Efecto inhibitorio in vitro de la infusión y aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans Puno 2017

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(1)UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE ODONTOLOGIA. “EFECTO INHIBITORIO IN VITRO DE LA INFUSIÓN Y ACEITE ESENCIAL DE Caesalpinia spinosa (TARA) SOBRE LAS CEPAS DE Streptococos mutans PUNO - 2017” TESIS PRESENTADA POR:. DELIA CANO ARAUJO BONET ANTONELA QUISPE EDUARDO PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:. CIRUJANO DENTISTA PUNO – PERÚ. 2017.

(2) UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTI PLANO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE ODONTOLOGIA "EFECTO INHIBITORIO IN VITRO DE LA INFUSIÓN Y ACEITE ESENCIAL DE Caesa/pinia spinosa (TARA) SOBRE LAS CEPAS DE Streptococos mutans PUNO· 2017" TESIS PRESENTADA POR: DELIA CANO ARAUJO BONET ANTONELA QUISPE EDUARDO PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE: CIRUJANO DENTISTA APROBADA POR EL JURADO SUPERVISOR CONFORMADO POR:. PRESIDENTE:. PRIMER MIEMBRO:. SEGUNDO MIEMBRO:. DIRECTOR I ASESOR: M Área : Ciencias de la Salud Tema : Medicina y patología estomatológica FECHA DE SUSTENTACION: 04-12-2017. •.

(3) DEDICATORIA. A Dios por darnos la vida, por darnos la fortaleza, por su infinito amor, por brindarnos la oportunidad de aprender cada día un poco más.. A nuestros padres quienes, con su constante cariño, apoyo y sacrificio, nos ayudaron e a lograr nuestras metas, por motivarnos a seguir creciendo.. A los docentes que nos apoyaron en el transcurso de nuestra carrera profesional.. A nuestros hermanos, por sus consejos, su constante estímulo, compañía y apoyo moral. A todas aquellas personas que conocimos a lo largo de este camino y hoy forman parte de nuestras vidas, gracias por la paciencia y ayuda brindada..

(4) AGRADECIMIENTO. A nuestra alma mater, la Universidad Nacional del Altiplano – Puno por darnos la oportunidad de realizarnos profesionalmente.. A la escuela profesional de Odontología, por habernos brindado los conocimientos teórico-práctico para realizarnos profesionalmente.. A nuestra asesora la Mg. Sonia Caroll Macedo Valdivia, por sus constantes orientaciones, apoyo moral y culminación de la presente investigación.. Y muy especialmente a nuestros padres y hermanos por su aliento y motivación en la ejecución y culminación de la presente investigación..

(5) ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................... vii ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................... viii ÍNDICE DE ACRÓNIMOS ......................................................................................... ix RESUMEN ................................................................................................................. 10 ABSTRACT ............................................................................................................... 11 I.. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 12 1.2. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION ............................................ 14 1.3. FORMULACION DEL PROBLEMA ........................................................... 19 1.4. IMPORTANCIA Y UTILIDAD DEL ESTUDIO.......................................... 19 1.5.. II.. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION ...................................................... 19 REVISION DE LITERATURA .................................................................... 21. 2.1.1.. CARIES DENTAL ................................. 21. 2.1.1.1.. FACTORES ETIOLÓGICOS ......................... 21. 2.1.1.2.. EPIDEMIOLOGÍA DE LA CARIES DENTAL ............. 22. 2.1.2. STREPTOCOCOS MUTANS ............................ 23 2.1.2.1.. ADQUISICIÓN STREPTOCOCOS MUTANS. .............. 23. 2.1.2.2.. FACTORES DE VIRULENCIA ....................... 24. 2.1.3. TARA ( Caesalpinia spinosa ) ....................................................................... 24 2.1.3.1.. Descripción botánica de la Caesalpinia spinosa ............. 24. 2.1.3.2.. Distribución geográfica de la Caesalpinia spinosa. ........... 25. 2.1.3.3.. Ubicación Taxonómica ............................. 25. 2.1.3.4.. Composición química de la Tara ....................... 25. 2.1.3.5.. Actividad Terapéutica .............................. 26. 2.2. III.. HIPOTESIS DE LA INVESTIGACION ....................................................... 27 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................... 28. 3.1.. TIPO Y DISEÑO DE LA INVESTIGACION ............................................... 28. 3.2.. POBLACION Y MUESTRA ........................................................................ 28. 3.2.1.. POBLACION ..................................... 28. 3.2.2.. MUESTRA ....................................... 28. 3.2.2.1 3.3.. Criterios de selección de muestra: ...................... 29. TECNICA E INSTRUMENTO DE RECOLECCION DE DATOS ............... 31.

(6) 3.4.1.. MATERIALES DE LABORATORIO ..................... 31. 3.4.4.. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ............... 33. IV.. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................... 37. 4.1. RESULTADOS ............................................................................................ 37. 4.2.. DISCUSIÓN ................................................................................................. 50. V.. CONCLUSIONES ........................................................................................ 53. VI.. RECOMENDACIONES ............................................................................... 54. ANEXOS .................................................................................................................... 58.

(7) ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA N° 1.- Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 50% frente a las cepas de Streptococos mutans. ............ 38 FIGURA N° 2.- Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 75% frente a las cepas de Streptococos mutans. ............ 40 FIGURA N° 3.-Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% frente a las cepas de Streptococos mutans ........... 42 FIGURA N° 4.-Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% frente a las cepas de Streptococos mutans. .......... 45 FIGURA N° 5.- Comparación del halo de inhibición a las 24 y 48 horas con el tratamiento con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara), AL 50, 75 y 100%, aceite esencial Caesalpinia spinosa (Tara), control positivo (Clorhexidina al 0.12%) y control negativo (Agua destilada) frente a las cepas de Streptococos mutans. ........................................ 47 FIGURA N° 6.- Comparación de contraste con la prueba estadística de Tukey del halo de inhibición a las 24 y 48 horas con el tratamiento con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara), AL 50, 75 y 100%, aceite esencial Caesalpinia spinosa (Tara) y control positivo (Clorhexidina al 0.12%) frente a las cepas de Streptococos mutans. ............................ 49. vii.

(8) ÍNDICE DE TABLAS TABLA Nº 1.- Efecto inhibitorio de la infusión al 50% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. ........................................... 37 TABLA Nº 2.-Efecto inhibitorio de la infusión al 75% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. ........................................... 39 TABLA Nº 3.-Efecto inhibitorio de la infusión al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. ........................................... 41 TABLA Nº 4.- Efecto inhibitorio de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) entre las concentraciones de 50, 75 y 100% sobre la cepa de Streptococos mutans en 24 y 48 horas...... ..................................................................................................................... 43 TABLA Nª 5.- Efecto inhibitorio del aceite esencial al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. ................................. 44 TABLA Nº 6.- Comparación del efecto inhibitorio de infusión y aceite de Caesalpinia spinosa (Tara), el control positivo y control negativo sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. ............................................................................................. 46 TABLA Nº 7.- Sensibilidad de las Cepas de Streptococos mutans ante la infusiónde Caesalpinia spinosa (Tara), aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara), control positivo y control negativo en 24 y 48 horas. ............................................................... 48. viii.

(9) ÍNDICE DE ACRÓNIMOS APD: Agar de patata y dextrosa CG:. Cromatografía de Gas. CMB: Concentración mínima bacteriana CMI: Concentración mínima inhibitoria CPD: Caldo de patata y dextrosa DE:. Desviación estándar. DMS: Diferencia mínima significativa EM: Espectrometria de Masas g:. Gramo. GE:. Grupo experimental. kg:. Kilogramo. LI:. Límite inferior. LS:. Límite superior. m3:. Metro cúbico. ml:. Mililitro. NCCLS: National Comite for Clinical Laboratory Standards O.M.S.: Organización Mundial de la Salud. PEG 200: Polietilenglicol 200 RNA: Ácido ribonucleico rpm: Revoluciones por minuto T:. Prueba de T. Trolox: (6-hydroxy-2, 5, 7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid). Se utiliza en aplicaciones biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo o daño. TMS: Tiempo medio de supervivencia v/p:. volumen peso. UFC: Unidades formadoras de colonias μg:. Micro gramo. μl:. Micro litro. ix.

(10) RESUMEN OBJETIVO: Fue determinar el efecto inhibitorio in vitro de la infusión y aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans, Puno - 2017. MATERIALES Y MÉTODOS: La muestra estuvo conformada por 7 cultivos por cada placa Petri haciendo un total de 28 mediciones por cada aplicación. El grupo experimental estuvo conformado por la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) a concentraciones de 50, 75 y 100% y aceite esencial, la Clorhexidina al 0.12% como control positivo y agua destilada para control negativo. Se empleó la técnica de cultivo propuesta por el Instituto Nacional de Salud, la detección del efecto inhibidor fue a través de la prueba de difusión de pocillos con disco de papel filtro por el método de Kirby Bauer. El trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Altiplano. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba t de Student, el análisis de varianza, diagramas de barras, y la prueba de significancia de Tukey. RESULTADOS: La infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) tiene un efecto inhibitorio sobre las cepas de Streptococos mutans en sus concentraciones de 50, 75 y 100% con un promedio de 14.20mm, 16.57mm y 17.11mm a las 24 horas y un promedio de 12.30 mm, 13.39 mm y 14.63 mm a las 48 horas respectivamente. El aceite esencial de Caesalpinia spinosa tiene un efecto inhibitorio mayor con respecto a la infusión con un promedio de 18.09mm a las 24 horas y con 15.04mm a las 48 horas. CONCLUSIONES: La infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) in vitro tiene un efecto inhibitorio sobre las cepas de Streptococos mutans, y a mayor concentración mayor efectividad. El efecto del aceite esencial de Caesalpinia spinosa es mayor en comparación a la infusión. Los grupos experimentales son más efectivos a las 24 horas que a las 48 horas. Palabras Clave: Efectividad inhibitoria, Streptococcus mutans, Caesalpinia spinosa, infusión, aceite.. 10.

(11) ABSTRACT OBJECTIVE: To determine the inhibitory effect in vitro of the infusion and essential oil of Caesalpinia spinosa (Tara) on the strains of Streptococcus mutans, Puno - 2017. MATERIALS AND METHODS: The sample consisted of 7 cultures per petri dish making a total of 28 measurements per application. The experimental group consisted of the infusion of Caesalpinia spinosa (Tara) at concentrations of 50, 75 and 100% and essential oil, chlorhexidine 0.12% as a positive control and distilled water for negative control. The culture technique proposed by the National Institute of Health was used, the detection of the inhibitory effect was through the test of diffusion of wells with filter paper disc by Kirby Bauer method. The research work was carried out in the Microbiology Laboratory of the Faculty of Biological Sciences of the National University of the Altiplano. For the statistical analysis we used the Student's t test, the analysis of variance, bar charts, and the Tukey test of significance. RESULTS: The infusion of Caesalpinia spinosa (Tara) has an inhibitory effect on the strains of mutans Streptococcus in its 50%, 75% and 100% concentrations with an average of 14.20mm, 16.57mm and 17.11mm at 24 hours and an Average of 12.30 mm, 13.39 mm and 14.63 mm at 48 hours respectively. The essential oil of Caesalpinia spinosa has a greater inhibitory effect with respect to the infusion with an average of 18.09mm at 24 hours and 15.04mm at 48 hours. CONCLUSIONS: The infusion of Caesalpinia spinosa (Tara) in vitro has an inhibitory effect on the strains of Streptococcus mutans, and at a higher concentration, greater effectiveness. The effect of the essential oil of Caesalpinia spinosa is greater in comparison to the infusion. The experimental groups are more effective at 24 hours than at 48 hours.. Keywords: Inhibitory effectiveness, Streptococos mutans, Caesalpinia spinosa, infusion, oil.. 11.

(12) I. 1.1.. INTRODUCCIÓN. EL PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN. En la actualidad una de las enfermedades que más prevalece en la cavidad oral es la caries dental que es una enfermedad del sistema estomatognático por lo que constituye uno de los mayores problemas de salud pública. 1. La caries dental es una entidad patológica, infecciosa, crónica, progresiva y transmisible, de origen multifactorial, que es producida por la acción de microorganismos de la placa bacteriana, los cuales por su metabolismo producen ácido, especialmente por la fermentación de hidratos de carbono, originando la desmineralización gradual del esmalte seguida de la destrucción proteolítica rápida de la estructura dental, hasta llegar a la pérdida total del diente.2 Los principales microorganismos de la placa bacteriana implicados en el inicio y desarrollo de la caries son: Streptococos mutans, Lactobacillus sp y Actinomyces sp.2. El Streptococos mutans presenta diferentes características que son determinantes en su cariogenicidad, que son muy importantes en la colonización y mantenimiento de esta bacteria sobre el diente; posee elementos que determinan fenómenos de adhesión, agregación y congregación; la producción y metabolización de polisacáridos intracelulares, lo que le permite obtener energía y producir ácido durante largos períodos de tiempo; rápido metabolismo de los azúcares a ácido láctico y otros ácidos orgánicos; poder acidógeno, acidófilo y acidúrico; también puede conseguir un pH crítico para la desmineralización del esmalte de manera más rápida que otro microorganismo de la placa.2. Existen diferente métodos para la prevención de la caries dental y la enfermedad periodontal que consiste básicamente en la remoción mecánica de la placa dental, además del uso de agentes antimicrobianos tales como Clorhexidina, importante como coadyuvante en la primera fase de la terapia de las enfermedades bucales; sin embargo, se plantea el desafío de buscar nuevas alternativas en agentes antimicrobianos y una disminución de las reacciones adversas que estos presentan como: tinción de dientes y de obturaciones, pigmentación del dorso de la lengua y con menor frecuencia, descamación. 12.

(13) de la mucosa bucal, gusto amargo o modificación gustativa, sensación de quemadura, sequedad bucal e inflamación ocasional y transitoria de la parótida. 1,2 .. En este sentido, la medicina tradicional, trata de buscar alternativas de solución a enfermedades bucales, con productos naturales, económicos y prácticos.. Las plantas medicinales desde tiempos antiguos han sido consideradas como el primer recurso terapéutico para tratamientos o manutención de la salud, como medicina casera. Desde entonces estos conocimientos han evolucionado y las plantas han pasado a constituir importantes fuentes de productos naturales biológicamente activos.. En el Perú últimamente se han realizado diversos estudios en diferentes plantas medicinales, comprobándose las propiedades de sus componentes como: antibacterianas, antihemorragicas, analgésicas, antiinflamatorias, etc. 2. Dentro de ellas la Caesalpinia spinosa (Tara) tiene una amplia utilización empírica, desde la época incaica es usada por sus propiedades curativas como: antiinflamatorio, antiinfecciones, antimicóticas y antibacterianas lo que constituiría un recurso alternativo. 3. Se realizaron estudios anteriores con extracto etanólico y extracto acuoso de la Caesalpinia spinosa (Tara) comprobando su efectividad antibacteriana sobre diferentes microorganismos dentro de ellos: Enterococos fecalis3, Streptococcus pyogenes4, Staphylococcus aureus5, Porphyromonas gingivalis6 y bacterias en la flora salival mixta7. Además, el aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) presenta efectividad sobre Staphylococcus aureus meticilino resistente8 y efectividad antifungica sobre Candida albicans.9. Es debido que a las últimas investigaciones en este estudio se pretende determinar la efectividad inhibitoria in vitro de la infusión y aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre cepas de Streptococos mutans en diferentes concentraciones para que pueda ser utilizada como una alternativa para la prevención y disminución de la incidencia de caries dental, ya que esta planta medicinal es de fácil acceso, manejo, bajo costo, y sobre todo no presenta efectos colaterales. 3. 13.

(14) 1.2.. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION. 1.2.1. ANTECEDENTES INTERNACIONALES Haro A. (2015) Quito - Ecuador. Objetivo: Evaluar la capacidad antibacteriana in vitro entre el Extracto alcohólico de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100 % e hipoclorito de sodio 5,25% sobre el Enterococcus faecalis mediante halos de inhibición. Se realizó un estudio in vitro de la eficacia antibacteriana entre el extracto alcohólico de Tara 100% e hipoclorito de sodio 5,25% sobre el E. faecalis. Metodología: Embebieron sensidiscos con 50uL de cada solución y colocándolos en medios de cultivo Mueller Hilton previamente preparados con colonias jóvenes de E. faecalis ATCC 29212, incubando las muestras a 37°C de 24 a 72 horas. Resultados: Demostraron que ambas soluciones fueron capaces de producir inhibición del crecimiento bacteriano; siendo durante las primeras 24 horas el NaOCl 5,25% más efectivo en comparación con el extracto de Tara 100%. Adicional a esto, se investigó el efecto de sustantividad de las soluciones en el transcurso de 48 y 72 horas; encontrando que el extracto de Tara 100% posee un efecto antimicrobiano mayor y prolongado en contraste con el NaOCl 5,25%, el cual presentó un efecto antibacteriano menor.3. 1.2.2. ANTECEDENTES NACIONALES Abanto M. (2016) Trujillo – Perú. Objetivo: Determinar el efecto antibacteriano IN VITRO del extracto etanolico de Caesalpinia spinosa (Tara) frente a cepas de Streptococos mutans. Metodología: Se realizó la prueba de suceptibilidad, utilizando el método de difusión de discos. Para hallar la concentración mínima inhibitoria se empleó el método de dilución en tubos, ensayando concentraciones de 40, 60 y 80% de Caesalpinia spinosa; de cada cultivo se sembró en placas con agar mueller himton/ sangre para determinar las unidades formadoras de colonias. Los resultados mostraron que el mayor halo de inhibición fue de 14.80mm y la mínima concentración inhibitoria fue del 40%. Se concluye que el extracto etanólico de las vainas de Caesalpinia spinosa (Tara) posee actividad antibacteriana in vitro sobre el crecimiento de cepas de Streptococos mutans.10 Castro A., et al. (2016) Lima – Perú. Objetivo: Determinar la composición química del aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara), obtenido por el método de destilación por arrastre con vapor de agua con un rendimiento de 0,125% v/p, así como su capacidad antioxidante y actividad antibacteriana frente a Streptococos mutans ATCC 35668.. 14.

(15) Metodología: Para la identificación de los constituyentes químicos se emplearon Cromatografía de Gas y Espectrometría de Masas (CG/EM), encontrándose 23 compuestos. La evaluación de la actividad antioxidante se realizó aplicando los métodos de 2,2–difenil-1- picrilhidracilo (DPPH) y del radical ácido 2,2’-azino-bis-(3etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS⁺), determinándose que el IC50 para los dos métodos fue > 200 µL/mL, utilizando como referente de captación para ambos Trolox®,que presentó IC50 (3,8 µg/mL). Resultados: La determinación de la actividad antibacteriana se efectuó por el método de difusión en agar, donde el aceite de Tara en concentraciones de 100, 50 y 25%, formó halos de inhibición de 21, 18 y 16 mm, respectivamente, frente a Streptococos mutans, siendo el control negativo etanol 96° y el control positivo ciprofloxacino, que presentó un halo de 25 mm. Se concluyó que la composición química del aceite esencial obtenido de Caesalpinia spinosa presenta actividad antioxidante, aunque no es significativa en comparación con el compuesto de referencia Trolox®, mientras que su actividad antibacteriana en las concentraciones utilizadas tuvo resultados significativos. 11 Centurión K. (2015) Trujillo – Perú. Objetivo: Determinar el efecto antibacteriano IN VITRO del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre Streptococos mutans ATCC 35668. La muestra estuvo conformada por 64 observaciones, distribuidas en 4 grupos de 4 placas Petri cada uno, en cada placa se colocó el porcentaje de concentración de estudio, frente a tres controles: control positivo (Clorhexidina al 0.12%), control negativo (Etanol) y un porcentaje de concentración similar (para comparación). Los resultados mostraron que la concentración al 30% del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa mostró el mayor halo de inhibición (34.5 mm) y concentración mínima inhibitoria. La presente investigación concluye que el extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Tara) posee efecto antibacteriano in vitro sobre el Streptococos mutans ATCC 35668.12 Terán Y., et. al (2015) Trujillo – Perú. Objetivo: Utilizar aceite esencial, a fin de evaluar su efecto in vitro sobre la viabilidad de Staphylococcus aureus meticilino resistente (SARM) y a la vez determinar las CMIs y CMBs. Metodología: De legumbres secas de tara se obtuvo aceite esencial, el que se extrajo por medio del sistema de hidrodestilación. Fueron evaluadas S. aureus ATCC 25923, cepa sensible y la cepa SARM ATCC 43300, el cultivo SARM HRDT347 por medio de la prueba de difusión en agar y excavado en. 15.

(16) placa, así como con la de dilución en caldo. Para determinar las CMIs y las CMBs, las diluciones utilizadas de aceite esencial de la Tara fueron 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.312, 0.156, 0.078, 0.039, 0.019 y 0.009 % respectivamente. Los resultados Nos permitieron llegar a las siguientes Conclusiones: Existe efecto inhibitorio del aceite esencial Tara sobre la viabilidad de cultivos SARM; las CMIs para S. aureus ATCC 43300 y HRDT347 son similares, es decir, son del orden del 0.156% del aceite esencial, mientras que para S. aureus ATCC 25923 es 0.039%; las CMBs para S. aureus ATCC 4330 y HRDT347 son similares, es decir, son del orden del 0.312% del aceite esencial, mientras que para S. aureus ATCC 25923 es 0.156%.13. Benites C. (2015), Trujillo - Perú. Objetivo: Comparar el efecto antimicrobiano in vitro de cuatro concentraciones del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa frente a Candida albicans ATCC 90028. Material y Métodos: Se llevó a cabo un estudio de tipo comparativo, prospectivo, experimental. La población estaba conformada por el conjunto de placas inoculadas con las cepas de Candida albicans, aplicándoseles el extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Tara) observando su efecto antibacteriano para dichas cepas. Resultados: En el presente trabajo se observó que el extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Tara) tuvo efecto inhibitorio in vitro frente a Candida albicans, al utilizar las diferentes concentraciones (25%, 50%, 75% y 100%), y este efecto se incrementa en relación directamente proporcional a las concentraciones utilizadas en el estudio, dando como CMI el 50%. Con respecto a los halos de inhibición, al medirlos según escala de Durafford, se logró obtener una sensibilidad media (++) en las concentraciones de 75% y 100% y una sensibilidad limite en las concentraciones de 25% y 50%. Conclusiones: En el presente trabajo se demuestra que el extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Tara) presenta efecto inhibitorio in vitro frente a cepas de Candida albicans ATCC 90028, siendo la CMI del 50%.9 Zarate M. (2015) Trujillo – Perú. Objetivo: Evaluar el efecto in vitro antibacteriano del extracto acuoso de Caesalpinia spinosa sobre cepas de Streptococcus pyogenes y Escherichia coli. Se evaluó el efecto antibacteriano in vitro del extracto acuoso de Caesalpinia spinosa (Tara), sobre cepas de Streptococcus pyogenes y Escherichia coli aisladas del Hospital Regional Docente de Trujillo. Metodología: Investigación de tipo experimental, aplicada, prospectiva, comparativa, transversal. Se investigaron 80 muestras de orina de pacientes con infección de vías urinarias por Escherichia coli y 80. 16.

(17) muestras de adultos con faringo amigdalitis por Streptococcus pyogenes, se aplicó a las cepas aisladas el extracto acuoso de Caesalpinia spinosa, para observar el efecto antibacteriano in vitro para dichas cepas. Resultados: Se demostró que el efecto antibacteriano in vitro del extracto acuoso de Caesalpinia spinosa comparado con amoxicilina presentó una alta sensibilidad, y comparado con Cotrimoxazol presentó el mismo efecto. Y en cepas de Escherichia coli, haciendo una comparación con el extracto acuoso de Caesalpinia spinosa con gentamicina presentó el mismo efecto in vitro, pero menor efecto frente a Ciprofloxacino. Conclusiones: El extracto acuoso de Caesalpinia spinosa tiene efecto antibacteriano In vitro contra Streptococcus pyogenes y Escherichia coli.4 Montenegro A. (2014). Lima – Perú. Objetivo: Determinar la actividad antibacteriana de un extracto alcohólico de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre cepas de Porphyromonas gingivalis. Metodología: Para el análisis de este estudio se utilizó cepas de Porphyromonas. gingivalis. previamente. identificadas. por. los. laboratorios. MICROBIOLOGIC, el estudio investigó la actividad antibacteriana, del extracto alcohólico de Caesalpinia spinosa “Tara” en cinco concentraciones (6,25 mg/ml; 12,5 mg/ml; 25 mg/ml; 50 mg/ml y 75 mg/ml) sobre la cepa ATCC 33277 Porphyromonas gingivalis mediante el test de difusión en Agar. Resultados: Mostraron que el mayor halo de crecimiento es decir de 25 mm lo tuvieron la concentración de 12,5 mg/ml y la concentración de 50 mg/ml, ambos en un 25% de los casos. Por su parte, para el grupo control negativo (Alcohol 96°) se observó que los mayores halos fueron de 7 mm (50 % de los casos) y los menores de 6 mm (50% de los casos) y para el grupo control positivo (Clorhexidina 0.12 %), se observa que el mayor halos de inhibición miden 9 mm (en el 25 % de los casos) y el menor de 8 mm (75 % de los casos) con una media de 8,25 mm. Concluyeron que el extracto alcohólico de la Caesalpinia spinosa (Tara) posee actividad antibacteriana sobre Porphyromonas gingivalis, aunque entre las cinco concentraciones no existe diferencia significativa.6 Guevara J. (2014) Lima – Perú. Objetivo: Comprobar la actividad antimicrobiana de tres biovariedades de Tara frente a cepas de Staphylococcus aureus sensibles y resistentes a oxacilina. Metodología: Se evaluó 31 cepas de S. aureus oxacilina sensibles y 29 resistentes, aislados de muestras clínicas, frente a tres cocimientos de Tara de las zonas de Huamanga, Huarochirí y Tarma. Se preparó el cocimiento de Tara y se impregnó. 17.

(18) discos en blanco para utilizarlos como un antibiograma por disco difusión. Principales medidas de resultados: Diámetro de los halos de inhibición. Resultados: Los tres cocimientos presentaron actividad antimicrobiana frente a las cepas de Staphylococcus aureus; el cocimiento de Huamanga presentó mayor halo de inhibición frente a cepas sensibles y resistentes. El cocimiento de Huarochirí mostró mayor halo de inhibición en cepas oxacilino resistentes que sensibles; la diferencia fue significativa. El cocimiento de Huarochirí tuvo una actividad menor y fue significativa, frente a los cocimientos de Huamanga y Tarma. Conclusiones: El cocimiento de Huarochirí presentó menor actividad que los de Huamanga y de Tarma. 8. Huarino M, et al, (2012) Lima - Perú. Objetivo: Determinar el efecto antibacteriano in vitro de diferentes concentraciones del extracto alcohólico de la Caesalpinia spinosa (Tara) sobre la flora salival mixta (EACS); Metodología: El análisis se hizo mediante el método de difusión en placa, se usó la flora mixta salival, para enfrentarlas a las soluciones de 6,25, 12,5, 25, 50 y 75 mg/mL del EACS y compararlas con los controles positivo Clorhexidina 0.12 % y Alcohol 70º. Resultados: Mostraron efecto antibacteriano del EACS sobre flora mixta salival muestra una mayor actividad directamente proporcional a su concentración, para la concentración del 6.25% se observa que los mayores diámetros de los halos de inhibición miden 12.32 mm, para la concentración del 12.5% ,13.8 mm, para la concentración del 25% ,14.92 mm; para la concentración del 50%,15.48 mm, para la concentración del 75%,17.32 mm; mientras que para el grupo control positivo clorhexidina 0.12%( CH) se observa que inhibición miden 9.2 mm y para el grupo control negativo Alcohol 70° se observa que los diámetros de los halos de inhibición miden 2.28 mm. Se concluye que se ha evidenciado el efecto antibacteriano sobre la flora mixta salival.7 Añanca E. (2009) Tacna – Perú. Objetivo: Determinar la capacidad antibacteriana in vitro del extracto acuoso de vainas de Tara frente a bacterias patógenas clínicamente conocidas. Metodología: Las vainas previamente molidas (polvo), fueron el material vegetal del que se obtuvo y estandarizaron las diferentes concentraciones del extracto, las cuales fueron impregnadas en disco de antibiogramas, a partir de una extracción acuosa. El material microbiológico estuvo constituido por dos cepas conocidas como: Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes obtenidos de pacientes ambulatorios, mediante exudados faríngeos se lograron aislar e identificar experimentalmente. Ambas. 18.

(19) cepas frente a las diferentes concentraciones nos permitieron determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) por los métodos de macrodilución determinación del perfil de sensibilidad, por el método de Kirby-Bauer y la determinación de la concentración mínima bactericida CMB. Resultados: Demostraron que el extracto acuoso de la Caesalpinia spinosa (Tara) presenta inhibición, sobre ambas cepas de estudio. Conclusiones: Teniendo como base la escala de Duraffourd se determinó que para Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, presentó una actividad antimicrobial con sensibilidad media (15 a 19mm), frente al extracto acuoso de la Caesalpinia spinosa (Tara) de esta manera se logra validar los usos medicinales (folclóricos) respaldados por las investigaciones científicas realizadas. 5. 1.2.3.. ANTECEDENTES LOCALES:. No se encuentra bibliografía.. 1.3.. FORMULACION DEL PROBLEMA. ¿Cuál es el efecto inhibitorio in vitro de la infusión y aceite esencial de Caesalpinia spinosa (TARA) sobre las cepas de Streptococos mutans Puno -2017?. 1.4.. IMPORTANCIA Y UTILIDAD DEL ESTUDIO. Siendo este un estudio de tipo experimental, brindara una contribución científica y una aplicación práctica, en el sentido de mejorar la salud bucal de la población. Proporcionará información que sirva de base, ayuda, consulta, o referencia a futuras investigaciones similares.. 1.5.. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION. OBJETIVO GENERAL Determinar el efecto inhibitorio IN VITRO de la infusión y aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans Puno - 2017.. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Determinar el efecto inhibitorio de la infusión al 50% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas.. 19.

(20) - Determinar el efecto inhibitorio de la infusión al 75% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. - Determinar el efecto inhibitorio de la infusión al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. - Comparar los resultados obtenidos por medición de halos de inhibición generados por la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) en concentraciones de 50%, 75%,100% sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. - Determinar el efecto inhibitorio del aceite esencial al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. - Comparar los resultados obtenidos por medición de halos de inhibición generados por la infusión y aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans. 1.6.. CARACTERIZACION DEL AREA DE INVESTIGACION. AMBITO GENERAL La presente investigación se realizó en el Distrito de Puno, Provincia de Puno, Departamento de Puno. Se encuentra ubicado en la parte sur oriental de Perú en la meseta del Collao. Estratégicamente sus límites son: por el norte con los departamentos de Cusco y Madre de Dios; por el sur con los departamentos de Moquegua y Tacna; por el oeste con los departamentos de Cusco y Arequipa y por el este con la República de Bolivia se encuentra en el altiplano entre los 3812 y 5500 msnm, cuenta con diversos atractivos de carácter natural (Lago Titicaca, lagunas, ríos, ceja de selva, flora, fauna, etc.) ruinas arqueológicas, templos coloniales y variado folclore; cabe mencionar que la capital de Puno, está ubicada a orillas del Lago Titicaca. AMBITO ESPECÍFICO Esta investigación se realizó en los laboratorios de la ciudad universitaria de la Universidad Nacional del Altiplano. Ubicado en la Av. Sesquicentenario Nº 1150. Laboratorio de la Facultad de Ciencias Agrarias donde se hizo el Aceite esencial de Caesalpinia spinosa y laboratorio de microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas, donde se realizó el procedimiento, análisis y lectura de resultados.. 20.

(21) II. 2.1. REVISION DE LITERATURA. MARCO TEORICO. 2.1.1.. CARIES DENTAL. La caries dental es una enfermedad cuyo proceso es dinámico, crónico, infeccioso posteruptivo, transmisible que se caracteriza por una disolución gradual y la destrucción de los tejidos mineralizados de los dientes. 14,. 15. También es una enfermedad. infectocontagiosa, de etiología multifactorial asociada a la interrelación de varios factores, imprescindible para que se inicie la lesión. 17 Dichos factores son: el huésped, las bacterias y la dieta. Posteriormente fue adicionado un nuevo factor, el tiempo, que permitió esclarecer de una forma más precisa la formación de la caries dental. 16, 17 Según la OMS ha definido la caries dental como un proceso localizado de origen multifactorial que se inicia después de la erupción dentaria, determinando el reblandecimiento del tejido duro del diente y que evoluciona hasta la formación de una cavidad y es la tercera calamidad sanitaria, después de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer.18. 2.1.1.1.. FACTORES ETIOLÓGICOS. Paul Keyes en 1960, estableció que la etiopatogenia de la caries obedece a la interacción simultánea de tres factores principales: un factor “microorganismo” que en presencia de un factor “sustrato” (ingesta de Carbohidratos), logra afectar a un factor “diente” (también denominado huésped). Dicho investigador, refirió tanto en forma teórica como experimental que la interacción entre estos tres factores constituye, la base fundamental para el desarrollo de la caries dental. 19. a. Huésped: La composición de su superficie y su localización hace que los dientes retengan más o menos placa dentobacteriana. Los factores que determinan una distinta susceptibilidad ante la cariogénesis son básicamente: la saliva y la morfología del diente.20. b. Tiempo: La placa dentobacteriana es capaz de producir caries debido a su condición acidogénica y acidurica que poseen los microorganismos que la colonizan, de tal forma que los carbohidratos fermentables en la dieta no son suficientes, sino que además éstos. 21.

(22) deben actuar durante un tiempo prolongado para mantener un pH ácido constante a nivel de la interface placa - esmalte.20. c. Dieta: El Streptococos mutans para poder producir glucano y polisacáridos responsables de la adhesión bacteriana, necesitan de un sustrato que consiste en la ingesta de hidratos de carbono, más específicamente la sacarosa, que es el carbohidrato fermentable con mayor potencial cariogénico. Durante el proceso de la caries, las bacterias orales fermentan los hidratos de carbono y producen ácidos que disuelven el esmalte dentario.22 d. Bacterias: Se estima que en ella habitan entre 200 y 300 especies. 28, 29 Aquellas capaces de adherirse a la película adquirida (formada por proteínas que precipitaron sobre la superficie del esmalte) y congregarse formando un "biofilm" (comunidad cooperativa) de esta manera evaden los sistemas de defensa del huésped que consisten principalmente en la remoción de bacterias saprófitas y/o patógenas no adheridas por la saliva, siendo estas posteriormente deglutidas. Inicialmente en el biofilm se encuentra una gran cantidad de bacterias Gram positivas con poca capacidad de formar ácidos orgánicos y polisacáridos extracelulares, pero estas posteriormente, debido a las condiciones de anaerobiosis de las capas más profundas son reemplazadas por un predominio de bacterias Gram negativas y es en este momento cuando es denominada a la placa "cariogénica" es decir, capaz de producir caries dental. Las bacterias se adhieren entre sí pero es necesario una colonización primaria a cargo del Streptococcus mutans, además se encuentran Lactobacillus acidophilus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces viscosus y otros.20. 2.1.1.2.. EPIDEMIOLOGÍA DE LA CARIES DENTAL. Según la OMS la caries dental afecta entre el 60 % y 90 % de la población escolar. El Perú es uno de los países de Latinoamérica más afectados por las enfermedades bucales, como se demuestra al precisar que entre el 90 y 95% de la población peruana (equivalente a 30 millones de habitantes según proyección 2013, sufre de caries dental, además de tener uno de los índices más altos de caries en niños menores de 12 años. 23 En 2009, las enfermedades bucales fueron la segunda causa de consulta externa en los establecimientos de salud del Ministerio de Salud y representaron 8,5% de todas las consultas. Según el reporte oficial ofrecido por Ministerio de Salud del Perú (MINSA) en el 2005. Los resultados mostraron como promedio 90% de prevalencia de caries dental. 22.

(23) en la población escolar. La prevalencia en el área urbana fue 90,6% y en el rural 88,7%. El promedio de piezas cariadas, perdidas y obturadas en la dentición temporal y permanente (índice ceo-d/ CPO-D) a nivel nacional fue de 5.84 y el promedio de piezas cariadas, perdidas y obturadas en la dentición permanente para la edad de 12 años (CPOD-12) a nivel nacional fue 3.67 (IC95%: 3,37-3,97).24 2.1.2. STREPTOCOCOS MUTANS Microorganismo presente en la cavidad bucal. Son cocos Gram - positivos, no móviles, anaerobios facultativos.21 Fue aislado e identificado por Clarke a partir de lesiones cariosas. Lo denomino “mutans” por las formas mutantes en que presenta: cocobacilo (forma ovalada) en un medio ácido y coco (forma redondeada) en un medio alcalino. Streptococcus mutans produce polisacáridos a partir de la sacarosa por la acción de dos enzimas, la glucosiltransferasa (GTF) y la fructosiltransferasa (FTF). La GTF es capaz de sintetizar glucano a partir de la glucosa; la FTF, fructano a partir de la fructosa.25 Otra característica del Streptococos mutans es su corto efecto post-pH, que puede definirse como el tiempo necesario para recuperar su actividad de crecimiento habitual, tras estar sometido a un bajo pH éste vuelve a la normalidad. Según lo expuesto, no es de extrañar que estas especies bacterianas sean las que consigan alcanzar más rápidamente el pH crítico 5.5 necesario para iniciar el proceso de desmineralización. Streptococos mutans forma parte de la microbiota normal de la boca y aparece junto con la erupción de las piezas dentarias, pero se hace patógeno al aumentar su proporción relativa en la boca.16 2.1.2.1.. ADQUISICIÓN STREPTOCOCOS MUTANS.. El Streptococos mutans se encuentra de forma permanente en la cavidad oral después de la erupción dental, debido a que requiere de tejido duro no descamativo para su colonización. La principal fuente de adquisición y transmisión de Streptococos mutans en los niños es la saliva de la madre transmitida cuando hay un contacto salival con la comida que se le dará al bebé, estas evidencias provienen de estudios que demuestran un patrón idéntico de DNA cromosomal en las bacterias de los niños y de las madres. Se ha demostrado que el tiempo exacto de colonización de esta bacteria es a los 26 meses de edad, periodo que ha sido denominado “ventana de infectividad”. Es importante recordar que el Streptococos mutans forma parte de la flora oral microbiana, por lo que se puede encontrar en pacientes con y sin caries.25. 23.

(24) 2.1.2.2.. FACTORES DE VIRULENCIA. Son aquellas condiciones o características específicas que hacen patógeno a este microorganismo. Entre ellas tenemos:. Acidogénesis: Rápidamente se metabolizan los azucares por la vía glicolitica, así se alcanza el pH critico de desmineralización de 4.5 – 5.5 el Streptococos mutans presenta distintos mecanismos enzimáticos para el transporte de azucares al interior de la célula. Estos sufren un proceso de fermentación y producción de ácidos, principalmente ácido láctico.. Acidofilia: La acidificación del biofilm, producto de la fermentación de carbohidratos favorece el crecimiento de Streptococos mutans y al mismo tiempo inhibe el crecimiento de microorganismos comensales.26. Aciduricidad: Es la capacidad de producir ácido en un medio con pH bajo.. 16. 2.1.3. TARA (Caesalpinia spinosa) 2.1.3.1.. Descripción botánica de la Caesalpinia spinosa. La Tara es un árbol siempre verde de 3-5 m. de altura, a veces más, con la copa globosa y ramas cortas, estriadas, puberulentes de jóvenes, con espinas cónicas recurvadas entre los nudos; tronco corto, a menudo ramificado desde la base y dando la apariencia de varios troncos, con la corteza rugosa de color gris. 12. Sus flores son hermafroditas, zigomorfas; cáliz tubular, púber con segmentos obtusos, de tres mm de longitud, el superior con fibras pectinadas; corola con cinco pétalos libres, amarillos, orbiculares, espatulados o raramente oblongos, estambres, filamentos filosos o glandulares, blancos, anteras rojizas, con dehiscencia longitudinal, pistilo curvado verdoso.6. Sus frutos son legumbres rojizas, oblongas, ligeramente comprimidas de seis a once cm de longitud, indehiscentes de color rosado, con el mesocarpio arenoso, esponjoso, y nueve a doce semillas de unos 1 x 0,5 x 0,3 cm, reniformes, de color marrón pardo con la superficie lustrosa dura, y con uno de los dos lados más grande.. 6. 24.

(25) 2.1.3.2.. Distribución geográfica de la Caesalpinia spinosa.. El Perú es el país que tiene mayor área de bosques de Tara, con el 80 % de la producción mundial, seguido muy de lejos por Bolivia, Colombia, Chile, Ecuador y Venezuela. También es cultivada en el norte y este de África, Estados Unidos, Brasil y Argentina. 6,12. Hábitat Eco regiones de la costa y la serranía entre los 0 - 4500 msnm, en bosques secos mayormente a partir de los 1000 msnm, reportada en todos los departamentos del país. Muy usada como cerco vivo, árbol de sombra y árbol ornamental. 6,12. 2.1.3.3.. Ubicación Taxonómica. Nombre científico: Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze. Taxonomía Reino: PLANTAE División: MAGNOLIOPHYTA Clase: MAGNOLIOPSIDA Subclase: ROSIDAE Orden: FABALES Familia: FABACEAE Género. Caesalpinia Especie: spinosa Nombre Vulgar: “Tara”6,12 2.1.3.4.. Composición química de la Tara. Taninos Los taninos están constituidos por un amplio grupo de compuestos hidrosolubles con estructura polifenólica, capaces de precipitar ciertas macromoléculas (proteínas, alcaloides, celulosa, gelatina). 27,28. Los taninos son polímeros polifenólicos producidos en las plantas como compuestos secundarios y que tienen la habilidad de formar complejos con proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, esteroides, alcaloides y saponinas desempeñando en las plantas una acción defensiva frente a los insectos. Son astringentes (precipitan las proteínas), la. 25.

(26) astringencia se explica al unirse los taninos con macromoléculas y provocar la precipitación de las glicoproteinas ricas en prolina que contiene la saliva.. Es indudable la importancia que los taninos vegetales han adquirido a través de los años, conforme se ha profundizado su conocimiento y encontrado aplicaciones tan variadas. Quizás la aplicación más antigua es en la industria del cuero, para el proceso del curtido, aprovechando su capacidad de precipitar proteínas; ésta propiedad fue también aplicada en los tejidos vivos, constituyendo la base para su acción terapéutica, empleándolos en medicina, en tratamientos del tracto gastrointestinal y para las excoriaciones y quemaduras de la piel. En este último caso las proteínas forman una capa protectora antiséptica bajo la cual se regeneran los tejidos. También se prescriben como astringentes. Externamente, los preparados a base de drogas ricas en taninos, como las decocciones, se emplean para detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad bucal.. Flavonoides Los flavonoides forman un complejo con las proteínas solubles y extracelulares y el complejo de la pared de la célula bacteriana, impidiendo el desarrollo de las células bacterianas.. Los flavonoides proceden del metabolismo secundario de los vegetales a través de la ruta del ácido shikímico y la ruta de los policétidos. Los flavonoides están ampliamente distribuidos entre los vegetales superiores y se encuentran prácticamente en todas las plantas superiores, sobre todo, en partes aéreas: hojas, flores y frutos. Algunos flavonoides son responsables del color amarillo de ciertas flores. 28. Los flavonoides, quedan unidos a muy diversos grupos químicos, por ejemplo, los flavonoides glucosados portan moléculas de azúcares o sus derivados. También pueden encontrarse flavonoides parcialmente polimerizados dando lugar a dímeros, trímeros, o complejos multi enlazados, como los taninos condensados.. 2.1.3.5.. Actividad Terapéutica. Las acciones farmacológicas de la Tara dependen de los taninos que son un derivado de los flavonoides que están relacionadas con sus propiedades. Las principales son: 28. 26.

(27) a. Antídotos en intoxicaciones por metales pesados y alcaloides. b. Astringentes, debido a su capacidad para precipitar proteínas de la piel (curtido de la piel), proteínas salivares, etc. Por su capacidad astringente se usa por vía externa como cicatrizante y por vía interna antidiarréicos. c. Antisépticos, tienen una acción bactericida y bacteriostática. También ejercen un efecto antifúngico. d. Protectores, los taninos aplicados en forma de pomada de uso externo impermeabilizan la piel y la protegen de los agentes externos. e. Antioxidante, son capaces de captar radicales libres e inhibir la peroxidación lipídica. Inhiben la autooxidación del ácido ascórbico (Vitamina C). Las diferentes especies que contienen flavonoides poseen acciones farmacológicas muy variadas. Acción vitamina C (factor antiescorbuto), Antihemorrágicos, Antirrítmicos, Protectores de la pared vascular o capilar, Antiinflamatorios, Antirradicales libres, Antihepatóxicos, Antibacterianos, antivíricos y antifúngicos, diuréticos y antiurémicos, antiespasmódicos.. 2.2.. HIPOTESIS DE LA INVESTIGACION. H1:. La infusión al 50% de Caesalpinia spinosa (Tara) tiene efecto inhibitorio IN. VITRO sobre las cepas de Streptococos mutans. H2:. El aceite esencial al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) tiene efecto inhibitorio. IN VITRO sobre las cepas de Streptococos mutans.. 27.

(28) III. 3.1.. MATERIALES Y MÉTODOS. TIPO Y DISEÑO DE LA INVESTIGACION. TIPO DE INVESTIGACION: Según la intervención del investigador: Experimental: Existe intervención del investigador; los datos no revelan la evolución natural de los eventos.. Según la planificación de la toma de datos: Prospectivo: Los datos fueron recogidos a propósito de la investigación.. Según el número de ocasiones en que se mide la variable: Longitudinal: Las variables de estudio serán medidas dos ocasiones.. Según el número de variables: Analítico: Presenta más de dos variables.. DISEÑO DE INVESTIGACION:. Explicativo: Se Investigó los orígenes de problema, estableciendo relaciones de causa efecto entre las variables independientes y la variable dependiente.. 3.2.. POBLACION Y MUESTRA. 3.2.1. POBLACION Cepas de Streptococos mutans obtenidas del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad Nacional del Altiplano.. 3.2.2. MUESTRA De tipo probabilístico porque todas las muestras tienen la probabilidad de ser incluidas en la investigación.. 28.

(29) TAMAÑO DE LA MUESTRA 𝑛=2(𝑍∝/2+𝑍𝛽)2(𝐷𝐸)2/𝑑2 Se usó la fórmula para comparar dos o más medias: n: Tamaño de cada grupo de estudio α: Probabilidad de cometer error tipo I β: Probabilidad de cometer error tipo II Z: Valor estándar de la distribución normal asociada a un tipo de error DE: Desviación estándar d: Diferencia entre promedios para rechazar igualdad de medias Considerando los requerimientos de una confianza del 99% (α =0.01, Z = 2.57) y una potencia en la prueba del 80% (β=0.20, Z =0.84), para (DE/d=0.50) n=2(2.87+0.84)2 (0.5)2 n= 6.8 n=7. Con estos valores se determinó una muestra de 7 repeticiones en 24 placas Petri, obteniendo un total de 28 aplicaciones para cada grupo de experimentación. 16,17. GRUPOS DE ESTUDIO Diseño de los grupos de experimentación Se considerará la concentración del producto, el tiempo de crecimiento y el halo de inhibición en mm. -. Infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 50%. -. Infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 75%. -. Infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100%. -. Aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100%. -. Clorhexidina al 0.12%. -. Agua destilada. 3.2.2.1 Criterios de selección de muestra: Criterios de inclusión. -. Placas con siembra adecuada de Streptococos mutans.. -. Placas que después del proceso de incubación presentaron halos de inhibición en óptimas condiciones.. 29.

(30) Criterios de exclusión. -. Placas que después del proceso de incubación no mostraron halos de inhibición. por defectos de técnica de laboratorio. -. Soluciones que presenten alteraciones en su consistencia, color, esterilidad,. caducidad y conservación.. OPERACIONALIZACION DE VARIALES OPERACIONALIZACION. DE. VARIABLES INDICADOR. VARIABLES. DEFINICIÓN. DIMENSIÓN. (variable independiente) Efecto inhibitorio de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara). Es una leguminosa natural del Perú, que posee propiedades Astringentes, antiséptico, antioxidante, antiinflamatorios, Antibacterianos, antivíricos y antifúngicos.. Concentración 10 ul por cada - 50% disco de papel - 75% filtro. - 100%. (variable independiente) Efecto inhibitorio del aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara). Capacidad del aceite escencial de Caesalpinia spinosa (Tara) Consiste en inhibir el crecimiento de microoganismos que se desarrollan en un medio dado. Concentración Concentración Aceite puro al - 100% del aceite 100% esencial de Caesalpinia spinosa puro. Es una bacteria que se encuentra normalmente en la cavidad bucal humana, formando parte de la placa dental o biofilm dental. Se asocia al inicio y desarrollo de la caries dental.. -Halos de inhibición.. - Vernier. mm. -Tiempo. Observación. 24hrs 48hrs. (variable dependiente) Streptococos mutans. ESCALA 50% (50 gr/125ml) 75% (75 gr/187.5ml) 100% (100 gr/250ml). 30.

(31) 3.3.. TECNICA E INSTRUMENTO DE RECOLECCION DE DATOS. TÉCNICA Observación directa.. INSTRUMENTOS - Documental: Fichas de recolección de datos. - Mecánico: Vernier digital y/o regla milimetrada.. 3.4.1. MATERIALES DE LABORATORIO -. Autoclave (horno a presión de calor húmedo).. -. Microscopio óptico compuesto con objetivo de inmersión y láminas porta y cubre. objetos. -. Estufa de Incubadora Microbiológica.. -. Jarra Microbiológica de Anaerobios.. -. Placas Petri.. -. Matráz.. -. Pipeta calibrada.. -. Tubos de ensayo.. -. Mechero Bunsen.. -. Safranina, alcohol cetona, lugol. -. violeta de genciana.. -. Solución peptonada.. -. Solución para medio de transporte.. -. Medios de cultivo.. -. Agua destilada. -. Suero fisiológico.. -. Cocina eléctrica.. -. Jeringas desechables de 5 ml. y tuberculina.. -. Hisopos estériles.. -. Bandeja porta objetos.. -. Regla metálica milimetrada para medir espacios.. -. Pinzas porta algodón.. -. Algodón y gasa.. 31.

(32) 3.4.2. ELEMENTOS DE BIOSEGURIDAD -. Equipo de protección personal. (EPP). -. Mandil color blanco.. -. Gorra color blanco.. -. Guantes quirúrgicos estériles.. -. Mascarilla desechable. -. Detergente, desinfectantes y jabón carbólico.. -. Escobilla para lavado de manos.. 3.4.3. INFRAESTRUCTURA -. Laboratorio de Microbiología de la Escuela Profesional de Biología de la. Universidad Nacional del Altiplano de Puno. -. Laboratorio de suelos de la Facultad de Ingeniería Agronómica de la Universidad. Nacional del Altiplano de Puno.. 3.4.4. ELEMENTOS AUXILIARES DE REGISTRO -. Cámara fotográfica digital 7,5 mega píxeles y computadora. -. Regla milimetrada. -. Papel, lápiz y lapiceros.. 3.4.. PROCEDIMIENTO Y RECOLECCION DE DATOS. 3.4.1. OBTENCION DE Caesalpinia spinosa (Tara) Se realizó la compra de las vainas de Caesalpinia spinosa (Tara) en el departamento de Cuzco – Anta.. 3.4.2. OBTENCION DE LA INFUSION DE Caesalpinia spinosa (Tara) Las infusiones se prepararon de forma similar al uso cotidiano (infusiones acuosas). De las vainas de Caesalpinia spinosa (Tara) se pesaron 100 gr y se llevaron a 250 ml de agua destilada, se dejó en ebullición durante 5 min en un recipiente tapado para evitar, en lo posible, una pérdida acuosa por evaporación. Posteriormente se filtró y se distribuyó en volúmenes de 50, 75 y 100%. Cada infusión se almaceno en un frasco previamente esterilizados por medio de autoclave, cada frasco fue rotulado para su posterior identificación.31. 32.

(33) 3.4.3.. EXTRACCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE Caesalpinia spinosa. (Tara) Para la extracción del aceite esencial se trabajó con 10 Kg de vainas de Caesalpinia spinosa (Tara) se retiraron las semillas, utilizando un sistema de hidrodestilación por arrastre con vapor de agua que es una técnica usada para separar sustancias orgánicas insolubles en agua y ligeramente volátiles, de otras no volátiles que se encuentran en la mezcla. La fracción de aceite esencial extraída se almaceno en un frasco para los análisis posteriores.11, 13 Métodos Cuando se usa vapor saturado o sobrecalentado, generado fuera del equipo principal, ya sea por una caldera, una olla de presión o un matraz adecuado, esta técnica recibe el nombre de “destilación por arrastre con vapor”, propiamente dicha.32 También se puede usar el llamado “método directo”, en el que el material está en contacto íntimo con el agua generadora del vapor. En este caso, se ponen en el mismo recipiente el agua y el material a extraer, se calientan a ebullición y el aceite extraído es arrastrado junto con el vapor de agua hacia un condensador, que enfría la mezcla, la cual es separada posteriormente para obtener el producto deseado. Este método es usado de preferencia cuando el material a extraer es líquido o cuando se utiliza de forma esporádica. 32, 33 Una variante de esta última técnica es la llamada “hidrodestilación”, en la que se coloca una trampa al final del refrigerante, la cual va separando el aceite del agua condensada, con lo cual se mejora y se facilita el aislamiento del aceite esencial. También puede montarse como un reflujo, con una trampa de Clevenger para separar aceites más ligeros que el agua.33. 3.4.4. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO A.. Preparación del medio de cultivo. La preparación de los medios de cultivo comprende los siguientes tiempos fundamentales: 1. Pesada de los ingredientes y disolución con calor. 2. Adición de las sustancias de sostén: Agar-nutritivo, gelatina, etc.. 33.

(34) 3. Ajuste del pH. Por lo general las bacterias exigen una reacción neutra o ligeramente alcalina pH 6,8 - 7,2. Un pH alto o bajo retarda o inhibe el crecimiento de las bacterias. Para determinar el pH, se ha empleado el siguiente método: -. Método del papel indicador universal de pH. 4. Repartición en placas Petri. 5. Esterilización a 121 °C a 15 libras de presión/pulg por 20 minutos. 6. Control de la esterilidad en la estufa a 37°C por 24 horas. 7. Almacenamiento de los medios en la nevera hasta el momento de usarlos.. B.. Preparación de agar sangre. -. Se colocó en Baño María un frasco o balón con 100 ml de Agar nutritivo estéril. hasta que licuó completamente. -. Se dejó enfriar hasta 45 - 50°C.. -. Se añadió asépticamente sangre (humana) en proporción del 5-8%.. -. Se agitó suavemente para mezclar. Repetir en placas Petri.. -. Se dejó solidificar.. -. El color de este medio es rojo - cereza.. -. Se controló la esterilidad y se guardó en nevera.. C.. Siembra y aislamiento. Se sembró colocando los microorganismos en medios de cultivo adecuado (agar sangre) para que se desarrollen y multipliquen en condiciones óptimas.. Se realizó la siembra por Trasplante. El material contiene una sola especie bacteriana, y se realizó con la finalidad de conservar el microorganismo renovando su medio de cultivo para conocer sus propiedades biológicas y bioquímicas. -. Siembra de una muestra líquida a un medio sólido.. Procedimiento 1. Se esterilizó el asa de Kolle por flameado. 2. Se dejó enfriar. 3. Se tomó con la mano izquierda el tubo con la muestra se le dio leve inclinación para evitar, contaminación con microorganismo del medio ambiente, al ser destapado.. 34.

(35) Trabajar cerca del mechero 4. Con la mano derecha, se sostuvo el asa y ayudado con el dedo meñique de esta misma mano, se sacó la lámina metálica del tubo con la cepa. 5. Se flameo la boca del tubo, e introdujo el asa sin tocar las paredes y se cargó con cepa. Se retiró el asa. 6. Se flameó de nuevo la boca del tubo, y se tapó con la lámina metálica. 7. Inmediatamente tomar con la mano izquierda el tubo con el medio de cultivo sólido estéril, destapar con cuidado de esterilidad e introducir el asa hasta el fondo, y apoyando la aguja sobre la superficie, hacer una línea o estría sin romper el medio de cultivo. 8. Flamear la boca del tubo y el asa de Kolle. 9. Rotular la Placa, con el nombre y fecha 10. Incubar en la estufa a 37°C por 24 a 48 horas. 11. Transcurrido el tiempo se realiza la observación.. D.. Obtención de la bacteria indicadora. El transporte de las cepas, se hizo en un tubo de ensayo cuidadosamente esterilizado contenido de 3 ml. De solución peptonada. Las cepas fueron homogenizadas en cuatro tubos de ensayo contenido de caldo nutritivo, obteniéndose una dilución de 3 ml por cada tubo. Se llevó a la incubadora por 24 horas a 37ºC. Transcurrido este tiempo se realizó la siembra en, Agar sangre. El medio de cultivo Agar sangre nos sirvió para determinar la hemólisis de la bacteria e identificar si es alfa o beta para proceder su aislamiento. La identificación de colonias de Streptococos mutans, se realizó en base a la observación de la morfología colonial y la adherencia de la colonia al agar.. A. Preparación del inoculo por el Método de Kirby Bauer -. Inoculación de la suspensión bacteriana. Transcurrido la inoculación de la suspensión bacteriana, después de 10 minutos se procedió a realizar los pocillos en la placa Petri para luego introducir los discos uniformemente, de modo que estén a una distancia mínima de 25 mm uno del otro (el diámetro de los discos según las normas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) debe ser de 6 mm). No deben colocarse más de 12 discos en una placa de 150 mm, para evitar la superposición de las zonas de inhibición de antibiograma. Colocar los discos sin contenido y estéril para aplicar con una pipeta automática la infusión Caesalpinia Spinosa (Tara) a concentraciones al 50%, 75% y 100%, aceite esencial, control positivo y negativo. 35.

(36) en un volumen de 10 ul, para cada uno de los 7 pocillos por placa, se llevó a incubar la totalidad de las muestras a una temperatura de 37°C por 24 y 48 horas determinadas en medio anaerobio.. B. Métodos realizados para la medición de los halos de inhibición. Para la medición de los halos de inhibición se tomó en cuenta la totalidad de los 7 pocillos con el tratamiento desarrolladas en la placa Petri, precisión del recuento.. 1.- Se realizó la medición del diámetro del halo de inhibición en milímetros. Con un vernier digital, para una mejor medición. 2.- Sumar el número las medidas del halo de inhibición de los 7 pocillos por placa para sacar los promedios respectivos.. El efecto antibacteriano se consideró en función al diámetro de los halos de inhibición del crecimiento del microorganismo según la escala de Durafford: nula (-) si es inferior o igual a 8 mm; sensibilidad limite (sensible = +) de 9 a 14 mm; media (muy sensible = ++) de 15 a 19 mm y sumamente sensible (S.S. = +++) si es igual o superior a 20 mm.. 3.5.. DISEÑO Y ANALISIS ESTADISTICO. Para interpretar los resultados una vez obtenidos del presente estudio; en concordancia con los objetivos e hipótesis, se utilizó pruebas estadísticas inferenciales. Se empleó la prueba de TUKEY entre los grupos de estudio, para establecer si hay diferencias significativas entre los tiempos. Se utilizó el Análisis de varianza (ANOVA), esta prueba permite evaluar si existe una diferencia estadísticamente significativa entre los promedios de halo de inhibición y los efectos conjuntos de dos o más variables, un valor de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo, la prueba de t de Student y diagramas de barras.. 36.

(37) IV. 4.1. RESULTADOS Y DISCUSION. RESULTADOS. TABLA Nª 1.- Efecto inhibitorio de la infusión al 50% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas.. PRUEBA ESTADÍSTICA DE T STUDENT. EFECTO INHIBITORIO DE INFUSION AL 50% DE Caesalpinia spinosa (Tara) SOBRE Streptococos mutans. TIEMPO. 24 horas. 48 horas. PROMEDIO. 14.20mm. 12.30mm. D.E. ± 0.70. ± 0.48. LI. 13.93mm. 12.12mm. LS. 14.47mm. 12.49mm. P. ≤ 0.0001. ≤ 0.0001. Fuente: Base de datos.. INTERPRETACION: Al comparar el efecto inhibitorio de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 50% sobre las cepas de Streptococos mutans, se aprecia que el promedio de los halos inhibitorios a las 24 horas fue de 14.20mm y de 12.30mm a las 48 horas, teniendo una diferencia de 1.9mm a favor de los halos inhibitorios a las 24 horas; la Desviación estándar (DE) fue mayor a las 24 horas ±0.70 que a las 48 horas ±0.48. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los promedios de los halos inhibitorios p ≤ 0.0001, según el Análisis de Varianza; teniendo un efecto mayor según los halos de inhibición a las 24 horas mediante la prueba de Tukey con una probabilidad de p<0.05.. 37.

(38) FIGURA N° 1.- Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 50% frente a las cepas de Streptococos mutans.. 38.

(39) TABLA Nª 2.-Efecto inhibitorio de la infusión al 75% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas. PRUEBA ESTADÍSTICA EFECTO INHIBITORIO DE INFUSION AL 75% DE DE T STUDENT. Caesalpinia spinosa (Tara) SOBRE Streptococos mutans. TIEMPO. 24 horas. 48 horas. PROMEDIO. 16.57mm. 13.39mm. ± 0.40. ± 0.37. LI. 16.42mm. 13.25mm. LS. 16.73mm. 13.54mm. P. ≤ 0.0001. ≤ 0.0001. D.E. Fuente: Base de datos.. INTERPRETACION: Al comparar el efecto inhibitorio de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 75% sobre las cepas de Streptococos mutans, se aprecia que el promedio de los halos inhibitorios a las 24 horas fue de 16.57mm y de 13.39mm a las 48 horas, teniendo una diferencia de 3.18mm a favor de los halos inhibitorios a las 24 horas; la Desviación estándar (DE) fue mayor a las 24 horas ±0.40 que a las 48 horas ±0.37. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los promedios de los halos inhibitorios p ≤ 0.0001, según el Análisis de Varianza; teniendo un efecto mayor según los halos de inhibición a las 24 horas mediante la prueba de Tukey con una probabilidad de p<0.05.. 39.

(40) FIGURA N° 2.- Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 75% frente a las cepas de Streptococos mutans.. 40.

(41) TABLA Nª 3.-Efecto inhibitorio de la infusión al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas.. PRUEBA ESTADÍSTICA EFECTO INHIBITORIO DE INFUSION AL 100% DE DE T STUDENT. Caesalpinia spinosa (Tara) SOBRE Streptococos mutans. TIEMPO. 24 horas. 48 horas. PROMEDIO. 17.11mm. 14.63mm. D.E. ± 0.44. ± 0.62. LI. 16.94mm. 14.39mm. LS. 17.28mm. 14.86mm. P. ≤ 0.0001. ≤ 0.0001. Fuente: Base de datos.. INTERPRETACION: Al comparar el efecto inhibitorio de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% sobre las cepas de Streptococos mutans, se aprecia que el promedio de los halos inhibitorios a las 24 horas fue de 17.11mm y de 14.63mm a las 48 horas, teniendo una diferencia de 2.48mm a favor de los halos inhibitorios a las 24 horas; la Desviación estándar (DE) fue mayor a las 48 horas ±0.62 que a las 24 horas ±0.44. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los promedios de los halos inhibitorios p ≤ 0.0001, según el Análisis de Varianza; teniendo un efecto mayor según los halos de inhibición a las 24 horas mediante la prueba de Tukey con una probabilidad de p<0.05.. 41.

(42) FIGURA N° 3.-Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% frente a las cepas de Streptococos mutans. 42.

(43) TABLA Nª 4.- Efecto inhibitorio de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) entre las concentraciones de 50, 75 y 100% sobre la cepa de Streptococos mutans en 24 y 48 horas.. Fuente: Base de datos.. INTERPRETACION: Al comparar los promedios de la actividad inhibitoria de la infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) en las concentraciones de 50, 75 y 100% a las 24 y 48 horas frente a las cepas de Streptococos mutans se encontró que el mayor halo de inhibición se da a una concentración del 100% a las 24horas con un promedio de 17.11mm y el menor halo de inhibición se da a una concentración de 50% a las 48horas con un promedio de 12.30mm, resultando que a mayor tiempo disminuye el promedio de halo de inhibición. Sometido los datos a la prueba de Análisis de Varianza resulta un p ≤ 0.0001. Para observar mejor la diferencia significativa entre las diferentes concentraciones a las 24 y 48 horas se sometió a la prueba estadística de Tukey de p<0.05, por lo que el mejor comportamiento se da con la aplicación de infusión de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% frente a las cepas de Streptococos mutans a las 24 y 48 horas.. 43.

(44) TABLA Nª 5.- Efecto inhibitorio del aceite esencial al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas.. PRUEBA. ESTADÍSTICA EFECTO INHIBITORIO DEL ACEITE AL 100% DE. DE T STUDENT. Caesalpinia spinosa (Tara) SOBRE Streptococos mutans. TIEMPO. 24 horas. 48 horas. PROMEDIO. 18.09mm. 15.04mm. D.E. ± 0.51. ± 0.52. LI. 17.89mm. 13.44mm. LS. 18.29mm. 13.85mm. P. ≤ 0.0001. ≤ 0.0001. Fuente: Base de datos.. INTERPRETACION:. Al comparar el efecto inhibitorio del aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% sobre las cepas de Streptococos mutans, se aprecia que el promedio de los halos inhibitorios a las 24 horas fue de 18.09mm y de 15.04mm a las 48 horas, teniendo una diferencia de 4.45mm a favor de los halos inhibitorios a las 24 horas; la Desviación estándar (DE) fue mayor a las 48 horas ±0.52 que a las 24 horas ±0.51. Se encontró diferencia. estadísticamente significativa entre los promedios de los halos inhibitorios. p ≤ 0.0001, según el Análisis de Varianza; teniendo un efecto mayor según los halos de inhibición a las 24 horas mediante la prueba de Tukey con una probabilidad de p<0.05.. 44.

(45) FIGURA N° 4.-Promedio de halo de inhibición a las 24 y 48 horas con aceite esencial de Caesalpinia spinosa (Tara) al 100% frente a las cepas de Streptococos mutans.. 45.

(46) TABLA Nª 6.- Comparación del efecto inhibitorio de infusión y aceite de Caesalpinia spinosa (Tara), el control positivo y control negativo sobre las cepas de Streptococos mutans en 24 y 48 horas.. Fuente: Base de datos.. INTERPRETACION: La actividad inhibitoria entre los promedios de las aplicaciones de infusión de Caesalpinia spinosa (Tara), en concentraciones de 50, 75 y 100%, aceite esencial al 100% de Caesalpinia spinosa (Tara) , el control positivo (Clorhexidina al 0.12%) y control negativo (agua destilada) a las 24 y 48 horas frente a la cepas Streptococos mutans, resultando que el mayor halo de inhibición se da con el control positivo con un promedio de 21.71 mm en relación a las demás aplicaciones, seguido por la aplicación con aceite esencial con un promedio de 18.09 mm a las 24 horas, y con infusión al 100% con un promedio de 17.11 mm a las 24 horas, existiendo una diferencia estadísticamente significativa con un p ≤ 0.0001. Se observa que a las 24 horas existe un mayor promedio de halo de inhibición en las aplicaciones de Caesalpinia spinosa. (Tara).. 46.