Análisis de la actividad antimicrobiana de las NPs-SiO 2

La realización de esta prueba constó de 3 métodos diferentes. Los pasos generales para estas técnicas consiste en la obtención de colonias de E.Coli para ello se procedió a realizar lo siguiente:

72 a) Preparación del medio de cultivo

Se preparó Agar Mueller Hinton como indica las instrucciones del producto. Para que la solución sea homogénea se calentó y se agitó en constante movimiento hasta observar que la mezcla tenga un color amarillo claro uniforme. Esta pasó a ser autoclavada con los otros materiales requeridos a ser esterilizados.

Fotografía 3: Pesado de agar Mueller Hinton

Fotografía 4: Autoclavado de materiales usados para preparación de cepas bacterianas de E.Coli

b) Sembrado de la cepa bacteriana

Se colocó aproximadamente 15 ml de agar en 4 placas, una de ellas para control (placa no inoculada con E.Coli) . Una vez gelificadas los medios se procedió a sembrar la

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bacteria haciendo uso de un cultiloops (asas de inoculación desechables que contienen microorganismos viables y estabilizados) y se sembró por agotamiento en las 3 placas restantes, todos ellos en presencia de un mechero para esterilizar la zona donde se realizarán las pruebas. Las placas fueron puestas en una estufa por 24 horas a 37ºC.

Fotografía 5: Cultivo de E.Coli

Fotografía 6: E.Coli sembrada en agar Müeller Hinton

c) Preparación del inóculo

Se preparó caldo Mueller Hinton con las indicaciones necesarias. Se realizó la medición del pH del medio y se procedió a autoclavar. Se tomó 3 colonias uniformes de las placas antes sembradas para inocularlos en el medio preparado y utilizándose el Vortex por 5 minutos a 1000 Microtires con la presencia de un mechero. Se incubó la solución por 4 horas y se procedió a ajustar la solución bacteriana a 0.5 Escala McFarland con suero quirúrgico NaCl 0.9%.

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Fotografía 7: Medición de pH en el caldo Mueller Hinton

Fotografía 8: Muestra inoculada en el vortex

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Fotografía 9: Comparación de Escala Mc Farland y solución bacteriana

Las técnicas usadas son descritas a continuación:

2.3.2.1. Método de difusión de discos

a) Preparación de solución con NPs-SiO2

Se preparó soluciones con concentraciones de 10, 20 y 40 ppm de nanopartículas de óxido de silicio, luego se pasó a sonicar las muestras por 30 minutos para una mayor homogenización. Adicional a ello se preparó una solución de ampicilina como antibiótico de prueba.

Fotografía 10: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica

b) Aplicación de discos de papel filtro

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Se preparó agar en 2 placas Petri. Luego estas fueron inoculadas con la solución bacteriana antes preparada. En estas placas fueron colocas 4 discos las que contenían:

Ampicilina y nanopartículas de sílice a las diferentes concentraciones preparadas.

Fotografía 11: Inoculación de placas Petri con solución bacteriana

Fotografía 12: Aplicación de discos

2.3.2.2. Método de microdilución en caldo a) Preparación de medio de cultivo

Para ello se usó caldo Mueller Hinton. Se pesó 2.2 g del caldo y se diluyó en 100 ml, para que la solución sea homogénea se calentó en microondas en intervalos de 4 por 10 segundos cada uno y 3 intervalos de 5 segundos cada uno. Una vez visualizado la homogenización de la muestra se procedió a medir el pH el cual mostraba un valor neutro.

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Luego se autoclavó conjuntamente con los materiales necesarios en el experimento para evitar contaminación de la muestra. Terminado este paso para el control visual de la actividad antimicrobiana de las nanopartículas se procedió a añadir 150 µl de rojo de fenol 0.8% la que tiene un pH de 7.0 (0.08 g en 100 ml de agua destilada) en el caldo preparado, el que se tiñe de color rojizo si el pH es ácido por la presencia de bacterias y la producción de la enzima β-lactamasa o amarrillo en pH básico por la poca producción de esta enzima.

b) Preparación de solución con antibiótico

Se pesó 0.012 g de NPs de SiO2 para disolverlo en 100 ml para obtenerse 120 ppm. Para que la solución este más homogénea se llevó a sonicar por 15 minutos. Para preparar las demás concentraciones se diluyó la solución madre para obtener 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ppm de NPs SiO2.

Fotografía 13: Medición de pH de rojo de fenol y caldo Mueller Hinton

Fotografía 14: Soluciones seriadas de NPs SiO2

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c) Aplicación de la microdilución en placas Elisa

Se diluyó en 1/20 la suspensión bacteriana ajustada a 0.5 escala Mc Farland en las diferentes concentraciones de NPs SiO2. Se consideró un volumen final de 200 μL de cada pocillo de la placa Elisa.

La fila A, columna 1 y 12 son de control (no contiene NPs SiO2), y las demás pruebas en filas intercaladas para evitar su contaminación. La columna 2 tiene una concentración de 20µg/ml hasta llegar a la columna final de 120 µl/ml. Realizado las diluciones correspondientes, se empaquetó la placa Elisa con microfilm y se llevó a la estufa para su incubación a 37°C por 24 horas.

Tabla 9: Distribución de microdiluciones en placa Elisa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A ^{C C C C C C C C C C C C}

B

C ^{C NP SiO2}

20µg/ml NP SiO2

30µg/ml NP SiO2

40µg/ml NP SiO2

50µg/ml NP SiO2

60µg/ml NP SiO2

70µg/ml NP SiO2

80µg/ml NP SiO2

90µg/ml

NP SiO2

100µg/ml

NP SiO2

110µg/ml

NP SiO2

120µg/ml

D

E ^{C NP SiO2}

20µg/ml NP SiO2

30µg/ml NP SiO2

40µg/ml NP SiO2

50µg/ml NP SiO2

60µg/ml NP SiO2

70µg/ml NP SiO2

80µg/ml NP SiO2

90µg/ml

NP SiO2

100µg/ml

NP SiO2

110µg/ml

NP SiO2

120µg/ml

F

G ^{C C C C C C C C C C C C}

H

Fuente: Propia

2.3.2.3. Método de la curva de inhibición del crecimiento

a) Preparación de solución con NPs-SiO2

Se preparó soluciones con concentraciones de 5, 10, 20, 120, 240, 480 ppm de nanopartículas de óxido de silicio, luego se pasó a sonicar las muestras por 30 minutos para una mayor homogenización.

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Fotografía 15: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica

b) Medición de densidad óptica del crecimiento bacteriano

Se realizaron mediciones de densidad óptica del caldo inoculado en contacto con solución de nanopartículas a diferentes concentraciones en dos días, el primer día concentraciones bajas de 5, 10 y 20; en segundo día concentraciones altas de 120, 240 y 480 ppm. Las lecturas se realizaron por 8 horas en intervalos de 1 hora, siendo incubadas en una estufa a 37°C.

Fotografía 16: Espectrofotómetro UV-Vis usado para medir la densidad óptica

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Fotografía 17: Celdas con muestra a analizar