Universidad Nacional del Centro del Perú
Facultad de Ingeniería Química
Evaluación de la concentración y el tiempo de contacto de las nanopartículas de óxido de silicio para la inactivación de las
bacterias E. Coli en aguas residuales municipales
Cornelio Pucuhuayla, Eileen Solange Quiñones Coronel, Nicole Ginger
Huancayo 2019
Esta obra está bajo licencia https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Repositorio Institucional - UNCP
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y EL TIEMPO DE CONTACTO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE SILICIO PARA LA INACTIVACIÓN DE LAS BACTERIAS E. COLI EN AGUAS RESIDUALES
MUNICIPALES
Tesis
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO QUÍMICO AMBIENTAL
Presentado por:
CORNELIO PUCUHUAYLA, Eileen Solange QUIÑONES CORONEL, Nicole Ginger
HUANCAYO, PERÚ 2019
ii ASESOR:
Ms. EVER F. INGARUCA ALVAREZ CO-ASESORA:
Mg. ANA MARÍA OSORIO ANAYA
iii
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado de manera especial a mi madre Doris, siendo ella la base para la construcción de mi carrera profesional, siempre le estaré agradecida por todo.
Eileen Cornelio
Este trabajo va dedicado a Dios, por concederme la oportunidad de seguir con vida, por estar conmigo en cada paso que doy y por haber puesto en mi camino a mis padres, Rubén y Mery, a mis hermanos, Ayrton y Patrick que han sido mi apoyo durante todo el periodo de estudio.
Nicole Quiñones
iv
AGRADECIMIENTO
A Dios, por darnos la vida y guiarnos en las metas propuestas a lo largo de nuestras de vidas.
A nuestros padres, que son su amor, comprensión y trabajo arduo nos educaron y apoyaron en toda nuestra formación profesional.
A nuestra alma mater, la Universidad Nacional del Centro del Perú, que gracias al concurso de Tesis de Pregrado 2018-UNCP, nuestro proyecto de tesis se pudo concretar con éxito; brindándonos el apoyo económico y la asesoría necesaria para desarrollar la presente tesis.
A nuestro asesor, Ms. Ever Ingaruca Alvarez, por todo su apoyo brindado en asesorías y consejos para guiarnos al final de nuestro trabajo.
A nuestra co-asesora, la Dr. Ana María Osorio, por compartir sus conocimientos y experiencias, así como por recibirnos en la Universidad Nacional Mayor San Marcos, brindarnos las facilidades para desarrollar la experimentación de nuestro trabajo en el Laboratorio de Nanotecnología e Innovación Tecnológica de la Facultad de Química e Ingeniería Química.
Al Dr. Julio Santiago Contreras, docente de la Universidad Nacional Mayor San Marcos, por permitirnos el uso del equipo espectrofotómetro UV-Vis, para las mediciones de crecimiento bacteriano.
A nuestros compañeros Hidalgo Eustaquio y Bryan Canal, por la ayuda prestada en toda nuestra estadía en la Universidad Nacional Mayor San Marcos.
v RESUMEN
En el presente trabajo de investigación se evaluó un nuevo método de inactivación de bacterias E. coli presentes en aguas residuales municipales sintetizadas en un reactor RAFA utilizando nanopartículas de sílice (NPs-SiO2). La investigación se dividió en 3 etapas. La etapa 1 consistió en la caracterización de las NPs-SiO2, el estudio de la actividad microbiana de las NPs-SiO2, el arranque del reactor RAFA y las mediciones del reactor, en la etapa 2 se continuó las mediciones hasta determinar una eficiencia mayor del 80%, y en la etapa 3 ya con una eficiencia del 81,5% se empezó con la evaluación de concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para inactivar las bacterias E. coli en el efluente del reactor. Las NPs-SiO2 se caracterizaron mediante Difracción Dinámica de Luz (DLS) obteniendo un diámetro hidrodinámico entre 11 y 11,7 nm, por Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) mostrando nanopartículas aglomeradas formando poros de menos 100 nm con forma semiesféricas, por Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) mostrando un diámetro menor a 20 nm y por el método de Espectrofotometría UV-Vis obteniendo un pico más elevado en 195,5 nm que corresponde al grupo funcional con el material sintetizado. En el estudio de la actividad microbiana, se realizaron lecturas de inhibición de crecimiento bacteriano de la bacteria E. coli a concentraciones bajas y altas, se obtuvieron valores de CMI de 20 ppm en concentraciones bajas y de 120 ppm en concentraciones altas. El reactor trabajó 168 días y se logró la remoción de DQO de más del 80 % con un TRH de 12,8 horas y un caudal de 4,8ml/min. Del efluente del reactor RAFA se inoculó las NPs-SiO2 a concentraciones de 20, 120 y 240 ppm y se tomaron muestras a diferentes tiempos de 2, 4, 6 horas de contacto, obteniendo un resultado óptimo de concentración y tiempo de 120 ppm en 2 horas presentando una inactivación de 71,4%, Se concluye que se logró desarrollar una metodología simple y muestra que el uso de las NPs-SiO2 pueden inactivar mas no eliminar las bacterias E. coli.
vi
INTRODUCCIÓN
Unos de los problemas mayores asociado con la contaminación hídrica es la descarga de agentes patógenos de las plantas de tratamiento de las aguas residuales municipales lo que ocasiona el daño de biodiversidad y enfermedades. Para solucionar este problema, es importante el tratamiento de las aguas residuales con nuevas tecnologías que incluyan tratamientos avanzados para la disminución del crecimiento bacteriano presente en los efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Existen diferentes formas de eliminar los agentes patógenos presentes en el agua. Entre los métodos de desinfección más empleados se encuentra la cloración, ozonificación, luz ultravioleta, la nanotecnología entre otros (Unidas, 2016)
Actualmente la rama de la nanotecnología se ha identificado como una solución a la eliminación o inactivación de las bacterias presentes en las aguas residuales municipales e industriales. En estudios anteriores se ha identificado que las NPs pueden interactuar directamente con las células microbianas y provocar la inactivación de las mismas (Eversdijk J, 2012)
Con base a lo anterior surge la presente investigación que tiene como objetivo el desarrollo de nuevos métodos para la inactivación de E. coli mediante la aplicación de NPs-SiO2 se divide en tres capítulos. El primero se basa en la revisión bibliográfica que contiene los antecedentes internacionales de la investigación. El segundo capítulo se presenta la parte experimental: Materiales, equipos y procedimiento y en el último capítulo se presentan el tratamiento de datos y discusión de resultados y por último se presentan las conclusiones recomendaciones y anexos.
vii OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para la inactivación de las bacterias E. coli en aguas residuales municipales.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Caracterizar una muestra de NPs-SiO2.
Analizar la actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2.
Determinar la concentración de NPs-SiO2 que inactive las bacterias E. coli presentes a aguas residuales municipales
Determinar el tiempo de contacto en que las NPs-SiO2 inactiven a las bacterias E. coli presentes en las aguas residuales municipales
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SIMBOLOGIA UTILIZADA
SÍMBOLO SIGNIFICADO UNIDADES
pH Potencial de Hidrógeno -0 – 14
𝑇𝑅𝐻𝑖 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑢𝑙𝑖𝑐𝑎 h
mg/L Miligramos por litro mg/L
Ppm Partes por millón mg/L
μS Micro siemens μS
NMP Nivel más probable ---
Q Caudal ml/min
STD Solidos totales disueltos ppm
UFC Unidad formadora de colonias
NTU Unidades nefelométricas de turbidez < 30 NTU
NPs-SiO2
Nanopartículas de óxido de silicio o silice
NPs-ZnO Nanopartículas de óxido de zinc
DBO Demanda bioquímica de oxigeno mgO2/l
DQO Demanda química de oxigeno mgO2/l
CMI Concentración mínima inhibitoria UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanquet
RAFA
Reactor Anaerobio de Flujo Ascendente
E. coli Escherichia coli ETEC Enterotoxigénico
ix EPEC Enteropatógeno EHEC Enterohemorragico
EIEC Enteroinvasivo
P Población
D.O. Densidad óptica λ/cm
A Absorbancia T Transmitancia
°C Grados Celsius
PTAR
Planta de tratamiento de aguas residuales
TLF Tratamiento de lagunaje facultativo SEM Microscopio Electrónico de Barrido
TEM
Microscopio Electrónico de Transmisión
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ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ... iii
AGRADECIMIENTO ... iv
RESUMEN ... v
INTRODUCCIÓN ... vi
OBJETIVOS ... vii
OBJETIVO GENERAL: ... vii
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ... vii
SIMBOLOGIA UTILIZADA ... viii
ÍNDICE DE CONTENIDO ... x
ÍNDICE DE TABLAS ... xii
ÍNDICE DE FIGURAS ... xiii
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS ... xiv
CAPÍTULO I ... 15
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ... 15
1.1 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA ... 15
1.2 BASES TEÓRICAS ... 24
1.2.1. Aguas Residuales ... 24
1.2.2. Aguas Residuales Municipales ... 24
1.2.3. Elementos y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales Municipales. ... 24
1.2.4. Escherichia coli. ... 26
1.2.5. Modelo matemático del crecimiento bacteriano ... 32
1.2.6. Cinética del crecimiento poblacional ... 34
1.2.7. Medición del crecimiento bacteriano ... 36
1.2.8. Factores que afectan el crecimiento... 40
1.2.9. Métodos de eliminación de bacterias ... 42
1.2.10. Métodos de Inactivación de la bacteria ... 43
1.2.11. Métodos para la determinación de la actividad antimicrobiana ... 44
1.2.12. Nanopartículas. ... 48
1.2.13. Nanopartículas de óxido de silicio... 51
1.2.14. Síntesis de las NPs-SiO2 ... 52
1.2.15. Caracterización de nanopartículas de óxido de silicio (Sílice) ... 54
xi
1.2.16. Reactor Anaerobios U.A.S.B. ... 59
1.3. MARCO CONCEPTUAL ... 65
CAPITULO II ... 67
PARTE EXPERIMENTAL ... 67
2.1. Materiales e insumos ... 67
2.2. Equipos e instrumentos ... 68
2.3. Procedimiento ... 69
2.3.1. Caracterización de una muestra de NPs-SiO2. ... 69
2.3.2. Análisis de la actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2 ... 71
2.3.3. Concentración de NPs-SiO2 ... 80
CAPITULO III ... 95
TRATAMIENTO DE DATOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ... 95
3.1. Caracterización de una muestra de nanopartículas de óxido de silicio ... 95
3.1.1. Dispersión Dinámica de Luz ... 95
3.1.2. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) ... 96
3.1.3. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) ... 97
3.1.4. Espectrofotometría UV-visible ... 97
3.2. Análisis de Actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2 ... 98
1.2.1. Método de difusión de discos ... 98
1.2.2. Método de microdilución en caldo ... 100
1.2.3. Método de la curva de inhibición del crecimiento ... 102
3.3. Determinación de la concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para la inactivación de las bacterias E. coli ... 106
3.3.1 Porcentaje de inactivación de E. coli a diferentes concentraciones de NPs-SiO2 ... 107
3.3.2 Porcentaje de inactivación de E. coli a diferente tiempo de contacto con NPs- SiO2 ... 109
CONCLUSIONES ... 111
RECOMENDACIONES ... 113
BIBLIOGRAFÍA ... 114
ANEXOS ... 119
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Componentes y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales
municipales. ... 25
Tabla 2: Estándares de calidad de agua para diferentes usos ... 26
Tabla 3: Clasificación taxonómica de Escherichia coli ... 27
Tabla 4: Cepas de E. coli ... 29
Tabla 5: Escala de McFarland ... 39
Tabla 6: Principales tipos de nanopartículas y sus aplicaciones ... 50
Tabla 7: Ventajas y desventajas del tratamiento anaerobio ... 61
Tabla 8: Reacciones Bioquímicas en la digestión Anaerobia de la materia orgánica .... 64
Tabla 9: Distribución de microdiluciones en placa Elisa ... 78
Tabla 10: Especificaciones del reactor RAFA ... 80
Tabla 11: Tiempo de retención hidráulica a investigar ... 81
Tabla 12: TRH y Caudal de operación a investigar... 82
Tabla 13: Composición del sustrato sintético (basado sobre la demanda química de oxígeno en el influente de 1150 mg/L) ... 83
Tabla 14: Demanda Química de Oxigeno (DQO) para una razón C/N de 3 ... 84
Tabla 15: Periodos del proyecto de investigación ... 89
Tabla 16: Distribución detallada de las muestras ... 91
Tabla 17: Resumen de datos para medición de diámetro hidrodinámico NPs SiO2 ... 95
Tabla 18: Resumen de mediciones realizadas en espectroscopia UV-Vis ... 98
Tabla 19: Sensibilidad de las cepas control ... 99
Tabla 20: Antibiótico y diámetros críticos para Enterobacterias ... 99
Tabla 21: Resultados de mediciones de halos de inhibicion a diferentes concentraciones de NPs SiO2... 99
Tabla 22: Análisis microbiológico de E. coli ... 106
Tabla 23: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 20 ppm de NPs-SiO2 .. 107
Tabla 24: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 120 ppm de NPs-SiO2 107 Tabla 25: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 240 ppm de NPs-SiO2 108 Tabla 26: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 2 horas de contacto de NPs- SiO2 ... 109
Tabla 27: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 4 horas de contacto de NPs- SiO2 ... 109
Tabla 28: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 6 horas de contacto de NPs- SiO2 ... 110
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Componentes estructurales de E. coli ... 27
Figura 2: Clasificación de E. coli ... 28
Figura 3: Bacteria que contiene un plásmido que codifica mientras que el otro no. ... 31
Figura 4: El pilus en conexión citoplasmática temporal entre dos células ... 31
Figura 5: Replicación de la célula a través del pilus ... 31
Figura 6: El pilus se retira, dando como resultado dos células que contienen el mismo plásmido... 32
Figura 7: Crecimiento bacteriano ... 33
Figura 8: Cámara de Neubaver ... 37
Figura 9: Antibiograma de disco de difusión ... 45
Figura 10: Método de microdilución en caldo de un extracto de planta contra B. subtilis usando resazurina como indicador de crecimiento ... 46
Figura 11: Escala de comparación de los órdenes de magnitud hasta llegar a la escala nanométrica ... 48
Figura 12: Esquema de un equipo DLS ... 55
Figura 13: Resonancia plasmónica (polarización) de una nano partícula metálica ... 56
Figura 14: Esquema de microscopio electrónico donde se muestra las componentes principales ... 57
Figura 15: Partes del microscopio electrónico de transmisión ... 58
Figura 16: Esquema de un reactor UASB con sus principales dispositivos. ... 60
Figura 17: Etapa de la digestión anaerobia ... 62
Figura 18: Diagrama de flujo de agua residual sintetizada en el reactor RAFA piloto .. 85
Figura 19: Histogramas obtenidos por DLS ... 96
Figura 20: Espectro UV-Vis de NPs SiO2 ... 98
xiv
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS
Fotografía 1: Pesado de agar Mueller Hinton ... 72
Fotografía 2: Autoclavado de materiales usados para preparación de cepas bacterianas de E.Coli ... 72
Fotografía 3: Cultivo de E.Coli ... 73
Fotografía 4: E.Coli sembrada en agar Müeller Hinton ... 73
Fotografía 5: Medición de pH en el caldo Mueller Hinton ... 74
Fotografía 6: Muestra inoculada en el vortex ... 74
Fotografía 7: Comparación de Escala Mc Farland y solución bacteriana ... 75
Fotografía 8: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica ... 75
Fotografía 9: Inoculación de placas Petri con solución bacteriana ... 76
Fotografía 10: Aplicación de discos ... 76
Fotografía 11: Medición de pH de rojo de fenol y caldo Mueller Hinton ... 77
Fotografía 12: Soluciones seriadas de NPs SiO2 ... 77
Fotografía 13: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica... 79
Fotografía 14: Espectrofotómetro UV-Vis usado para medir la densidad óptica ... 79
Fotografía 15: Celdas con muestra a analizar ... 80
Fotografía 16: Laboratorio de la Facultad de Química e Ingeniería Química ... 81
Fotografía 17: Extracción de las muestras de lodos activos de CITRAR UNI ... 85
Fotografía 18: Puntos de monitoreo del reactor RAFA ... 86
Fotografía 19: Termometro digital , BOECO ... 87
Fotografía 20: Multiparámetro, Milwaukee modelo MW801 ... 88
Fotografía 21: Distribución de NPs-SiO2 ... 90
Fotografía 22: soluciones de NPs-SiO2 dentro del sonicador ... 90
Fotografía 23: Distribución de las muestras ... 92
Fotografía 24: llenado de muestra para ser analizadas ... 92
Fotografía 25: Imágenes SEM de NPs SiO2 ... 96
Fotografía 26: Imágenes TEM de NPs SiO2 ... 97
Fotografía 27: Halos de inhibición de Nps SiO2 ... 99
Fotografía 28: Placa Elisa para la determinación de la CMI de las NPs SiO2 ... 101
Fotografía 29: Materiales usados en el proyecto de investigación ... 123
Fotografía 30: Nanoparticulas de silice a concentraciones de 20,120 y 240 ppm ... 123
Fotografía 31: Sonicación de las nanoparticulas de silice a diferentes concentraciones ... 124
Fotografía 32: Muestra de agua residual simulada ... 124
Fotografía 33: Inoculacion de las nanoparticulas en el agua residual simulada ... 125
Fotografía 34: Muestras en contacto con las nanoparticulas ... 125
Fotografía 35: Envases para las muestras a analizar ... 125
Fotografía 36: Toma de muestras a analizar ... 125
15 CAPÍTULO I
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA
En los últimos años se han realizado muchas investigaciones en el campo de la nanotecnología aplicados a temas de tratamientos de aguas residuales, dentro de ellos uno de los que tiene muy pocos estudios son los métodos de inactivación de agentes patógenos con nanopartículas de Sílice.
(Osorio, y otros, 2008) es su investigación “Síntesis y caracterización de materiales macroporosos modificados de óxido de silicio” usan el método SOL-GEL para la síntesis de nanopartículas de silicio. Usando silicato sódico como precursor, esta pasa a una etapa de hidrólisis, para la formación de material macroestructurado aplicándose la síntesis hidrotermal, para finalmente eliminar la materia orgánica por calcinación.
Mediante este proceso se observó la formación de macroporos con 100 nm de diámetro determinada por el análisis de TEM.
(Arce, 2010) realizó una investigación denominada “Modificación y caracterización de nanopartículas de sílice. Reactividad con estados excitados”. La modificación consistió en esterificar sus grupos silanoles con alcoholes alifáticos y aromáticos para luego caracterizarlos mediante las técnicas Espectroscopía UV-visible, Microscopía de transmisión electrónica (TEM), entre otros. Los resultados mostraron que las nanopartículas funcionalizadas en una suspensión de 0.0025 g/l y 0.6g/l muestran absorción en la zona de los alcoholes libres usados para la síntesis de estas con ello determinándose la unión de los alcoholes hacia la superficie del óxido de silicio. Para el análisis en el equipo TEM, la muestra en suspensión 0,1 g/l de nanopartículas en mezcla
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acetonitrilo: buffer fosfato, muestra un tamaño menor a 20nm y formación de agregados en la suspensión.
En el estudio titulado “Nanopartículas de sílice: preparación y aplicaciones en biomedicina”, (Llinàs & Sánchez-García, 2013) investigan las NPs-SiO2 mesoporosas para su uso como vehículos de transporte aplicados a la biomedicina. El método usado para su obtención es una adaptación del método Stöber, a la que se le incorpora un tensoactivo catiónico. En su caracterización, este estudio determina el tamaño global de las NPs-SiO2 mediante las técnicas del DLS y de TEM. Obteniéndose un valor promedio de 200 nm de diámetro hidrodinámico.
(Espinoza, 2015) en su estudio “Síntesis de nanopartículas de SiO2 como potenciales vehículos para administración de fármacos” sintetiza nanopartículas de dióxido de silicio mediante el método de Stober modificado para evaluarlos como superficies de actuación y liberar fármacos. La caracterización fue se realizó por SEM, TEM, DLS entre otras; las que mostraron nanopartículas esféricas y porosas con un tamaño aproximado de partículas 70 nm.
(Velazco, Rodríguez, Castillo, Fernández, & Rojas, 2016) realizan un estudio titulado
“Síntesis y caracterización de nanopartículas de SiO2 por el método de Stöber”, con la finalidad de estudiar la influencia de la velocidad de agregado de los reactivos en las características de nanopartículas de SiO2, se ensayaron dos métodos de reacción uno que denominamos lento que consiste en añadir de 4 ml de Tetraetil ortosilicato en 25 ml de etanol a razón de 1 gota por segundo a una solución de 2 ml de Hidróxido de Amonio en 25 ml de Etanol, agitándose por 24 horas a 22°C; y uno rápido que mezcla 2 ml de hidróxido de amonio en 25 ml de etanol con una solución de 4 ml de Tetraetil ortosilicato en 25 ml de etanol en agitación por 24 horas a 22°C. Con la finalidad de estudiar la
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estabilidad de los métodos aplicados, las Nps fueron dispersadas en agua/ Carboximetil celulosa (CMC)/ Polietilenglicol (PEG) y Quitosano y se determinó la distribución de tamaños empleando dispersión dinámica de luz (DLS). Se logra distinguirse partículas de forma cuasi-esférica de diámetros inferiores a 100 nm.
(Darryl, Sheryl, & Tracey, 2006), analizaron las nanopartículas de sílice, sílice/óxido de hierro y oro para conocer sus efectos en la actividad de crecimiento de las E.Coli. Las mediciones de crecimiento bacteriano mostraron que a concentraciones de 3.3 x 10-2 g/ml, 2.2 x 10-3 g/ml y 1.1 x 10-4 g/ml, el desarrollo de las bacterias no mostraban signos de toxicidad.
(Ghaida, Muatez, & Ridha, 2009) realizó una investigación que lleva por título “The Antimicrobial Activity of Silica Oxide Nanoparticles Against Some Bacteria and Fungi Isolates “(“La actividad antimicrobiana de las nanopartículas de óxido de sílice contra algunas bacterias y aislamientos de hongos”) el cual tuvo como objetivo visualizar el efecto de las nanopartículas de sílice en algunas bacterias y hongos aislados.
Dichas nanopartículas se adquirieron de Sky Spring. Nanomateriales Inc., según información el tamaño fue de 20 nm con una pureza de 98.7%, se preparó a diferentes concentraciones de 10, 20, 30, 40 ppm disuelta en agua destilada con 5% de ácido acético, según los estudios se obtuvo una concentración mínima de inactivación para las NPs SiO2
de 10 ppm para todas la especies bacterianas analizadas dentro de ella E.coli ,demostrando que las nanopartículas muestran actividad bacteriana a concentraciones bajas , si estas sobrepasan los 5000 ppm se convierten en toxicas.
A nivel internacional existen interesantes investigaciones realizada por (Qian Wang, 2016) titulada “ Sequestration of nanoparticles by an EPS matrix reduces the particlespecific bactericidal activity”(“El secuestro de nanopartículas por una
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matriz EPS reduce la actividad bactericida específica de partículas”) cuyo objetivo principal es verificar si las bacterias E. coli cubiertas de una sustancia polimérica extracelular (EPS) pueden protegerlas de las NPs-ZnO y NPs-SiO2 , la cual reduciría la actividad bactericida de estas nanopartículas mencionadas . Inicialmente realizaron unas pruebas de toxicidad a las NPs-ZnO y NPs-SiO2 teniendo como resultado la inexistencia de toxicidad. Realizaron experimentos de manipulación del EPS en las suspensiones de E. coli o la eliminación de la EPS unida a las células por sonicación, que sirve para la reducción de la actividad bactericida. Según resultados observados después de 16 horas, la tasa de supervivencia de las bacterias E. Coli sin manipulación de EPS alcanzo el 65%
con (NPs-ZnO, 500 ppm) y el 79% con (NPs-SiO2, 500 ppm), mientras que la tasa de supervivencia después de la eliminación de EPS por sonicación fue del 11 y 63 % respectivamente. Asimismo, las nanopartículas después de la reacción con E. coli los diametros disminuyeron de 15 nm a 11 nm para NPs-ZnO y 13 nm para NPs- SiO2. Por lo tanto, según lo leído y entendido los resultados demuestran que las NPs-ZnO tienen mayor efecto bactericida que las NPs- SiO2
(Annadurai, 2013) en su investigación “Fluorescent Silica Nanoparticles in the Detection and Control of the Growth of Pathogen”(“Nanopartículas de sílice fluorescente en la detección y control del crecimiento de patógenos”) cuyo objetivo es el control del crecimiento de la bacteria E. coli mediante las nanopartículas de silice fluorescentes modificadas en la superficie, estas nanopartículas fueron cubiertas o modificadas con grupos carboxilos con carga positiva, trabajaron a concentraciones de 20 ppm, 50 ppm y 100 ppm se agregaron a un medio autoclavado libre de microorganismos y luego el cultivo de E. coli se inoculó, se tomaron muestras cada 2 horas dando como resultado que a concentración de 100 ppm tiene la máxima inhibición de bacterias E. coli a las 2 primeras horas, también demostraron que las bacterias se dañaron seriamente en
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su membrana externa y perdieron la confiabilidad celular de las especies bacterianas cuando se contactaron con las nanopartículas. En conclusión, las nanopartículas modificadas interactúan con las estructuras de las membranas bacterianas, lo que llevo a la muerte de las células, lo que conlleva que la actividad antibacteriana de las nanopartículas fue influenciada por el tamaño de estas.
Una parte fundamental para la investigación y del cual no es ubicó mucha información es sobre la interacción de las nanopartículas de sílice con las bacterias E. coli , pero en Turquia un grupo de investigadores realizaron el siguiente trabajo titulado
“Characterization of Silica Nanoparticles in Interaction with E. coli Bacteria”(“
Caracterización de nanopartículas de sílice en interacción con bacterias E. coli”), (Ibtissem Gammoudi, 2013) tuvieron como objetivo principal la evaluacion de la morfología de la bacteria E. coli en interacción con las NPs-SiO2. Este estudio se realizó mediante microscopía de fuerza atómica y microbalanza de cristal de cuarzo utilizando NPs-SiO2 con diámetros de 10 nm, 50 nm y 100 nm y bacterias inmovilizadas en películas de múltiples capas de polielectrolito obtenidas mediante recubrimiento por centrifugación o mediante el método de "capa por capa". Asimismo, mencionan que el tamaño, la forma, la superficie química, la composición y el estado de agregación de las nanopartículas serian determinantes en la interacción de la membrana de las bacterias. En sus primeros experimentos interactuaron con nanopartículas de 100 nm donde se concluyó que su morfología (forma y tamaño) de las bacterias no cambian, esto quiere decir que las bacterias están sanas
Según estudios realizados por científicos brasileños (Maiara Emer, 2017) “Nature and Bactericidal Impact on Surface Modified silica Nanoparticles.”(“ Naturaleza e impacto bactericida en nanopartículas de sílice de superficie modificada”), lograron demostrar el efecto bactericida de las nanopartículas de sílice cubiertas con distintos
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grupos funcionales (NH2, NCO, SH y COOH) en bacterias E. coli y S. aureus , . En la primera etapa, se obtuvieron nanopartículas de sílice por hidrolisis y condensación, en el segundo paso, diferentes grupos funcionales se injertaron en la superficie de las nanopartículas utilizando distintos silanos funcionalizados. Estas nanopartículas presentan una estructura cuasi esférica con tamaño de aproximadamente 110 nm, el tamaño de las nanopartículas se determinó mediante mediciones de partículas SEM y mediante la técnica de DLS da como resultado un tamaño de 20 nm, estos resultados SEM y DLS están bien correlacionados ya que el análisis de tamaño realizado por SEM se basa en números mientras que DLS proporciona diámetros hidrodinámicos (Dh) que son resultados basados en la intensidad. En las pruebas bacterianas trabajaron a concentraciones de 5,10,15 ppm con los distintos grupos funcionales, y obtuvieron una reducción del 60 % del crecimiento bacteriano con excepción del SiO2-NCO, y esto se debió a la agregación de la muestra. Se concluyo que a una mayor concentración de nanopartículas disminuye el crecimiento bacteriano y el mecanismo de actividad se especula que estas nanopartículas son atraídas por la superficie de las bacterias y que interactúan físicamente con su pared. Luego, que las partículas que presentan una interacción mejorada con la pared bacteriana dan como resultado una alta actividad bactericida. Pero la explicación más lógica se relaciona con la estabilidad coloidal, así como con los efectos de carga de la superficie en general, y es razonable considerar que las nanopartículas con menos estabilidad coloidal en un medio dado tenderán a desarrollarse y da como resultado una reducción del área expuesta y por lo tanto la interacción con las bacterias tiende a ser reducido
(Mustafa, 2018) menciona en el artículo titulado “Preparación, caracterización y propiedades antimicrobianas de nano revestimiento a base de sílice” que se sintetizan recubrimientos híbridos orgánico-inorgánicos con matriz orgánica (soluble en agua) que
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contiene NPs-SiO2. El proceso de Stober se utilizó para preparar nanopartículas de sílice monodispersadas. Las reacciones se llevaron a cabo a altas concentraciones de silicato de sodio [Na2SiO3] = 0.1-1 M, bajas concentraciones de hidróxido de amonio [NH4OH] =, acetonitrilo, en mezcla alcohólica (etanol, metanol y polietilenglicol). La composición y morfología de las formulaciones de recubrimiento se estimaron mediante espectroscopia infrarroja (FT-IR) y dispersión dinámica de la luz (DLS). Las actividades antimicrobianas de estas formulaciones de recubrimiento fueron investigadas contra varias bacterias patógenas (estreptomicina, Burkholderia pseudomallei, Salmonella gallinarum, neumonía por Klebsiella, Xanthomonas campestris y Pseudomonas fluorescens). Se reveló que las formulaciones resultantes que contienen NPs-SiO2 persisten su efecto antimicrobiano durante un tiempo de almacenamiento razonable.
En el artículo, titulado “Antimicrobial propertiesof silica modified nanoparticles”
(“Propiedades antimicrobianas de nanopartículas modificadas con sílice”), (Thibaud Coradin, 2013) menciona que los antibióticos encapsulados en nanopartículas tienen muchas ventajas como: la composición química y las modificaciones en la superficie de las nanopartículas permiten prolongar, localizar, apuntar y tener un medicamento protegido que logran interactuar con el tejido enfermo. Haciendo un claro ejemplo con óxido nítrico se analizó la actividad antimicrobiana, la cual se demostró la producción no es parte de una respuesta eficaz del huésped a la infección por lo tanto no inhiben o destruyen los microbios cuando se administra directamente in vitro. Es aquí donde se han utilizado NPs-SiO2 liberadoras de óxido nítrico para controlar con éxito la formación de biopeliculas mediante microorganismos como Pseudomonas aeruginosa y E. Coli.
En el año 2012 (Alexandros Besinis, 2012) realizo una investigación sobre “Los efectos antibacterianos de las nanopartículas de plata, dióxido de titanio y óxido de sílice en comparación con el desinfectante dental clorhexidina en Streptococcus mutans
22
utilizando un conjunto de bioensayos” donde Las NPs-SiO2 y NPs-TiO2 examinadas en este estudio mostraron un efecto limitado o nulo contra S. mutans y, por lo tanto, no pueden considerarse sustitutos de la clorhexidina. Este hallazgo está de acuerdo con estudios previos que demostraron que se requieren concentraciones considerablemente más altas de sílice o TiO2 (> 1000 mg/l) para comenzar a proporcionar alguna evidencia de inhibición del crecimiento bacteriano. Sin embargo, el papel de los diferentes tipos de sílice en la prevención de la adherencia bacteriana en sustratos orgánicos o inorgánicos debe investigarse más a fondo.
Por otra parte (Y. Liu, 2009) en su investigación “Antibacterial activities of zinc oxide nanoparticles against E. Coli O 157:H7” (“Actividades antibacterianas de las nanopartículas de óxido de zinc contra E. Coli O 157: H7”) tiene como objetivo investigar las actividades antibacterianas de las NP-ZnO y su modo de acción contra un importante patógeno transmitido por los alimentos, E. Coli O157:H7, la cual el método que utilizaron fue mostrar un efecto inhibitorio a diferentes concentraciones 0, 3, 6 mmol con un tamaño de nanopartícula de 70 nm y para caracterizar los cambios de morfología y estudiar el modo de acción de NP-ZnO contra Escherichia Coli usaron Microscopia Electronica de barrido (SEM), transmicion Microscopia Electronica (TEM) y espectroscopia Raman , con este ultimo las células bacterianas aumentaron después de la exposición a NP-ZnO mientras que no hubo cambios significativos y en el ácido nucleico se observaron bandas, por lo tanto se llegó a la conclusión de que si existe actividad antimicrobiana NP-ZnO contra la bacteria E. coli O157:H7 y que los efectos inhibitorios aumentan a medida que la concentración de NP-ZnO aumentan, la cual pueden distorsionar y dañar las células bacterianas, el impacto que genera es que puede ser utilizado para proteger la agricultura y seguridad alimenticia.
23
(Samah, 2017) muestra en su investigación el estudio de la actividad antimicrobiana de dos nanopartículas, una de óxido de silicio y otra de zinc contra diferentes bacterias gram positivas y gram negativas. Sus resultados mostraron que la mejor zona de inhibición era 20 mm a una concentración de 10 µg/ml de NP-SiO2 en P. aeruginosa, mientras que la zona de inhibición más baja era (2 mm) a una concentración de 4 µg / ml en el misma nanopartícula en S. epidermidis sin zona de inhibición a la concentración de 2 µg / ml observada en la misma bacteria. Todas las bacterias probadas se inhibieron por completo a la concentración de 0.625 µg / ml de NP-SiO2 y el (MBC) fue el mismo que (MIC) para todos aislamientos probados. Por lo tanto, las dos nanopartículas (ZnO y SiO2) tenían actividad antibacteriana, pero las NP-ZnO eran mejor que las NP-SiO2 y podía inhibir la mayoría de las bacterias patógenas importantes a las concentraciones analizadas aisladas de pacientes hospitalizados.
(Sánchez-Venegas, y otros, 2016) en su investigación titulada “Actividad inhibitoria del crecimiento bacteriano por cobre nanoestructurado obtenido de minerales de la región Marañón: comparación con cobre comercial”, estudian la actividad inhibitoria para el desarrollo bacteriano por NPs CuO cementado y comercial. Usaron dos tipos de microrganismos: Staphylococcus aureus y Escherichia coli para determinar la concentración mínima inhibitoria de las nanopartículas diluidas. Las técnicas usadas fueron dilución en caldo y microdilución em caldo, aplicando una variación al procedimiento general, ya que fortifican el medio de cultivo con rojo de fenol como indicador de presencia bacteriana. Sus resultados mostraron una CMI de 20 μg/mL para el cobre comercial frente a S. aureus. Por otro lado, el cobre cementado no produjo impacto en la inhibición de desarrollo de ningún microorganismo usado.
24 1.2 BASES TEÓRICAS
1.2.1. Aguas Residuales
Según (OEFA, 2014) define como cualquier agua con cualidades originales que han sido modificadas por las actividades humanas y/o animales y que por su calidad requieren un tratamiento, antes de ser reusadas, desembocadas a un cuerpo natural de agua o desechadas al sistema de alcantarillado.
1.2.2. Aguas Residuales Municipales
Según RJ N° 224-2013-ANA las aguas residuales domesticas las que pueden estar combinadas con aguas de drenaje pluvial o con aguas residuales de industrias previamente tratadas, para ser admitidas en los sistemas de alcantarillado de tipo combinado.
1.2.3. Elementos y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales Municipales.
Los elementos y variables físicas, químicas y biológicas que tienen las aguas residuales, según definido por METCALF & EDDY INC, se indican a continuación:
25
Tabla 1: Elementos y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales municipales.
Fuente: METCALF & EDDY INC, pag 6
Asimismo, cabe mencionar que en el DS. N° 004-2017-MINAM publicado en el diario (PERUANO, 2017) se aprueban los Estándares de Calidad Ambiental definiendo los
CARACTERÍSTICA VARIABLE PROCEDENCIA
Propiedades Físicas Color Aguas residuales domesticas e industriales, desintegración de materiales orgánicos.
Olor Aguas residuales de descomposición, vertimientos industriales.
Sólidos Aguas de suministro, Aguas residuales domesticas e industriales, erosión del suelo, infiltración y conexiones incontroladas.
Temperatura Aguas residuales domesticas e industriales.
Orgánicos Carbohidratos Aguas residuales comerciales e industriales.
Grasa animal y aceite
Aguas residuales domésticas, comerciales e industriales.
Pesticidas Residuos Agrícolas.
Fenoles Vertidos industriales
Proteínas Aguas residuales domésticas y comerciales.
Otros Desintegración natural de materiales orgánicos Inorgánicos Alcalinidad Aguas residuales domésticas agua de suministro,
infiltración de aguas subterráneas.
Cloruros Agua de suministro, Aguas residuales domésticas, infiltración de aguas subterráneas.
Metales pesados
Vertimientos industriales, Aguas Residuales domésticas y residuos agrícolas.
Nitrógeno Aguas residuales domésticas y residuos agrícolas.
PH Vertimientos industriales.
Fosforo Aguas residuales domésticas, industriales, escorrentía residual.
Azufre Aguas de suministro, aguas residuales, domesticas e industriales.
Compuestos tóxicos
Vertidos industriales.
Propiedades Biológicas Animales Cursos de aguas y plantas de tratamiento.
Plantas Cursos de aguas y plantas de tratamiento.
Protistos Aguas residuales domésticas, plantas de tratamiento
Virus Aguas residuales domésticas, plantas de tratamiento
Bacterias Aguas residuales domésticas, plantas de tratamiento
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límites Máximos Permisibles de las sustancias y o parámetros físicos, químicos y biológicos presentes en el agua, que no muestran riesgos para la salud ni el ambiente según categorías, a continuación se detalla solo los parámetros biológicos, para una posible comparación con los resultados obtenidos en el proyecto.
Tabla 2: Estándares de calidad de agua para diferentes usos
ECA AGUA ESTANDARES DE
CALIDAD DE AGUA-PERÚ
Categoría 1: Agua superficiales destinadas a la producción de agua
potable
Categoría 3: Riego
Categoría 4: Conservación del ambiente Acuático
A1: Con simple desinfec ción
A2: Con tratamiento convenciona
l
A3: Con tratamient
o avanzado
Riego de vegetales de tallo alto y tallo
bajo
E1:
Lagunas y lagos
E2:
Ríos Costa, Sierra y
Selva
E2: Ecosistemas marinos costeros
Parámetro Unidad Estuario
s
Marino s
DBO mg/L 3 5 10 15 5 10 15 10
DQO mg/L 10 20 30 40 ** - ** **
E. coli NMP/
100 mL
0 ** ** 1000 ** ** ** **
** No aplica para esta subcategoría Fuente: : Modificado de (Minam, 2017) 1.2.4. Escherichia coli.
1.2.4.1. Definición
Escherichia coli es un bacilo gran negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, género o tribu Escherichia, no forma esporas, son móviles (flagelos perítricos), miden 0.5 u de ancho por 3 u de largo, reducen nitratos a nitritos y producen vitamina B y K, y como partes principales son: Flagelo, fimbrias, ribosomas, cadena de ADN circular, mesosoma, cápsula (Angeles, 2002)
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Figura 1: Componentes estructurales de E. coli
Fuente: (Rojas., 2015)
1.2.4.2. Clasificación taxonómica
La Escherichia coli, también conocida como, E. coli, es uno de los organismos más estudios por la humanidad y su clasificación taxonómica es la siguiente:
Tabla 3: Clasificación taxonómica de Escherichia coli
Escherichia coli Reino: Bacteria Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria Orden: Enterobaceriales Familia: Enterobacteriaceae Genero: Escherichia
Especie: E. Coli ( E. Freundi) Nombre binomial
Escherichia Coli
Fuente: Microbiologia General, 2015
Se han demostrado la existencia de colonias de E. Coli. se reconocen 4 grupos 1.2.4.3. Clasificación de Escherichia Coli
28
En la investigación realizada por (Ingerson, 2011) menciona que el mayor porcentaje de bacterias E. coli no generan enfermedad, pero si una persona se enferma de E. coli, se producirá infección en el tracto gastrointestinal y como consecuencia se producirá náusea, vómito, diarrea y fiebre. Estas bacterias tienen como habitad natural el tracto gastrointestinal, si se introducen en lugares erróneos, por ejemplo: los riñones o la sangre pueden causar infecciones, y esta puede diseminarse en el cuerpo (el sistema nervioso, la sangre, el hígado, etc.). Las formas más comunes de estar expuesto a las bacterias E. coli son los alimentos y el agua contaminada.
Hay tipos específicos de E. coli que pueden o no causar enfermedades y se clasifican como se muestra en la figura 2, la cual estas bacterias pueden ser transmitidos generalmente a través de alimentos y agua contaminada. La tabla 4 resume los tipos dañinos de E. coli, el modo de transmisión y evolución de la enfermedad.
Escherichia Coli Enteroinvasivo
(EIEC)
Enterohemorragico (EHEC)
Enterotoxigénico (ETEC) Enteropatogeno
(EPEC)
Figura 2: Clasificación de E. coli Fuente: (Rojas., 2015)
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Tabla 4: Cepas de E. coli
Cepas de E. coli Modo de transmisión Enfermedad
Enterotoxigénico (ETEC)
Alimentos o ingestión de agua ETEC ocasiona diarrea sin fiebre.
Enteropatógeno (EPEC)
Los alimentos o agua, el contacto humano directo e indirecto
EPEC ocasiona diarrea acuosa, a veces con sangre.
Enterohemorrágico (EHEC)
Alimentos o ingestión, el contacto humano directo o indirecto
EHEC ocasionan diarrea consagre, a veces pueden dañar los riñones
Enteroinvasivo (EIEC)
La ingestión de alimentos o agua EIEC provoca disentería, como la diarrea. La fiebre es un síntoma común
Fuente: Microbiologia General, 2015
1.2.4.4. Características de E. coli
Las bacterias E. coli se caracterizan por tener bacilos Gram negativo, no producción de acetoína. Ademas, fermenta la glucosa y lactosa con producción de gas
Las bacterias E. coli están cubiertas de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y péptido glucano. El ultimo elemnto le da a la bacteria su forma y rigidez, la cual le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente elevadas.
La E. coli es una bacteria mesofílica, esto quiere decir que su optimo desarrollo o crecimiento se encuentra en un rango de temperatura corporal (35-43°C) y su temperatura límite de crecimiento se encuentra alrededor de 7°C. sin embargo, E.
coli son muy sensible a temperaturas superiores a 70°C, solo a esa temperatura pueden ser eliminadas fácilmente.
El pH y la actividad de agua tienen un papel muy importante ya que pueden influir en la proliferación de la E. coli. Las condiciones óptimas de crecimiento para estos parámetros son de 7.2 y 0.99 respectivamente. Para el crecimiento o desarrollo de
30
las bacterias E. coli varia en el rango de pH (3.8 a 9.5) y para la actividad de agua (aw) superiores a 0.94. Por ello, el grado de acidez de un alimento puede definir un factor de protección y seguridad.
La adaptación de la E. coli no son muy comunes, debido a la adquisición de nuevos genotipos a partir de plásmidos, bacteriófagos y otros elementos que ceden su material genético. Así mismo, su capacidad de movilización favorece la aparición de nuevas cepas con capacidades patógenas que no son reconocidas con facilidad.
1.2.5.5. Reproducción bacteriana
Las bacterias, como células procarióticas, se dividen por medio de la fisión binaria.
(Raven, 2008) nos dice que la fisión binaria es un proceso de reproducción que resulta en dos copias idénticas de la célula madre original. Una bacteria contiene un solo ADN circular de doble cadena circular, el proceso comienza del origen de la replicación y mover ambas direcciones alrededor del cromosoma hasta que se encuentren de nuevo en el extremo de la replicación, creando dos moléculas del ADN. Durante este tiempo, la célula se alarga y comienza a separarse una vez se completa la replicación del ADN.
En el caso de las bacterias E. coli la cantidad de tiempo que tarda en dividirse es de 20 a 30 minutos dependiendo de la cepa específica y el ambiente en el que se encuentra, después de esta división las bacterias aún pueden intercambiar más información genética y esto ocurre a través de la conjugación, transducción y la transformación. La conjugación implica la conexión física de las células por medio de un pilus. Un pilus es una conexión citoplasmática entre dos bacterias, en la cual intercambian segmentos de ADN hasta inclusive la resistencia de los antibióticos. El proceso se muestra en las siguientes figuras 4,5 y 6 (Raven, 2008)
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ADN Plásmido
Fuente: (Raven, 2008)
Fuente: (Raven, 2008) PILUS
Fuente: (Raven, 2008)
Figura 3: Bacteria que contiene un plásmido que codifica mientras que el otro no.
Figura 4: El pilus en conexión citoplasmática temporal entre dos células
Figura 5: Replicación de la célula a través del pilus
32 1.2.4.8. Uso de nutrientes
Las bacterias deben de consumir más de una fuente de energía para lograr sobrevivir, en el caso de las E. coli prefieren consumir la glucosa sobre cualquier otra forma de azúcar.
Si en caso no existiera glucosa, las bacterias pueden activar un gen que le permite consumir lactosa en vez de la glucosa. Si el ambiente no tiene la concentración de nutrientes necesarios para poder alimentar a la población bacteriana, los E. coli, como muchas otras especies, pueden ingresar a una fase latente, donde se minimizan sus necesidades metabólicas y el crecimiento de la población se detiene. Las causas de inactivar las bacterias pueden ser la baja concentración de los nutrientes, el medio ambiente y otros factores que afectan el metabolismo, como la temperatura. (Aizawa, 1985)
1.2.5. Modelo matemático del crecimiento bacteriano
Según (Garre Perez, 2016) menciona que el crecimiento de una bacteria suele mostrarse a través de la curva de crecimiento, que se define logarítmicamente el número de microorganismos con respecto al tiempo. En la Figura 7 se muestra la forma sigmoidal de la curva de crecimiento a condiciones constantes y favorables.
Fuente: (Raven, 2008)
Figura 6: El pilus se retira, dando como resultado dos células que contienen el mismo plásmido
33
Figura 7: Crecimiento bacteriano Fuente: (Velandia, 2014), pág. 6
Entonces podemos decir las fases del crecimiento bacteriano son las siguientes:
Fase de latencia
En esta fase el número de bacterias no varían ya que se están adaptando al medio, el tiempo de crecimiento puede variar entre horas a días.
Fase exponencial
En esta fase se caracteriza por su duración, el tiempo necesario para que la población duplique su tamaño exponencialmente, y esto se expresa como generaciones por hora.
Fase estacionaria
En esta fase en un determinado punto el crecimiento disminuye, la población no aumenta, su actividad metabólica es más lenta y ocurre la fase de esporogénesis para las especies productoras de esporas.
Fase de muerte
En esta fase el recuento de células disminuye sensiblemente, el número de células muertas supera al número de células vivas y disminuye los nutrientes
Este crecimiento eventualmente se convierte en una fase estacionaria, donde la concentración de nutrientes es limitada y la acumulación de desechos metabólicos hacen
34
que el ambiente sea incapaz de soportar una colonia más grande de bacterias. En la mayoría de los modelos esto se conoce como: “La capacidad de carga”, se describe la siguiente formula donde:
P: población
r: tasa de crecimiento de la población K: capacidad de carga en sí misma
𝒅𝑷
𝒅𝒕 = 𝒓𝑷 (𝟏 −𝑷
𝑲) (𝟏)
La solución a la ecuación diferencial 1 es entonces:
𝑷(𝒕) = 𝑲𝑷𝒐𝒆𝒓𝒕
𝑲 + 𝑷𝒐(𝒆𝒓𝒕− 𝟏) (𝟐)
1.2.6. Cinética del crecimiento poblacional
La descripción del crecimiento bacteriano incluye aspectos tanto estequiométricos como cinéticos. Mientras que la estequiometria se ocupa de los aspectos cuantitativos la cinética describe el desarrollo dependiente del tiempo de los procesos bacterianos.
Los estudios estequiométricos de (A, 1998)se inician en la década de 1850 por Pasteur, investigadores ingleses y alemanes informaron las primeras investigaciones cinéticas justo antes de 1900, explicaban los ciclos de crecimiento de los lotes, los tiempos de generación informados y las tasas de división celular. En 1912, Slator introdujo la
“constante de tasa de crecimiento” para relacionar la tasa de crecimiento con el numero de células reales. Para el año 1942 J. Monod realizó el mayor paso en la cinetica del crecimiento bacteriano, refinó y calibró el método para cuantificar el crecimiento
35
bacteriano a través de la turbidimetría y demostró como el crecimiento puede ser matemáticamente descrito
1.2.6.1. Tasa de crecimiento basadas en el número de células
La ecuación para el aumento de células binarias dentro de un periodo de tiempo se da en la ecuación o formula 3:
𝑵𝒕 = 𝑵𝒐∗ 𝟐𝒏 (𝟑)
Donde:
𝑁𝑡 𝑦 𝑁𝑜: Numero de células al principio y después de haber transcurrido un determinado tiempo t
n: Numero de divisiones en este periodo
Ahora para poder saber el número de divisiones, se da en la fórmula 4:
𝒏 = 𝒌 ∗ 𝒕 = 𝒕
𝒈 (𝟒)
Donde:
k: constante
g: Tiempo de generación
Sustituyendo la fórmula 4 en la 3, se obtiene:
𝑵𝒕 = 𝑵𝟎∗ 𝟐𝒌∗𝒕= 𝑵𝟎∗ 𝟐
𝒕
𝒈 (𝟓)
𝒌 = 𝟏
𝒈=𝒍𝒏𝑵𝒕− 𝒍𝒏𝑵𝟎
𝒕. 𝒍𝒏𝟐 = 𝐥𝐨𝐠𝟐𝑵𝒕− 𝐥𝐨𝐠𝟐𝑵𝟎
𝒕 (𝟔)
36 1.2.7. Medición del crecimiento bacteriano
El crecimiento bacteriano se determina a través mediciones sucesivas en tiempos determinados de la población de estudio, estas mediciones pueden ser directas o indirectas.
MEDICIONES DIRECTAS:
Determinación del peso húmedo
Para la determinación del peso húmedo se inicia de una muestra en suspensión que es pesada luego de pasar por filtración y centrifugación, luego que se centrifuga el cultivo se elimina el sobrenadante se determina el peso del sedimento
Ecuación que determinara el peso húmedo es:
𝑝𝑒𝑠𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 (𝑔𝑚𝐻
𝑚𝑙) =(𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜+𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎)−(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜)
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=5 𝑚𝑙 (7)
Determinación del peso seco
Para la determinación del peso seco sucede como el anterior método indirecto, pero el sedimento se seca antes de ser pesado a una temperatura de 105°C por toda una noche hasta obtener un peso constante. Los resultados del peso seco suelen mostrar el 10-15% de los valores del peso húmedo. Existen varios inconvenientes ya que requiere mucho tiempo y con bastantes errores por la dificultad de pesar con exactitud cantidades menores a 1 mg y dentro del conjunto de bacterias no solo se encuentran bacterias vivas , si no también muertas, material inerte y material orgánica adsorbida.
Ecuación para determinar el peso seco es:
37 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 (𝑔𝑚𝑠
𝑚𝑙) =(𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜+𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎)−(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜)
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=5 𝑚𝑙 (8)
Recuento de placas
Para estos recuentos se utilizan principalmente cámaras de recuentos (cámara de Petroff Hauser, cámara de Neubaver ver figura 8). Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es que nos muestra el tamaño y la forma de los microorganismos.
La muestra puede utilizarse como se encuentra inicialmente o puede prepararse en dilución.
Figura 8: Cámara de Neubaver
Cálculo de recuento de placas:
Si se contaron todas las células presentes en los 4 cuadros de 1 mm2 marcados como A, B,C y D, la concentración celular seria:
𝑪 = 𝑵 ∗ 𝟏𝟎𝟒∗ 𝒅𝒊𝒍 (𝟗)
38 Donde:
C: cél/mL
N: promedio de células presentes en 1 mm2 (0.1ul)
dil: Factor de dilución (cuando se consideró necesario diluir)
Si las celulas se contaron en el cuadro central (25cuadros) considerando solo los 5 cuadros menores del cuadro central marcado con X, la concentración celular seria:
𝑪 = [ 𝑵 𝟒
𝟏𝟎−𝟔] ∗ 𝒅𝒊𝒍 (𝟏𝟎)
Donde:
C: cél/mL
N: promedio de células presentes en los 5 cuadros pequeños del cuadro central 4*10-6: Corresponde al volumen de la muestra expresado en cm3(ml)
dil: factor de dilución
MEDICIONES INDIRECTAS:
Métodos turbidimétricos
Lo común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz que es transmitida a través de un cultivo bacteriano. Cabe mencionar que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua.
39 a) Escala de MacFarland:
Consiste en una serie de 11 tubos con patrones de turbidez previamente calibrados.
En estos tubos de vidrio herméticamente cerrados contienen cantidades de cloruro de bario y acido sulfúrico a 0.36 M como se muestra en la tabla 5, por lo tanto generan precipitados y se puede visualizar la turbidez en cada tubo. Para las cepas bacterianas hay que definir la equivalencia entre la turbidez de los diferentes tubos. Una de los inconvenientes es que es un método poco preciso.
Tabla 5: Escala de McFarland
N° BaCl2 0.048M ml
H2SO4 0.36 M ml
Vf ml
N° Células
0.5 0.05 9.95 10 1.5*108
1 0.1 9.90 10 3*108
2 0.2 9.80 10 6*108
3 0.3 9.70 10 9*108
4 0.4 9.60 10 12*108
5 0.5 9.50 10 15*108
6 0.6 9.40 10 18*108
7 0.7 9.30 10 21*108
8 0.8 9.20 10 24*108
9 0.9 9.10 10 27*108
10 1 9.00 10 30*108
b) Espectrofotómetro
Según antecedentes, medir la densidad óptica es equivalente a la absorbancia, por ende, para hallar la densidad óptica es que podemos reconocer las fases de crecimiento de las bacterias, y asi tomar decisiones sobre los tiempos de dilución. Con las mediciones de densidad óptica podemos definir la curva de crecimiento graficando los valores de densidad óptica (DO) con el tiempo, recordando que cuando se usa la transmitancia (T = % de la luz incidente recibida por el fotodetector), es necesario utilizar la transformación: DO = 100 - T
40
𝑫. 𝑶. = 𝑨 = −𝒍𝒐𝒈𝑻
𝟏𝟎𝟎 (𝟏𝟏)
Donde
D.O.: Densidad óptica A: Absorbancia T: Transmitancia
1.2.8. Factores que afectan el crecimiento
Todos los microrganismos necesitan una fuente de micronutrientes para que puedan crecer y vivir en un medio, por lo cual estos factores son diferentes para cada microorganismo, por ejemplo, las bacterias requieren de ambientes diferentes que las levaduras para poder crecer. Los diferentes factores que influyen en el crecimiento bacteriano son generalmente conocidos como factores intrínsecos y extrínsecos.
Los factores intrínsecos se refiere a las características físico-químicas y los factores extrínsecos a las condiciones de almacenamiento y las condiciones ambientales. Existen otros factores las cuales tienen que ver con las características del propio microorganismo y son llamados factores implícitos
1.2.8.1. Factores intrínsecos a. Nutrientes
La presencia de vitaminas, aminoácidos, etc de mayor o menor cantidad va a permitir el crecimiento de algunos microorganismos. En el caso de las bacterias E. coli los nutrientes que influyen en el crecimiento son: fuente de carbono, oxigeno, nitrógeno, fosforo, azufre,
41
hidrogeno, potasio y magnesio como macronutrientes y elementos traza Cobalto, cobre, zinc, molibdeno, etc como micronutrientes.
b. pH
Las bacterias E. coli pueden sobrevivir en el ácido estomacal de pH 2, según estudios realizados por (Spector, 1995) las bacterias E. coli poseen sistemas para sobrevivir a pH bajo, se han comprobado 3 mecanismos de las cuales 2 son dependientes de la descarboxilasa de aminoácidos y el restante es con catabolitos de glucosa y por lo tanto pueden considerarse una bacteria intrínsecamente resistente a los ácidos, pero el pH óptimo para el crecimiento de las bacterias E. coli es alrededor de pH igual a 7
c. Agua disponible
La disponibilidad de agua es otro determinante clave de la supervivencia y el crecimiento de E. coli. (Van, 2010) nos dice que la disminución severa del contenido de agua provoca un aumento del estrés hídrico alrededor de las células, mientras que la saturación de agua rodeará rápidamente las células con agua e inducirá condiciones anóxicas. Ambos extremos tienen graves consecuencias para la fisiología y la supervivencia de E. coli en el sistema, dado que una sequía extrema puede provocar una muerte celular masiva, mientras que las inundaciones cambiarán el metabolismo celular a procesos anaeróbicos. Sin embargo, aún no está claro el comportamiento de E. coli en ambientes abiertos, en particular cómo el organismo se enfrenta a las fluctuaciones en la disponibilidad de agua.
42 1.2.9.2. Factores extrínsecos
a. Temperatura
La temperatura es otro de los factores importantes que afecta la supervivencia y el crecimiento de las bacterias E. coli. En un cuerpo animal hospedador, la temperatura suele ser estable, mientras que puede variar fuertemente en un ambiente no hospedador, como el suelo o el agua. Estudios realizados por (Semenov, 2007) mostró que la supervivencia a temperaturas fluctuantes era generalmente más baja que la temperatura constante.
Además, la reducción en la supervivencia del organismo fue más pronunciada cuando la amplitud en las oscilaciones de temperatura fue mayor (7 ° C) que a amplitudes menores (4 ° C). Entonces se podría concluir a bajas temperaturas disminuyen, mientras que las temperaturas superiores a 40°C desnaturalizan las bacterias, se necesita una temperatura óptima para un crecimiento la cual es de aproximadamente 37 °C.
1.2.9. Métodos de eliminación de bacterias
1.2.9.1. Alquilantes (Óxido de etileno, formaldehido, glutaraldehído)
Estos agentes tienen un mecanismo de acción en la cual modifican de forma irreversible los grupos funcionales de proteínas, el núcleo de la bacteria y provocan inhibición enzimática, lo que lleva a la muerte celular.
1.2.9.2. Autoclavado
Es un método de eliminación microbiana más efectivo, y asegura la eliminación al 100
%, este proceso utiliza vapor de agua a 121°C durante 15 min o 20 min. El equipo que se utiliza es la autoclave, del cual existen distintos tipos, como ser:
Vertical de manejo manual
Que opera por gravedad
De esterilización rápida
43 1.2.9.3. Radiaciones UV
El principal mecanismo es la incidencia de la luz UV sobres las membranas de las bacterias, al tener contacto daña la membrana y por ello genera la destrucción de la bacteria.
1.2.9.4. Filtración
Existen filtros de membrana, son inertes y nos dan un buen medio para aglomerar a los microorganismos, por ejemplo, para el cultivo de bacterias a concentraciones bajas en un gran volumen del liquido
1.2.9.5. Tratamiento de lagunaje facultativo
El tratamiento de lagunaje facultativo consiste en una planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) la cual está compuesta por un pre tratamiento, tratamiento primario y lagunas biológicas. Para evaluar la eficiencia del tratamiento de lagunaje facultativo se realizaron muestreos de entrada y salida de la PTAR, realizando análisis físicos, químicos y microbiológicos.
1.2.10. Métodos de Inactivación de la bacteria
Es el proceso en la cual se logra la detención de su crecimiento de las bacterias, pero lo que se observa son poblaciones de organismos y no individuos y esto resulta en un efecto cinético en términos de la tasa de crecimiento. (Bravo, 2015), menciona los siguientes métodos de inactivación:
Adición de sustancias químicas
Ozono – luz ultravioleta
Radiación solar
Nanotecnología
