Identificación, caracterización y aislamiento de células madre somáticas en los miomas humanos

(1)

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Biotecnología de la Reproducción Humana Asistida

T

ESIS D

OCTORAL

“Identificación, caracterización y aislamiento

de células madre somáticas

en los miomas humanos”

Autora:

Aymara Mas Perucho

Licenciada en Biología

Directores:

Prof. Carlos Antonio Simón Vallés

Dra. Irene Cervelló Alcaraz

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Prof. Carlos Antonio Simón Vallés

, Catedrático de Pediatría,

Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Valencia y Director

Científico del Instituto Valenciano de Infertilidad (IVI).

CERTIFICA:

Que el trabajo de investigación titulado:

“Identificación,

caracterización y aislamiento de células madre somáticas en los

miomas humanos”

ha sido realizado íntegramente por Dña. Aymara

Mas Perucho bajo mi dirección. Dicha memoria está concluida y

reúne todos los requisitos para su presentación y defensa como

TESIS DOCTORAL ante un tribunal.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo la

presente certificación en Valencia a 12 de Julio de 2012.

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Dra. Irene Cervelló Alcaraz,

Doctora en Biología e

Investigadora de la Fundación IVI.

CERTIFICA:

Que el trabajo de investigación titulado:

“Identificación,

caracterización y aislamiento de células madre somáticas en los

miomas humanos”

ha sido realizado íntegramente por Dña. Aymara

Mas Perucho bajo mi dirección. Dicha memoria está concluida y

reúne todos los requisitos para su presentación y defensa como

TESIS DOCTORAL ante un tribunal.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo la

presente certificación en Valencia a 12 de Julio de 2012.

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AGRADECIMIENTOS

Siempre que leo un libro, observo las páginas en las que los autores presentan sus agradecimientos. Lo hago porque creo que son una parte importante del trabajo publicado.

Esta es la primera vez que una servidora hace un trabajo tan extendido que representa el fin-comienzo de una nueva etapa de mi vida. Por ello, quiero expresar mi gratitud a todas aquellas personas que me han acompañado en este viaje. Sin ellas, hubiese sido imposible afrontar con éxito la elaboración de este proyecto, en la que tanta ilusión he puesto.

En primer lugar, quiero agradecer al profesor Carlos Simón, mi director de tesis, la oportunidad y confianza depositada en mí desde el inicio. Gracias por haber sido mi ejemplo, mi punto de referencia, porque a tu lado he aprendido y aprendo muchísimo día a día.

A mi co-directora Irene Cervelló, gracias por tu disponibilidad y orientación, por el seguimiento y supervisión continúa de la presente tesis, pero sobre todo gracias por la motivación y el apoyo recibido a lo largo de estos años.

A los doctores Pellicer y Remohí, por permitir la realización de esta tesis en los laboratorios de la Fundación IVI.

A todos los miembros del IVI que, en mayor o menor medida, han ayudado a la elaboración de esta tesis proporcionando muestras o apoyo técnico, especialmente a Vicenta y al Dr. Jaime Ferro.

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Isa, Juanma, Sebas, Paco, José Vicente, Felip, Ana, Mercedes y a la recién incorporada Eva. Gracias a todos por vuestro cariño, por ayudarme, quererme y aceptarme como soy. Por hacerme más fácil la convivencia día a día con almuerzos, debates, confesiones…Aunque solo os haya nombrado, cada uno sabe lo que significa para mí y todo lo que hemos compartido en estos años.

Agradecer de forma especial a mis amigas y compañeras de viaje: Claudia y Amparo. Sin vosotras nada habría tenido sentido. Gracias por todas las horas y esfuerzo dedicados. Gran parte del trabajo es vuestro. Ha sido un placer trabajar codo con codo.

Gracias también a los compañeros que han estado y por algún motivo u otro ya no están. Porque de vosotros he obtenido más que apoyo y amistad. Carlos Estella, Isabel Galarza, Laura, Federica, Oscar, Paquillo, Josón, Patri… os deseo todo lo mejor.

A la gente de administración: Jaime, Loreto, Carmen, Mari Carmen, Raquel, Teresa, Marcos y Leo, gracias por hacer más fácil todos los aspectos burocráticos e informáticos que tanto nos complican la vida a veces. A los Igenómicos María Ruiz y David Blesa. Gracias también a toda la gente de DGP: Ana, Julio, Pere, José Antonio, Vicente, Mila, Mariaje y a nuestros compañeros más recientes de FISH, con los que espero compartir buenos momentos.

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A mis compañeros del CIPF, a cada uno de ellos, gracias por los momentos compartidos. Diana, Amparo Galán, Eva Sánchez, Marcia, Cristóbal, Eva Gómez, José Vicente, Anabel, Ana Martínez y María Eugenia. Os deseo lo mejor en esta nueva etapa que nos ha tocado vivir. Pero sobretodo a mis cómplices Sonia, Vero y María, gracias por vuestro cariño y apoyo día tras día, por todas las cosas que nos unen.

A José Enrique O’Connor y todo su equipo, por su apoyo y amabilidad. Especialmente a Alicia y Domingo, por hacer tan amenas las tardes sorter y por facilitarme tanto las cosas. Ha sido un placer conoceros y poder colaborar con vosotros.

A Viviana Bisbal, veterinaria del CIPF, por su cercanía y ayuda con el manejo de animales.

A Marga, gracias por haberme guiado y asesorado durante estos meses. Por demostrarme tu preocupación y apoyo para que todo esto saliera adelante de la mejor forma posible.

A mis compañeros de la Uni, por los comienzos en este mundo

bioloco, porque a pesar de la distancia, siempre os tengo presentes y porque la mayoría han pasado, están pasando o pasarán por la misma situación que yo. Gracias Eliseta, Fer, Carmenxu, Ana, Elena, Sarah, Aranxa y especialmente a Teresa, por tu amistad incondicional, por tu apoyo y por tu cariño.

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Ari, Virginia H, Vita, Ángela y Virginia S, mil gracias chicas. Pero sobretodo, agradecer a mi fiel amiga Ana el apoyo recibido durante estos años, por ayudarme a ver el lado bueno de las cosas y por ser mi espejo tantas veces. Porque nuestra amistad perdure toda la vida.

A mis amigos más recientes pero no por ello menos importantes en mi vida, Cris y Bau, Lorena y Quique, Sisa y Primo, Víctor y Sheila, Mari y Blesa y en general a toda la cuadrilla de Segorbe, por todo lo que nos queda por compartir juntos.

Gracias a toda mi familia, la cercana y la lejana, la política y la heredada: tíos Carmen y Jorge, Mari y Goyo, tía Carmen, Vicenta, Anna…Y en especial a dos personas que han sido mi sosiego y distracción en los momentos más difíciles: Vicenta y Luis, gracias por suplir el papel de mis abuelos a los que apenas he tenido oportunidad de conocer y por quererme como una nieta más.

A mi hermano, mi chico pequeño, por hacerme sentir un ejemplo a seguir y por tener el privilegio de ser su “chacha”. Porque te querré siempre.

A mi padre, porque me has inculcado valores tan importantes como el cariño, la honradez y el esfuerzo, por demostrarme que en la vida se puede conseguir lo que deseas si te lo propones. Gracias por ser mi paño de lágrimas en los momentos más difíciles y por disfrutar a mi lado todo lo bueno que nos ha pasado. Te quiero papi.

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A mi madre, por tu amor incondicional y tu ejemplo de trabajo y superación. Por darme todo sin esperar nada a cambio, por disfrutar y sufrir conmigo, por enseñarme a vivir. Porque a pesar de tus despistes, sé que siempre estarás ahí. Te adoro mamá.

Finalmente quiero dedicarle esta tesis a la persona con la que comparto mi vida desde hace ocho años, la que me da fuerzas para levantarme todas las mañanas y la que me anima en los momentos más difíciles. Paco eres mi mejor amigo, mi compañero, mi confidente. Gracias por tu infinita paciencia. Sin tu cariño y apoyo continuo, simplemente no habría llegado hasta aquí. Te quiero.

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El presente trabajo de tesis doctoral ha sido realizado en parte en los laboratorios de la Fundación IVI, así como en los laboratorios del Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia, y también en las dependencias del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), gracias a la ayuda de un proyecto de investigación con la Universidad de Valencia en la Facultad de Medicina, Departamento de Obstetricia y Ginecología que ha sido financiado por la ayuda PROMETEO de la Generalitat Valenciana para la realización de proyectos I+D para grupos de investigación (Diciembre 2008- Diciembre 2011).

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SIGLAS, ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS Y ANGLICISMOS 7-ADD: ABCG2: ADN: ADNc: APC: ARN: ARNm: A-T: BSA: BSP: CALP: CE: CEEA: CIPF: CIT: CMF: TC: DAPI: DEPC: DMEM: DNasa: dNTP: E₂: ESCs: ESR1: EDTA: 7-aminoactinomicina

ATP-binding cassette sub-family G member 2 Ácido DesoxirriboNucleico.

Ácido DesoxirriboNucleico complementario. Allophycocyanin (aloficocianina)

Ácido RiboNucleico.

Ácido RiboNucleico mensajero.

Adenina- Timina

Bovine Serum Albumin

Bone sialoprotein

Calponina (receptor muscular)

Cloning Efficiency (Eficiencia clonal)

Comité Ético de Experimentación con animales

Centro de Investigaciones Príncipe Felipe

Cell Initiator of Tumor (célula iniciadora de tumor)

Citometría de Flujo

Tomografía Computarizada

4',6-diamidino-2-phenylindole

Dietil Pirocarbonato

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

Desoxirribonucleasa

Deoxyribonucleotide triphosphate Estradiol.

Embryionic Stem Cells (células madre embrionarias)

Receptor de estrógenos 

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FITC: FS: FSHr: FT: GAPDH: G-C: HBSS: HEPES: H&E: IBMX: ICM: IMR: IP: IVI: LDH: LeioSP: LHr: MCGS: MMLV-RT: MDR1: N: NK: NOD: NSP: O2: P₄:

situación con respecto a otra). Isotiocinato de fluoresceína

Forward Scatter

Receptor de la hormona folículo-estimulante

Fracción Total

Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa Guanina- Citosina

Hank's buffered salt solution

(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)

Hematoxilina y Eosina.

3-isobuty-l-methyl-xanthine

Inner Cell Mass (masa celular interna)

Imagen de resonancia magnética

Ioduro de Propidio

Instituto Valenciano de Infertilidad.

Lactato deshidrogenasa

Línea generada a partir de la Side Population de miomas Receptor de hormona luteinizante.

Mesenchymal Cell Growth Supplement

Moloney Murine Leukemia Virus Retro-Transcriptase

(retrotranscriptasa del virus murino de la leucemia Moloney).

MultiDrug Resistance 1 número de muestras.

Natural- Killer (células nulas)

Non- Obese Diabetic

Non Side Population

Oxígeno

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PBS: PGC: PGR: PE: p/v: RNasa: RNM: RT-PCR: SBF: SCID: SMOOTH: SP: SS: SSC: TA: TAC: Taq: VAL-9: v/v:

Phosphate buffered saline (tampón salino fosfato)

Primordial Germ Cells (células madre germinales) Receptor de progesterona

Phycoerythrin (ficoeritrina)

peso/ volumen Ribonucleasa

RNM: Resonancia nuclear magnética

RT-PCR: Real Time Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real).

Suero Bovino Fetal

Severe Combined Immune Deficiency smoothelina (receptor muscular)

Side population

Side Scatter

Somatic Stem Cells (células madre somáticas)

Transit Amplifying cells ( células de amplificación transitoria)

Tomografía axial computarizada ADN polimerasa

Línea de células madre embrionarias

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Batch Effect: tendencia en los resultados debida a las condiciones del experimento.

Blast: (Basic Local Alignment Search Tool) es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN, ARN o de proteínas.

Dot plots: Representación gráfica que permite la comparación de secuencias biológicas y la identificación de determinadas regiones de interés.

Fold change (FC): tasa de cambio.

Forward Scatter (FS): Luz dispersada a 0º en un citómetro de flujo

Imprinting: impronta génica

In vivo: En el cuerpo. Conjunto de experimentos y de fenómenos observados que se efectúan directamente sobre el organismo vivo.

In vitro: Conjunto de fenómenos observados en el laboratorio, investigando y manipulando fuera del organismo vivo.

Microarray de expresión génica: Matriz bidimensional de soporte sólido en las que están impresas miles de sondas que detectan los genes expresados con una secuencia conocida.

Pathway: ruta de señalización.

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Primer: cebador. Secuencia corta de ácido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases con una hebra molde complementario y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde.

Screening: cribado o tamizaje

Side Population (SP): Población lateral

Side Scatter (SS): luz dispersada a 90º del eje de haz lumínico

Software: programa informático.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

I.- INTRODUCCION………. 1

1. El útero: fisiología y patología……… 1 1.1 El endometrio humano………...

1.2 El miometrio humano……….. 1.3 Alteraciones del miometrio………

1 4 4 1.3.1 Adenomiosis……….

1.3.2 Miomas o fibromas uterinos……… 1.3.3 Leiomiosarcoma………...

4 6 9 1.4 Teorías relacionadas con la formación de miomas……... 10 2. Implicación de las células madre en el desarrollo de miomas.. 12 2.1 Tipos de células madre y clasificación……… 12

2.1.1 Células madre embrionarias……….. 2.1.2 Células madre germinales……….. 2.1.3 Células madre de teratocarcinomas………. 2.1.4 Células madre somáticas………

13 15 16 17 3. Células madre somáticas en el útero humano……….. 21

3.1 Evidencias sobre la existencia de células madre

somáticas en el endometrio humano……….. 3.2 Evidencias sobre la existencia de células madre

somáticas en el miometrio humano……… 3.3 Evidencias sobre la existencia de células madre

somáticas en los miomas……….

21 23 25

(22)

IV.-DISEÑO EXPERIMENTAL……….. 1. Identificación, aislamiento y caracterización de la Side Population. 2. Modelo in vitro/ in vivo………

V.- MATERIALES Y MÉTODOS………

39 39 40

45

1. Obtención de candidatas a células madre somáticas

formadoras de miomas………. 45

1.1 Muestras biológicas y criterios de inclusión……… 1.2 Aislamiento de la Side Population………

45 45 1.2.1 Obtención y procesado de muestras biológicas….

1.2.1 Citometría de flujo……… 1.2.3 Viabilidad celular……….. 1.2.4 Tinción con Hoechst……… 1.2.5 Aislamiento de las células Side Population……….

46 47 51 52 54 1.3 Caracterización molecular de la Side Population……….. 55

1.3.1 Aislamiento de ARN………. 1.3.2 Retrotranscripción……… 1.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa………..

55 56 57 1.4 Transcriptómica de la Side Population……… 63

1.4.1 Aislamiento de ARN……… 1.4.2 Análisis transcriptómico: microarrays de expresión 1.4.3 Validación de la técnica de microarrays…………...

64 65 66

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2. Modelo in vitro: Generación de líneas celulares a partir de la

Side Population de miomas………. 67 2.1 Ensayo de clonogenicidad in vitro………

2.2 Creación de líneas celulares: LeioSP1 y Leio SP2……... 2.3 Análisis citogenético de LeioSP1 y LeioSP2……….. 2.4 Caracterización molecular de las líneas……….. 2.5 Caracterización fenotípica de las líneas………. 2.6 Diferenciación in vitro………. 2.7 Análisis estadístico de los datos obtenidos………

67 67 69 70 73 75 76 3. Modelo in vivo………. 77 3.1 Elaboración de un modelo animal………

3.2 Caracterización inmunohistoquímica en tejidos

candidatos………...

78

82 3.2.1 Detección de componentes de matriz extracelular

en tejidos candidatos………. 3.2.2 Inmunohistoquímica de receptores hormonales…. 3.2.3 Controles………

82 83 84

VI.- RESULTADOS……….. 87

1. Identificación, aislamiento y caracterización de candidatas a

células madre somáticas en los miomas humanos……….. 87 1.1 Viabilidad celular……….

1.2 Presencia y aislamiento de la Side Population en

miomas……….

87 88

(24)

2. Modelo in vitro: Generación y caracterización de líneas celulares obtenidas a partir de la SP de miomas humanos:

LeioSP1 y LeioSP2………. 94

2.1 Evaluación de eficiencia clonal………. 2.2 Generación y establecimiento de líneas: LeioSP1 y

LeioSP2……… 2.3 Análisis molecular e inmunofenotipo de LeioSP1 y

LeioSP2……… 2.4 Diferenciación adipogénica y osteogénica de LeioSP1 y LeioSP2………

94 96 97

100 3. Modelo in vivo: Reconstrucción de tejido miomatoso humano

en ratones NOD-SCID desde las líneas LeioSP1y LeioSP2……… 102 3.1 Modelo Animal……….

3.2 Caracterización inmunohistoquímica del tejido

reconstruido………. 102 103 VII.-DISCUSIÓN……… 109 VIII.- CONCLUSIONES……… 125 IX.- BIBLIOGRAFÍA………. 129 X.- ANEXOS……….. 153

(25)

I. Introducción

Lo que con mucho trabajo se adquiere, más se ama

(26)

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I.- INTRODUCCIÓN

1. El útero: fisiología y patología

Situado en la cavidad pélvica, el útero es un órgano muscular, extraperitoneal y hueco, destinado a albergar

pera invertida y presenta un estrechamiento circular denominado istmo que lo divide en dos regiones anatómicas distintas: el cérvix y el cuerpo. A su vez, la pared gruesa del útero se compone desde dentro hacia fuera, principalmente por tres

(tejido laxo que se extiende por los lados del útero), tal y como se detalla a continuación(Figura1).

1.1 El endometrio humano

El endometrio humano es la capa mucosa que tapiza el interior de la cavidad uterina. Está regulado hormonalmente y sufre unos cambios periódicos que son la base del ciclo menstrual en humanos y primates

Figura 1. Representación esquemática e histología del útero humano.

1

INTRODUCCIÓN

fisiología y patología

Situado en la cavidad pélvica, el útero es un órgano muscular, extraperitoneal y hueco, destinado a albergar el embarazo

pera invertida y presenta un estrechamiento circular denominado istmo que dos regiones anatómicas distintas: el cérvix y el cuerpo. A su vez, la pared gruesa del útero se compone desde dentro hacia fuera, principalmente por tres capas: endometrio, miometrio y serosa o perimetrio (tejido laxo que se extiende por los lados del útero), tal y como se detalla a continuación(Figura1).

El endometrio humano

Representación esquemática e histología del útero humano.

Situado en la cavidad pélvica, el útero es un órgano muscular, el embarazo. Tiene forma de pera invertida y presenta un estrechamiento circular denominado istmo que dos regiones anatómicas distintas: el cérvix y el cuerpo. A su vez, la pared gruesa del útero se compone desde dentro hacia fuera, capas: endometrio, miometrio y serosa o perimetrio (tejido laxo que se extiende por los lados del útero), tal y como se detalla a

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2

superiores. Estos cambios van a servir para su preparación en la adquisición del estado receptivo, imprescindible para la implantación embrionaria y el desarrollo de la gestación. Asimismo, puede sufrir alteraciones patológicas como la endometriosis y el cáncer endometrial.

Desde el punto de vista celular-histológico, el endometrio se encuentra constituido por un compartimento epitelial, uno estromal y otro vascular con la existencia, además, de una población de células inmunes residentes. Todo ello se encuentra distribuido en dos regiones denominadas capa

funcionalis y capa basalis. La primera responde a progesterona y estradiol,

ejerciendo su acción a través de mediadores locales que actúan de manera paracrina sobre las células vecinas o sobre las propias células del endometrio de manera autocrina (Giudice, 1994; Giudice y cols., 2002), dando lugar a la descamación durante la menstruación y a lo largo del ciclo reproductivo de la mujer. Por el contrario, la región basalis no responde a hormonas esteroideas y no sufre descamación, constituyendo la base para la regeneración cíclica del endometrio.

Durante el ciclo menstrual, el endometrio sufre una serie de cambios en respuesta a fluctuaciones en los niveles de hormonas esteroideas procedentes del ovario. Ello hace que a lo largo del ciclo se distingan dos fases: la proliferativa y la secretora, separadas ambas por la ovulación (Figura2).

Fase proliferativa: en ella se desarrolla el folículo que contiene el ovocito. Se extiende desde el final de la menstruación (día 28/0) hasta la ovulación (día 14), y en ella existe una secreción elevada de estrógenos. En esta fase, todos los componentes del endometrio sufren una intensa

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proliferación; se hacen visibles muchas mitosis y aumenta el grosor endometrial desde 0,5 mm hasta unos 7 mm (McLennan y Rydell, 1965). S produce una inducción de los receptores de progesterona, que permitirán a las células responder a esta hormona durante la segunda mitad del ciclo. Varios factores de crecimiento y citoquinas como el factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento

de fibroblastos y el factor de crecimiento de células vasculares endoteliales entre otros, favorecen esta rápida proliferación (

Fase secretora:

14) hasta la menstruación (día 28/0). En ella, la concentración de progesterona aumenta debido a la secreción del cuerpo lúteo, y los estrógenos permanecen altos. Todos estos cambios están enfocados a la preparación del endometrio para la implantación del embrión. De modo que en ausencia de fecundación, el cuerpo lúteo se degenera y, los niveles de hormonas ováricas caen bruscamente, produciéndose la involución y descamación del endometrio, dando lugar al f

Figura 2.

durante las

3

proliferación; se hacen visibles muchas mitosis y aumenta el grosor endometrial desde 0,5 mm hasta unos 7 mm (McLennan y Rydell, 1965). S produce una inducción de los receptores de progesterona, que permitirán a las células responder a esta hormona durante la segunda mitad del ciclo. Varios factores de crecimiento y citoquinas como el factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento de células vasculares endoteliales entre otros, favorecen esta rápida proliferación (Figura

Fase secretora: comprendida desde el momento de la ovulación (día

14) hasta la menstruación (día 28/0). En ella, la concentración de progesterona aumenta debido a la secreción del cuerpo lúteo, y los estrógenos permanecen altos. Todos estos cambios están enfocados a la reparación del endometrio para la implantación del embrión. De modo que en ausencia de fecundación, el cuerpo lúteo se degenera y, los niveles de hormonas ováricas caen bruscamente, produciéndose la involución y descamación del endometrio, dando lugar al flujo menstrual (

. Representación gráfica del endometrio humano

durante las distintas fases del ciclo menstrual

proliferación; se hacen visibles muchas mitosis y aumenta el grosor endometrial desde 0,5 mm hasta unos 7 mm (McLennan y Rydell, 1965). Se produce una inducción de los receptores de progesterona, que permitirán a las células responder a esta hormona durante la segunda mitad del ciclo. Varios factores de crecimiento y citoquinas como el factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento de células vasculares endoteliales

igura 2).

comprendida desde el momento de la ovulación (día 14) hasta la menstruación (día 28/0). En ella, la concentración de progesterona aumenta debido a la secreción del cuerpo lúteo, y los estrógenos permanecen altos. Todos estos cambios están enfocados a la reparación del endometrio para la implantación del embrión. De modo que en ausencia de fecundación, el cuerpo lúteo se degenera y, los niveles de hormonas ováricas caen bruscamente, produciéndose la involución y

lujo menstrual (Figura 2).

Representación gráfica del endometrio humano distintas fases del ciclo menstrual

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1.2 El miometrio humano

Constituye casi la totalidad de la pared uterina y está formado por una intrincada red de fibras musculares lisas, dispersas en una matriz extracelular de tejido conectivo principalmente por fibras de colágeno y proteoglicanos. Esta musculatura está dispuesta en 3 capas: una capa fina externa longitudinal, una oblicua media y una circular submucosa, que aportan al útero su tonicidad normal.

En humanos, el crecimiento del útero durante el embarazo se debe principalmente a la hipertrofia (aumento del tamaño celular) del miometrio, sin embargo en las primeras semanas de gestación también tiene lugar una importante hiperplasia (aumento en el número de células) que contribuye de forma más significativa a este engrosamiento del miometrio. Ambos procesos contribuyen de forma dramática al crecimiento del útero durante el embarazo, exhibiendo una expansión hasta 20 veces superior a la longitud de la fibra del estado no grávido, y se repite sucesivamente en cada gestación (Ramsey, 1994). También existe un aumento en el número de uniones estrechas entre las células miometriales, que conducen el estímulo electrofisiológico y favorecen una adecuada transmisión de las contracciones uterinas antes de iniciarse el parto (Garfield y cols., 1977).

1.3 Alteraciones del miometrio

1.3.1 Adenomiosis

La adenomiosis es una enfermedad benigna del útero en la cual componentes normalmente limitados al endometrio son encontrados en el miometrio. Los adenomiomas se presentan como un nódulo circunscrito

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compuesto por fibras musculares lisas, glándulas endometriales y ocasionalmente estroma endometrial. Puede presentarse como un pólipo endometrial o como una masa intramiometrial (Fukunaga y cols., 1995).

La prevalencia exacta no es conocida, aunque algunos estudios consideran que el 20% de las mujeres padecen la enfermedad, siendo más frecuente entre los 40 y 50 años. Sin embargo, cuando se efectúa un análisis microscópico cuidadoso su prevalencia puede incrementar hasta en un 65%.

La causa de la adenomiosis es también desconocida. La teoría más aceptada acerca del desarrollo de la enfermedad propone que la barrera entre el endometrio y el miometrio se encuentra alterada, la cual normalmente previene la invasión de las glándulas endometriales y el estroma hacia el miometrio. Esta alteración permite que ocurra invasión hacia el miometrio. Se piensa que este proceso solo ocurre bajo la presencia de estrógenos, sin embargo, existe muy poca evidencia científica que apoye esta hipótesis.

En la mayoría de casos, la adenomiosis está asociada con otros trastornos uterinos. De hecho, más del 80% de las mujeres con adenomiosis tienen otro proceso patológico asociado: 50% tienen fibromas, 11% endometriosis (tejido endometrial fuera del útero, más común en los ovarios) y 7% tienen pólipos endometriales (sobrecrecimiento benigno del tejido endometrial). Por todo ello, los síntomas de estas patologías asociadas pueden a menudo ocultar el diagnostico de adenomiosis.

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1.3.2 Miomas o fibro

Los miomas uterinos también conocidos como leiomiomas, fibromas o fibroides uterinos, son el tumor pélvico benigno más frecuente en la mujer (Stewart y cols., 2001). Crecen en el

masas firmes, blanquecinas o rosado grisácea, fasciculadas, bien delimitadas y no encapsuladas. Histológicamente están constituidos por haces de musculatura lisa con un alto contenido en matriz extracelular fundamentalmente colágeno, fibronectina y proteoglicanos.

Pueden presentar diferentes tamaños

clasifican generalmente en función de su localización en el útero, distinguiendo entre

hacen protrusión hacia la cavidad endometrial

en el miometrio, pudiendo distorsionar la cavidad uterina

situados debajo de la serosa uterina protruyendo en su crecimiento

cavidad abdominal, estos a su vez pueden ser pedunculados (adosados al cuerpo del útero por un tallo estrecho) o sésiles (de base ancha) (

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1.3.2 Miomas o fibromas uterinos

Los miomas uterinos también conocidos como leiomiomas, fibromas o fibroides uterinos, son el tumor pélvico benigno más frecuente en la mujer (Stewart y cols., 2001). Crecen en el miometrio y se caracterizan por ser masas firmes, blanquecinas o rosado grisácea, fasciculadas, bien delimitadas y no encapsuladas. Histológicamente están constituidos por haces de musculatura lisa con un alto contenido en matriz extracelular

colágeno, fibronectina y proteoglicanos.

Pueden presentar diferentes tamaños, ser únicos o múltiples. Se clasifican generalmente en función de su localización en el útero, distinguiendo entre submucosos – se originan en la pared miometrial y hacen protrusión hacia la cavidad endometrial-, intramurales

en el miometrio, pudiendo distorsionar la cavidad uterina

situados debajo de la serosa uterina protruyendo en su crecimiento

cavidad abdominal, estos a su vez pueden ser pedunculados (adosados al cuerpo del útero por un tallo estrecho) o sésiles (de base ancha) (

Figura 3

gráfica de un útero

polimiomatoso en el que se pueden observar los

tipos de miomas.

Los miomas uterinos también conocidos como leiomiomas, fibromas o fibroides uterinos, son el tumor pélvico benigno más frecuente en la mujer y se caracterizan por ser masas firmes, blanquecinas o rosado grisácea, fasciculadas, bien delimitadas y no encapsuladas. Histológicamente están constituidos por haces de musculatura lisa con un alto contenido en matriz extracelular

colágeno, fibronectina y proteoglicanos.

ser únicos o múltiples. Se clasifican generalmente en función de su localización en el útero, se originan en la pared miometrial y

intramurales - localizados

en el miometrio, pudiendo distorsionar la cavidad uterina- y subserosos – situados debajo de la serosa uterina protruyendo en su crecimiento hacia la cavidad abdominal, estos a su vez pueden ser pedunculados (adosados al cuerpo del útero por un tallo estrecho) o sésiles (de base ancha) (Figura 3).

Figura 3. Representación

gráfica de un útero

polimiomatoso en el que se pueden observar los distintos

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A nivel histológico también se han identificado varios subtipos de miomas: miomas celulares - constituidos por células pequeñas y citoplasma escaso-, atípicos- con células atípicas distribuidas por el tumor-,

epiteloides- incluyen los leiomioblastomas y los miomas plexiformes, su

conducta clínica va a depender de la atipia, grado de hialinización, tamaño y actividad mitótica-, mixoides- bien circunscritos sin numerosas mitosis ni atipias-, lipoleiomiomas- con áreas de tejido adiposo, circunscritas o difusas y miomas con túbulos- poco frecuentes, se observan túbulos revestidos por epitelio y diferenciación mesotelial.

Aunque las causas exactas de los miomas son desconocidas, existe una cierta tendencia hereditaria, familiar y racial (National Center for Health Statistics). Esta triada, hace pensar en una etiología genética, sin embargo, hasta el momento, los genes determinantes no han podido ser descritos. También se han descrito factores de crecimiento (factor de crecimiento epidérmico, de tipo insulínico, etc) y factores hormonales (prolactina, hormona del crecimiento) involucrados en su desarrollo (Flake y cols., 2003).

Estos factores posiblemente son responsables de la iniciación de los cambios genéticos adquiridos, incluyendo anomalías en el miometrio, cambios hormonales, una respuesta al daño isquémico y una elevada presencia de los receptores de estrógenos en el miometrio. De hecho, la aparición y crecimiento de los miomas se ven favorecidos por los estrógenos, por lo que su presentación se produce en la edad fértil de la mujer. Se estima que aproximadamente una de cada cuatro a cinco mujeres en edad reproductiva padecen de este tipo de tumor, resultando muy

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infrecuente que lo haga antes de la primera menstruación ( después de la menopausia

En muchos casos, la exploración por un ginecólogo permite detectar la presencia de estos tumores, su tamaño y localización, aunque en pacientes obesas con miomas pequeños, la exploración puede ser confusa (falsos negativos). La técnica diagnóstica más útil

realizar tanto por vía vaginal como abdominal. Los ecógrafos modernos permiten detectar miomas de hasta 5mm y los sistemas Doppler que incorporan, permiten analizar su vascularización. Otras técnicas diagnósticas son la tomografía axial computerizada (TAC) y la resonancia nuclear magnética (RNM). Además, los estudios de imagen como por ejemplo la ultrasonografía

tomografía computarizada

diagnóstico y distinguir los miomas de otras lesiones intramurales.

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infrecuente que lo haga antes de la primera menstruación ( menopausia. (Figura 4).

En muchos casos, la exploración por un ginecólogo permite detectar la presencia de estos tumores, su tamaño y localización, aunque en pacientes obesas con miomas pequeños, la exploración puede ser confusa (falsos negativos). La técnica diagnóstica más útil es la ecografía

realizar tanto por vía vaginal como abdominal. Los ecógrafos modernos permiten detectar miomas de hasta 5mm y los sistemas Doppler que ten analizar su vascularización. Otras técnicas diagnósticas son la tomografía axial computerizada (TAC) y la resonancia nuclear magnética (RNM). Además, los estudios de imagen como por

ultrasonografía, imágenes de la resonancia magnética

tomografía computarizada (TC) pueden ser útiles a la hora de confirmar el diagnóstico y distinguir los miomas de otras lesiones intramurales.

Figura 4.

factores que influyen en el desarrollo del mioma uterino.

Obsérvese el papel que se le concede no solo a los estrógenos, sino también a la progesterona, a los factores genéticos y de crecimiento.

infrecuente que lo haga antes de la primera menstruación (menarquia) o

En muchos casos, la exploración por un ginecólogo permite detectar la presencia de estos tumores, su tamaño y localización, aunque en pacientes obesas con miomas pequeños, la exploración puede ser confusa (falsos ecografía, que se puede realizar tanto por vía vaginal como abdominal. Los ecógrafos modernos permiten detectar miomas de hasta 5mm y los sistemas Doppler que ten analizar su vascularización. Otras técnicas diagnósticas son la tomografía axial computerizada (TAC) y la resonancia nuclear magnética (RNM). Además, los estudios de imagen como por , imágenes de la resonancia magnética (IRM), y ) pueden ser útiles a la hora de confirmar el diagnóstico y distinguir los miomas de otras lesiones intramurales.

Figura 4. Acción de los diferentes

factores que influyen en el desarrollo del mioma uterino.

Obsérvese el papel que se le concede no solo a los estrógenos, sino también a la progesterona, a los factores genéticos y de crecimiento.

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El tratamiento de los miomas depende de varios factores: a) de la edad, b) de que la paciente desee tener hijos o no, c) del número, d) tamaño y e) de la localización de los miomas y por supuesto, de la sintomatología que se presente. Si la paciente desea tener hijos y el mioma puede ser el causante de su infertilidad, la mejor medida será la quirúrgica (Buttram, 1986). Existen técnicas como la histeroscopia y la laparoscopia que evitan heridas mayores y normalmente son ambulatorias (Hurst y cols., 2003). Si los miomas son pequeños y están estables, el mejor tratamiento serán los controles ginecológicos periódicos. Si se observa que los miomas crecen y/o empiezan a causar dolor, hinchazón abdominal y sangrados excesivos, determinados fármacos como los progestágenos, esteroides andrógenos (danazol y gestrinona) y los antinflamatorios que inhiben la síntesis de las prostanglandinas pueden ayudar a controlarlos. Cuando los miomas crecen muy deprisa, o cuando los síntomas no responden a las medidas farmacológicas, el mejor tratamiento serán técnicas quirúrgicas o procedimientos menos invasivos como es la embolización de arterias que irrigan el mioma por parte de los radiólogos intervencionistas.

1.3.3 Leiomiosarcoma

La transformación de los miomas uterinos (benignos) en leiomiosarcomas uterinos (tumores malignos del músculo liso del útero) es extremadamente inusual, y de hecho muchos investigadores y clínicos creen que nunca ocurre este tipo de transformación. Sin embargo, sin un examen patológico del útero, no es posible determinar si es el caso. El diagnóstico con lactato deshidrogenasa (LDH) total en suero y la resonancia nuclear magnética (RNM) con contraste de gadolino (Gd-DTPA) con imágenes cada 40 y 60 segundos ha resultado ser de una alta

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precisión. Gracias a estas técnicas se estima que los leiomiosarcomas uterinos se encuentran en aproximadamente el 0.1% de las mujeres con miomas y se ha reportado que están frecuentemente asociados con fibromas grandes o que crecen rápidamente. Por lo tanto, en mujeres con estos tipos de tumores se puede considerar una intervención quirúrgica para descartar el leiomiosarcoma, una lesión poco común pero médicamente importante.

1.4 Teorías relacionadas con la formación de miomas

A pesar del importante impacto de los miomas, poco se sabe acerca de las principales causas implicadas en su formación y desarrollo. Hasta hace poco, las hormonas esteroides (estrógeno y progesterona) fueron consideradas los más importantes reguladores del crecimiento de los miomas. Hay abundantes evidencias científicas que indican que el estrógeno fomenta el crecimiento del fibroma, incluyendo las observaciones clínicas de que los fibromas crecen en presencia de altos niveles de estrógeno, durante los años reproductivos, y que sufren un retroceso en presencia de niveles bajos de estrógeno, como se produce después de la menopausia o durante la terapia con análogos de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Además, los fibromas tienen tienen más receptores de estrógenos, y convierten el estradiol a estrona más lentamente que el miometrio normal. (Sabry y cols., 2012)

También se cree que la progesterona desempeña un papel importante en el crecimiento del fibroma, sobre todo a nivel clínico. Por ejemplo, el tamaño del fibroma aumenta durante el tratamiento con progestágenos sintéticos. La disminución del tamaño del mioma bajo

(37)

11

tratamiento con el agente antiprogesterona, RU-486, también apoya el papel de la progesterona como promotor del crecimiento de los fibromas. Histológicamente, los fibromas de las pacientes tratadas con progesterona muestran mayor crecimiento que los de las pacientes sin tratar y a nivel bioquímico, también se observa una mayor concentración de receptores de progesterona en los fibromas que en miometrio normal. En conjunto, estos datos sugieren que la progesterona también aumenta el crecimiento del fibroma.

Otras hormonas como la hormona del crecimiento (GH) y la prolactina (PRL) también parecen promover el crecimiento de los fibromas, pero su papel aún no está claramente definido.

Más recientemente, se ha demostrado que los factores de crecimiento, (mediadoras de los efectos de promoción del crecimiento de los estrógenos) podrían jugar un papel importante en el desarrollo de fibromas. Los factores potencialmente importantes incluyen factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento insulinico (IGF), y el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). En general, los factores de crecimiento y la progesterona probablemente también actúan sobre el crecimiento del tumor, pero sólo después de que éstos ya se hayan formado.

La incidencia de miomas con alteraciones cromosómicas es aproximadamente de un 40%, debido fundamentalmente a translocaciones, delecciones y duplicaciones en los cromosomas 7, 12, 14 y 6 (Brosens y cols., 1998). Además se ha visto una posible relación de estas alteraciones

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12

con el tamaño del tumor (Rein y cols., 1998) y su localización (Brosens y cols., 1998).

En los últimos años, se han identificado mutaciones en los genes “high mobility group” (HMGA) (Tallini y Dal, 1999; Ligon y Morton, 2000) y en “mediator complex subunit 12” (MED12) (Mäkinen y cols., 2011; McGuire y cols., 2012), que parecen ser importantes en el desarrollo de algunos fibromas. Normalmente, estos genes codifican proteínas que ayudan a controlar el crecimiento celular al regular indirectamente la transcripción del ADN. Sin embargo, las mutaciones en estos genes son probablemente cambios secundarios en las células ya genéticamente susceptibles.

2. Implicación de las células madre en el desarrollo de miomas

2.1 Tipos de células madre y clasificación

Según Alberts y cols. en 1994 “una célula madre es toda aquella que no

está totalmente diferenciada, tiene capacidad de división ilimitada y cuando se divide, cada célula puede permanecer como célula madre o puede iniciar una vía que conduce de forma irreversible a su diferenciación terminal”.

A lo largo del desarrollo ontogénico, podemos identificar y aislar distintos tipos de células madre. Atendiendo a su potencial de desarrollo se clasifican como totipotentes (capaces de diferenciarse en un nuevo organismo), pluripotentes (capaces de dar lugar a cualquier tipo celular del organismo) o multipotentes (dan lugar a células especializadas de su mismo linaje). Dependiendo de su procedencia se distinguen, varios tipos diferentes de células madre: embrionarias, germinales, de teratocarcinomas y somáticas,

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tal y como se muestra en la figura 5 2000).

2.1.1 Células madre embrionarias

Las células madre embrionarias (del inglés Embryonic Stem cells, ESCs) fueron aisladas por primera vez en 1981 a partir de la masa celular interna (ICM) de blastocistos de ratón (Evans y Kaufman, 1981) y más tarde a partir de embriones humanos (Thomson y M

morfología redondeada y con un reducido ratio núcleo: citoplasma, que crecen formando colonias bajo determinadas condiciones de cultivo y que se caracterizan por ser pluripotentes (capaces de generar todos los tipos celulares del organismo tanto

Figura 5. Desarrollo ontogénico y tipos de células madre, ESC (células madre

embrionarias), PGC (células madre germinales), SSC (células madre somáticas) y ECC (células madre de

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se muestra en la figura 5 (Thomson, 1998;

.1 Células madre embrionarias

Las células madre embrionarias (del inglés Embryonic Stem cells, ESCs) fueron aisladas por primera vez en 1981 a partir de la masa celular interna (ICM) de blastocistos de ratón (Evans y Kaufman, 1981) y más tarde a partir de embriones humanos (Thomson y Marshall, 1998). Se trata de células de morfología redondeada y con un reducido ratio núcleo: citoplasma, que crecen formando colonias bajo determinadas condiciones de cultivo y que se caracterizan por ser pluripotentes (capaces de generar todos los tipos elulares del organismo tanto in vitro como in vivo, mediante la formación de

Desarrollo ontogénico y tipos de células madre, ESC (células madre embrionarias), PGC (células madre germinales), SSC (células madre somáticas) y ECC (células madre de teratocarcinoma).

(Thomson, 1998; Reubinoff y cols.,

Las células madre embrionarias (del inglés Embryonic Stem cells, ESCs) fueron aisladas por primera vez en 1981 a partir de la masa celular interna (ICM) de blastocistos de ratón (Evans y Kaufman, 1981) y más tarde a partir arshall, 1998). Se trata de células de morfología redondeada y con un reducido ratio núcleo: citoplasma, que crecen formando colonias bajo determinadas condiciones de cultivo y que se caracterizan por ser pluripotentes (capaces de generar todos los tipos , mediante la formación de

Desarrollo ontogénico y tipos de células madre, ESC (células madre embrionarias), PGC (células madre germinales), SSC (células madre somáticas) y

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cuerpos embrioides y teratomas, respectivamente), así como de mantenerse indiferenciadas en cultivo manteniendo su identidad genética.

Según Marshall y cols., (2001) y Smith (2001) las características que definen las ESCs son las siguientes:

• Proceden de la masa celular interna de embriones en estado de blastocisto, de mórula o incluso de blastómera única.

• Tienen capacidad de división asimétrica ilimitada, y se mantienen indiferenciadas en las condiciones de cultivo adecuadas.

• Presentan cariotipo normal que permanece estable.

• Son capaces de diferenciarse a derivados de las tres hojas embrionarias: ectodermo, mesodermo, endodermo y también células germinales. Por lo tanto tienen capacidad pluripotente, lo que las convierte en un tipo celular único.

• Cuando se transplantan durante el desarrollo embrionario murino, poseen la capacidad de integrarse en todos los tejidos fetales dando lugar a quimeras.

• Tienen la capacidad de dar lugar a células de la línea germinal

• Presentan expresión de marcadores de indiferenciación, entre ellos los factores de transcripción octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4), Sex determining Region Y-box 2 (SOX2) y Nanog, que regulan gran número de genes y mantiene las células embrionarias en estado de proliferación e indiferenciación.

• Pueden inducir su proliferación o diferenciación bajo condiciones in

vitro.

Estas características convierten a las ESC en las perfectas candidatas para el establecimiento de modelos in vitro del desarrollo de diversos linajes

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celulares, además de otras aplicaciones como el screening de fármacos y el trasplante alógeno (procedentes de pacientes sanos) para reparar órganos dañados en pacientes con enfermedades crónico-degenerativas. Sin embargo, el hecho de que para su derivación haya que manipular embriones humanos, ha puesto en entredicho su utilización por razones éticas. Además, existe la posibilidad de rechazo inmune en los pacientes en que se trasplanten. Es por ello que se han hecho grandes esfuerzos en la comunidad científica en la búsqueda de maneras alternativas de generar células con estas características sin la necesidad de destruir embriones humanos y que además pudieran ser autólogas a los pacientes que las recibirán para evitar su rechazo.

2.1.2 Células madre germinales

La línea germinal proviene de una pequeña población de células pluripotentes que se segrega del resto de células del embrión durante los primeros estadios de la embriogénesis y conforma lo que se denominan células germinales primordiales (del inglés Primordial Germ Cells, PGCs). Se obtienen de la cresta gonadal de embriones de ratón entre los días E8.5 y E12.5 (Wylie y cols., 1986) y de embriones humanos de 5-9 semanas de gestación (Fujimoto y cols., 1977) siendo las precursoras de los gametos.

Las células madre germinales o “primordial germ cells” (PGC) tienen propiedades bioquímicas, morfológicas, inmunológicas y de desarrollo comunes a las células madre embrionarias, ya que son pluripotentes y contribuyen a la formación de la línea germinal cuando se inyectan en blastocistos dando lugar a animales quiméricos (Matsui y cols., 1992; Stewart y cols., 1994). Asimismo, pueden diferenciarse a cuerpos

(42)

16

embrioides y formar teratomas in vivo. No obstante, existen diferencias a nivel del patrón de metilación de estos tipos celulares, ya que la secuencia de ADN se mantiene inalterada, pero su capacidad de expresión se ve modificada. Dichas diferencias podrían reflejar los cambios en el programa de desarrollo de las PGC versus las ESC. A pesar de ello, la existencia de este patrón de metilación génica no parece afectar a la capacidad de estas células para contribuir al desarrollo de la línea germinal en quimeras (Sato y cols., 2003).

Existe una gran variabilidad en la expresión de los genes sujetos a

imprinting o mecanismo de regulación génica, donde pueden modificar su

funcionamiento sin necesidad de un cambio en la secuencia del ADN en las líneas de células germinales primordiales, ya que en algunos de los descendentes de ratones quiméricos resultantes de la inyección de estas células, se puede ver que los genes de las PGC se transmiten de forma normal, mientras que en otros casos, los animales presentan anomalías a nivel de crecimiento y de su estructura ósea.

Aunque la mayor parte de los estudios se han realizado en ratón (Matsui y cols., 1992), cada vez existe un mayor interés en la obtención de PGC humanas (Shamblott y cols., 1998; 2001).

2.1.3 Células madre de teratocarcinomas

Los teratocarcinomas son tumores que contienen una gran variedad de tipos celulares que incluyen desde una población de células indiferenciadas, hasta células con una diferenciación completa como son las células musculares, cartílago, hueso, epitelio, neuroectodermo primitivo, estructuras ganglionares y epitelio glandular.

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Se localizan en las gónadas y se forman a partir de células madre pluripotentes de carcinoma embrionario, también llamadas células madre de teratocarcinomas, que derivan, a su vez, de células primordiales germinales del embrión. Ésta población de células indiferenciadas, tienen propiedades bioquímicas y de desarrollo similares a las de la masa celular interna. Además, no solo se dividen, sino que también pueden diferenciarse hacia una amplia variedad de tejidos y formar tumores constituidos por una amalgama de tejidos somáticos yuxtapuestos de manera desorganizada (Kleinsmith y Pierce 1964; Stevens, 1984).

Las primeras líneas de células madre aisladas a partir de teratocarcinomas se obtuvieron en los años setenta (Kahan y Ephrussi, 1970; Jakob y cols., 1973; Gearhart y Mintz, 1974; Nicolas y cols., 1976). Estas conservan su capacidad de diferenciación, produciendo derivados de las 3 capas embrionarias: endodermo, mesodermo y ectodermo (Nicolas y cols., 1976). Además, tras micro-inyectarlas en la masa celular interna de blastocistos de ratón, dan lugar a animales quiméricos viables y fértiles (Mintz y Illmensee, 1975). Sin embargo, las células madre de teratocarcinomas embrionarios no conservan la misma capacidad pluripotente de las células embrionarias tempranas y además de presentar un cariotipo aneuploide, sufren cambios durante su transición in vivo al estado tumoral (Andrews, 2002).

2.1.4 Células madre somáticas

Una población de células madre somáticas (del inglés Somatic Stem Cells, SSC) es una población relativamente indiferenciada de células localizadas en tejidos u órganos adultos, que pueden renovarse a sí

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mismas y diferenciarse en tipos celulares más especializados de su propio tejido (Weissman, 2002; Potten y Loeffler, 1990; Eckfeldt y cols., 2005). Su singularidad, escasez y la falta tanto de características morfológicas distintivas como marcadores específicos hacen que su identificación y localización sean muy complejas en la mayoría de los tejidos. Por ello, gran parte de las SSC son identificadas por sus propiedades funcionales, entre las cuales se incluye el alto potencial de proliferación, la importante capacidad reparadora y la capacidad para diferenciarse hacia las estirpes celulares de las que provienen e incluso hacia otras distintas.

La propiedad de autorenovación o la capacidad de producir células hijas idénticas a sí mismas es esencial para mantener la reserva de células madre en los tejidos. La mayoría de los tejidos que tienen células madre somáticas (SSC), son capaces de renovar un número limitado de células diferenciadas de acuerdo con su localización (Sanai y cols., 2004; Beltrami y cols., 2003). En algunos tejidos, estas células son unipotenciales y están capacitadas para generar un tejido celular específico (Körbling y cols., 2003; Alison y cols., 2004). En otros tejidos, las SSC están relativamente indiferenciadas y se localizan en un microambiente fisiológico denominado nicho (Schofield, 1978; Li y cols., 2007), en el que permanecen en estado de quiescencia a través de micro ambientes moleculares de señalización inhibitorios frente a la división y a la diferenciación celular, entre los cuales a menudo están implicados el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y miembros de la familia morfogénica del hueso, también conocida como Bone Morphogenic Protein (BMP) (Li y Xie, 2005).

(45)

Dentro del proceso

celular asimétrica que genera una célula progenitora y otra célula intermedia parcialmente diferenciada y con capacidad de

célula de amplificación transitoria (

transitoria dará lugar a diferentes tipos celulares adultos presentes en el tejido de origen, mientras que las progenitoras generaran, a su vez, célula idénticas a sí mismas que permitan mantener el reservorio de células madre somáticas (SSC) en el órgano o tejido en cuestión (

Para que este proceso se lleve a cabo son cruciales las interacciones con el nicho donde se localizan

general, estas células están en fase G

reparar el tejido donde residen. Pueden dar lugar a células diferenciadas del mismo linaje del tejido de origen y son mucho más plásticas de lo que en principio se pensó, ya que también pueden dar lugar a células de lin

diferentes.

Se define como plasticidad celular, la capacidad de una célula madre somática de un tejido especifico para generar un tipo celular especializado

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proceso de diferenciación, tiene lugar un proceso de división celular asimétrica que genera una célula progenitora y otra célula intermedia parcialmente diferenciada y con capacidad de división, conocida como célula de amplificación transitoria (transit Amplifying cells,

transitoria dará lugar a diferentes tipos celulares adultos presentes en el tejido de origen, mientras que las progenitoras generaran, a su vez, célula idénticas a sí mismas que permitan mantener el reservorio de células madre somáticas (SSC) en el órgano o tejido en cuestión (

Para que este proceso se lleve a cabo son cruciales las interacciones con el nicho donde se localizan (Zhang y cols., 2003

general, estas células están en fase G0 y su papel es mantener, renovar y/o reparar el tejido donde residen. Pueden dar lugar a células diferenciadas del mismo linaje del tejido de origen y son mucho más plásticas de lo que en principio se pensó, ya que también pueden dar lugar a células de lin

Figura 6.

jerarquía de la diferenciación de las células madre. Las células madre son capaces de auto renovar

células progenitoras

Estas proliferan y dan lugar a células TA, las cuales darán lugar a células diferenciadas sin capacidad de diferenciación.

de diferenciación, tiene lugar un proceso de división celular asimétrica que genera una célula progenitora y otra célula intermedia división, conocida como

transit Amplifying cells, TA). Esta célula

transitoria dará lugar a diferentes tipos celulares adultos presentes en el tejido de origen, mientras que las progenitoras generaran, a su vez, células idénticas a sí mismas que permitan mantener el reservorio de células madre somáticas (SSC) en el órgano o tejido en cuestión (Figura 6).

Para que este proceso se lleve a cabo son cruciales las interacciones , 2003; Li y cols., 2007). Por lo y su papel es mantener, renovar y/o reparar el tejido donde residen. Pueden dar lugar a células diferenciadas del mismo linaje del tejido de origen y son mucho más plásticas de lo que en principio se pensó, ya que también pueden dar lugar a células de linajes

Figura 6. Esquema de la

jerarquía de la diferenciación de las células madre. Las células madre son capaces de auto-renovarse y de diferenciarse a células progenitoras.

Estas proliferan y dan lugar a células TA, las cuales darán a células diferenciadas sin capacidad de diferenciación.

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diferente al de su origen embrionario. Por lo tanto, para evaluar la plasticidad en condiciones experimentales deben cumplirse criterios básicos que incluyen: la capacidad de auto-renovación, la diferenciación morfológica y funcional hacia tipos celulares de su origen embrionario y por lo menos a un tipo celular de diferente linaje.

Hasta el momento, la mayor fuente de células madre en el organismo adulto es la médula ósea (Prockop,1997; Weissman, 2000; Pittenger,1999), aunque en los últimos años han sido descritas en prácticamente todos los tejidos: sistema nervioso central (Gage, 2000; Reynolds y cols.,1992), hígado (Forbes y cols., 2002), órganos hematopoyéticos (Bonnet, 2002), músculo esquelético (Hughes y Blau, 1990), endometrio (Chan y cols., 2004; Cervelló y cols., 2007a, 2007b ; Gargett, 2007) y más recientemente en miometrio (Ono y cols., 2007). Con todo ello, queda más que demostrada la presencia de células madre somáticas (SSC) en los tejidos adultos.

Estas células madre somáticas obtenidas de los diferentes tejidos juegan un papel clave en la homeostasis celular ya que promueven el reemplazamiento celular, por un lado en los tejidos altamente regenerativos y por otro lado la pérdida celular (Li y Xie, 2005; Snyder y Loring, 2005). Al hallarse parcialmente diferenciadas se evita tanto la producción de tejidos no deseados, como la formación de tumores, al contrario de lo que ocurre con las embrionarias, o indiferenciadas. Además, es posible obtenerlas del enfermo que las va a necesitar, evitándose así completamente el rechazo inmunológico. A diferencia de las embrionarias, el uso de estas células madre no ofrece inconvenientes éticos ya que no se obtienen a partir de embriones, aunque tienen otra serie de inconvenientes como son las mismas deficiencias genéticas que el individuo del que se obtienen.

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3. CÉLULAS MADRE SOMÁTICAS EN EL ÚTERO HUMANO

3.1 Evidencias sobre la existencia de células madre somáticas en el endometrio humano

El endometrio humano tiene una alta capacidad regenerativa; crece desde 0,5mm hasta 7mm en grosor durante cada ciclo menstrual (McLennan y Rydell, 1965), y mantiene procesos celulares cíclicos que implican proliferación, diferenciación y desprendimiento del tejido endometrial. Estos procesos hicieron postular por primera vez hace 35 años, la teoría de la existencia de células madre en el endometrio y su localización en la zona basal (Prianishnikov, 1978).

Estudios cinéticos sobre proliferación celular endometrial muestran diferencias en esta proliferación entre las distintas zonas, que predicen un remplazamiento ordenado de la células estromales y epiteliales en la capa funcional desde posibles células madre residentes en la capa basal cerca del limite miometrio-endometrio, y cuya progenie serían las células TA que proliferarían rápidamente y que podrían ser observadas en la capa funcional (Ferenczy y cols., 1979; Padykula y cols., 1989).

Las primeras evidencias de la existencia de una población de células madre endometriales humanas basadas en ensayos funcionales han sido publicadas hace unos años (Chan y cols., 2004; Cho y cols., 2004; Schwab y cols., 2005; Chan y cols., 2006; Matthai y cols., 2006).

Tras el cultivo de suspensiones celulares endometriales purificadas, el grupo de la Dra.Gargett obtuvo dos tipos de colonias celulares de diferente

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tamaño (Chan y cols., 2004). Las más grandes, poco frecuentes, podrían ser las candidatas a células madre endometriales y se localizarían en las criptas glandulares y estroma de la zona basalis (

se identificaron además

para la formación de colonias:

growth factor-

α

(TGF

Asimismo, se examinaron algunos marcadores clásicos de célula hematopoyéticas (c

respectivamente, que fueron localizados en el endometrio humano desde el período fetal hasta la vejez (Cho y cols., 2004; Matthai y cols., 2006).

Otra evidencia de la existencia de células madre endometriales está basada en la capacidad de expulsión del colorante vital Hoechst 33342, determinada por la presencia de transportadores de membrana ABC:

multidrug resistance protein 1

member 2 (ABCG2), etc, propios de células inmaduras candidatas a células

Figura 7. Diagrama de la posible

glándulas y estroma, localizados en la zona basalis cerca de los vasos sanguíneos. Adap

282.

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tamaño (Chan y cols., 2004). Las más grandes, poco frecuentes, podrían ser las candidatas a células madre endometriales y se localizarían en las criptas glandulares y estroma de la zona basalis (F

se identificaron además una serie de factores de crecimiento requeridos para la formación de colonias: epidermal growth factor

(TGF-α) o platelet derived growth factor B

Asimismo, se examinaron algunos marcadores clásicos de célula

hematopoyéticas (c-kit/ CD117 y CD34) y pluripotencia (Oct respectivamente, que fueron localizados en el endometrio humano desde el período fetal hasta la vejez (Cho y cols., 2004; Matthai y cols., 2006).

multidrug resistance protein 1 (MDR1), ATP-binding c

(ABCG2), etc, propios de células inmaduras candidatas a células

Diagrama de la posible localización de las CME en la base de las glándulas y estroma, localizados en la zona basalis cerca de los vasos sanguíneos. Adaptado de Cervelló y cols., 2009. Expert Review

tamaño (Chan y cols., 2004). Las más grandes, poco frecuentes, podrían ser las candidatas a células madre endometriales y se localizarían en las Figura7). En este trabajo una serie de factores de crecimiento requeridos

epidermal growth factor (EGF), transforming platelet derived growth factor B (PDGF-BB).

Asimismo, se examinaron algunos marcadores clásicos de células madre kit/ CD117 y CD34) y pluripotencia (Oct-4) respectivamente, que fueron localizados en el endometrio humano desde el período fetal hasta la vejez (Cho y cols., 2004; Matthai y cols., 2006).

binding cassette sub-family G

(ABCG2), etc, propios de células inmaduras candidatas a células

localización de las CME en la base de las glándulas y estroma, localizados en la zona basalis cerca de los vasos