UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTA') tú,' AGROSoiVIIA
ESCUELA DE AGRONOMÍA
EFECTO NEMATICIDA DEL NE1VIATHOR 20L ® Y
NEMAKILL® CONTRA EL "NEIVIATODO DEL NUDO DE
LA RAÍZ"
Me/oidogy-ne
spp.
TESIS
PARA OPTAR EL TITULO DE
INGENIERO'
ÁGRÓN
' OMO
PRESENTADA POR:
Br. KAREN LISBIIET PALMA' MORE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE AGRONOMIA
EFECTO NEMATICIDA DEL NEMATHOR 20L ® Y
NEMAKILL® CONTRA EL "NEMATODO DEL NUDO DE
LA RAÍZ" Meloldogyne.
spp.
TESIS
PRESENTADA A LA FACULTAD DE AGRONOMIA PARA OPTAR EL
TITULO DE INGENIERO AGRONOMO
Br. Karen Lisb et 'a i More
Tesista
Ing. Edgar Ábr
e
cal .;nx• ~~~ ~ ••••••••••••
Ing. Carlos E. San Martin Zapata Secretario
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE AGRONOMIA
EFECTO NEMAT1CIDA DEL NEMATHOR 20L Y
NEMAKILL® CONTRA EL "NEMATODO DEL NUDO DE
LA RAÍZ" Meloidogyne spp.
PRESENTADA ALA FACULTAD DE AGRONOMIA PARA OPTAR EL TITULO DE INGENIERO AGRONOMO
B . KAN LISBIIET PALMA MORE
Aprobada por:
Ing. Edgar. miindo Rodríguez Gálvez Presidente
Presidente Vocal UNIVERSIDAD NACIONAL DE PlURA <
FACULTAD DE AGRONOMIA - COMISION DE INVESTIGACION AGRICOLA
ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS 005-2017- aA1A - UNP
Los miembros del jurado calificador que suscriben, congregados para ,
estudiar el Trabajo de Tesis denominado 7EFECTO,NEMATICIDA DEL NEMATHOR 201.0 Y NEMAICILLO CONTRA EL 19,EMATODO DEL„NL/Dd DE LA RAIZ", Meloidogyne spp", conducido por la BR. KAREÑ '12SBHET PALMA MORE, asesorada por el Dr. Cesar Murguía Reyes y Co - asesorada por el Ing Javier Caro Alburqueque.
Luego de oidas las observaciones y respuestas a las preguntas formuladas, lo declaran ...A.e.l.kfflA , en consecuencia queda en condiciones de ser calificado APTO para -glstiOrKO• ante el•Consejo -Universitario de la Universidad Nacional de Piura, el Título Profesional de Ingeniero Agrónomo de conformidad con lo estipulado en ,e1 artículo > N°171, inciso 2° del Estatuto General de la Universidad Nacional de Piura.
Piura, 23 de Enero del 2017.
Dr. Egdr R. -Rodríguez Gálvez Zb . onado Duque
DEDICATORIA:
A Dios por haberme dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad
y amor, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en cada paso que doy, por
fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas
personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio. -
A mis padres por los ejemplos de perseverancia y constancia que los caracterizan y que
me ha infundado siempre, por el valor mostrado para salir adelante.
A mi maestro Dr. Cesar A. Murguía Reyes por su gran apoyo y motivación para la
elaboración de esta tesis; por su tiempo compartido y por impulsar el desarrollo de nuestra
formación profesional.
A mis amigos que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación profesional y que
hasta ahora, seguimos siendo amigos: Esther Silva, Mercedes More, Adriano Olguín,
AGRADECIMIENTOS:
El presente trabajo de tesis pritheratnente Me gustaría agradecerle a la Empresa GRUPO
ANDINA, por su apoyo y tiempo brindado.
Al Ing. Javier Caro, por ser el iniciador de este proyecto, por darme su respaldo y
confianza durante este Proceso.
A los ingenieros y técnicos con los cuales trabaje les agradezco por su enseñanza y
formación en mi vida profesional.
Son muchas las personas que han formado parte de mi vida profesional a quienes les
agradezco su amistad, consejos, apoyo, ánimo y compañía en los momentos más difíciles
de mi vida. Algunas están aquí conmigo y otras en mis recuerdos y en mi corazón, sin
importar en donde estén quiero darles las gracias por formar parte de mí, por todo lo que
Actualmenté el uso de nematicidas químicos son menos priorizados por ser
contaminantes y como consecuencia es importante encontrar otras alternativas que sean
iguales o rriás efectivas. En el presente estudio se evaluó el potencial nematicida de los
productos comerciales Nemakill® y Nemathor 20L® originados a partir de extractos de
plantas contra una población de Meloidogyne spp. Se evaluaron en condiciones in vitro
siete concentraciones de cada nematicida sobre masa de huevos, huevos y juveniles (J2)
del nematodo. En invernadero se evaluó la eficacia de tres dosis comerciales de los
nematicidas sobre la reproducción y agallamiento de Meloidogyne spp en el cultivo de
tomate. In vitro, Nemakill® presentó alta acción nemastática, inmovilizando más del 60
% de los J2 del nematodo a una concentración de 2000 mg/1, con una acción nematicida
muy baja, causando una mortalidad de J2 inferior al 34 %. Nemakill® presentó
significativa acción ovicida observándose que la eclosión a partir de masa de huevos varió
entre el 5.1 y 18.7 % respecto al testigo; a 4000 mg/1 se observó el menor número de
huevos eclosionados (15 %) diferenciándose significativamente de las demás
concentraciones. Las tres dosis del Nemakill® presentaron una ligera eficacia preventiva
en la supresión de Meloidogyne spp a nivel de invernadero, principalmente sobre la
reproducción del nematodo. Nemathor 20L®, demostró acción nematicida, causando una
mortalidad de J2 del nernatodo superior al 62% a partir de una concentración de 2000
mg/1, superando significativamente al nematicida químico Vydate L. Asimismo se 1
1
observó ación ovicida contra huevos directamente expuestos, a 3000 mg/1 se presentó
un O % de huevos eclosionados. Nemathor 20L® a 5 1/ha presentó la mayor eficacia en el
control de Meloidogyne spp., observándose también que este tratamiento presentó los
mejores parámetros de crecimiento de plantas.
Currently the uses of chemical nematicides are less prioritized as pollutants and
consequent y it is important to find other alternatives that are the same or more effective.
In the present study the nematicidal potential of the commercial products Nemakill® and
- Nemathor i0L0 .originated from extracts of plants against a population of Meloidogyne
spp. Seven concentrations of each nematicide ofi nematode egg, egg and juvenile mass
(J2) were evaluated Under in vitro conditions. In greenhouse the efficacy of three
commercial doses of nematicides on the reprocluction and agglutination of Meloidogyne
spp. In tomato culture. In vitro, Nemakill e showed a high nematode action, irnmobilizing
more than 60% of the J2 of the nematode at a concentration of 2000 mg / 1, with a very
low nematicidal action, causing a J2 mortality of less than 34%. Nemakill ® showed
significant 9vicidal action, bbserving that hatching from egg mass varied between 5.1 and
18.7% with respect to the control; At 4000 mg / 1 the lowest number of hatching eggs
(15%) was observed, differing significantly from the other concentrations. The three
doses of Nemakill presented a slight preventive efficacy in the suppression of
Meloidogyne spp at greenhouse level, rnainly on the nematode reprocluction. Nemathor
20Le, demonstrated nematicidal action, causing a mortality of J2 of the nematode higher
than 62% from a concentration of 2000 mg / 1, significantly surpassing the chemical
nematicide 'Vydate L. Likewise, ovicidal action was obserVed against directly exposed
eggs, 3000 Img / 1 0% of hatchecl eggs were present. Nemathor 20Le at 5 1 / ha showed
the highest efficacy in the control of Meloidogyne spp., Also observing that this treatment
had the best plant growth paratneters.
ÍNDICE GENERAL
Página
CAPÍTULO!
1. Introducción
1.1 Objetivos
CAPITULO 2
Revisión De Bibliografía 3
2.1. Meloidogyne spp 3
2.2. Ciclo de' Vida 3
2.3. Formas de Reproducción 6
2.4. Factores que afectan el desarrollo del nematodo 7
2.5. Distribución y hospedantes 7
2.6. SintoMatología 8
2.7. Control químico 8
2.8. Control Biológico 9
2.8.1. Hongos facultativos 10
2.8.2. Trichoderma spp 10
2.8.1 Enmiendas orgánicas 11
2.8.4. Compuestos fitoquímicos naturales 11
,CAPITULO 3
MATERIALES Y MÉTODOS • 13
3.1. Lugar y período de ejecución •• 13
3.2. Obtención de la población de M incognita 13
3.3. Mantenimiento de la población de Meloidogyne spp 13
3.4. Descripción técnica de los nematicidas biológicos 13
3.5. Ensayos in vitro 14
3.5.1. Concentraciones 15
3.5.2. Obtención del inoculo 15
3.5.3. Ohtención de la masa de huevos 16
3.5.4. Observaciones experimentales 17
1
3.5.5. Diseño estadístico y análisis de datos 17
3.6. Ensayos en invernadero 17
3.6.2. Evaluación de la acción nematicida del Nemakill® y Nemathor 20L® antes de la infección de las raíces (acción preventiva) por
Meloidogyne spp. 18
3.6.3. Observaciones experimentales 19
3.6.4. Diseño estadístico y análisis de datos 19
CAPITULO 4
RESULTADOS Y DISCUSION 20
4.1. Efecto in vitro del Nemakill® 20
4.1.1. Acción nematicida o nemastática 20
4.1.2. Efecto in vitro acción ovicida, período de incubación por 10 días 23
4.1.3. Evaluación de la eficacia de tres dosis comerciales del Nemakill® en
condiciones de invernadero 24
4.2. Efecto in vitro del Nemathor 20L® 27
4.2.1. Acción nematicida o nemastática 27
4.2.2. Evaluación de la eficacia de tres dosis comerciales del Nemathor
20L® en condiciones de invernadero 31
CAPITULO 5
CONCLUSIONES 33
CAPITULO 6
Recomendaciones 35
CAPITULO 7
Referencias bibliográficas 36
CAPITULO 8
INDICE DE 'CI.;'ÁDROS Cuadro 1: Cuadro 2. Cuadro 3. Cuadro 417 - Cuadro 5. r Cuadro 6t Cuadro 7: Cuadro 8. 'Cuadro 9. Cuadro 10. Cuadró 11. Página 14 Ingredientes activos y concentraciones de los nematicidas
biológicos y químico
Diferentes concentraciones del Nemakill® utilizadas para
evaluar la eficacia contra Meloidogyne spp en condiciones in
vitro.
Diferentes concentraciones del Nemathor 20 L® utilizadas para
evaluar la eficacia contra Meloidogyne spp. en condiciones in
vitro.
Escala de grados • utilizada pata evaluación el índice de
agallamiento causado por Meloidogyne spp. en plantas de
tomate en condiciones de invernadero.
Efecto de siete concentraciones de Nemakill® sobre la
movilidad de J2 de Meloidogyne spp. en condiciones in vitro.
Número de juveniles en segundo estado (J2) de Meloidogyne
spp. eclosionados a partir de masa de huevos expuestos a siete
concentraciones de Nemakill® en condiciones in vitro.
Efecto de cinco concentraciones de Nemakill® sobre la eclosión
de huevos de Meloidogyne spp. en condiciones in vitro.
Índice de agallamiento y número de huevos más juveniles de
Meloidogyne spp, en raíces de tomate tratadas con tres dosis del
nematicida Nemakill® en condiciones de invernadero.
Parámetros de crecimiento de plantas de tomate Lycopersicon
esculentum cv Río Grande inoculadas con Meloidogyne spp. y
tratadas con tres dosis del nematicida Nemakill®, en
condiciones de invernadero.
Efecto de siete concentraciones de Nemathor 20 L® sobre la
movilidad de J2 de Meloidogyne spp. en condiciones in vitro.
Número de juveniles en segundo estado (J2) de Meloidogyne
spp eclosionados a partir de masa de huevos expuestos a siete
concentraciones de Nemathor 20L® en condiciones in vitro.
- .
Cuadro 12. Efecto de siete concentraciones de Nemathor 20L® sobre la
eclosión de huevos de Meloidogyne spp en condiciones in
vitro.
Cuadro 13. Índice de agallamiento y número de huevos más juveniles de
Meloidogyne spp en raíces de tomate tratadas con los
nematicidas Nemathor 20L® bajo condiciones de invernadero.
Cuadro 14. Parámetros de crecimiento de plantas de tomate Lycopersicon
esculentum cv Río Grande inoculadas con Meloidogyne spp. y
tratadas con tres dosis del nematicida Nemathor 20L®, bajo
condiciones de invernadero.
Cuadro 11. Análisis de la varianza de las siete concentraciones de
Nemakill® sobre la movilidad de J2 de Meloidogyne spp a
24horas. En condiciones in vitro.
Cuadro 16. Análisis de la varianza de las siete concentraciones de
Nemakill® sobre la movilidad de J2 de Meloidogyne spp a
48horas. En condiciones in vitro.
Cuadro 17. Análisis de la varianza de las siete concentraciones de
Nemakill® .sobre la movilidad de J2 de Meloidogyne spp a 24
horas de lavado. En condiciones in vitro.
Cuadro 18. Análisis de varianza del Número de juveniles en segundo
estado (J2) de Meloidogyne spp. Eclosionados a partir de masa
de huevos expuestos a siete concentraciones de Nemakill® en
condiciones in vitro.
Cuadro 19. Análisis de Varianza del Efecto de cinco concentraciones de
Nemakill® sobre la eclosión de huevos de Meloidogyne spp. En
condiciones in vitro.
Cuadro 2 . Análisis de varianza del índice de agallamiento de Meloidogyne
spp, en raíces de tomate tratadas con tres dosis del nematicida
Nemakill® en condiciones de invernadero.
Cuadro 21. Análisis de varianza de huevos + J2 de Meloidogyne spp, en
raíces de tomate tratadas con tres dosis del nematicida Nemakill® en condiciones de invernadero.
30
31
32
42
42
42
43
43
43
Cuadro 22. Análisis de varianza de la altura plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemakill®, en condiciones de invernadero.
Cuadro 23. Análisis de varianza del peso de raíces en plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemakill®, en condiciones de invernadero.
Cuadro 24. Análisis de varianza del peso de área foliar en plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemakill®, en condiciones de invernadero.
- Cuadro 25. Análisis de la varianza de las siete concentraciones de
Nemathor 20L® sobre la movilidad de J2 de Meloidogyne spp
a 24horas. En condiciones in vitro
Cuadro 26. Análisis de la varianza de las siete concentraciones de
Nemathor 20L® sobre la movilidad de J2 de Meloidogyne spp
a 48horas. En condiciones in vitro.
Cuadro 27. Análisis de la varianza de las siete concentraciones de
Nemathor 20L® sobre la movilidad de J2 de Meloidogyne spp
a 24 horas de lavado. En condiciones in vitro.
Cuadro 21. Análisis de varianza del Número de juveniles en segundo
estado (J2) de Meloidogyne spp eclosionados a partir de masa N
de huevos expuestos a siete concentraciones de Nemathor 20L®
en condiciones in vitro.
Cuadro 29. Análisis de varianza del Efecto de cinco concentraciones de
Nemathor 20L® sobre la ecloión de huevos de Meloidogyne
spp. En condiciones in vitro:
Cuadro 30. Análisis de varianza del índice de agallamiento de Meloidogyne
spp, en raíces de tomate tratadas con tres dosis del nematicida
Nemathor 20L® en condiciones de invernadero.
44
44
44
44
45
45
45
45
Cuadro 31. Análisis de varianza de huevos + J2 de Meloidogyne spp, en
raíces de tomate tratadas con tres dosis del nematicida
Nemathor 20L® en condiciones de invernadero.
Cuadro 32. Análisis de varianza de la altura plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemathor 20 L®, en condiciones de invernadero.
Cuadro 33. Análisis de varianza de la longitud de raíz en 'plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemathor 20L®, en condiciones dé invernadero.
Cuadro 34. Análisis de varianza del peso de área foliar en plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemathor 20 L®, en condiciones de invernadero
Cuadro 35. Análisis de varianza del peso de raíces en plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con
Meloidogyne spp y tratadas con tres dosis del nematicida
Nemathor 20L®, en condiciones de invernadero
46
46
47
47
ÍNDICE DE FIGURAS
:Figura 4. Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 5.
Figura 8.
Figura 9.
Método del tamizado para la obtención del inoculo (huevos +
J2) de Meloidogyne spp
Masa de huevos de Meloidogyne spp sobre raíces de tomate; 45
días después' de su inoculación
Plantas de tomate con 15 días de edad inoculadas con huevos +
J2 de Meloidogyne spp, inoculo aplicado en 4 hoyos alrededor
de tallo.
Formas adquiridas por los J2 de Meloidogyne spp. e
inmovilizados después de una exposición de 48 horas en Vydate®
L (A) y Nemakill® (B), ensayos in vitro.
J2 de Meloidogyne spp. activos después de un enjuague y
expuestos en agua por 24 horas y previamente tratados con
Vydate®L (A) y Nemakill® (B), ensayo in vitro.
Huevos y J2 no eclosionados de Meloidogyne spp. afectados por
la acción tóxica del nematicida biológico Nemakill®.
Grados de •agallamiento causados por Meloidogyne spp. sobre
raíces de tomate tratadas con diferentes dosis del nematicida
biológico Nemakill®. A: testigo, B: Nemakill® 10 L/ha y C:
Nemakill® 12 L/ha.
Formas del cuerpo adquiridas por el J2 de Meloidogyne spp. e
inmovilizados después de 48 horas de exposición en Nemathor®
20L, ensayos in vitro.
Huevos y J2 no eclosionados de Meloidogyne spp. afectados por
la acción tóxica del nematicida biológico Nemathor 20L®. Figura 6.
Figura 7.
Página
16
16
18
21
22
24
25
28
,
.,las especies..:U.Mélóid.ogyné conocidas ,ai.mo lol, .;neniatódós del nudo de la . • •
-,raiz ',son importantes-parasitos ,`de raíces-- que afectan 1acantidad y .calidad de la -
4,—,,,,r751;ducci-oñird-él-dr---cultivosanuales"ly =perennes en el" infeZtádas
presentan síntomas típicos, incluyendo agallamientos y atrofias en raíces y deficiencias
de nutrientes, especialmente de nitrógeno (Siddiqui, 2001). En Piura, este nematodo es
considerado como uno de los mayores problemas en los cultivos de vid, caria de azúcar,
pimientos, cucurbitáceas y otros. Aunque no existe información exacta del impacto de la
infección del nematodo sobre estos cultivos es evidente que las plantas severamente
afectadas presentan menor vigor, disminuyen su producción, se reduce la brotación y en
algunos casos causan la muerte de la planta.
Las poblaciones de nematodos parásitos de plantas en el campo se pueden
reducir a través de varias medidas de control tales como la aplicación de nematicidas
químicos, nematicidas biológicos, enemigos naturales, prácticas culturales y cultivares
resistentes. Desde el ario 1950 los productores han priorizado el uso de nematicidas
sintéticos más que las otras alternativas. Dando como resultado en algunos casos el uso
el excesivo de estos pesticidas. Como consecuencia es importante encontrar otras
alternativas para ser aplicadas dentro de una estrategia de manejo, que sean iguales o más
efectivas que los nematicidas sintéticos, inofensivo para los productores, consumidores y
el medio ambiente. Una de las posibles alternativas es el uso de nematicidas originados a
partir de extractos de plantas conocidos Como pesticidas botánicos (Javed el al., 2006).
Estos nematicidas son considerados generalmente como no persistentes bajo condiciones
de campo siendo rápidamente transformados por la luz, oxígeno y microorganismos en
productos menos tóxicos. Por tanto, no dejan residuos sobre los productos o el medio
ambiente. En el presente estudio se evaluará el potencial nematicida de dos productos
comerciales originados a partir de extractos de plantas contra una población de
Meloidogyne spp. aislada de raíces de vid, estos nematicidas se compararán con el
1.1 OBJETIVOS
a. Evaluación del efectó in vitro de siete concentraciones de los nematicidas biológicos
Neálakill® y Nemathor 20L® sobre masa - de huevos, huevos y juveniles (J2) de
Meloidogyné spp.
b. Evaluación de la eficacia de tres dosis comerciales de los hématiéidas Nemakill® y "
Nemáthor 20L® sobre la reproducción y agallamiento de Meloidogyne' s'pp: en el cultivo 4
CAPITULO 2
2. REVISIÓN DE BIBLIOGRAFÍA
2.1. Meloidogyne spp.
El género Meloidogyne Goeldi, 1892 (Nematoda: Heteroderidae) comprende a
un grupo dé nematodos parásitos de plantas de amplia distribución en el mundo, son
polífagos y endoparásitos de raíces, se conocen como los "nematodos formadores de
.nódulos o agallas radiculares". Se han descrito más de 97 especies validas, pero se
considera que cuatro son las especies importantes y destructivas que causan el 90 % del
daño estimado en el mundo (Sasser, 1980; Eisenback et al., 1981; Siddiqi, 2000; Hunt y
Handoo, 2009).
2.2. Ciclo de Vida
Los huevos de Meloidogyne spp., se encuentran inmersos en una masa
gelatinosa, la cual los mantiene juntos y los protege tanto de las condiciones ambientales
extremas como de depredadores. Las masas gelatinosas están compuestas por
glicoproteínas y también se les atribuye propiedades antimicrobianas. Generalmente,
están depositadas en la superficie de los nódulos, pero algunas veces se encuentran
directamente sobre la superficie o dentro del tejido de la raíz de la planta hospedante.
La masa dé huevos es inicialmente suave, pegajosa y hialina, pero se hace más firme y
de color marrón oscuro con el tiempo (Moens et al., 2009). Se pueden encontrar más
de 1000 huevos en una masa, que puede ser más grande que el cuerpo de la hembra
(Taylor y Sasser, 1983).
El desarrollo del huevo comienza breves horas después de la ovoposición,
resultando en 2, 4, 8, 16 a más células, hasta que se ve el primer estado juvenil
completamente formado, ,enrollado y con un estilete. Se puede mover dentro del huevo
pero no es muy activo. La primera muda tiene lugar en el huevo y no es dificil distinguir
la cutícula [del primer estado juvenil, sobresaliendo más allá de la cabeza del segundo
estado juvenil (J2). Poco después, este emerge rompiendo la membrana flexible del
huevo, por medio de pinchazos repetidos con el estilete. La eclosión de los huevos es
influenciaclá por la temperatura y ocurre sin requerir ningún estímulo por parte de la raíz
de la planta], sin embargo los exudados radiculares algunas veces estimulan la eclosión
(Taylor y Sasser, 1983; Karssen y Moens, 2006).
E) juvenil de segundo estado que ha emergido, se mueve a través del suelo 1
, en busca d'e una raíz de la que pueda alimentarse. Su capacidad de sobrevivir se ve
reforzada por varias adaptaciones fisiológicas y bioquímicas, incluyendo la quiescencia
y la diapausa, y las reservas de lípidos que prolongan su viabilidad hasta que llega e
invade la planta hospeclante "(Moens et al., 2,009). La búsqueda de la raíz es al azar hasta
que se acerca a unos cuantos centímetros. Luego, son atraídos por los exudados
radiculares, acumulándose y penetrando la raíz por la zona de elongación debajo del
punto de crecimiento. Se considera que el dióxido de carbono es el factor más
importante para atraer a los juveniles de segundo estado (Taylor y Sasser, 1983; Hussey
y Janssen, 2001; Karssen y Moens, 2006).
El juvenil de segundo estado penetra la raíz a través de algún punto de la
zona subapical donde la •eridodermis presenta escaso desarrollo y no constituye una
barrera física para el ingreso hacia el interior (Wyss et al., 1992). El nematodo avanza
hasta el tejido cortical y una vez allí la migración continúa intercelularmente hasta
llegar al cilindro vascular en diferenciación. El avance a través del espacio intercelular
sé realiza recurriendo a la separación de la laminilla media por medios mecánicos a
través de gólpes de estilete, sin haberse precisado hasta la fecha si también concurren
mecanismos enzimáticos en el proceso. Cada juvenil establece su sitio permanente de
alimentación una vez que alcanza el cilindro vascular (Hussey y Williamson, 1998).
Este sitio consiste en un conjunto de grandes células modificadas llamadas células
gigantes, icracterizadas por la presencia de muchos núcleos de gran tamaño, altamente
lobulados, 'Con nucléolos prominentes, un alto número de orgánulos, citoplasma denso
Con altas tasas metabólicas y paredes engrosadas e invaginadas. Los nematodoá
absorben los nutrientes del citoplasma directamente o a través de tubos de alimentación
sintetizados con tal propósito mediante las secreciones procedentes de las glándulas
Varios estudios han documentado los efectos de la infección por nematodos en
la expresión génica. Algunos estudios en las células gigantes han revelado que el ARNm
de algunos genes puede estar presente en niveles muchas veces mayor que en células de
una raíz nO, infectada (He et al., 2005; Ramsey et. al, 2004). También se ha reportado
que los niveles de enzimas oxidoreductasas se incrementa, indicando un aumento en la
actividad metabólica (Hussey y Janssen, 2001; Karssen y Moens, 2006).
Los nematodos del nódulo de la raíz secretan a través de su cutícula, enzimas
antioxidantes que son producidas en la hipodermis y protegen al nematodo de la
respuesta oxidativa del hospedante frente a la infección. Así también, las proteínas
producidas y secretadas por las células de las glándulas esofágicas dentro de la planta
hospedante por medio del estilete, son señales moleculares que desencadenan la
activación de rutas de señalización, que conducen a la supresión de la defensa- del
hospedante y a la inducción de células gigantes (Abad et al., 2009).
Mientras se están formando las células gigantes y los nódulos, aumenta el
ancho del nematodo y hay una dilatación considerable de las glándulas esofágicas. Las
células del primordio genital se dividen y éste se agranda haciéndose notorio, dos
ramificaciones en la hembra o formando un cuerpo alargado en el macho (Taylor y
Sasser, 1983).
Cuando se completan la segunda y tercera muda en la hembra, evidenciadas
por las dos cutículas desprendidas, el estilete y el bulbo esofágico medio desaparecen.
Poco después de la cuarta muda el estilete y el bulbo medio son regenerados, se
forman el útero y la vagina y el patrón perineal se hace visible. La hembra de la
- cuarta etapa continúa aumentando de grosor y un poco más de longitud, sufriendo la
última muda y desarrollándose como hembra adulta, de forma piriforme. Las hembras
pueden producir huevos por dos a tres meses y viven algún tiempo más después de que
cesa la producción de huevos. El ciclo termina cuando la hembra pone su primer hu6o
(Taylor y Sasser, 1983).
Después de la segunda y tercera muda en el macho, el estilete no es visible,
el bulbo esofágico medio se ha degenerado y sólo la gónada se ha alargado. Luego ocurre
una rápida metamorfosis: el cuerpo alargado se desarrolla dentro de la cutícula,
completo con estilete, esófago con bulbo medio, espículas, y esperma en los testículos.
El macho de la cuarta etapa es vermiforme y sufre una última muda y emerge de la raíz
ya como adulto. No hay evidencia de alimentación por parte de machos adultos y
pueden ser ' encontrados en especies partenogenéticas cuando las condiciones son
desfavorables para el desarrollo de la hembra, por ejemplo, cuando las densidades son
muy altas y hay una limitación del suministro de alimentos. Los machos probablemente
viven sólo semanas (Taylor y Sasser, 1983; Moens etal., 2009).
2.3, Formal de Reproducción
Existen tres tipos de reproducción dentro del género Meloidogyne: (a)
anfimixis, én el cual el esperma de los machos fertiliza los ovocitos en las hembras
y posteriormente se produce una meiosis, (b) partenogénesis rneiótica facultativa, en
el cual en presencia de machos se produce una anfimixis, pero en su ausencia, se lleva
a cabo una meiosis en los ovocitos, con dos de sus núcleos, con una reducción de
complemenio cromosómico (el pronúcleo y el segundo cuerpo polar), posteriormente se
fusionan (automixis), y (c) partenogénesis mitótica obligada, donde los machos no están
involucrados y uno de los dos núcleos producidos durante la división mitótica inicial
dentro del ovocito se deteriora y el otro se convierte en el precursor del embrión
posterior (apomixis) (Chitvvood y Perry, 2009).
LasI poblaciones de una misma especie de Meloidogyne pueden ser diferentes
en el modo de reproducción, por ejemplo, 29 de las 32 poblaciones estudiadas de M
hapla se reprodujeron por partenogénesis meiótica facultativa, las otras por
partenogénésis mitótica (Chitwood y Perry, 2009).
Tanto en el género Meloidogyne, como en Globodera y Heterodera, los
cromosomas sexuales están ausentes y la proporción de machos y hembras puede estar
iñfiuida por factores ambientales. En las especies que se reproducen por partenogénesis
meiótica y mitóticas, el hacinamiento, la escasez de alimentos, las temperaturas
extremas u. otras tensiones ambientales adversas, pueden dar lugar a la formación de 1
machos por inversión sexual. Estos machos raramente inseminan hembras, e incluso
cuando lo hacen, una división mitótica en el ovocito inicia la embriogénesis sin fusión
2.4. Factores que afectan el ds ióilÓdc1 nematódó
La temperatura, la humedad, la porosidad del suelo, la disponibilidad de oxígeno
y la presencia de toxinas pueden limitar o detener el movimiento, el desarrollo y
la eclosión de huevos de los nematodos noduladores de la raíz (Curtis etal., 2009; Evans
y Pe, 2009).
La temperatura no sólo afecta la tasa de multiplicación del nematodo sino
también su distribución, especialmente en relación cón la capacidad de sobrevivir a los
, efectos de alta o baja temperatura. Dentro del género Meloidogyne hay dos grupos,
termófilos y criófilos, según su capacidad de sobrevivir las transiciones de fase de
lípidos que se producen a 10 °C. M chitwoodi, M hapla y M naasi son criófilos y
pueden sobrevivir en el suelo a lemperaturas- de hasta por debajo de 10 °C, mientras
que M javanica, M arenaria y probablemente M exigua son termófilos y no sobreviven
en el suelo a temperaturas inferiores a 10 °C (Evans y Perry, 2009).
Wallace (1964), reconoció el papel esencial desempeñado por la humedad del
suelo en la supervivencia y eclosión de los huevos de Meloidogyne. La sequía
excesiva puede frenar o incluso matar al nematodo, igual ocurre con el encharcamiento
prolongado que, por falta de oxígeno en el suelo, el nematodo es también afectado.
Todos los juveniles de segundo estado requieren una película de agua de cierto grosor
para su circlación en el suelo (Curtis et al., 2009).
La textura del suelo es otro factor de importancia, la distribución y la severidad
del ataque del nematodo dependen de ella. El daño y pérdidas de producción por
nematodos 'noduladores de la raíz son generalmente más severos sobre suelos de textura
arenosa (Wállace, 1964), debido que, en suelos pesados, la eclosión disminuye y el
desplazamiento del nematodo se hace más lento.
2.5. Distribución y hospedantes
La especies de Meloidogyne son parásitos obligados con una amplia
distribución geográfica y rango de hospedantes. Tienen la capacidad de infectar raíces de
vegetales (Abad et al., 2003); , por lo tanto, sé„ pueden considerar en general como
polífagtis. M. incógnita, M arenaria, M javanica y M hapla son las especies
generalizadas que representan el 95 % de los nematodos formadores de agallas
. radiculares. Las primeras tres especies son de regiones tropicales y templadas, mientras
que M hapla se encuentra en climas fríos- (Lamberti, 1979).
2.6. Sintomatología
El darlo que ocasionan a las plantas se debe principalmente a la alteración de los
tejidos vasculares de la raíz, que reduce sustancialmente la absorción de nutrientes y agua,
- con el consiguiente debilitamiento de la planta y disminución del rendimiento
(OrtonWillilams, 1973; Siddiqi, 2000; Abad, eta!, 2003). Además, los efectos negativos
de Meloidogyne se agravan en algunas ocasiones por interacciones con otros patógenos.
Los síntomas más comunes e indirectos son la reducción del crecimiento, clorosis del
follaje, susceptibilidad al marchitamiento y menor producción de frutos. La mayoría de
especies de Meloidogyne inducen a la raíz infectada a engrosarse alrededor del punto
donde el nernatodo se está alimentando, formándose así el típico nódulo radicular. Los
nódulos pueden presentarse simples, o varios de ellos coalescen para formar un conjunto
masivo de nódulos. Algunas especies estimulan también a la planta a producir muchas
raíces laterales que emergen de la agalla, lo que da por resultado un sistema radical
compacto, normalmente abundante y entrelazado. Aunque algunas especies producen un
tipo característico de nodulación, la identificación de ellas no puede hacerse basándose
solamente en estos síntomas radicales (Eisenback etal., 1981).
2.7. Control químico
Los nematicidas químicos se han clasificado de acuerdo a su método de
aplicación en dos grandes grupos, los fumigantes y los no fumigantes. Éstos últimos en
diversas situaciones han demostrado menor eficacia que los fumigantes, y tienen su
actividad nematicida fundamentalmente sobre los estadios activos de los nematodos, pero
no sobre htievos, retrasando su eclosión. Los no fumigantes no son tan fitotóxicos como
los fumigarites, por lo que en muchas ocasiones sólo se pueden usar en post-plantación
(Haydock eta!, 2006; Díez-Rojo eta!, 2010). Los fumigantes utilizados y permitidos en
isotiocianato de metilo (metan sodio, inétam potasio y Clazomet), tetratiocarbonato de
sodio que libera disulfuro de carbono y el ioduro de metilo. En un principio los metam ya
sea el sódico o el potásico, así como el clazomet-no son fumigantes, pero tras su aplicación
en el suelo ,desprenden metilisotiocianato (Nyczepir y Thomas, 2009). Los nematicidas
no fumigantes no son supresivos a poblaciones de nematodos como los tiimigantes debido
a.que no presentan una actividad de amplio espectro (Luc et al., 2005). Se formulan como
materiales granulados y líquidos, aquí se incluyen a productos como el aldicarb, oxamyl,
ethoprop/ethoprophos, fenamiphos, carbofuran, fosthiazate y terbufos, todos ellos tienen
al menos una eficacia moderada contra Meloidogyne spp. -en condiciones de campo e
invernaderó. A su vez los no fumigantes se dividen en dos grupos clases químicas los
organofosforados y los carbamatos. Ambas clases son consideradas nemastáticos, debido
a que su efecto es reversible, y no nematicida. 'Actúan inhibiendo la acetilcolinesterasa
(Opperman y Chang, 1990; Haydock et al, 2006).
2.8. Control Biológico
Varias alternativas no químicas pueden utilizarse para el manejo de nematodos
parásitos de plantas. Sin embargo, algunos métodos no químicos no son efectivos cuando
son usados solos, por lo que la integración de métodos es necesaria para lograr un manejo
óptimo del nematodo, particularmente en un sistema sustentable (Roberts, 1993; Noling
y Becker, 1994). Aplicaciones de enmiendas orgánicas y la rotación de cultivos se han
evaluado para el manejo de nematodos (Muller y Gooch, 1982; Rodríguez-Kábana, 1986;
Trivedi y Barker, 1986), aunque los resultados han sido inconsistentes (McSorley y
Gallaher, 1995). El control biológico es una alternativa de manejo de poblaciones de
nematodos a través de diferentes mecanismos: parasitismo, predación, competencia y
antibiosis. Numerosos organismos del suelo atacan a los nematodos fitoparásitos, entre
ellos los hongos y bacterias son los más conocidos, aunque también los protozoos,
insectos, ácaros y nematodos depredadores ejercen regulación bajo diferentes condiciones
del ecosiStema (Rodríguez-Kabana et al., 1984).
2.8.1. Hongos facultativos
Los hongos que infectan huevos o hembras de fitonematodos han sido
clasificados como patógenos facultativos o hongos oportunistas facultativos (Sikora,
1992). Estos hongos no dependen de los nematodos para su proliferación sino de la
rizosfera que contiene los exudados de raíces y material orgánico; ejemplo de estos
hongos son Verticillium clamydosporium, que colonizan masas de huevos y que durante
el proceso de infección produce enzimas, las cuales rompen la membrana externa de la
cáscara del huevo exponiéndolo a una infección (Kerry y Bourne, 1996), este hongo
disminuyen densidades poblacionales de especies de nematodos del nudo y lesionadores;
similares resultados se encontraron con el hongo parasito facultativo Paecilomyces
lilacinus contra Meloidogyne spp. (Kiewnick y Sikora, 2003). Estos tipos de hongos
podrían ser importantes en sistemas de producción de ciclos cortos, aplicándolos al suelo
antes de establecer el cultivo.
2.8.2. Trichoderma spp.
Trichoderma spp. es un hongo anaerobio facultativo que se encuentra
naturalmente en un número importante de suelos agrícolas y otros tipos de medios. Se
encuentra distribuido a nivel mundial y en diferentes rangos de zonas de vida y hábitat,
especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos vegetales en
descomposición, así mismo en residuos de cultivos. Barman (2006) menciona que aparte
de su facilidad para colonizar las raíces de las plantas, Trichoderma ha desarrollado
mecanismos para atacar y parasitar a otros hongos y así, aprovechar una fuente nutricional
adicional.
Trichoderma actúa como biocontrolador y como colonizador de las raíces por
micoparasifismo, antibiosis, competición por nutrientes y espacio. Hidalgo (1999)
describe el Comportamiento de Trichoderma con respecto al biocontrol de fitonematodos,
mediante la capacidad de envolver al nematodo con su micelio, además producen
metabolitos como trichodermin, suzukacilina, alameticina, dermadina, penicilina,
2.8.3. Enmiendas orgánicas
Una enmienda orgánica es cualquier material de origen animal o vegetal que se
añade al suelo. Entre estos materiales se pueden incluir los compost, los residuos de
- cosechas anteriores, estiércol animal, desperdicios agroindustriales y municipales, entre
otros. La aplicación de material orgánico como enmienda, afecta directa o indirectamente
las poblaciones y la diversidad de nematodos en el suelo. De forma directa, este material
libera compuestos nematicidas en su descomposición o 'que son sintetizados por
microorganismos envueltos en su descomposición, proveyendo un ambiente favorable
para el crecimiento de microorganismos antagónicos o parasíticos a los fitonematodos.
De manera indirecta, puede incrementar el desarrollo y rendimiento de una planta
infestada con nematodos, mejora la estructura del suelo, aumentando su potencial de
retención de agua y suple nutrientes en los suelos deficientes (Chavarría-Carvajal y
Rodríguez-Kábana, 1998; Widmer et al., 2002).
Análisis químicos y toxicológicos de excrementos de aves y ganado han
determinado que las propiedades nematóxicas de estas enmiendas se debe a que durante
su ,descomposición liberan ácido acético, propiónico, butírico, gases fermentados y
fenoles (Badra et al., 1979). La -adición de materia orgánica al suelo estimula la actividad
microbiana al incrementarse las poblaciones de actinomycetes, algas, bacterias, hongos y
nematodos microbivoros. La proliferación de microorganismos aumenta la actividad
enzimática de los suelos enmendados y la acumulación de compuestos específicos que
tienen propiedades nematicidas.
2.8.4. Compuestos fitoquímieos naturales
Las plantas superiores producen un amplio espectro de compuestos activos,
incluyendo los polytienilos, isothiocianatos, glucosinolatos, glycosidos cyanogénicos,
PálYadetilenos, alkaloides, lípidos, terpenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides,
quassinoides, esteroides, triterpenoides, compuestos fenólicos simples y complejos
(Chitwood; 2002). Estos compuestos Son metabolitos secundarios que por lo general no
son parte del metabolismo básico de la planta y están relacionados a los componentes
antagonistas han demostrado acción nernastática y nematicida bastante eficaces en el
control de estos patógenos (Walla et al., 1999).
Recientemente, Meyer et al. (2016), demostraron la eficacia in vitro de los
extractos de la cáscara seca de la granada (Punica granatum) y de las hojas de la rosa de
jamaica (Hibiscus sabdariffa) contra M incognita. Ambos extractos inhibieron la
eclosión de los huevos y la viabilidad de los juveniles de segundo estadio (J2).
Dependiendo de la concentración del extracto, el efecto sobre los J2 fue en ocasiones
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Lugar
y
período de ejecución. Todos los ensayos in-vitro e invernadero se realizaron en el laboratorio de
Nematología del Departamento de Sanidad Vegetal de la Universidad Nacional de Piura.
El período de ejecución del trabajo de investigación se desarrolló entre enero y junio de
2016.
3.2. Obtención de la población de M. ineognita
Se aisló una población de Meloidogyne spp a partir de raíces afectadas de plantas
de uva de mesa procedente del valle de Cieneguillo. Los huevos y juveniles en segundo
estado (J2) del nematodo se extrajeron de las raíces agalladas con una solución de 0.5%
de Na0C1 (Hussey y Barker, 1973).
3.3. Mantenimiento de la población de Meloidogyne spp.
La población de Meloidogyne spp. aislada de uva se inoculó en plantas de tomate
susceptible con la finalidad de multiplicar el nernatodo y tener inoculo para el desarrollo
de los diversos trabajos. Las plantas inoculadas de tomate tuvieron 14 de días edad y se
sembraron en un sustrato de suelo estéril. 45 días después de la inoculación se obtuvo la
fuente de inoculo (J2, huevos y masa de huevos) para realizar los bioensayos de eficacia.
3.4. Descripción técnica de los nematicidas biológicos
Nemakill ® es un producto compuesto por terpenos y polifenoles de naturaleza
ácida, extraído de tallos y hojas de especies de• plantas, tiene acción sinérgica de sus
componentes. Es de formulación líquida, con pH 4.9 +/- 0.2, densidad (gr/mL) a 20 °C
1.31 +/- 0.02, soluble en agua, no inflamable, no explosivo, no corrosivo (Cuadro 1).
Nemathor 20 L® es un compuesto de origen natural, contiene como ingrediente
activo quino eína fenólica presente en la destilación de la 'quinina. Es un concentrado
emulsionable, insoluble en agua, punto de ebullición = 363°C, punto de fusión = 80°C.
pKb = 9,46, coeficiente de partición pK = 3,90, calor de vaporización =58,5 kJ•mori.
Ambos productos son una marca registrada por la empresa Comercial Andina
Industrial S.A.C.
-.Cuadro I. Ingredientes activos y concentraciones de los nematicidas biológicos y químico.
Nombre Comercial Ingrediente Activo Concentración
(gil)
Nemakill® Temerlos y Polifenoles 80 - 72
Nemathor_20L® Quinoleíná fenólica .. 96
Vydate® L Oxamilo 235.2
3.5. Ensayos in vitro
Se evaluó el efecto in vitro de cada nernaticida sobre masa de huevos, huevos y
J2 del nematodo. Para todos los ensayos in vitro se utilizaron microtubos marca
eppendorf, colocándose 20 J2 activos y 20 huevos de Meloidogyne spp por cada
concentración de los productos. Para la obtención de todos los estados del nematodo se
•
aplicó el protocolo descrito en el punto 3.5.2. Todas las concentraciones se repitieron por
5 veces (microtubo) bajo condiciones de laboratorio.
La evaluación del efecto nematicida sobre J2 se determinó a las 24 y 48 h
después de la exposición. La eclosión de los J2 'se realizó a los 10 días, el porcentaje de
3.5.1. Concentraciones
Se evaluaron siete concentraciones del Nemakill .® y del Nemathor 20L e, en ambos ensayos se utilizó como testigo comercial el nematickla químico Vydate (i.a. oxamilo) y un testigo absoluto (sólo agua) (Cuadro 2 y 3).
Cuadro 2. Diferentes concentraciones del Nemakill® utilizadas para evaluar la eficacia contra Meloidogyne spP en condiciones in vitro.
Tratamiento Concentraciones (mg/h
Nemakill® 500
Nemákill 750
Nernakill ® 1000
Nemakill 1250
Nemakill 1500
Nemalcill ® 1750
Ñemakill® !2000
Vydate L 1000
Teestigo (agua)
Cuadro 3. Diferentes concentraciones del Nemathor 20 utilizadas para evaluar la eficacia contra Meloidogyne spp. en condiciones in vitro.
Tratamiento Concentraciones
Nemathor 2000
Nemathor 20 2500
Nemathor 20 3000
Nemathor 20 Le 3500 Nemathor 20 L® 4000 Nemathor 20L® 4500 Nemathor 20 L® 5000
Vydate L 1000
Testigo (agua)
3.5.2. Obtención del inóculo
De las plantas de tomate inoculadas y mantenidas en invernadero se obtuvieron los huevos y J2 del nematodo, utilizándose segmentos de raíces con agallas visibles. Las raíces se agitaron en una suspensión acuosa al 1°/0 de hipoclorito sódico durante 3 min. La suspensión se decantó por un tamiz de 2 mm (del cual se recogió el filtrado). Se añadió más agua para lavar los fragmentos de raíces y se dejaron en agua durante 15 minutos para tener un buen aclarado Finalmente se volvió a tamizar y decantar, se retiró el agua de lavado y se recogió 100 ml del tamizado. Los trozos de raíces se trocearon finalmente con una licuadora eléctrica, la disolución -se dejó 24 horas para que se liberen la masa de huevos, huevos y J2.
•
Figura 1. Método del tamizado para la obtención del inoculo (huevos + J2) de
Meloidogyne spp
3.5.3. Obtención de la masa de huevos
Cada Masa de huevos sé aisló:directam. elite .de iaíceá con un alfiler entomológico
bajo el microscopio estereoscopio, se. seleccionaron masa de'huevolhoniogéneos.
1
3.5.4. ObserVaciones experimentales
Para 'cada ensayo se realizará las siguientes observaciones experimentales: Determinación del porcentaje de nematodos J2 inmovilizados a las 24 y 48 horas después', de la exposición.
Detlerminación de la acción nematicida o nemastática, los J2 inmovilizados a
las 24 y 48 horas se expusieron a un enjuague en agua por 24 horas.
Determinación del porcentaje de eclosión de J2 a partir de huevos directamente i
expuestos, acción ovicida.
3.5.5. Diseño iestadístico y análisis 'de datos
Para : cada ensayo se aplicó un diseño completamente al azar (DCA) con 9
tratamientos repetidos por 5 ve,ces cada uno. Los datos se sometieron a un análisis de la varianza (A VA) utilizándose el Software Statgraphics Plus 5.0. Para estimar las diferencias,silgnificativas entre las e;áicentracímies se realizó un análisis estadístico
; -
mediante la'priieba
,
3.6. Ensayos en invernadero - . ".
Para éícil ensayos se útilizó .1a misa población, dei'iiemátodo y fuénie de inóculddesbrito líneas arriba
3.6.1. Siembra y trasplante de tomate
--Púa evaluar lá eficacia de los nematicidas en condiciones de invernadero se
utilizó como hospedántésúscePtibles plantas de tomate Lycopersicuria _sculentym var.' Río
' Grande,. Semillas de tomate se sembraron en bandejas de germinación Cofitenienctp turba esterilizada, Clespiiés de‘la,gerrninatión las plantas se mantuvieron por un . , 15 días
o hasta cuando tengan 3 a 4, hojas verdaderas, luego se trasplantaron en ifiacetá plásticas de 1000 ein3 'conteniendo -una mezcla de arena turba (v/v 50%) esterilizada para su •
posteriár'inoculáción con nernatodós y aplicación de los neinaticidas. .^
Las plantas inoculadas se mantuvieron bajo condiciones de invernadero por un
período de 45 días, abonándose periódicamente con un fertilizante comercial soluble
NPK-20-10-20 (Peters, Renamar, Perú), a razón de 12 g/1 durante los ensayos.
3.6.2. Evaluación de la acción nematicida del Nemakill y Nemathor 20L® antes de la infección de las raíces (acción preventiva) por Meloidogyne spp.
Para Nemakill® se evaluaron tres dosis comerciales: 10, 12 y 15 1/ha y para el Nemathor®20L: 5, 7 y 10 1/ha. En cada ensayo con los nematicidas biológicos se utilizó
el VydateeL (testigo químico) a una dosis de 4.01/ha y un testigo control (sin nematicida).
Durante el día O se aplicó vía drench las dosis de los nematicidas y tres días después las
plantas se inocularon con 3500 huevos + J2 de Meloidogyne spp. El inóculo se aplicó en una suspensión' de agua e inyectándolo en 4 hoyos alrededor del tallo de cada planta. Las
plantas se mantuvieron en evaluación bajo condiciones de invernadero por 45 días, se
regaron y abonaron de acuerdo a lo indicado anteriormente.
Figura 3. Plantas de tomate con 15 días de edad inoculadas con huevos + J2 de
Meloidogyne spp, inoculo aplicado en 4
3.6.3. Observaciones experimentales
Se determinó la reproducción la reproducción del nematodo y el agallamiento
Causado en las raíces. Para estimar el índice de agallamiento se utilizó la escala de Taylor y Sasser (1971) descrita en el Cuadro 4.
Cuadro 4. Escala de grádos utilizada pata evaluación el índice de agallannento ,causado por Meloiclokyne spp en plantas de tomate en condiciones de inVernadero.
Grado Características
O Ausencia de nódulos Yio masas dé .huevos. 1 172nodulOS o:Masal de huevos
2 3 a 10 nódulos o masas de huevos 3 11 a 30 nódulos: ó masas de huevos 4 31a 100 nódulos o Masas de huevos
MIS de 100 nódulos o Masas de huevos.
La reproducción del nematodo se estimó cuantificándose el número de huevos + J2 por gramo de raíces
y
por. todo el .sistema radiCular, la extracción de los diferentes estados del nematodo se realizó mediante la utilización de una solución de 0.5% de Na0C1 (Hussey y Barker, 1973).También se evaluaron los siguientes parámetros del crecimiento: altura de planta desde el cuelló de planta hasta el último brote, peso fresco de parte aérea y peso fresco de raíces.
3.6.4. Diseño estadístico y análisis de datos
Para cada ensayo se aplicó un diseño de bloques completamente al azar (DBCA) con cinco tratamientos repetidos por 5 yeces. Los datos se sometieron a un análisis de la
varianza (ANVA) utilizándose el software Statgraphics Plus 5.0. Para estimar las diferencias significativas entre las concentraciones se realizó un análisis estadístico mediante la prueba Tukey.
CAPITULO
4
4. RESULTADOS Y DISCUSION
4.1. Efecto in vitro del Nemakilr
4.1.1. Acción Inematieida o neinastática
El Nemakill® presentó un efecto adverso significativo sobre la movilidad de los
.12 de Meloidogyne spp. A las 24 h de haber estado expuestos con el nematicida se
inmovilizaron entre el 55 al 87 % de los J2 del nematodo. El porcentaje más alto de
inmovilización se observó a una concentración de 2000 mg/1, diferenciándose
significativamente (P< 0.01) de las demás concentraciones (Cuadro 5). No se estimaron
mayores aumentos en el número de nematodos inmovilizados a las 48 h de contacto con
el Nemakill®. Con Vydate® L la mayor inmovilización del nematodo se observó a las 48
h, superando Significativamente (P< 0.01) a las concentraciones de Nemakill® (Cuadro
5).
Cuadro 5. Efecto de siete concentraciones de Nemakill® sobre la •• •
movilidad de 32 de Meloidogyne spp. en condiciones in vitro.
J2 Meloidogyne spp. inmovilizados (%)
Tratamientos Período exposición Enjuague
24W 48h agua por
24h
Nemakill® 500 mg/1 56.7b 53.3 ab 17.2 ab Nemakill® 750 mg/I 55.0 b 50.0 b 23.3 ab Nemakill® 1000 mg/1 68.3 ab 65.0 ab 28.5 a Nemakill® 1250 mg/1 68.3 ab 68.3 ab 28.3 a Nemakill® 1500 mg/1 60.0 ab 61.7 ab 34.2 a Nemakill® 1750 mg/1 68.3 ab 56.7 ab 34.2 a Nemakill® 2000 mg/1 86.7 a 60.0 ab 33.3 a
Vydateit 1000 mg/I 71.7 ab 85.0 a 8.3 b
Testigo (agua) 11.7 c 11.7c
'Promedios de una columna con la misma letra no presentan diferencias significativas (p< 0.01).
3Datos originales transformados en-ff--F-Tti.
Bajo el microscopio los nematodos muertos con Vydate®L adoptaron una posición
similares respuestas encontraron -McGarvey (1984) cuando enfrentaron a Meloidogyne spp. a una contentación de 41.1g/m1 de okamil. Los nematodos muertos por el Nemakill®
presentaron t'es formas distintitas del cuerpo, algunos con una forma curvada o sigmoide
y otros se engrosaron tomando un aspecto de "banana", en todos los casos de notaron
pliegues en toda la superficie del cuerpo (cutícula) acompañada de una desintegración de los contenidos internos del nematodo- (Fig. 4). Wiratno et al. (2009) evaluaron la actividad
nematicida de extractos de 17 especies de plantas y tres pesticidas sintéticos contra
Meloidogyne spp. concluyeron que las formas del cuerpo de los nematodos muertos
diferían en una forma característica entre los grupos de plag-uicidas y extractos de plantas,
por lo que está característica podría ser un indicador para conocer los modos de acción de
los extractos vegetales ensayados. Determinaron que los nematodos muertos por el tabaco
y el ricino presentaron la forma curvada, un poco dobladas y sigmoideas, que eran similares a los muertos por clorpirifos y carbosulfan inbibidores de la acetil
colinaesterasá. Otros extractos vegetales causaron en los nematodos muertos formas rectas o dobladas parecidas a una "banana", similar a los muertos por el piretroide
deltametrina, él cual probablemente afecte el sistema nervioso central de los nematodos. El Nemakill®, causó en los nematodos muertos algunas formas parecidas a las indicadas
por Wiratno et al. (2009) lo que indicaría que éste nematicida presenta distintos modos de acción.
Figura 4. Formas adquiridas por los J2 de Meloidogyne spp. e inmovilizados después de una exposición de 48 horas en Vydate® L (A) y Nemakill® (B), ensayos in vitro.
A las 24 horas después de someter a los nematodos con sus respectivos
tratamientos a un enjuague y luego expuestos en agua se observó que entre el 17.y 34 % de los nematódos permanecieron inmovilizados con Nemakill®, no reaccionando a un
estímulo mecánico ni recuperaron su movilidad Por lo que se consideraron como muertos
(Cuadro 5, Fig. 4), produciéndoáé un dallo irreversible,.(aCCión nematicida). Con Vydate
más del 80 % de los nématodos tratados recuperaron su actividad motriz (Fig. 5),
5
confirmándose que este produOto a concentraciones inClulo altas actúa como nemastático, paralizando los nematodós sin provocarles la muerte dire-Cta'afectando diferentes aspectos de su , - comportamiento (orientación, movilidad, eclosión y otros), por lo que los nematodos pueden recuperar su actividad después de laguna horas de eXposición(M¿Garvey ét al., 1984; Opperman y Chang, 1990).
Figura 5. J2 de Meloicióáne spp. áctivoS despnéI denn enjuague y expuestos en agita por 24 horas y previaineine tratadós Con Vydaíe% (A) y Nemakill® (B), ensayo in viiro.
-
Una ligera acción nematicidá (menos dél 34 % de inóttalidad) se determinó con Nemakill®, la mayor mortalidad se obseKr¿ a concentracionés superiorés a 1500 mg/1, es
, . -
posible que el potencial tóxico mejore si en nuevos ensayos se evalúan concentraciones más. altas y con períodos de exposición más largos. La -acción netnáticida del Nemakill®
se debe a su compleja composición de sus ingredientes activos (rutin, rutarin, undecanona y limoneno), que son extractos paturales„derivádos dé plantas superiores con actividad nematicida. Para el limoneno (un componente del, aceite dé 'cítricos) varios autores han
•
informado que inhibió la reproducción. de Meloidagyne: javanica, M incognita y
Heterodera sci hachtii (Viglierchio y Wit,"1989; Bauskéet al., 1994; Osman y Viglierchio,
1998).
"
Cuadro 7. Efecto de cinco concentraciones de Nemakill® sobre la eclosión de huevos de Meloidogyne spp. en condiciones in vitro.
Tratamientos
Eclosión de huevos (%) Nemakill® 2000 mg/1
Nemakill® 2500 mg/1 Nemakill® 3000 mg/1 Nemakill® 3500 mg/1 Nemakill® 4000 mg/1 Vydate®L 1000 mg/1 Testigo (agua) 33.0 bcx 41.7 be 45.0 b 23.3 bc 15.0 c 16.7 bc 85.0 a
'Promedios de una columna con la misma letra no presentan diferencias significativas (p< 0.01).
4.1.2. Efecto in vitro acción ovicida, período de incubación por 10 días
El VydateeL y Nemakill® presentaron una importante actividad ovicida
reduciendo el número de nematodos (J2) eclosionados a partir de masa de huevos y huevos directamente expuestos (Cuadros 6 y 7). Comparado el Nemakill® con el testigo
(agua) se observó que con este nematicida la eclosión de J2 varió entre el 5.1 y 18.7 %
respecto al testigo, diferenciándose significativamente (Cuadro 6). No se estimaron mayores diferencias significativas entre las concentraciones del Vydate ®L y Nernakill®.
Es importante destacar que el Nemakill® a una concentración de 2000 mg/1 obtuvo el
menor porcentaje de nematodos eclosionados (Cuadro 6).
Cuadro 6. Número de juveniles en segundo estado (J2) de Meloidogyne spp. eclosionados a partir de masa de huevos expuestos a siete concentraciones de Nemakill® en condiciones in vitro.
N° de J2 Tratamientos eclosionados Nemakill® 500 mg/1 43.0 bcdi Nemakill® 750 mg/1 60.7 b Nemakill® 1000 mg/1 27.0 bc Nemakill® 1250 mg/1 48.7 be Nemakill® 1500 mg/1 23.3 bc Nemakill® 1750 mg/1 30.7 bc Nemakill® 2000 mg/1 16.7 c Vydate ®L 1000 mg/1 16.7 c Testigo (agua) 324.3 a
'Promedios de una columna con la misma letra no presentan diferencias significativas (p< 0.01).
En la exposición directa de huevos se evaluaron concentraciones del Nernakill®
superiores a los 2000 mg/1, estimándose que a 4000 mg/1 se observó el menor número de huevos eclosionados (15 %) diferenciándose significativamente (P< 0.01) de los demás
tratamientos (Cuadro 7). Otro componente del Nemakill® es la undecanona, sobre este compuesto Amaral et al. (2002) determinaron que los ex/actos acuosos de Ruta
graveolens conocida como la "ruda" causaron 100% de inactivación de J2 de M. exigua,
atribuyendo que la fuerte acción nematicida de esta planta se debe a su componente
2-undecanona. Kuhn (2015) también encontró una alta reducción de la eclosión de huevos de Meloidogyne spp. usando extractos de hojas seca de R. graveolens. La acción ovicida
de muchos extractos vegetales se debe a que poseen sustancias que afectan las diferentes
fases del proceso de la eclosión, COM014 Multiplicación celular, el desarrollo embrionario, cambio de cutícula y salida del J2 (Campos et al., 2006): En este ensayo diferentes daños
se observaron inmediatamente antes de la eclosiói del riematodo, por lo que se determina qüe la acción tóxica de Nemakill® afectó las diferentes capas de la cascara del huevo
degradándola y exponiendo al J2 no eclosionado a una totál descomposición del cuerpo por el nematicida (Fig. 6).
Figura 6. Huevos y J2 no eclosionados 4,de Melpidogyne spp. ,
afectados por la acción tóxica del nematicida' biológico Nemakill®.
4.1.3. Evaluación de la eficacia de tres dosis comerciales del Nemakill/ en condiciones de invernadero
i • • 1
Vydate presentó el menor, índice de agállámiento (1A) y nivel de reproducción, diferenciándose significativamente (P< 0.01) del Nemakill® Sin Sin embargo, las tres dosis
del Nemakill® presentaron menores niveles de infestación - y daño con respecto
ir' • :." —
tratamiento testigo (agua), el 1A promedio de la 'dosis no superaron el grado 4 (31 a 100
nódulos o masas de huevos) (Fig. 7). La misma tendencia se determinó con respecto a la •
reproducción del nematodo, las Póblaciones rprómedid ph el número de huevos + J2 de las dosis de Nemakill® representaron Menos de 62' % de las estimadas en el testigo
La fuente de inóculo utilizada en una combinación de huevos más J2 del
nematodo, y de acuerdo al modo de acción del Nemakill° observado en laboratorio se
deduce que la mayor acción tóxica tanto del Nemakill/ como del Vydate® L se da contra
los J2, afectando el movimiento y la penetración de éstos en las raíces, asimismo también
se demostró a nivel in vitro que el Nemakill® presenta acción nemastática y una baja
acción nematicida.
Cuadro 8. Índice de agallamiento y número de huevos más juveniles de Meloidogyne spp, en raíces de tomate tratadas con tres dosis del nematicida Nemakill® en condiciones de invernadero.
Tratamientos Dosis
(L/ha)
LA Huevos + J2
Nemakill® 10 4.0 a 51,746b
Nemakill® 12 4.8 a 77,868 ab
Nemakill® 15 3.8 a 59,115 b
Vydate® L 4 1.2b 7,100 c
Testigo agua 5.0 a 102,018 a
'Promedios de una columna con la misma letra no presentan diferencias significativas (p< 0.01).
'Datos originales transformados en Logio(x+10) antes del ANVA y prueba de Tukey.
IA = índice de agallamiento, basada en una escala de O a 5, donde: O = sin agallas y 5 = más de 100 agallas o masa de huevos en el sistema radicular.
Figura 7. Grados de agallamiento causados por Meloidogyne spp. sobre raíces de tomate tratadas con diferentes dosis del nematicida biológico Nemakill®. A: testigo, B: Nemakill® 10 L/ha y C: Nemakill® 12 L/ha.
Las tres dosis del Nemakill® produjeron una ligera acción preventiva contra el nematodo, no Ise observó grandes diferencias significativas entre ellas, tampoco la acción
tóxica aumentó a mayores dosis del Nemakill®. En ese sentido, Nemakill® 10 L/ha
presentó una mayor eficacia en el control de la infección el nematodo. La buena acción tóxica mostrada por el Nemakill® in vitro contra los huevos y J2 (Fig. 6 y 7) no se
manifestó en condiciones de invernadero, se conoce que el comportamiento de los compuestos fitoquímicos naturales purificados algunas veces disminuyen su eficacia
cuando toman contacto con las condiciones suelo y otros factores, causándose una rápida degradación de estos compuestos (Chitwood, 2002). El Nemakill® se describe como un
nematicida biológico constituido por diversos compuestos que podrían interactuar sinergísticamente o antagonísticamente provocando complejas relaciones biológicas y bioquímicas.
No se observó diferencias significativas entre las dosis del Nemakill® y Vydate®L respecto a la altura de plantas. El Testigo (inoculado) destacó por presentar la menor altura, diferenciándose significativamente (P< 0.01) de los nematicidas (Cuadro 9). El
peso fresco de raíces y aéreo estimado sobre las distintas dosis del Nemakill® superaron significativamente a las del Vydaten... Los parámetros de crecimiento observados en el
tratamiento Vydatc®L indicarían un efecto adverso (fitotóxico) de este nematicida que
influyó sobre el peso fresco de raíces y área foliar.
Cuadro 9. Parámetros de crecimiento de plantas de tomate
Lycopersicon esculentum cv Río Grande inoculadas con Meloidogyne
spp. y tratadm con tres dosis del nematicida Nemakill®, en condiciones de invernadero.
Tratamientos Dosis Altura Peso Peso
(Liba) planta fresco fresco
(cm) raíces (g) aéreo (g)
Nemakill 10 67.4 ax 26.6 a 65.2 a
Nemakill® 12 68.4 a 24.2 a 66.0 a
Nemakill® 15 63.6 a 30.4 a 62.2 a
Vydate®L 4 62.6 a 6.6 b 23.2 b
Testigo Agua 32.0 b 24.2 a 69.6 a
