VII.-Capítulo 2
Métodos para el estudio de la
expresión de genes
Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G. 1 Introducción
La capacidad de secuenciar genomas com-pletos desarrollada en la última década ha impulsado a la investigación científica en la dirección de definir la función de cada uno de los genes identificados. Para contribuir con ese objetivo se han diseñado técnicas que permiten estudiar la expresión génica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo, posibili-tando la identificación inicial y el agrupamien-to en clases funcionales de secuencias nue-vas con una actividad asociada.
Los procedimientos para esta evaluación han progresado desde los métodos desarro-llados para el análisis de genes únicos especí-ficos (como el Northern slot y dot blotting, la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de protección de nucleasas) hacia otros enfocados en la identificación de múl-tiples transcriptos que difieren en su repre-sentación entre las diversas muestras experi-mentales (como la hibridación substractiva, el display diferencial, el ADNc-AFLP®, la
secuenciación de etiquetas expresadas o EST, el análisis serial de la expresión de genes o SAGE y la hibridación de microarreglos). La organización de las secuencias dentro de gru-pos funcionales basada en los datos de ex-presión y de homología proporciona un mar-co básimar-co para mar-conducir nuevos estudios diri-gidos a definir la actividad precisa de cada producto génico.
2 Hibridación substractiva
Los métodos de hibridación substractiva fueron creados a principios de la década que comenzó en 1980 con el propósito de cons-truir bibliotecas de ADNc para obtener son-das de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de ma-nera amplia con el propósito de identificar genes regulados positiva o negativamente en
una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de función relacio-nada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de técnicas comunes de biología molecular que no requie-ren equipos especializados de detección y análisis.
El procedimiento general consiste en la hibridación de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). Los transcriptos expresados en am-bas muestras (tester y driver) forman molé-culas de ARNm/ADNc híbridas, mientras que las secuencias de ADNc que están presentes únicamente en la muestra tester permane-cen como hebras simples. Las moléculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografía en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden enton-ces ser recuperados y clonados o usados di-rectamente como sondas para analizar una biblioteca.
Dos limitaciones importantes del proto-colo original son: i) el requerimiento de gran-des cantidagran-des de ARNm y ii) la tendencia a una menor eficiencia en la identificación de transcriptos poco abundantes.
La hibridación substractiva es aplicable sólo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tan-to aumentan-tos como disminuciones en los ni-veles de expresión. Además no genera una medida cuantitativa y aunque es eficiente en la identificación de genes que están comple-tamente ausentes en el driver no revela fácil-mente a aquellos que están presentes en ambas muestras en distinta proporción.
A fin de mejorar el protocolo original se realizaron modificaciones que incluyen la pro-ducción de ADNc con marcas de biotina u oligo(dT)30-látex de manera de refinar la se-paración de las moléculas de cadena simple y doble. También se incorporó la amplifica-ción de ADNc selectos por PCR para dismi-nuir la cantidad inicial de mARN requerido y aumentar la eficiencia de clonado de los transcriptos seleccionados. En la actualidad se utiliza más comúnmente un protocolo in-genioso conocido como hibridación substractiva de supresión (SSH) que fue
transcriptos raros expresados diferencial-mente. Este incluye una normalización en la representación de los transcriptos diferencia-les basada en la inhibición de la amplificación de aquellos que son más abundantes, elimi-nando también la necesidad de separar mo-léculas de cadena doble y simple (Fig.1).
3 Display diferencial y RAP-PCR
Las técnicas conocidas en general como «huellas digitales genéticas de ARN» (ARN fingerprinting) incluyen al display diferencial (DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos métodos están basados en una amplificación por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o más muestras.
La primera etapa de ambos procedimientos es común y con-siste en generar ADNc haciendo una transcripción reversa de una fracción de las moléculas de ARNm de una muestra. En el dis-play diferencial esto se logra uti-lizando como cebador de la transcripción reversa a un poliT anclado con una o más bases adi-cionales al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplo (T)12AC). Estos oligonucleótidos se fijan al ARN mensajero a través de la unión de las bases adicionales, impidiendo que el poliT «resba-le» sobre distintas zonas del poli A. El único grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las moléculas que llevan las bases complemen-tarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensaje-ro adyacente al poliA. En con-traste, la RAP-PCR utiliza oligonucleótidos de secuencia ar-bitraria para la transcripción reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias
com-Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridización substractiva de supresión (SSH). El
ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formación de los productos de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de
un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las
hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. El enriquecimiento en las moléculas e se logra durante la amplificación por PCR ya que: i) a y c pueden
unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificación de b está suprimida debido a la
complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formación de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de
unión a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrán de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y además su representación estará normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrán mayores posibilidades de formar moléculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko
plementarias permitiendo formar una hebra de ADNc desde este sitio. En este caso el subgrupo de ARNms que sufre transcripción reversa estará integrado por aquellas molé-culas que presenten la secuencia complemen-taria a la del cebador orientada en el senti-do adecuasenti-do.
Luego de haberse realizado la síntesis de la primer hebra del ADNc, se amplifican seg-mentos de los transcriptos usando pares múl-tiples de cebadores de PCR. Tanto para el display diferencial como para la RAP-PCR, el cebador superior es un oligonucleótido arbi-trario de 10 pares de bases. El cebador infe-rior es el mismo oligonucleótido poliT
anclado (para el caso del display dife-rencial) o el decámero arbitrario (para el caso de RAP-PCR) que se usaron al-ternativamente para hacer la trans-cripción reversa.
Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones parti-culares de pares de cebadores de dis-play diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 cleótidos arbitrarios y 12 oligonu-cleótidos anclados) representan estadísticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la mues-tra.
Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporación de un nucleótido radiactivo o de una molé-cula que pueda ser detectada a tra-vés de su interacción con un anticuer-po conjugado a un sistema de detec-ción (por ejemplo digoxigenina). Tam-bién puede usarse un cebador unido a un fluoróforo u optarse por no mar-car los fragmentos amplificados y usar luego una tinción con nitrato de pla-ta para revelar los geles. La visualiza-ción de los productos de PCR se logra luego de la electroforesis en geles de poliacrilamida seguida de la apropia-da generación y detección de imáge-nes, que son evaluadas comparando la intensidad relativa de las bandas producidas a partir de diferentes muestras experimentales.
Los fragmentos que están presen-tes en una muestra y ausenpresen-tes en la otra o aquellos que están presentes con diferentes intensidades relativas
en los distintos tratamientos experimenta-les representan potenciaexperimenta-les transcriptos de ARNm de expresión diferencial. Típicamen-te, las bandas son evaluadas sólo si amplifi-can en forma consistente en reacciones de PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2).
La fase final del display diferencial consis-te en la identificación de la secuencia del transcripto representado por el producto de PCR y la confirmación de que este realmente se expresa en forma contrastante. Estas eta-pas se logran localizando físicamente y escindiendo la sección del gel de poliacrilamida que contiene al producto de
Figura 2: Representación gráfica del método de display diferencial.
Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando como cebador un oligonucleótido poliT de secuencia 5´T(T)nTXY 3´ (donde 10 Í n Í 12) que se fija en forma estable al extremo 3´de los transcriptos a través de la unión de las bases adicionales de secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del ADNc, ésta se usa como molde para una reacción de PCR que utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decámero de secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decámeros generan numerosos perfiles de amplificación a partir de diversas subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrón de bandas de las muestras experimentales se compara en busca de diferencias de tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las bandas.
interés. En la mayoría de los casos debe rea-lizarse un alineamiento de las imágenes de los fragmentos de amplificación con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tinción con nitrato de plata no es ne-cesario realizar este paso, por lo cual la recu-peración de la banda es mucho más eficien-te. Los productos de PCR son purificados del gel y reamplificados.
Se han utilizado varias estrategias para confirmar la expresión diferencial de los transcriptos, que incluyen el uso de los frag-mentos como sondas de Northern, la siem-bra de los fragmentos en memsiem-branas para someterlos a análisis de Northern inverso y el clonado y secuenciación de los productos para diseñar cebadores específicos que per-mitan realizar PCR semicuantitativas. Inde-pendientemente de cuál sea la táctica usada para confirmar la expresión diferencial, las secuencias de los fragmentos de los genes expresados diferencialmente se requieren siempre para comenzar a entender la fun-ción del gen. El aislamiento de la secuencia completa de los genes involucrados puede lograrse usando los clones diferenciales en estudios de bibliotecas de ADNc o realizan-do experimentos de 5´RACE.
Dos ventajas importantes de los méto-dos de fingerprinting de ARN con respecto a los de hibridización substractiva son la capa-cidad de comparar muestras experimentales múltiples en forma simultánea y la de identi-ficar genes que están regulados tanto positi-va como negatipositi-vamente en una muestra res-pecto de las otras. Sin embargo, los méto-dos de fingerprinting de ARN comparten con el SSH la limitación de que no son cuantitati-vos. Además suelen aparecer numerosos fal-sos positivos, es decir, fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresa-dos pero son artefactos de PCR. Otro pro-blema es que estas técnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mis-mo individuo sometido a distintas condicio-nes o sobre individuos genéticamente idén-ticos (por ejemplo, isolíneas). Cuando se com-paran los perfiles de ARNm de individuos di-ferentes genéticamente, pueden aparecer fal-sos positivos que son resultado de una am-plificación diferencial debida a una variación en la secuencia de los transcriptos más que a
diferencias en su representación. Ese proble-ma puede ser evitado utilizando estrategias de análisis de segregantes en grupo (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN.
Finalmente, la investigación de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de última generación y una inversión extensiva de tiempo y trabajo para detectar y confirmar la expresión diferencial de cada uno de los genes individuales. 4 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP®)
La tecnología de AFLPÒ, generalmente utilizada para producir huellas genéticas de ADN genómico, puede ser aplicada también a preparaciones de ADNc de doble hebra para obtener un perfil del transcriptoma. Los pa-trones obtenidos por esta técnica son una herramienta confiable y eficiente para la iden-tificación de los ARNm expresados diferen-cialmente.
La técnica de ADNc-AFLPÒ detecta frag-mentos de restricción de ADN por medio de amplificación por PCR. Comprende las siguien-tes etapas: i) generación de ADNc, ii) restric-ción del ADNc con dos endonucleasas espe-cíficas, preferiblemente una que reconoce si-tios de 6 bases y otra que reconoce sisi-tios de 4 bases, iii) ligación de adaptadores de cade-na doble a los extremos de los fragmentos de restricción, iv) amplificación de un subgrupo de los fragmentos de restricción usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicio-nales en el extremo 3´ v) electroforesis de los fragmentos de restricción amplificados en geles de poliacrilamida, vi) visualización de las huellas digitales genéticas mediante el uso de autorradiografías, fosfoimágenes y otros métodos (Fig. 3, ver pág.7).
Las mayores ventaja del uso de la tecno-logía de ADNc-AFLPÒ son: i) no se requiere información previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fracción muy grande de todos los genes expresados, iii) es una técnica muy sensible que permite la detección de transcriptos de baja abundancia, iv) los frag-mentos son extraídos fácilmente de los geles
y las secuencias correspondientes pueden de-terminarse sin necesidad de clonados previos. 5 Etiquetas de secuencia expresadas («Expressed sequence tags, EST»)
Los avances tecnológicos que facilitan la secuenciación masiva condujeron a principios de los años 90 a idear el concepto de las bi-bliotecas de etiquetas de secuencia expresa-das (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola re-acción de secuenciación que abarca 300-500 pb del clon. Las diferencias en la expresión de genes pueden ser identificadas conside-rando el número de veces en que aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias EST a menudo se ge-neran a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abun-dancia de clones que corresponden a los di-ferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas últimas pueden ser compa-rados para identificar transcriptos que se ex-presan en una biblioteca y están completa-mente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que des-criban abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no normalizadas. La posibilidad de detectar di-ferencias en la expresión de genes a través de la comparación de la abundancia de se-cuencias en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas ba-ses.
La combinación de la información gene-rada por los EST (nivel y localización espacio/ temporal de la expresión génica) y la de los proyectos de secuenciación de genomas (se-cuencias completas de los genes y sus pro-motores) permite realizar asociaciones de expresión y homología estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la po-sible función de los genes identificados. Por supuesto, esto constituye una instancia ini-cial en la identificación de la función de cada gen. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios particulares en ge-neral dirigidos a bloquear o aumentar su ex-presión por ingeniería genética y a modificar estructuralmente la molécula de manera de
alterar la actividad de los diferentes dominios de la proteína que codifica.
6 Análisis serial de la expresión de genes El análisis serial de la expresión de genes (SAGE) consiste esencialmente en una ver-sión acelerada de la secuenciación de EST. Está basada en el concepto de que una eti-queta corta de unas pocas bases es suficien-te para identificar inequívocamensuficien-te a un transcripto, siempre y cuando esté ubicada en una posición definida dentro de la secuen-cia del mensajero. Una etiqueta SAGE con-siste típicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del último sitio de reco-nocimiento de una endonucleasa específica en el transcripto blanco. Múltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reacción de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver pág.7). Como cada etiqueta SAGE represen-ta un único transcripto de ARNm, es posible obtener una visión general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresión de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE específicas en di-ferentes bibliotecas. Los genes o las secuen-cias EST representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos detec-tando aquellos transcriptos que tengan la eti-queta SAGE en la posición adecuada.
Una limitación del SAGE es la identifica-ción de los genes representados por las se-cuencias de etiquetas. Este proceso está en primer lugar restringido a secuencias que es-tén accesibles en las bases de datos. Sin em-bargo, esta limitación se tornará menos pro-blemática a medida que se generen más se-cuencias EST y que a las sese-cuencias existen-tes se les asignen asociaciones y función. Otra limitación potencial es la identificación erró-nea de las etiquetas. Esto puede resultar de errores de secuenciación y de la identificación fallida de la región que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Además, ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra, dependiendo de cuál sea la enzi-ma específica usada para generar la bibliote-ca de SAGE. Otros ARNm por el contrario
pueden estar representados por múltiples etiquetas SAGE a causa de la existencia de polimorfismos en un sólo nucleótido o el pro-cesamiento alternativo de los transcriptos. Se espera que muchos de esos problemas afec-ten a una porción relativamente pequeña de los genes representados, pero no deberían ser dejados de lado en la interpretación de los resultados.
Por otra parte, dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridación substractiva y el display diferencial es que los datos obteni-dos son cuantitativos y acumulativos. Si se genera la suficiente cantidad de información de secuencia se obtienen perfiles exactos de la expresión de los transcriptos, que descri-ben la abundancia de todos los genes expre-sados en una célula o tejido. Existe una base de datos pública de expresión génica que ha sido creada para el almacenamiento y análi-sis de secuencias de SAGE cuyo poder conti-nuará creciendo a medida que se contribuya con más información. Otra característica de los datos de SAGE es que pueden comple-mentar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de ADNc normalizadas o substraídas. Los EST brindan información de secuencia mientras que el SAGE provee da-tos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos.
Finalmente, a pesar de que el SAGE re-quiere capacidad de secuenciación de última generación, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibi-lita la misma cantidad de secuenciación EST. 7 Hibridación de microarreglos o
micromatrices
La evaluación de la expresión de genes usando la tecnología de micromatrices ha demostrado ser un procedimiento muy efec-tivo para una variedad de aplicaciones. Los tres tipos generales de micromatrices inclu-yen: i) «chips» de oligonucleótidos, construídos realizando la reacción de síntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio, ii) arreglos de cleótidos, construídos depositando oligonu-cleótidos sobre placas de vidrio o membra-nas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obteni-dos depositando insertos amplificaobteni-dos por PCR a partir de una biblioteca sobre placas
de vidrio o membranas de nylon.
Uno de los aspectos más importantes de la experimentación con micromatrices es la selección de los fragmentos de ADN que contendrá. Aún cuando el número de genes representado suele ser grande (3000 a 10000), pueden faltar algunos que sean im-portantes para una cuestión experimental particular. La selección de la biblioteca más adecuada para una aplicación en particular y la elección de los clones son factores críticos que determinan el éxito de estos experimen-tos.
En algunas situaciones, puede ser más efectivo enfocar los experimentos en un gru-po pequeño de genes seleccionados gru-por cri-terios más específicos como, por ejemplo, perfiles de distribución de tejidos, clasificación funcional o cambio de expresión conocidos. Se pueden adquirir clones de fuentes comer-ciales u otras fuentes y/o clonar secuencias específicas usando técnicas estándar de bio-logía molecular.
Después de que los clones han sido selec-cionados deben ser ensamblados y organi-zados para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. Típicamente, el largo de los insertos será mayor a 500 ba-ses, pero esto depende de los clones selec-cionados.
Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o «impresos») en luga-res precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. Los instrumentos usa-dos para la producción de micromatrices han mejorado en los últimos años. Las opciones varían desde la construcción de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema com-pleto.
Independientemente de cuál sea el ori-gen de los clones, es esencial saber con segu-ridad la secuencia de cada sonda que está siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretación exacta de los datos resul-tantes. Por la tanto, puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una por-ción de los fragmentos organizados (Fig. 5, ver pág.8).
El ARNm que representa las muestras experimentales se prepara para la hibridación con las micromatrices de ADNc por transcrip-ción reversa y marcado con nucleótidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o radiactivos ([33P] dCTP). Las moléculas
Figura 4: Procedimiento general para la obtención de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es
transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de restricción ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la mayoría de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algún sector de su secuencia. Los extremos 3´de las
moléculas son recuperados por unión a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuación son digeridas con una segunda enzima de restricción (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero corta al transcripto unos 20 pares de base más abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan,
se ligan y amplifican con dos oligonucleótidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatémeros y se
clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.
Figura 3: Generación de una huella digital de ARN por
la técnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se transcribe en forma reversa utilizando un poliT como cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos enzimas de restricción, una de corte raro y otra de corte frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a ambos extremos y se preamplifican por PCR los fragmentos utilizando cebadores que reconocen la secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que contienen adaptadores diferentes en los extremos son amplificados preferentemente a causa de que en general tienen un tamaño intermedio. Luego se realiza una segunda amplificación utilizando cebadores anclados con una o dos bases adicionales en el extremo 3´que amplifican una subpoblación de fragmentos. El cebador correspondiente al adaptador para la enzima de corte raro está marcado radiactivamente. La combinación de diferentes cebadores anclados genera perfiles provenientes de distintos subgrupos de ARNms.
Figura 5: Expresión de genes controlada a través del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por
PCR se imprimen sobre un soporte sólido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluoróforos y se hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisión de cada fluoróforo. La intensidad de
la señal de hibridización será proporcional al contenido de cada molécula particular de ARN en la muestra. Los patrones de emisión de ambas muestras son comparados para detectar expresión diferencial.
fluorescentes generalmente se usan para marcar sondas con las que se hibridarán pla-cas de vidrio, mientras que las radiactivas se incorporan a sondas que se usarán sobre membranas de nylon. Los fluoróforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emi-sión, por lo tanto dos muestras experimen-tales pueden ser marcadas alternativamen-te con cada uno de ellos, hibridadas juntas en una reacción única competitiva y luego evaluadas en forma separada con un detec-tor de fluorescencia. Por el contrario, las mues-tras radiactivas deben ser hibridadas indivi-dualmente en reacciones seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimágenes.
Independientemente del diseño experi-mental, el análisis de micromatrices se basa en la premisa de que la intensidad de la se-ñal de hibridación resultante para una secuen-cia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa secuencia en la mues-tra original. La expresión relativa de cada se-cuencia representada en el microarreglo es evaluada comparando las señales de intensi-dad de hibridación generadas por las dife-rentes muestras experimentales.
Cada experimento de micromatrices ge-nera una gran cantidad de datos y es crítico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. El análisis de la información obteni-da puede ser dividido en tres componentes: i) identificación y cuantificación de las inten-sidades de hibridación; ii) visualización de los datos; iii) técnicas de agrupamiento.
El primer componente incluye la identifi-cación exacta de los puntos de la imagen, la normalización según el fondo, la cuantifi-cación de las intensidades de hibridación y la salida de los datos en una forma utilizable. La visualización de los datos incluye su clasifi-cación y presentación en una forma lógica y su organización en diferentes formatos para apuntar a la resolución de cuestiones múlti-ples. Finalmente, los algoritmos de agrupa-miento permiten identificar conjuntos de genes con patrones de expresión similar a través de distintas muestras experimentales. En base a la presunción de que la expresión de los genes con funciones relacionadas es-tán regulada en forma coordinada, el agru-pamiento de datos de microarreglos se con-vierte en un método poderoso para asignar
posibles clasificaciones funcionales a genes nuevos.
8 Conclusión
Los métodos descriptos en este capítulo son tecnologías eficaces que expanden los estudios de expresión desde los genes úni-cos hasta el nivel genómico. Ninguno de es-tos procedimienes-tos per se es óptimo para
todas las aplicaciones y la mejor estrategia para situaciones específicas puede ser crear combinaciones de varios de ellos. El continuo refinamiento de las técnicas genómicas y de la bioinformática relacionada proporcionará a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresión de la información hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el control genético de los procesos fi-siológicos.
9 Lecuras Recomendadas
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