte por vía transdérmica y administración oral de fármacos y vacunas. 16.

(32) Las nanopartículas que se encuentran en el tracto digestivo se pueden distribuir al sistema linfático y al sistema circulatorio por un proceso llamado persorción[59]. Otros estudios realizados en ratas han permitido confirmar que las nanopartículas se absorben principalmente en las placas de Peyer del intestino delgado y también a través de los enterocitos intestinales [18, 32, 60]. También en algunos estudios se ha logrado determinar que la carga de las partículas es un factor determinante para su absorción, ya que partículas positivas son absorbidas con mayor eficacia en el tracto gastrointestinal a diferencia de las partículas neutras o negativas [61]. Otro factor determinante en la absorción es el tamaño de las nanopartículas el cual se observa en el trabajo realizado por Jani et al[62] donde se encontró que nanopartículas de poli estireno de 50 y 100 nm se absorbieron en un 34% y 26%, respectivamente.. Las nanopartículas al ser adsorbidas y distribuidas al sistema linfático y circular, pueden dispersarse por todos los órganos del cuerpo humano generando posiblemente estrés oxidativo, generación de especies reactivas de oxígeno o reacciones inesperadas del sistema inmune[8]. Si la presencia de una nanopartícula en la corriente sanguínea no genera un efecto citotóxico directo (muerte celular) las nanopartículas pueden inducir una respuesta inesperada del huésped, como la secreción de citoxinas inflamatorias y metaloproteinasas las que juegan un papel importante en la destrucción de tejidos [63]. Otro posible daño que se pude presentar en el sistema circulatorio por la presencia de nanopartículas se genera debido a que las proteínas presentes en la sangre se pueden adherir a la superficie de la nanopartícula, cambiando la forma de la proteína, así como su función; estos cambios producidos en las proteínas podrían provocar. efectos no deseados y peligrosos, tales como la coagulación. sanguínea[64]. Otro importante efecto que se puede generar es la alteración intracelular de la concentración de calcio en las células lo que causa la creación de especies reactivas de oxígeno, generando inflamación en la célula [37].. 17.

(33) En la Figura 9 se observa el porcentaje de participación de los elementos utilizados en aplicaciones nanotecnológicas, en este gráfico podemos observar que todas las nanopartículas que se aplican para productos de consumo son las que han arrojado resultados preocupantes en los estudios realizados por los diferentes investigadores nombrados anteriormente, por esta razón es de gran importancia analizar el transporte de nanopartículas y sus efectos en el cuerpo humano. 1% 9%. Carbono. 9%. 34%. 17%. Plata Sílice. 30%. Titanio (incluido óxido) Zinc (incluido óxido) Oxido de Cerio. Figura 9. Nanomateriales usados en productos de consumo (2006). Fuente: Maynard, Andrew (2006). Nanotechnology: A Research Strategy for Addressing Risk. Woodrow Wilson International Center for Scholars. US.. 1.8. MODELOS UTILIZADOS EN EL TRANSPORTE DE NANOPARTÍCULAS: En esta sección observaremos algunos de los modelos matemáticos realizados por algunos investigadores de la distribución de drogas transportadas por nanopartículas en el cuerpo Humano. 1.8.1. Distribución de agentes anti cancerígenos. Modelo de difusión: La liberación de un fármaco a partir de una matriz polimérica generalmente sigue la segunda ley de Fick[2]. Donde el gradiente de concentración de las partículas esféricas está dada por: [Ec-1]. Donde c es la concentración local de la droga en el tiempo t y a la distancia r del 18.

(34) centro de la partícula y D es el coeficiente de difusión del fármaco en la matriz polimérica. Por lo tanto, [Ec-2]. α=V/(VsKp) donde V es el volumen del líquido del medio circundante, Vs es el volumen total de las partículas qn = λR, donde λ es el valor Eigen y R es el radio de las partículas.. 1.8.2. Modelamiento de la distribución de nanopartículas en esferas tumorales multicelulares. En el estudio realizado por Goodman et al [65], se desarrolló un modelo matemático de la penetración de nanopartículas en esferas multicelulares mostrando la dependencia de los cambios de distancia radial de la arquitectura del tumor, representado por la fracción de volumen de tejido accesible a la difusión de las nanopartículas. El modelo utilizado fue desarrollado teniendo en cuenta la no uniformidad estructural de las esferas en la dirección radial y la internalización de las partículas en las esferas multicelulares:. [Ec-3] [Ec-4] [Ec-6]. Donde r es la coordenada radial (r = 0 es el centro de la esfera y r = R es su borde exterior), t es la variable tiempo, ε es la porosidad volumétrica de las esferas (fracción del volumen de las esfera accesible a las partículas), C es la concentración molar de partículas libres en el volumen de la esfera (C / ε es la concentración de partículas no ligadas en el volumen intracelular), Cb es la 19.

(35) concentración de partículas ligadas, Cbs es la concentración de sitios de enlace disponibles en la superficie celular, Ci es la concentración de partículas interiorizadas, D es el coeficiente de difusión efectiva, ka es el coeficiente de velocidad de asociación, kd es el coeficiente de velocidad de disociación, y ki es el coeficiente de velocidad de internalización. Las condiciones iniciales y límites utilizados para la difusiónson:. [Ec-7]. Donde C0 es la concentración de partículas fuera de las esferas, la cual está definida por condiciones experimentales. El coeficiente de difusión efectivo, la porosidad volumétrica, y la concentración inicial de sitios de unión son funciones de la coordenada radial.. Utilizando un simple modelo de poros paralelos para medios porosos, la concentración inicial molar de los sitios de enlace en el interior de la esfera puede ser relacionada con la estructura esférica y la cantidad de sitios de unión sobre la superficie de las células.. [Ec-10]. Donde a es el radio de las partículas, rp es el radio de poro efectivo, NA es el número de Avogadro, y β es el coeficiente adimensional que caracteriza la densidad de sitios de enlace disponibles sobre la superficie celular. El coeficiente kβ cuantifica la diferencia de densidad en los sitios de enlace de las superficies de las células con configuración en monocapa en comparación con las células de esféricas.. 20.

(36) El coeficiente de difusión puede ser modelado como una de las formas sugeridas por Fournier y Saltzman. para espacios intercelulares y porosos en. biomateriales[66, 67].. El modelo para el coeficiente de difusión se define como sigue:. [Ec-13] [Ec-14]. Donde D0 es el coeficiente de difusión en medio líquido, k B es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta, µ es la viscosidad del líquido, L (λ) es el factor responsablede la reducción de hidrodinámica y estérica del coeficiente de difusión en el poro, τ (ε) es la tortuosidad causada por el aumento de la longitud de difusión en la esfera, y F> 1 es el factor de forma cuantifica la obstaculización en los poros de la esfera.. 1.8.3. Transporte de nanopartículas de oro en piel e intestinos de ratas. Para el modelo del transporte de las nanopartículas de oro en la piel de ratas e intestino realizado por Sonavane et al[31] se utilizó lo siguiente: La ley de Fick de difusión en estado estacionario se establece mediante la siguiente ecuación: Ec-15. Donde J es el flujo de difusión (mol /cm2 s), D es el coeficiente de difusión (cm2 /s), C es la concentración (mol/cm3) y x es la longitud (cm). Modificando la Ec-9 obtenemos: Ec-16 21.

(37) Ec-17. Donde V1 y V2 representan el volumen de la suspensión de oro nanoparticulada y la solución tampón fosfato en las fases de los donantes y receptores, respectivamente. C1 (t) y C2 (t) denota la densidad del número de nanopartículas de oro en las fases respectivas según lo indicado por los subíndices 1 y 2. P es el coeficiente de permeabilidad (cm / s) y A es el área de superficie de la membrana (cm2), es decir, la piel de rata o el intestino. Inicialmente, en el tiempo t = 0, las condiciones son las siguientes:. Donde, Ec-18. Teniendo en cuenta que la concentración de coloides de oro en el interior de la membrana es muy baja, reordenando la ecuación (Ec-18), obtenemos:. Ec-19 Sustituyendo la Ec-18 en la Ec-16 obtenemos,. Ec-20 Ec-21 Sustituyendo Ec-21 en Ec-20 Ec-22 Ec-23 Y Ec-24 Donde Ec-25 22.

(38) El coeficiente de difusión teórico se calculó usando la ecuación de StokesEinstein: Ec-26. Donde D (T) es el coeficiente de difusión, T es la temperatura, µ es la viscosidad del medio y a es el radio de las nanopartículas de oro. El coeficiente de permeabilidad teórico [P (T)] se calculó mediante la ecuación siguiente: Ec-27. Donde d es el espesor de la membrana.. En el artículo realizado por Siepmann et al[68] se observa un modelo matemático realizado por Saltzman y Radomsky (1991) donde se tiene en cuenta la difusión de las drogas en los sistemas de administración intercraneal, así como la eliminación de las drogas. La teoría se basa en los siguientes supuestos: (i). En la superficie de los sistemas de dosificación de la concentración de la droga es constante.. (ii). La eliminación del fármaco sigue una cinética de primer orden (la velocidad de eliminación del fármaco es proporcional a su concentración).. (iii). La difusión es isotrópica (no dependiente de una dirección espacial).. (iv). Los procesos de convección son insignificantes.. (v). La liberación del fármaco desde los dispositivos cilíndricos se produce sólo en la dirección axial.. Este modelo se basa en la segunda ley de Fick de difusión (teniendo en cuenta una dimensión), eliminando el término de primer orden.. Ec-28 23.

(39) Donde c es la concentración del fármaco en el tejido cerebral, t es el tiempo (t = 0 en el momento de la administración de dispositivos), D representa el coeficiente de difusión aparente del fármaco en el cerebro, x es la coordenada espacial (distancia de la interfaz de sistema de administración al tejido del cerebro"), y k es la tasa de eliminación. constante. de. primer. orden. de. la. droga. administrada.. Las siguientes condiciones iniciales y de contorno se consideraron:. Donde a es la mitad de espesor de la forma de administración cilíndrica y c0 la concentración de fármaco (constante) en la superficie del dispositivo. La Ec-24 indica que el tejido cerebral está libre de drogas antes de la administración de la forma farmacéutica. La Ec-25 establece la concentración constante de droga en la interfaz sistema de administración-tejido cerebral es independiente del tiempo, y la Ec-26 expresa el hecho de que la concentración de la droga disminuye a cero a grandes distancias del cilindro.. En condiciones de estado estable, cuando la concentración del fármaco en el tejido cerebral no varía con el tiempo, sólo con la posición, este conjunto de ecuaciones se puede resolver para dar: Ec-29. Por otra parte, teniendo en cuenta las condiciones de estado no estable (en el que la concentración de la droga varía con el tiempo y la posición), la siguiente solución puede obtenerse: Ec-30. Ambas ecuaciones permiten encontrar la concentración de la droga a cualquier distancia axial de la superficie para las formas de administración cilíndrica. 24.

(40) Otro modelo propuesto por Saltzman y sus colegas [69] considera la liberación de fármacos a partir de formas de administración esféricas, la difusión de las drogas, la eliminación y la convección dentro del cerebro. La teoría asume que el cerebro está libre de drogas antes de la administración de dispositivos, que la concentración de fármaco en la interfaz "vía administración-tejido cerebral" es constante y que la concentración de fármaco a distancias muy lejanas del sitio de administración es insignificante. De estas condiciones, se derivó la siguiente ecuación: Ec-31. En este caso, c es la concentración de la droga, estando en función del tiempo y la distancia radial desde el centro de la vía de dosificación r; c0 denota la concentración de fármaco en la interfaz "vía de administración-tejido cerebral", a es el radio del dispositivo esférico, v es la velocidad radial aparente en el espacio extracelular, y D representa la difusividad aparente de la droga en el cerebro.. Raman et al[70] propuso un interesante modelo matemático de la cuantificación de la liberación de fármaco de micropartículas esféricas de PLGA. La teoría considera la difusión de la droga, la degradación del polímero y la distribución no homogénea de los medicamentos en el sistema en t=0 La ecuación básica es la segunda Ley de Fick de difusión para geometría esférica:. Ec-32. Donde c es la concentración de la droga, t es el tiempo, r la coordenada radial y D(Mw) denota la dependencia de la difusividad de la droga del peso molecular del polímero. Para el peroxican cargado en las micropartículas de PLGA, se encontró la siguiente dependencia empírica del coeficiente de difusión D sobre el peso molecular promedio del polímero: 25.

(41) Ec-33 Las condiciones iniciales y condiciones límites considerados fueron:. Donde R es el radio de las microesferas. La distribución inicial de la droga f(r) se determinó por micrografía confocal.. Sólo algunas pocas teorías matemáticas han sido reportadas en la literatura para la descripción del mecanismo de transporte de masa en el control de liberación de fármacos basados en lípidos. Recientemente Guse et al[71], propuso la siguiente solución analítica de la segunda ley de Fick de difusión para cuantificar la liberación de proteínas de los cilindros constituidos por triglicéridos.. Ec-34. Donde Mt y M∞, representan las cantidades acumuladas absolutas de la proteína liberada en el tiempo t y en el tiempo infinito, respectivamente, qn son las raíces de la función de Bessel de primer tipo de orden cero (J0 (qn) = 0), y Rc y H denota el radio y la altura del cilindro.. Observando todos estos modelos desarrollados para la descripción del fenómeno de transporte de las nanopartículas en medios biológicos, se puede detallar que todos se derivan de la segunda ley de Fick, lo que conlleva a inferir que estos modelos no describen de buena manera el fenómeno de transporte ocurrido debido a que la ecuación de Fick tiene ciertas restricciones como la suposición de que el gradiente de concentración varía en forma constante, se considera transporte unidireccional y además se ignoran los efectos convección; es por esto 26.

(42) que es necesario implementar un modelo teórico que describa con una mayor aproximación lo que sucede en el ámbito del transporte, sin ignorar algunos parámetros que pueden modificar sustancialmente el transporte de los nanomateriales en estos medios complejos.. Difusión Anómala: Una consecuencia de la teoría cinéticaesla ecuación de difusión, que describe las fluctuaciones de la densidad en un material a lo largo del tiempo. La ecuación usualmente se escribe como: Ec- 35 Donde φ(r, t) es la densidad del material que se está difundiendo en un punto r del espacio y al tiempo t, D es el coeficiente de difusión que se supone constante. En su importante trabajo de 1905 Einstein presentó una nueva derivación de la ecuación de difusión. En esta derivación hay dos clases de distribuciones. Una es la probabilidad f(x, t)dx de encontrar una partícula Browniana en un intervalo [x, x + dx], al tiempo t, y otra es la densidad de probabilidad φ(Δ), para. un. desplazamiento Δ de la partícula dentro de un sólo paso en el tiempo discreto. La ecuación básica de evolución es la siguiente: Ec-36. donde φ(Δ) satisface la condición φ(Δ) = φ(−Δ). Es claro que esta ecuación es consistente con condiciones de normalización sobre f(x, t) y φ(Δ). Suponiendo analiticidad de f(x, t), Einstein derivó la ecuación de difusión ∂f/∂t = D∂2f/∂x2donde la constante de difusión está dada por. Ec-37. Y como mencionábamos antes, el desplazamiento medio crece en el tiempo como:. 27.

(43) Ec-38. Donde los paréntesis representanvalor de expectacióncon respecto a. f(x, t).. Ahora, en muchos sistemas naturales encontramos con frecuencia procesos de difusión que no satisfacen la ecuación anterior sino que el ancho de la distribución crece como t α. con un exponente α diferente de 1/2 .Uno se refiere a los. fenómenos con α = 1/2 como ―difusión anómala‖ y existen varios ejemplos en la naturaleza que exhiben difusión anómala.. 28.

(44) 3. TEORIA, DISEÑO, METODOLOGÍA Y PROTOCOLOS DE EXPERIMENTACION 3.1. TEORIA DE EXPERIMENTACION 3.1.1. Decelularización Es un proceso el cual consiste en extraer todas las células de un órgano de un individuo muerto dejando tan solo su andamiaje de tejidos internos (matriz de colágeno) [72], preservando así la estructura tridimensional, la resistencia mecánica y la estructura básica de la matriz extracelular como las estructuras de colágeno, las fibras de elastina y algunos glicosaminoglicanos [73]. El proceso de decelularización ha sido ampliamente utilizado en diferentes tipos de tejidos y órganos como válvulas cardiacas [74, 75], vasos sanguíneos [76, 77], piel [78], nervios [79], tendones [80], vejiga[81], tráquea[82], intestinos [83], hígado[84, 85], corazón [86, 87] y pulmones [88, 89] , utilizados para la ingeniería de tejidos y en medicina regenerativa. En la Figura 10 se presentan las imágenes del proceso de decelularización de un hígado.. Figura 10. Proceso de decelularización de un hígado de rata. Fuente: Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Debido a la variabilidad de masa de tejido, tipo de tejido, función, estructura y características biomecánicas, cada tejido u órgano requiere un manejo y procesamiento de decelularización específico. 3.1.1.1.. Métodos de Decelularización. Los métodos que comúnmente se utilizan para la decelularización de tejidos y órganos incluyen una combinación de tratamientos físicos y químicos. Los tratamientos físicos pueden incluir agitación o sonicación, masaje mecánico, o proceso de congelación/descongelación. Estos métodos se caracterizan por romper la membrana celular, liberar el contenido celular, y facilitar la eliminación 29.

(45) de los restos celulares de la matriz extracelular. Estos tratamientos físicos son generalmente insuficientes para lograr una decelularización completa y deben ser combinados con tratamientos químicos o enzimáticos. En los tratamientos enzimáticos se utiliza normalmente tripsina, dispasa o endonucleasas, y en los tratamientos químicos,. se utilizan soluciones detergentes iónicas, no iónicas,. detergentes zwitterionicos soluciones hipotónicas e hipertónicas y agentes quelantes; todas estas para romper las membranas celulares y los enlaces responsables de las conexiones intercelulares y extracelulares (Ver Figura 11).. Figura 11. Métodos de Decelularización de Órganos y Tejidos.. 3.1.1.1.1.. Métodos Físicos:. Los métodos físicos que se pueden utilizar para facilitar la decelularización de tejidos incluyen: congelamiento/descongelamiento, presión directa, sonicación y agitación. El método de congelación se utiliza frecuentemente para tejidos tendinosos o ligamentosos y tejidos nerviosos. Al congelar rápidamente un tejido se forman cristales de hielo intracelulares, los cuales rompen las membranas 30.