UNIVERSIDAD DE COLIMA
DOCTORADO EN CIENCIAS. ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
DISTRIBUCIÓN NATURAL DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS (NEMATODA: STEINERNEMATIDAE Y HETERORHABDITIDAE) EN
SISTEMAS AGROECOLÓGICOS DE ZACATECAS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS. ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
MIGUEL ÁNGEL SALAS LUÉVANO
ASESORES:
DR. JAIME MOLINA OCHOA DR. HÉCTOR RENÉ VEGA CARRILLO
AREA: BIOTECNOLOGÍA P R E S E N T E .
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: de Biotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis del Doctorado y en virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresión dc la tesis " Distribución natural de nematodos entomopatógcnos (Nematoda: Steinernematidae y Heterorhabditidae) en sistemas agroecológicos de Zacatecas ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Jaime Molina Ochoa, Profesor Investigador de esta Facultad y Dr. Héctor René Vega Carrillo de la Universidad Autónoma de Zacatecas.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial para obtener cl grado de Doctor en Ciencias; Arca: Biotecnología y fue revisado en cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. José-Gerardo López Aguirre, Dr. Roberto Lezama Gutierrez y el Dr. Jaime Molina Ochoa, Profesores-Investigadores dc la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.
A T E N T A M E N T E
“ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA”
TECOMÁN, COL., A 21 DE NOVIEMBRE DEL 2002.
ING. RODOLF NTÍN DELGADO
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO.
RVMD/gmg* * Of. No. 652/2002.
Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100 Tel. 01 (313) 322 94 05 • Est. 52251 • Fax 52252 • [email protected]
A Dios Por permitirme existir.
A mis Padres Prof. Everardo Salas Marín | donde quiera que estés y Maria Soledad Luévano Guerrero, quienes por su ejemplo e inspiración he logrado mi mayor ilusión profesional y personal, para ellos mi amor eterno.
A mi esposa Silvia por su paciencia, apoyo, comprensión incondicional y por compartir conmigo la felicidad de culminar esta meta.
A mis hijas Karina, Silvia y Paloma mi adoración y luz de mi vida; mis mujeres, todo lo que puedo ser, es por ustedes.
A mi nieto Luis Ángel mi adoración y alegría en mi vida, quien junto con tu mami y tías en un futuro lleven a feliz termino sus más caras ilusiones.
A mi hijo Luis Manuel por su motivación sincera y compartir con mi familia este logro nuestro.
A mis hermanos Marco Antonio, Juan Manuel, Ma. Guadalupe, Mario Alberto, Ma. Soledad, Ma. de Lourdes, Isabel Cristina, Héctor Martín y Martha Araceli, por su apoyo y cariño fraternal siempre.
A la familia Don Ángel |, Doña Amparo, Ángeles, Lilia, José Ángel, Enrique, Muñoz Delgado Olivia | y Haydee por su ánimo fraterno.
A la Universidad Autónoma de Zacatecas a través de la Unidad Académica de Agronomía, por el apoyo institucional brindado en mi superación profesional.
Al Programa de Mejoramiento del Profesorado, PROMEP-UAZ por su apoyo económico para la realización de mi doctorado en ciencias.
A la Universidad de Colima a través de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, por hacer posible mi formación académica.
Al I. Q. Rogelio Cárdenas Hernández Rector de la Universidad Autónoma d e Zacatecas, por su confianza, apoyo incondicional y amistad brindada.
Al Dr. Jaime Molina Ochoa y el Dr. Héctor René Vega Carrillo, por su acertada asesoría, invaluables consejos y amistad brindada, mi agradecimiento sincero.
Al Dr. Roberto Lezama Gutiérrez, Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. José Gerardo López Aguirre, por su valiosa revisión y excelentes sugerencias para la composición final de mi tesis doctoral.
Al Dr. Miguel Arenas Vargas modelo íntegro a seguir por su enseñanza académica innovadora, así como por su amistad brindada, mi reconocimiento sincero.
A mis amigos Eduardo, Rómulo, Martín, Carlos, Víctor, Julían, Héctor y Adalberto por sus consejos, apoyo incondicional, por su grata convivencia y nuestra amistad siempre.
A mi Cuquis, José y mi compadre Avelar quienes siempre me han brindado amistad y apoyo incondicional.
A todas aquellas personas que de alguna manera contribuyeron para la realización del presente trabajo.
ÍNDICE
Página
I. INTRODUCCIÓN
II. ANTECEDENTES
2.1 Los nematodos parásitos de insectos 7
2.2 Los nematodos entomopatógenos Steinernematidae y Heterorhabditidae 7
2.3 Rango de hospederos 10
2.4 Taxonomía de los nematodos entomopatógenos 15
2.5 Identificacion de los nematodos entomopatógenos 18
2.5.1 Identificación morfológica y morfométrica 18
2.6 Biología de los nematodos 21
2.6.1 Comportamiento de los nematodos 21
2.6.1.1 Búsqueda de los hospederos susceptibles 21
2.6.1.2 Penetración a los hospederos 23
2.6.2 Ciclo de vida de los nematodos 24
2.6.3 Asociación mutualista nematodo-bacteria 28
2.7 Ecología de los nematodos entomopatógenos 32
2.7.1 Factores ambientales 32
2.7.2 Supervivencia de los nematodos entomopatógenos 33
2.7.3 Condiciones edafológicas 35
2.7.3.1 El medio ambiente del suelo 35
7.3.3.2 El pH del suelo 36
2.7.3.3 Aireación del suelo 36
2.7.3.4 Humedad del suelo 37
2.7.4 Dispersión de los nematodos en el suelo 39
2.7.5 Temperatura del suelo 41
2.7.5.1 Tolerancia a la desecación 41 2.7.5.2 Luz ultravioleta 44 2.7.5.3 Tolerancia al frío 44
1
7
2.8 Biodiversidad y poblaciones naturales de nematodos entomopatógenos 46 2.8.1 Aislamiento y distribución geográfica de Steinernema y Heterorhabtidis 47 2.8.2 Distribución natural y rango de hábitats de Steinernema y Heterorhabtidis 52
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Lugar del experimento 65
3. 2 Descripción de los sistemas agrícolas de la región Centro-Sur de Zacatecas 65
3.3 Cría de Galleria mellonella 66
3.4 Áreas de muestreo 67
3.4.1 Recolección de las muestras 67
3.5 Aislamiento de los nematodos entomopatógenos 68
3.6 Pruebas de patogenicidad 69
3.7 Estudios taxonómicos 69
3.7.1 Identificación morfológica 70
3.8 Medición de los factores edafológicos y climáticos 70
3.9 Análisis de datos 71
IV. RESULTADOS
4.1 Determinación y distribución de los nematodos entomopatógenos 734.2 Pruebas de patogenicidad 78
4.3 Identificación de los nematodos Steinernema y Heterorhabtidis 78
4.4 Correlación entre los nematodos entomopatógenos y los sistemas agroecológicos, factores edafológicos y climáticos 4.4.1 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los sistemas agroecológicos 4.4.2 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores edafológicos 83 4.4.2.1 Tipo de suelo 83
4.4.2.2 Textura del suelo 85
4.4.2.3 pH del suelo 86
4.5 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores climáticos 88 4 . 5 . 1 T i p o d e c l i m a 8 8 4.5.2 Temperatura ambiental y del suelo 90
4 . 5 . 3 P r e c i p i t a c i ó n p l u v i a l 9 1
65
73
79 804 . 5 . 4 A l t i t u d 9 2
V . D I S C U S I Ó N 9 5
5.1 Determinación y distribución de los nematodos entomopatógenos 95
5.2 Pruebas de patogenicidad 104
5.3 Identificación de los nematodos Steinernema y Heterorhabtidis 105
5.4 Correlación entre los nematodos entomopatógenos y los sistemas agroecológicos, 106
factores edafológicos y climáticos 5.4.1 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los sistemas agroecológicos 106
5.4.2 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores edafológicos 106 5.4.2.1 Tipo de suelo 117
5.4.2.2 Textura del suelo 117
5.4.2.3 pH del suelo 118
5.5 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores climáticos 121
5.5.1 Tipo de clima 123
5.5.2 Temperatura ambiental y del suelo 123
5.5.3 Precipitación pluvial 126
5.5.4 Altitud 131
VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN
VII. LITERATURA CITADA
VIII. ANEXO
133
134
137
161
TABLA DE CUADROS Y FIGURAS
Cuadro Pág.
Figura Pág. 1 Especies descritas y reconocidas para el género Steinernema. 16 2 Especies descritas y reconocidas para el género Heterorhabditis. 17 3 Inspecciones generales y objetivas de nematodos entomopatógenos. 48 4 Distribución de los sitios y muestras positivas con nematodos 73
entomopatógenos en la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.
5 Distribución y existencia natural de nematodos entomopatógenos en la 75 región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.
6 Existencia de los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y 78 Beauveria bassiana en la región Sur de Zacatecas, Zac.
7 Distribución y existencia natural de Steinernema y Heterorhabditis en los 82 sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur de Zacatecas, Zac.
8 Tipo de suelo de los sitios y muestras que dieron positivo a los géneros 84 Steinernema y Heterorhabditis en la región Centro-Sur de Zacatecas.
9 Características edafológicas de los sistemas agroecológicos que 88 confirmaron nematodos entomopatógenos Steinernema y Heterorhabditis en suelos zacatecanos.
10 Carácterísticas climáticas de los sistemas agroecológicos que registraron 94 nemátodos entomopatógenos Steinernema y Heterorhabditis en Zacatecas.
1 Distribución y abundancia de nematodos entomopatógenos (Steinernema 74 y Heterorhabditis) en la región Centro-Sur de Zacatecas
2 Mapa de muestreo para nematodos entomopatógenos asociados en la 76 región Centro-Sur de Zacatecas (Ä = Steinernema spp.; = Heterorhabditis spp.).
3 Hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana 77 aislados en la región Sur de Zacatecas.
4 Géneros de nematodos entomopatógenos aislados en los agrosistemas de 79 la región Centro-Sur de Zacatecas.
5 Asociación de los nematodos entomopatógenos en los agrosistemas 80 (anuales y perennes) de la región Centro-Sur de Zacatecas.
6 Asociación entre los nematodos entomopatógenos y el tipo de suelo de la 85 región Centro-Sur del Estado de Zacatecas, Zac.
7 Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y el pH en la región Centro- 87 Sur de Zacatecas.
8 Estratificación ambiental del Estado de Zacatecas. 89 9 Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y la temperatura ambiental 91
en los agrosistemas inspeccionados.
10 Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y la precipitación en los 92 agrosistemas inspeccionados.
11 Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y la altitud en los 93 agrosistemas inspeccionados.
RESUMEN
Una inspección objetiva fue conducida en diversos sistemas agroecológicos en la región Centro-Sur de Zacatecas, para determinar la presencia de nematodos entomopatógenos. Esta fue evaluada por la técnica de cebado con Galleria. De las 142 muestras de suelo de 72 sitios, los nematodos fueron aislados de 28.1% de las muestras, representando el 50% de los sitios estudiados, de las cuales 12.7% contenían Steinernema spp. y 15.4% Heterorhabditis spp. A excepción de un solo sitio con cultivo de alfalfa, no se encontraron infecciones naturales, en cadáveres de ninfas de Brachystola ponderosa posiblemente infectado por Steinernema scapterisci. Los steinernematidos fueron más prevalecientes en maíz y alfalfa; suelos de textura franco, pH entre 6.0 a 8.4, áreas templadas situadas en altitudes altas, promedios de temperatura y precipitación anual baja. Mientras que los heterorhabditidos predominaron en guayabo, en suelos franco arenoso arcilloso, pH de 6.0 a 9.2, áreas cálidas localizadas en latitudes intermedias, promedios de temperatura anual alta y precipitación intermedia.
Palabras clave: Nematodos entomopatógenos, distribución geográfica, existencia natural, características ambientales, Zacatecas, Steinernematidae, Heterorhabditidae, inspección.
ABSTRACT
A targeted survey was conducted in several agro-ecology systems in the central-south region of Zacatecas, and the presence of entomopathogenic nematodes was evaluated by Galleria baiting technique. Of the of 142 soil sample of 72 sites the nematodes were isolated form 28.1% of the samples, representing 50% of the sites studied, of which 12.7% of the samples contained Steinernema spp. and 15.4% contained Heterorhabditis spp. No natural infections were found except in one site of lucerne in cadavers of nymphs of Brachystola ponderosa posibility infected by Steinernema scapterisci. The steinernematids were more prevalent in corn and lucerne, soil loam, ph between 6.0 to 8.4, temperate areas situated in high altitud, lower annual median temperature and rain. While heterorhabditids predominated in guava, soil sandy loam and clay, pH of 6.0 to 9.2, warm areas localited in intermediate altitude, high annual median temperature and intermediate rain.
Key works: Entomopathogenic nematodes, geographical distribution, natural occurrence, environmental characteristics, Zacatecas, Steinernematidae, Heterorhabditidae, survey.
I. INTRODUCCIÓN
Por décadas los plaguicidas químicos han sido el método de control de plagas más utilizado, pero sus efectos sobre organismos no objetivo, contaminación de agua, residuos en cosechas y alimentos, el desarrollo de resistencia de los insecticidas y el incremento a la degradación microbiana (Gaugler, 1988; Georgis, 1992) han originado un clima político y social en contra de ellos (Georgis y Hague, 1991). Como consecuencia, asociaciones ambientalistas han forzado la atención de la industria para el desarrollo e incremento de investigaciones, sobre otros métodos de control alternativo menos tóxicos para el manejo de insectos plagas (Georgis y Poinar, 1994).
El control microbiano se ha expandido con el descubrimiento y desarrollo de nuevos agentes de control. Por su selectividad y reducido impacto ambiental, algunos organismos entomopatógenos pueden ser componentes ideales en programas de manejo integrado de plagas en el principio y más allá del siglo XXI (Lacey y Goettel, 1995). Durante la última década, el interés sobre el control biológico de plagas agrícolas y forestales, se ha intensificado alrededor del mundo (Kaya y Gaugler, 1993). Entre la diversidad de agentes bioreguladores reconocidos ampliamente, numerosas especies de nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae, pueden jugar un papel trascendental en la agricultura, al limitar las poblaciones de insectos plaga de importancia económica (Gaugler, 1981).
Como resultado de los progresos que durante los últimos 20 años se han hecho sobre la taxonomía, biología, genética, ecología, rango de hospederos, pruebas de laboratorio y de campo, aplicaciones tecnológicas, la comercialización de los nematodos entomopatógenos y sus bacterias simbióticas (Bedding, 1998), los nematodos del género Steinernema y Heterorhabditis han surgido como candidatos excelentes de biocontrol alternativo de insectos plaga, ya que posiblemente ellos ocupan una gran parte en conjunto con los depredadores/parasitoides y patógenos (Gaugler, 1988; Grewal y Georgis, 1999). Estos han recibido considerable atención como bioinsecticidas, por la combinación impresionante y única de los atributos que poseen (Gaugler y Kaya, 1990). Asimismo, por la asociación nematodo-bacteria que reúne muchos criterios para el control aumentativo de insectos a través
de liberaciones inundativas, entre los que se incluye: el amplio rango de hospederos; la capacidad para buscar y matar rápidamente a los ho spederos, un estadio infeccioso durable capaz de almacenarse, la distribución y persistencia, su disponibilidad para pruebas, la seguridad para las plantas y vertebrados, la disponibilidad de tecnologías baratas para la producción en masa, la existencia de equipos que facilitan la aplicación de rociado y la excención de requerimientos de registro y regulaciones estatales y federales en muchos países (Poinar, 1986; Gaugler, 1988; Kaya, 1990).
Además, debido a que los insectos del suelo son el objetivo lógico y como los nematodos también existen naturalmente aquí, pueden tener ventajas sobre los plaguicidas y otros patógenos microbianos (Gaugler, 1988). El uso potencial en el control biológico de diferentes especies de insectos plaga va en aumento (Miduturi et al., 1996). Por otro lado, a través de extensos programas de investigación en campo, se han estado desarrollando estrategias de aplicación que proporcionan niveles comparables al de los insecticidas convencionales (Georgis y Gaugler, 1991). Asimismo, con el desarrollo y producción de nematodos entomopatógenos a través de fermentaciones líquidas y formulaciones estables, se inició la introducción de un número de productos contra un amplio espectro de insectos plaga del suelo y de ambientes crípticos. Las investigaciones se han enfocado en la optimización del proceso de producción, para encontrar una mejor formulación, perfeccionar la aplicación tecnológica y utilizar especies/cepas más virulentos (nativos o por manipulación genética) que reduzcan la brecha entre los nematodos y los insecticidas sintéticos (Georgis y Hague, 1991).
En el futuro una oportunidad final de desarrollo notable, es la incorporación de los nematodos entomopatógenos en los programas de manejo integrado de plagas (Georgis, 1992), debido a que éstos generalmente son compatibles con la mayoría de los plaguicidas comerciales (Hara y Kaya, 1993; Rovesti et al., 1988; Zimmerman y Cranshaw, 1990), así como con hongos entomógenos (Kamionek et al., 1974), bacterias (Poinar et al., 1990) y virus (Kaya y Brayton, 1987). La combinación de los nematodos con los plaguicidas, patógenos y las medidas culturales, podrían resultar en una mayor mortalidad de las plagas y en una reducción en el importe de productos agroquímicos para su control (Kaya, 1985). De esta manera, presentarán una participación predominante en el mercado de control de ciertas plagas
y su participación continuará incrementándose (Smart, 1995) a mayor escala en el manejo integrado de plagas y en los sistemas de agricultura sustentable (Ehlers, 1996).
Complementariamente, con el incremento de las inspecciones y recuperación de aislamientos de numerosas poblaciones de nematodos entomopatógenos, el conocimiento de la biodiversidad de nuevos especímenes de steinernematidos y heterorhabditidos, se ha intensificado en el mundo. Mediante el método trampa de Galleria mellonella (L) es posible determinar la existencia y aislar especies y cepas en el suelo y en insectos infestados (Bedding y Akhurst, 1975). Sin embargo, en diversas regiones geográficas donde las condiciones bióticas y abióticas de cada sitio inspeccionado juegan un papel importante para su adaptación (Hominick et al., 1998), pueden ser diferentes completamente en su infectividad y supervivencia, de tal manera, que el potencial para obtener muchos y mejores aislados de nematodos entomopatógenos, es mayor, particularmente donde una especie conocida es eficaz contra insectos plagas en particular, con promedios más favorables para utilizarse en programas de control biológico (Bedding et al., 1983; 1998).
Por consiguiente, recuperar y aprovechar los aislamientos de entomopatógenos como agentes potenciales de control biológico, requiere de un gran entendimiento de los factores que determinan la existencia y abundancia de los nematodos en la naturaleza. La importancia de los estudios ecológicos de enemigos naturales, radica en ensayar y seleccionar la mayor cantidad de especies que exhiban mayor potencialidad en contra de un insecto plaga como problema particular. Estas investigaciones son fundamentales, en la determinación para el uso más efectivo de nuevos nematodos que tienen una o toda una gama de características biológicas deseables como agente de biocontrol (Gaugler et al., 1997).
De esta forma, diversas especies de nematodos entomopatógenos han sido promovidas para utilizarse en el mercado, para el control de una variedad de plagas de cultivos ornamentales y viveros, pastos, cultivos anuales y perennes y bosques, incluso para especies urbanas de importancia médica y veterinaria (Kaya y Gaugler, 1993). Igualmente, un rango de especies y cepas de Steinernema y Heterorhabditis son utilizadas como agentes de control biológico de plagas en cultivos industriales protegidos y cultivos intensivos de invernaderos
(Richardson, 1992). Asimismo, especies particulares son reconocidas ampliamente por su potencial como agentes de control biológico clásico, tal es el caso de Steinernema scapterisci Nguyen y Smart contra el grillo topo Scapteriscus vicinus (Nguyen y Smart, 1990), aplicaciones de Steinernema riobrave como un control biológico inundativo para la supresión de Helicoverpa zea Boddie (Feaster y Steinkraus, 1996), incluso se han registrado importantes epizootias ocasionadas por Heterorhabditis spp. (Sexton y Williams, 1981; Akhurst et al., 1992).
Por esta razón, es importante descubrir y caracterizar diversas especies y cepas de steinernematidos y heterorhabditidos y sus bacterias; debido a la promoción y facilidad de encontrar especies de nematodos adaptadas localmente, ya que estos us ualmente tienen una base geográfica. La realización de inspecciones acerca de los nematodos entomopatógenos que habitan naturalmente y en donde probablemente se puedan introducir, es de vital importancia para diseñar y perfeccionar estrategias de control de insectos. Además, el uso de nematodos endémicos como agentes de control biológico, pueden representar menos riesgos para organismos no objetivos, en comparación con la introducción de aislamientos exóticos (Blackshaw, 1988). Como consecuencia, en diversos países existen leyes cuarentenarias relacionadas para la importación de organismos exóticos, con la finalidad de proteger la fauna y la flora nativa, así como la agricultura (Bedding et al., 1996; Richardson, 1996).
Numerosas investigaciones han demostrado la amplia distribución y gran diversidad de especies y cepas de nematodos entomopatógenos. En América Latina y el Caribe diversos nematólogos han contribuido significativamente en la taxonomía y descubrimiento de especies de Steinernema y Heterorhabditis que han sido recuperados de muestras de suelos y de insectos plagas infectados naturalmente (Georgis y Hom, 1992). En México solamente se ha documentado la cepa Mexicana de Steinernema carpocapsae, que originalmente fue recuperada de larvas infectadas de la palomilla de la manzana [Cydia pomonella (L.)]: en Allende, Chihuahua por Caltagirone (Poinar, 1970). Sin embargo, es poca la información respecto a la distribución, identificación y potencial de otros nematodos nativos, que puedan permitir la selección de aislados o especies eficaces (Stock, 1995). Motivo por el cual, es necesario caracterizar su biodiversidad, para manipularlos y contribuir de esta manera con la
agricultura sustentable, para promover la práctica de utilizar nematodos para el control biológico de insectos y otras plagas (Barker et al., 1994).
Por otro lado, en el Estado de Zacatecas el control de insectos plaga de interés económico, especialmente para cultivos de alta rentabilidad, se realiza mediante la aplicación de insecticidas convencionales, que han propiciado el incremento de restricciones para su uso debido al aumento de contaminación ambiental y problemas de resistencia de los insectos a estos productos químicos. La interacción con otros factores de carácter tecnológico, socioeconómico y cultural, impiden que las estrategias de control no den resultados favorables. Por consiguiente, es necesario la implementación de otros métodos de control alternativo y aprovechar los agrosistemas que ofrecen un gran potencial no explorado, por lo cual, se requiere buscar y caracterizar los nematodos entomopatógenos adaptados localmente, donde probablemente existen, interactúan y han logrado coevolucionar con insectos nativos, lo que permitirá establecer las bases para su uso en programas de manejo integrado de plagas, que posibiliten el desarrollo de nuevas tecnologías para su preparación y aplicación. El grado de adaptabilidad, persistencia, tolerancia, infectividad y variabilidad genética entre ellos, determinarán su potencial como agentes de control biológico sobre insectos plaga que afectan cultivos de importancia económica en el Estado.
Con base a lo anterior y ante la ausencia de estudios sobre la distribución natural de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) en Zacatecas, México, la pregunta científica de ésta investigación fue la siguiente: ¿Cuál es el efecto de las condiciones edafológicas y climáticas sobre la existencia, distribución natural y diversidad de los nematodos entomopatógenos en los sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas?
Como una posible respuesta a esta pregunta científica, la hipótesis de trabajo fue la siguiente: Las condiciones edafológicas y climáticas de los sistemas agroecológicos, son favorables para la existencia, distribución natural y diversificación de nematodos entomopatógenos de los géneros Steinernema y Heterorhabditis en la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.
Con el proposito de confirmar la hipótesis, el objetivo general del presente trabajo fue: Determinar la distribución natural de nematodos entomopatógenos (Nematoda: Steinernematidae y Heterorhabditidae) nativos en los sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur de Zacatecas. En tanto que para lograr lo anterior, los objetivos particulares planteados fueron los siguientes:
1.- Determinar la distribución natural de los nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) adaptados localmente en diversas áreas agroecológicas de Zacatecas. 2.- Confirmar la patogenicidad y postulados de Koch de los nematodos entomopatógenos
aislados en contra de larvas de palomilla mayor de la cera Galleria mellonella.
3.- Determinar los géneros de nematodos entomopatógenos (Steinernema y Heterorhabditis) asociados en los cultivos de la región.
4.- Correlacionar la incidencia y distribución natural de los nematodos entomopatógenos con los sistemas agroecológicos, los factores edafológicos y climáticos de la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.
II. ANTECEDENTES
2.1 Los nematodos parásitos de insectos
En la actualidad el parasitismo de los nematodos para los insectos es reconocido, de los cuales más de 30 familias están asociadas en alguna vía y de éstas, nueve muestran potencial para control biológico (Kaya, 1993). En orden ascendente aproximado las siguientes familias son Allantonematidae, Parasitylenchidae, Lotonchiidae, Tetradonematidae, Sphaerulariidae, Mermithidae, Phaenopsitylenchidae, Steinernematidae y Heterorhabditidae. Estos nematodos que infectan centenares de especies de insectos, de casi todos los Órdenes ocasionan esterilidad, reducción en la fecundidad, longevidad y actividad del vuelo, retardan el desarrollo y cambios de comportamiento, morfológicos o fisiológicos (Kaya et al., 1993).
2.2 Los nematodos entomopatógenos Steinernematidae y
Heterorhabditidae
El parasitismo de insectos ocasionado por los nematodos pertenecientes a las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae y su asociación simbiótica natural, con bacterias específicas del género Xenorhabdus y Photorhabdus respectivamente, durante años ha llamado la atención por parte de los nematólogos y entomólogos de todo el mundo, el cual es atribuido al éxito como agentes de control biológico de insectos plaga de importancia económica. Entre las razones que justifican este extraordinario interés, destacan la amplia distribución geográfica, el alto grado de adaptabilidad, su variabilidad genética y diversidad ecológica. Por lo cual, diversas especies están siendo utilizadas en el control biológico clásico, en programas de liberaciones inundativas o inoculativas y en el manejo integrado de plagas, contra una variedad de insectos. Por otro lado, la necesidad de encontrar e implementar nuevas estrategias de control alternativas para los insecticidas convencionales, diversas compañías comerciales han desarrollado y obtenido nuevos productos basados en nematodos entomopatógenos, lo que viene a confirmar la importancia de su uso como bioinsecticidas.
Los nematodos entomopatógenos forman parte de un grupo variado de organismos, que virtualmente existen en cada medio ambiente del mundo. Donde la mayoría de sus especies
han resultado ser aliados importantes en el control biológico de insectos plaga (Barker et al., 1994). Estos constituyen un grupo complejo y heterogéneo, en parte, por las diversas categorías taxonómicas que lo conforman, por las características biológicas de las diferentes especies y por los mecanismos variados de interacción con el medio ambiente donde habitan (Agüera y Laumond, 1993). Entre los insectos y nematodos, existen más de 3,000 asociaciones naturales clasificadas desde foresis a parasitismo y patogénesis; la mayoría de estas interacciones son dañinas o medianamente débiles; comparadas con algunos nematodos que causan mortalidad al hospedero (Poinar, 1990; Gaugler, 1981).
El Orden Rhabditida contiene a la mayoría de los nematodos de vida libre, donde están agrupadas las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae, parásitos facultativos (patógenos) de insectos y que representan la principal línea de patogenicidad, que ha dado origen a formas como Steinernema=Neoaplectana y Neosteinernema (Steinernematidae) y Heterorhabditis (Heterorhabitidae) (Poinar, 1990; Nguyen y Smart, 1994). Estos nematodos son denominados entomopatogénos, lo cual ha reforzando la vinculación entre la nematología de los insectos y la patología de insectos (Gaugler y Kaya, 1990; Tanada y Kaya, 1993). Esta relación entre el nematodo y la bacteria, es considerada mutualista, porque la bacteria no puede penetrar dentro del hemocele de los insectos hospederos sin el nematodo y estos no pueden crecer y reproducirse en ausencia de la bacteria (Georgis y Poinar, 1994). En la actualidad algunas de sus especies, son ampliamente reconocidas por su potencial como agentes de control biológico e inundativo (Downes y Griffin, 1996) y causantes de algunas importantes epizootias (Akhurst et al., 1992).
Kaya y Gaugler (1993) señalan que los juveniles infectivos de vida libre, no se alimentan, se asemejan y poseen atributos significativos tanto de insectos parasitoides o depredadores, como de patógenos, porque tienen quimioreceptores y son móviles, tienen un alto potencial reproductivo y una respuesta numérica pero no funcional y porque son altamente virulentos para sus hospederos. Después de su penetración en la cavidad del cuerpo de los insectos, rompen las reacciones de defensa, liberan su bacteria simbiótica que ocasiona una septicemia y la muerte del insecto objetivo. Además, porque estos nematodos actúan como vectores de las bacterias, tenemos que adoptar el término de nematodos
entomopatógenos, más bien que “entomofílicos”, “entomógenos”, “entomófagos” o “nematodos parásitos de insectos”. De hecho estos nematodos ocupan una posición entre depredadores y agentes microbianos (Gaugler y Kaya, 1990; Boemare et al., 1997).
Los nematodos entomopatógenos son únicos porque poseen todos los atributos de un agente de control biológico “ideal”, debido al amplio rango de hospederos que presentan, capacidad de búsqueda, desarrollo e introducción de sus bacterias simbióticas dentro del cuerpo de los hospederos; al matar a los insectos dentro de las 24-48 horas siguientes para su desarrollo y reproducción; facilidad relativa de reproducción de los estadios infectivos a gran escala en medios artificiales, sólidos o líquidos, los cuales pueden ser almacenados por largos períodos y mantener su viabilidad y patogenicidad hasta cinco meses a temperaturas bajas, incluso durante 12 meses en refrigeración y ser aplicados por métodos convencionales, persistiendo en el medio ambiente natural (Poinar, 1990; Georgis y Hague, 1991; Kaya et al., 1993). Asimismo, los steinernematidos y heterorhabditidos y su bacteria simbiótica, a diferencia de otros patógenos de insectos, en pruebas extensivas han demostrado una comp leta ausencia de patogenicidad sobre mamíferos, plantas y entomofauna benéfica no objetivos (Gaugler y Boush, 1979; Gaugler, 1981, 1987; Poinar et al., 1982; Timper, et al., 1988).
Por consiguiente, la Representación Federal de Insecticidas, Fungicidas y Rodenticidas de la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos de Norteamérica, ha exentado a estos nematodos de registros y regulaciones gubernamentales para su desarrollo comercial (Gorsuch, 1982; Nickle et al., 1988; Georgis, 1992). También se han elaborado guías para la importación, movimiento y liberación de nematodos exóticos (Parkman et al., 1992; Smart, 1992). Igualmente, han sido adoptados por países de la Organización para el Desarrollo y Cooperación Económica en Europa (Ehlers y Hokkanen, 1996). Consecuentemente, en ciertos países de América Latina y el Caribe no existen muchas leyes y normas regulatorias que hayan sido establecidas y que inspeccionen su liberación en campo (Georgis, 1992).
Sin embargo, existen importantes factores que afectan el nivel de riesgo por la introducción de estos nematodos, que incluyen: el potencial del rango de expansión, el rango
de hospederos del nematodo candidato, el efecto de sus encuentros con organismos no objetivos; la permanencia de la introducción y la vulnerabilidad del hábitat objetivo, las relaciones de los nematodos y su bacteria asociada y su efecto dinámico en la comunidad del ecosistema. Por lo cual, debido a que nuevas especies de Heterorhabditis y Steinernema y su bacteria asociada se siguen aislando, la liberación de estos nematodos deberán esperar resultados de estudios de pre- liberación más rigurosos, sobre identificación y rango de hospederos, así como el efecto sobre organismos no objetivos (Jansson, 1993).
Bergley (1990) me nciona que los nematodos entomopatógenos han sido usados principalmente, contra estadios de ciertos insectos del suelo y de hábitat crípticos, incluso para diversas plagas que se encuentran en el estiércol y en hábitat acuáticos. Aunque, también se pueden desarrollar en muchas especies de diversos hospederos, observándose que el desarrollo óptimo es diferente con la especie o cepa de nematodo que se pretende desarrollar (Georgis y Gaugler, 1991). Esto sugiere una susceptibilidad particular del insecto, que es variable también dentro de los diferentes estadios de desarrollo del insecto y una virulencia intrínseca del nematodo o cepa (Fuxa et al., 1988; Simöes y Rosa, 1996; Molina-Ochoa et al., 1996).
Por lo tanto, Gaugler (1987) señala otra ventaja importante en ellos y sugiere la posibilidad de realizar estrategias de mejoramiento genético, que incluyan hibridación, selección artificial y manipulación genética. Entre los candidatos ideales destacan los heterorhabditidos debido a su simplicidad, transparencia, facilidad de cultivo, generación de corto tiempo y el tamaño pequeño de su genoma (Gaugler et al., 1997) que permitan incrementar su infectividad, virulencia, capacidad reproductiva y tolerancia a las temperaturas extremas y a la desecación (Glazer, 1996; Shapiro et al., 1997) para aumentar la eficacia de las especies y cepas de nematodos cuando son aplicadas en el campo (Gaugler et al., 1997).
2.3 Rango de hospederos
Un aspecto importante que se debe considerar para que pueda realizarse una infección, es la coincidencia espacio temporal del complejo nematodo- insecto, lo que asegura el éxito de control. En este caso, una contribución significativa que proporcionan las especies y cepas de
nematodos entomopatógenos, es su especificidad contra un amplio rango de hospederos. La mayoría de los Ordenes de insectos, son susceptibles de ser infectados bajo condiciones experimentales, aún recientemente, se reporta su parasitismo en el campo o que son severamente dañinas en el laboratorio. Este control se ha extendido a diferentes estadios metamórficos de diferentes categorías taxonómicas y tróficas, particularmente en insectos plaga del suelo y de hábitat crípticos.
El interés intenso en los steinernematidos y heterorhabditidos, es un reflejo de su impresionante potencial para el control biológico. Significativamente, debido a la bacteria asociada que mata rápidamente a los hospederos, los nematodos no están adaptados al ciclo de vida del hospedero específico y son capaces de parasitar cientos de insectos plagas, este espectro de actividad, es más característico de un insecticida químico que de un biológico (Gaugler, 1988). Al respecto, Forschler et al. (1990) afirman que el mayor factor que determina la susceptibilidad, es la capacidad de los nematodos para penetrar a los insectos. Generalmente, la mayoría de estos hospederos susceptibles son aquellos más fácilmente penetrados por los nematodos (Georgis y Manweiler, 1994).
De este modo, el complejo nematodo-bacteria altamente adaptado, mata súbitamente a los insectos, así como aquellos nematodos que no realizan formas íntimas, relaciones características de hospederos-parásitos y otras asociaciones insecto-nematodo, por ejemplo, los mermítidos. Esta mortalidad rápida permite a los nematodos explorar un rango de hospederos que alcanzan aproximadamente a todos los Ordenes de insectos; un buen espectro de actividad más allá que de cualquier otro agente de control microbiano. Sin embargo, los nematodos poseen una especificidad estrecha o amplia, según se tengan en cuenta los datos provenientes de parasitismo natural o en condiciones de laboratorio, respectivamente. En efecto, pocos son los registros referidos al parasitismo en condiciones naturales; los insectos descubiertos parasitados naturalmente, pertenecen principalmente a coleópteros y lepidópteros que en algún momento de su ciclo de vida deben permanecer en el suelo. El éxito de los nematodos en campo es limitado por la sensibilidad a los factores intrínsecos (genéticos, fisiológicos y el comportamiento característico de los juveniles infectivos) y los factores extrínsecos, como los abióticos y bióticos que afectan la supervivencia de los nematodos
(Curran, 1993a). Entre los factores abióticos que perjudican su persistencia, se encuentran principalmente la humedad y textura del suelo, temperaturas extremas, luz ultravioleta y salinidad (Kaya, 1990; Smits, 1996; Thurston et al., 1994). Mientras que los factores bióticos que pueden destruir un número significativo de nematodos, restringir su uso como agentes de control biológico y afectar adversamente la supervivencia de ellos y su bacteria simbiótica, incluyen la antibiosis, competencia y enemigos naturales (depredadores, parásitos y patógenos) (Ishibashi y Kondo, 1986; Kaya, 1990; Kaya y Thurston, 1993).
Por otro lado, la efectividad del rango de hospederos en el campo es limitada, debido al bajo número de nematodos que buscan el hospedero (Smits, 1996) y por mecanismos de defensa efectivos de los insectos hospederos potenciales (Akhurst y Dunphy, 1993; Simöes y Rosa, 1996). La respuesta defensiva de los insectos, mediante la prevención de la infección, por la vía pasiva de barreras estructurales para la penetración del hemocele (Dunn, 1986). También existen barreras fisiológicas igualmente condicionantes, entre las que destacan la encapsulación de las larvas infectantes y las respuestas humorales contra las bacterias endosimbióntes que portan los nematodos (Dunphy y Thurston, 1990).
Gaugler (1988) señala que en la naturaleza, el rango de hospederos puede ser restringido por las barreras ecológicas y de comportamiento que existen para la infección. Evidencia considerable indica que el rango de hospederos de los nematodos en los sistemas naturales es menor y por consiguiente, infectan menos especies (Poinar, 1989; Kaya y Gaugler, 1993) debido a su corta persistencia (Curran, 1993b). Donde la inactivación es más sensible en heterorhabditidos, que impide su utilización como bioinsecticidas a su máxima ventaja bajo estas condiciones (Bedding, 1981). No obstante, el rango de hospederos (que es dependiente en la favorable penetración por los nematodos en los diferentes insectos) limita las posibilidades de reunirse en cada uno de los hábitat (por ejemplo, los insectos consumidores de hojas no pueden ser realmente atacados en la naturaleza) y por la densidad de poblaciones naturales de los nematodos (Peters, 1996). Entre los muchos hospederos favorables como larvas agregadas que dispausan o ivernan, representan grandes concentraciones de hospederos adecuados para el parasitismo y la reproducción rápida de los nematodos. Las agregaciones naturales de los insectos puede proporcionar importante
conocimiento sobre la distribución de los nematodos, su existencia en los hábitat, así como, en el impacto en la variación de la abundancia de los hospederos (Mrácek y Sthurhan, 2000).
Agüera y Laumond (1993) sugieren que sí se consideran las estrategias de aplicación y el conocimiento preciso de la etología de los insectos, destacan los resultados obtenidos en el control de insectos del suelo y el ámbito natural de acción de los juveniles infectivos. Donde cualquier insecto hospedero podría ser controlado en el propio cultivo en el que causan daño, a condición de que no existan barreras ecológicas y de comportamiento que limite su especifícidad. Al respecto, Bedding et al. (1983) consideran que el potencial actual para su uso en una variedad de plagas de cultivos es grande, porque diversos aislamientos muestran diferencias en la supervivencia e infectividad en plagas particulares, con promedio más favorables en algunos para utilizarse en programas de control biológico.
Sin embargo, los registros de infecciones naturales del número total de especies de Steinernema y Heterorhabditis reconocidas, se carece de información al menos de la mitad de ellas (Peters, 1996). Excepto para S. carpocapsae y S. feltiae ampliamente distribuidas la mayoría de las especies parecen tener un rango de hospederos restringido, infectando a pocas especies de insectos de dos Ordenes. Por ejemplo, solamente ha sido encontrado infectando larvas de escarabajos, mientras que en S. rara únicamente se ha observado en especies de Heliothis (Peters, 1996). En cambio, el rango de hospederos naturales de S. carpocapsae es amplio y frecuentemente cubre a cuatro Órdenes de insectos (Coleoptera, Hymenoptera, Diptera y Lepidoptera) y 10 familias, sin embargo, los escarabajos no son considerados en formar una parte significativa de su rango de hospederos. Igualmente S. feltiae se ha encontrado infectando a Coleoptera (Scarabaeidae, Curculionidae) y Lepidoptera, principalmente Noctuidae. En cambio S. glaseri únicamente se ha detectado en larvas de escarabajos. Mientras que H. bacteriophora se ha descubierto en asociación con Lepidoptera (Noctuidae) y Coleoptera (Scarabaeidae, Crysomelidae y Curculionidae). En tanto que H. megidis solamente ha sido aislado en Scarabaeidae y Curculionidae (Peters, 1996). Diversos experimentos en laboratorio y campo han demostrado que los heterorhabditidos son mejores para controlar larvas de escabajos que S. carpocapsae (Klein, 1990; 1993). Entre estos, S.
carpocapsae, S. feltiae y H. bacteriophora son apreciados como generalistas lo que refleja su amplia distribución global (Peters, 1996).
Por el contrario, bajo condiciones de laboratorio el número de insectos susceptibles de ser parasitados parecen ilimitados (Poinar, 1990; Laumond et al., 1979), en éstas condiciones son capaces de invadir y en muchos casos de matar un gran número de especies de insectos, puesto que se asegura el contacto del hospedero, las condiciones ambientales son óptimas y no existe ninguna barrera ecológica o de comportamiento a la infección (Gaugler, 1981; 1988). Las evaluaciones de S. carpocapsae han reportado que infecta a más de 250 especies de insectos (Poinar, 1979; 1990) pertenecientes aproximadamente de 75 familias que se extiende a casi 11 Ordenes de insectos: Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera, Homoptera, Isoptera, Saltatoria y Odonata, entre otros (Poinar, 1979; Peters, 1996); que pueden atacar a los estadios biológicos de larva, pupa e insectos adultos (Kaya, 1981), con una alta densidad de nematodos y sin posible escape de los hospederos (Poinar, 1986). Aunque una variedad de entomopatógenos que predominantemente infectan insectos larvas, también son observados normalmente en insectos adultos, tal es el caso de los steinernematidos (Lacey et al., 1993).
También destacan los resultados obtenidos por algunas especies de Steinernema para el control de poblaciones de lepidópteros barrenadores en hábitat crípticos (Bergley, 1990); moscas minadoras Liriomyza trifolii en plantas ornamentales de invernadero (LeBeck et al., 1993); moscas caseras Musca domestica en estiércol de gallineros (Belton et al. 1987) y en otras unidades intensivas de animales (Renn, 1998) y aquellas que parasitan únicamente grillos, termitas y otros orthópteros específicos (Nguyen y Smart, 1990; 1992; 1994). Por otro lado, epizootias naturales ocasionadas por nematodos entomopatógenos son raras, las cuales no han sido reportadas por miembros del gé nero Steinernema, parece ser que desarrollan una asociación relativamente balanceada con sus hospederos naturales (Peters, 1996). En cambio, para Heterorhabditis únicamente existen dos registros de epizootias y estas fueron limitadas en campos de menos de seis hectáreas, con una densidad alta de hospederos (Akhurst et al., 1992; Peters, 1996), mismas que fueron descubiertas en el picudo de las franjas blancas Graphognathus leucoloma (Sexton y Williams, 1981) y sobre larvas de escarabajos de la caña de azúcar (Akhurst et al., 1992).
Este extraordinario rango de hospederos, es una de las principales razones, por el intenso interés en el desarrollo de nematodos para el control biológico de plagas (Kaya y Gaugler, 1993). Evidentemente, diversas compañías han exp lorado el control biológico potencial de los nematodos entomopatógenos, cuya comercialización ocurrió en 1983 con la formación de Biosys enfocada en la eficiencia para su producción tecnológica in vitro (Friedman, 1990). Subsecuentemente, ha continuado su producción en el mercado contra una diversidad de plagas de frutales (manzano y durazno), en pastizales (grillo topo), champiñones (moscas sciaridas) y muchas otras plagas agrícolas y ornamentales (Gaugler et al., 2000).
2.4 Taxonomía de los nematodos entomopatógenos
Los nematodos entomopatógenos forman parte de la diversidad de formas de vida que habitan el planeta. Debido al extenso y complejo grupo que lo conforman, la clasificación taxonómica provee una sistematización para su estudio y organización, lo que permite ubicarlos jerárquicamente en grupos taxonómicos con base a sus relaciones morfológicas, biológicas y filogenéticas, de acuerdo a los principios, reglas y procedimientos del Código Internacional de Nomenclatura Zoológica.
Hominick et al. (1997) señalan con claridad la posición correcta de los diversos nombres propuestos y los establecidos por las autoridades en las especies de Steinernema, Neosteinernema y Heterorhabditis acordados por el Código Internacional de Nomenclatura Zoológica. La no menclatura y clasificación de los nematodos entomopatógenos Steinernema Travasos, 1927, Neosteinernema Nguyen y Smart, 1994 y Heterorhabditis Poinar, 1976 (Nematoda: Rhabditida: Rhabditoidea) es la siguiente: la familia Steinernematidae Chitwood y Chitwood, 1937 comprende a dos géneros, Steinernema Travasos, 1927 con un total de 22 especies y Neosteinernema Nguyen y Smart, 1994, con una sola especie. Mientras que la familia Heterorhabditidae Poinar, 1976 contiene un solo género Heterorhabditis con ocho especies (Poinar, 1990; Hominick et al., 1997). Las especies descritas y reconocidas para ambos géneros se muestran en los Cuadros 1 y 2, respectivamente.
Cuadro 1 Especies descritas y reconocidas para el género Steinernema
Especie Hospedero/Hábitat1 Localidad/País Autoridades
S. kraussei* S. glaseri S. feltiae S. affinis S. carpocapsae S. anomali S. intermedia S. rara S. kushidai S. ritteri S. scapterisci S. caudatum S. neocurtillae S. longicaudum S. riobrave S. puertoricensis S. cubanum S. bicornutum S. oregonense S. monticolum S. ceratophorum S. karii S. abbasi S. siamkayai S. loci S. thanhi S. sangi Cephalia habietis Popilia japonica Bibio spp. Bibio spp. Cydia pomonella Phyllophaga sp. Suelo Suelo Anomala cuprea Suelo Scapteriscus vicinus Suelo Neocultilla hexadactyla Suelo Helicoverpa zea Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Westphalia, Alemania New Jersey, EE.UU. Dinamarca
Skive, Dinamarca República Checa Ryazan, Rusia Central Carolina Norte, EE.UU. Córdoba, Argentina
Hamakita, Shizuoka, Japón Córdoba, Argentina Uruguay Japón y China Florida, EE.UU. China Texas, EE.UU. Puerto Rico Cuba Vojvodina, Yugoslavia Oregon, EE.UU. Gyeongnam, Korea Liaoning y Jining, China Provincia Central, Kenia Sultanato de Oman Lohmsak, Tailandia Hatinh, Vietnam Thanhhoa, Vietnam Thanhhoa, Vietnam Steiner (1923) Steiner (1929) Filipjev (1934) Bovien (1937) Weiser (1955) Kozodoi (1984) Poinar (1985) Doucet (1986) Mamiya (1988) Doucet y Doucet (1990) Nguyen y Smart (1990) Xu et al. (1991) Nguyen y Smart (1992) Shen y Wang (1992) Cabanillas et al. (1994) Román y Figueroa (1994b) Mrácek et al. (1994) Tallosi et al. (1995) Liu y Berry (1996) Stock et al. (1997) Jian et al. (1997) Waturu et al. (1997) Elawad et al. (1997) Stock et al. (1998) Phan et al. (2001a) Phan et al. (2001a) Phan et al. (2001b)
1 Especies aisladas del suelo usando larvas de Galleria mellonella (Bedding y Akhurst, 1975).
* Especie tipo del género Steinernema
En tanto que el género Neosteinernema Nguyen y Smart, 1994 ubicado en la familia Steinernematidae, contiene una sola especie tipo, N. longicurvicauda Nguyen y Smart, 1994 recuperada de la termita Reticulitermes flavipes en Florida, EE.UU. Sin embargo, difiere morfológica y biológicamente del género Steinernema.
En cambio, existen algunas cepas o aislamientos tanto de steinernematidos como de heterorhabditidos que se encuentran aún sin describir o no han sido asignadas a especies conocidas (Kaya y Gaugler, 1993).
Cuadro 2 Especies descritas y reconocidas para el género Heterorhabditis
Especie Hospedero/Hábitat1 Localidad/País Autoridades
H. bacteriophora* H. megidis H. zealandica H. indica H. brevicaudis H. hawaiiensis H. argentinensis H. marelatus Heliothis punctigera Popillia japonica Scarabaeidae Scirpophaga excerptalis Suelo Suelo Suelo Suelo
Brecon, Sur de Australia Jeromesville, Ohio, EE.UU. Auckland, Nueva Zelanda Coimbatore, India
China
Islas Hawaii, EE.UU. Rafaela, Argentina Oregon, EE.UU. Poinar (1975) Poinar et al. (1987) Poinar (1990) Poinar et al. (1992) Liu (1994) Gardner et al. (1994) Stock (1995) Liu y Berry (1996) 1
Especies aisladas del suelo usando larvas de Galleria mellonella (Bedding y Akhurst, 1975). * Especie tipo del género Heterorhabditis
Los nombres propuestos para muchos gr upos de estos nematodos parásitos de insectos, especialmente de steinernematidos, han sido propuestos en consideración a pioneros que contribuyeron en el desarrollo de la Nematología de Insectos y su Sistemática. Por ejemplo, la familia Steinernematidae y el género Steinernema fueron designadas en honor a Gotthold Steiner (1886-1961) considerado el “padre de los Nematodos Entomopatógenos” en América. De igual forma S. glaseri en reconocimiento a Rudolf W. Glaser (Poinar, 1990). Así como S. siamkayai Stock et al. (1998) en honor del Dr. Harry K. Kaya. Asimismo, el nombre de algunas especies se ha designado por el insecto hospedero del que se colectó, por ejemplo: S. scapterisci Nguyen y Smart (1990) y S. neocurtillae Nguyen y Smart (1992) de grillos topos Scapteriscus vicinus y Neocurtilla hexadactyla, respectivamente; Neosteinernema longicurvicauda Nguyen y Smart (1994) de la termita Reticulitermes flavipes, y H. hepialus Stock et al. (1996) de larvas de la palomilla fantasma Hepialus californicus. También por el país o ciudad donde se han localizado, por ejemplo, H. zealandica Poinar (1990), H. indica Poinar et al. (1992), H. argentinensis Stock (1993), H. hawaiiensis Gardner et al. (1994), S. puertoricensis Román y Figueroa (1994), S. cubanum Mrácek et al. (1994) y S. oregonense Liu y Berry (1996).
En cambio, otras especies se han nombrado de acuerdo a la presencia de un carácter morfológico en particular, tal es el caso de N. longicurvicauda Nguyen y Smart (1994), S. bicornutum Tallosi et al. (1995), H. brevicaudis Liu (1994), S. ceratophorum Jian et al. (1997). Incluso por el hábitat particular donde se han aislado, por ejemplo, S. riobrave
Cabanillas et al. (1994), H. marelatus Liu y Berry (1996). Finalmente, S. karii Waturu et al. (1997) nombre asignado después, en honor al Instituto de Investigaciones Agrícolas de Kenia. Del mismo modo, diversas especies de nematodos han sido referidas generalmente como cepas o aislamiento. Por ejemplo, muchas cepas de Steinernema carpocapsae después han sido designadas individualmente (All, Hamm, Breton, Pye); también a los países donde se han aislado (Mexicana, Argentina, Italiana); por los insectos hospederos (Agriotos, Rhagoletis) o por códigos (DD-136, HP 88, P7) (Poinar, 1990; Kaya y Gaugler, 1993).
2.5 Identificacion de los nematodos entomopatógenos
La identificación de nuevas especies y cepas de nematodos entomopatógenos, representa una mayor diversidad genética. Existen diversos métodos que facilitan y permiten la determinación de steinernematidos y heterorhabditidos, entre las que destacan principalmente las claves taxonómicas basadas en caracteres morfológicos. Aunque, debido a la considerable variación de la morfología entre espécimenes del mismo género o especie y la dificultad para observar carácteres taxonómicos de ciertos nematodos, el análisis morfométrico, también es utilizado. Para observaciones más detalladas de ciertos carácteres, comúnmente a través de microscopía electrónica se obtienen microfotografias de estructuras específicas. La técnica de cruzamiento-cría es realizada principalmente para nematodos heterorhabditidos. Así como diversas técnicas moleculares que han contribuido a la identificación exacta.
2.5.1 Identificación morfológica y morfométrica
Sosa et al.(1998) señalan que un estudio cualitativo y cuantitativo de caracteres que definen a un organismo se denomina caracterización, que puede ser realizada por la identificación de caracteres morfológicos, fisiológicos, de comportamiento y genéticos. La cual es de gran valor en los estudios de epizootiología y de distribución espacio-temporal, que permiten evaluar su capacidad de recombinación. También posibilita un reconocimiento de los aislados más adaptados a una localidad específica y facilita un entendimiento de las relaciones patógeno-hospedero a través de informaciones relacionadas a la variación de la estructura
poblacional. Estos aspectos son importantes cuando se pretende introducir o establecer un patógeno para un control permanente de una plaga o cuando se quiere evaluar el impacto amb iental resultante de la aplicación de un organismo.
Hirschmann (1985) menciona que los caracteres taxonómicos tienen una doble función: a) en microtaxonomía (identificación) tienen un aspecto del diagnóstico como indicadores de categorías al nivel de especie o más inferiores, y b) en macrotaxonomía (clasificación), como indicadores de las relaciones que ayudan en la correcta delimitación y clasificación jerárquica de taxas superiores. El uso de datos cuantitativos (medidas y conteos de caracteres), a menudo son importantes porque especies relacionadas no difieren por la presencia o ausencia de una estructura, pero sí más bien, por el tamaño, proporciones o número, son estandarizadas y exactas. Los estudios morfológicos detallados son esenciales para identificar bajo un procedimiento estándar la separación de especies (Poinar et al., 1972). Tales estudios deberán establecer la identidad de las especies y ayudar entre las comparaciones coespecíficas individuales. El descubrimiento y producción de una línea específica o tipo que es particularmente virulenta para ciertas plagas, deberán ser apremiantes. El estado taxonómico de las especies de nematodos, es enfocado más allá por la existencia de cepas, las cuales muestran rasgos morfológicos o de comportamiento que aparentemente segregan tales cepas de la serie del tipo específico (Simser, 1986).
Durante los últimos años, el número de nuevos aislamientos se ha incrementado enormemente (Glazer et al., 1991; Amarashinge et al., 1994; Liu y Berry, 1995). Los métodos morfológicos clásicos han sido aplicados sucesivamente para la descripción, identificación y clasificación de nematodos entomopatógenos para género y especie. La identificación correcta es esencial para que otros trabajos puedan ser replicados y comparados significativamente (Curran, 1990). Al respecto, Poinar (1990) sugiere algunos caracteres morfológicos y las proporciones para medir juveniles de estadios infectivos de especies de Heterorhabditis. Asimismo, Nguyen y Smart (1997) recomiendan la siguiente simbología común y abreviaciones usadas, en la morfometría de juveniles infectivos de 1ª y 2ª generación de Steinernema y Heterorhabditis: L = Longitud total del cuerpo; W = Anchura mayor del cuerpo; EP = distancia de la cabeza al poro excretor; NR = distancia de la cabeza al anillo
nervioso; ES = distancia de la cabeza a la base del esófago; T = distancia del ano a la punta de la cola; a = Longitud total del cuerpo/anchura mayor del cuerpo; b = Longitud total del cuerpo/distancia de la cabeza al esófago; c = Longitud total del cuerpo /longitud de la cola; D% = distancia de la cabeza al poro excretor/distancia de la cabeza a la base del esófago X 100; E% = distancia de la cabeza al poro excretor/longitud de la cola X 100.
Por otro lado, existen diversas claves taxonómicas basadas en juveniles infectivos de tercer estadio para especies de Steinernema (de Doucet y Doucet, 1990) y para juveniles infectivos y machos de especies de Steinernema y Heterorhabditis (Nguyen y Smart, 1996; Stock y Kaya, 1996). Especies sin describir han sido identificadas en la literatura (Smits et al. 1991; Dix et al., 1992) otras probablemente permanecen sin ser descritas e identificadas y se requieren estudios taxonómicos más detallados (Stuart y Gaugler, 1994). Wright (1990) y Joyce et al. (1994) afirman que es difícil encontrar un buen diagnóstico de caracteres morfológicos para la identificación de especies. Sin embargo, los estudios morfológicos deben continuar por formar el centro esencial de la taxonomía de los nematodos entomopatógenos (Curran, 1990). La identificación correcta de los nematodos deberá ser una prioridad en futuros trabajos, para prevenir la duplicación innecesaria de investigaciones (Hominick, 1990).
Hominick et al. (1997) reportan que en un taller donde participaron aproximadamente 40 especialistas europeos de 17 países y dos de América, el grupo de trabajo sobre aislamientos e identificación de nematodos entomopatógenos, proporcionaron detalles precisos de los métodos usados para obtener especímenes para descripciones taxonómicas. En donde, se recomendó que los métodos y protocolos detallados serán adoptados para las descripciones taxonómicas de steinernematidos y heterorhabditidos, como una línea base para la taxonomía en futuros trabajos. Esta incluye observaciones sobre disección de insectos hospederos; preparación de nematodos para su examinación en microscopio de luz y electrónico, resguardo y disposición de los especímenes tipos; la valoración de los caracteres taxonómicos de adultos y juveniles para estudios morfológicos y morfométricos usados, claves para las especies, así como diversas técnicas moleculares.
2.6 Biología de los nematodos entomopatógenos
Los nemátodos entomopatógenos son usados exitosamente contra una variedad de insectos plaga, pero los resultados contra ciertos insectos son muy diferentes. Esta variabilidad enfatiza la necesidad de obtener más información sobre los aspectos fisiológicos, genéticos, etológicos y ecológicos, que influyen en su eficacia, así como las interacciones que ejercen en la biología de los nematodos.
2.6.1 Comportamiento de los nematodos
La capacidad para encontrar y atacar hospederos susceptibles, es la clave precisa para determinar la actividad bioinsecticida de los nematodos entomopatógenos y probablemente, es la principal fuente de inconsistencia de los resultados en campo.
2.6.1.1 Búsqueda de los hospederos susceptibles
El comportamiento de búsqueda es la medida por la cual los animales localizan y adquieren los recursos necesarios para crecer, desarrollarse, mantenerse y reproducirse. Para los nematodos entomopatógenos de la familia Steinernematidae, donde todos los recursos se obtienen de un solo hospedero, el éxito para localizar un hospedero es de gran importancia (Lewis et al., 1993). La caracterización de especies/cepas de nematodos y su hábitat correspondiente en las zonas de actividad de los insectos objetivos, deberá ser el proposito para realizar la eficiencia incrementada (Gaugler, 1988).
Algunas especies, incluyendo S. glaseri y heterorhabditidos particularmente Heterorhabditis del grupo NW Europeo (Smits et al., 1991), migran activamente a través del suelo. Otras, tales como S. carpocapsae, migran menos y pueden zigzaguear sobre superficies sólidas cuando la humedad relativa es alta, esto es una conducta a través de diversos pasos guiados para la infección de un hospedero (Ishibashi et al., 1994). Comportamiento que ha sido estudiado en un período de tiempo, con los juveniles infectivos aplicados al suelo, antes de que emerjan directamente del cadáver dentro o fuera del suelo, lo que ha sugerido que ellos reflejan dos diferentes tipos de estrategias (Downes y Griffin, 1996). Estas estrategias
hallazgo- hospedero han sido denominadas navegadores-cazadores (aquellos que se mueven alrededor para hallar a los hospederos) y emboscadores (aquellos que esperan los hospederos que vienen a ellos) (Lewis et al., 1992). Al respecto, Cui et al. (1993) mencionan que los juveniles de S. glaseri y H. bacteriophora, son navegadores altamente móviles que buscan activa mente los hospederos y son más eficaces contra presas subterráneas sedentarias (Gaugler et al., 1989; Timper et al., 1991). En contraste, los juveniles de S. carpocapsae parecen tener una estrategia emboscadora (posarse y esperar) y son más efectivos contra presas móviles que habitan la superficie (Kaya y Gaugler, 1993). Sin embargo, estas especies acechadoras tendrán más dificultad en localizar los hospederos, principalmente a los sedentarios, tales como los gusanos blancos (Lewis et al., 1992, 1993). Mientras que S. feltiae y Steinernema sp. son intermedios en la búsqueda continua de compartir algunas características de búsqueda de navegadores y emboscadores (Grewal et al., 1994).
Georgis y Poinar (1983) señalan que las observaciones apoyadas por estudios avanzados, muestran que los infectivos tienen una tendencia para permanecer en el sitio de aplicación, aunque el insecto hospedero esté presente. Ishibashi y Kondo (1986b) mencionan que los juveniles de S. carpocapsae se vuelven inactivos en el suelo en ausencia del hospedero y se presume que esto, es una estrategia para conservar energía.
Grewal et al. (1994) consignan que las estrategias de búsqueda de cada especie de nematodo entomopatógenos, se predice de su respuesta a las señales volátiles del hospedero y del comportamiento de dispersión. Frecuentemente, parecen seguir vías favorables a través del suelo. Viajan menos a través de los espacios de poro pequeño (Molyneux y Bedding, 1984), una situación en la cual, probablemente las raíces de las plantas forman vías importantes. Para emigrar son agudamente sensibles en respuesta directa a la liberación de dióxido de carbono del hospedero (Gaugler et al., 1980; Gaugler y Campbell, 1988) y gradientes térmicos (Burman y Pye, 1980), también son atraídos por materiales de sus hospederos o heces fecales y la bacteria simbiótica y pueden ser activados por estrés térmico, mecánico y por ciertos químicos como el ácido úrico, xantina, alantoina, amonia y arginina (Schmidt y All, 1978; Kondo y Ishibashi, 1986; Gaugler y Campbell, 1991).
2.6.1.2 Penetración a los hospederos
Algunos autores enfatizan la importancia de la penetración en la susceptibilidad del insecto al nematodo, considerada como un factor clave en el proceso patogéno (Ishibashi y Kondo, 1990). Esta capacidad, unida con la existencia natural de estos nematodos en todos los suelos, sugiere que es una presión considerable de selección para los insectos del suelo, en desarrollar estrategias para evitar el parasitismo. Entonces, la tendencia de muchos insectos en el suelo, es la quiescencia, especialmente en las pupas, para liberar dióxido de carbono en tasas que continuamente rompen, con el período de emergencia de hasta 7 horas (Chapman, 1982) y puede ser en parte una respuesta coevolucionaria para escapar de la detección y además evitar el parasitismo del nematodo (Gaugler, 1988). Sin embargo, durante el período de emergencia los espiráculos están estrechamente cerrados, evitando el acceso del nematodo. Otros insectos se mueven casi constantemente a través del suelo, incrementando la dificultad de orientación a los hospederos potenciales. Los insectos estacionarios deberán ser objetivos fáciles, pero muchas especies de escarabajos consumidores de raíces, construyen las celdas pupales de partículas de suelo densamente apretadas que pueden presentar una formidable barrera física para la infección (Gaugler, 1988).
La señal del hospedero específico es necesaria para inducir el proceso de penetración. Si los nematodos no pueden reconocer el insecto como un hospedero potencial, resultará una baja en la actividad de la penetración (Simöes y Rosa, 1996). Poinar (1979) señala que los nematodos entomopatógenos para encontrar a los hospederos y vencer el sistema ínmune, a igual que muchos otros parásitos y patógenos, penetran varias barreras físicas para entrar al hemocele y causar la infección. Los juveniles infectivos usan como rutas las aberturas bucales y anales de los insectos, para entrar antes de penetrar a través de la pared del intestino. Triggiani y Poinar (1976) manifiestan que los JIs de S. carpocapsae penetran al insecto a través de los espiráculos, boca y ano. Los espiráculos son una ruta alternativa de entrada, en las cuales los nematodos penetran a través de la pared traqueal (Georgis y Hague, 1981; Nguyen y Smart, 1990).
Bedding y Molyneux (1982) reportan que los juveniles infectivos (la L2) de
Heterorhabditis al eclosionar, se desprenden de la cutícula ante la presencia de un insecto hospedero y muestran un diente largo, anterior y terminal, el cual es usado para facilitar la ruptura de las membranas intersegmentarias, al raspar y romper la cutícula de sus hospederos. Estos pueden ser capaces de entrar fácilmente en algunos insectos que son menos vulnerables a especies de Neoaplectana, los cuales no tie nen un diente terminal. También, Mrácek et al. (1988) confirman que la boca, ano y espíraculos son los sitios de entrada, a través de los cuales las larvas infectivas entran a sus hospederos. Nguyen y Smart (1991) afirman que los sitios de penetración de S. scapterisci en los grillos topo, se realiza por la boca y los espiráculos, pero probablemente no por el ano y se desarrollan primero en la cabeza y el tórax.
2.6.2 Ciclo de vida de los nematodos
El ciclo de vida de los nematodos entomopatógenos es similar, aunque el esquema entre las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae varía un poco. En general comprende seis estadios, el huevo, cuatro estadios larvales y los adultos. Existen diferencias complejas debido a que en steinernematidos incluyen dos ciclos amfimícticos separados del hospedero, mientras que en heterorhabditidos su ciclo es heterogónico, con hembras hermafroditas en el primero. El conocimiento de este patogenicidad.ciclo es de vital importancia, ya que está estrechamente relacionado con la
Los juveniles infectivos o larvas dauer son comúnes entre las especies de parásitos (de animales y plantas) y de vida libre (Bird y Bird, 1991) y son una adaptación común para el estrés ambiental entre diversas familias de nematodos rhabditidos (Evans y Womersley, 1980; Womersley, 1990), los cuales no se alimentan debido a su tracto digestivo colapsado y la boca y ano cerrados, posiblemente para limitar la pérdida de agua o el acceso de patógenos (Poinar, 1990). Una vez que los juveniles infectivos de tercer estadio de Steinernema y Heterorhabditis inician el ciclo de vida, son los responsables para localizar e invadir las larvas de una variedad de insectos hospederos favorables (Grewal y Georgis 1999). Todos los otros estadios de los nematodos existen solamente dentro del insecto. Mientras que estos existen únicamente en el suelo, los cuales suspenden su desarrollo, morfología y fisiología y están
