UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS METANÓLICOS DE LAS HOJAS Y FLORES DE LA
ESPECIE VEGETAL MASTUERZO (Tropaeolum majus L.) FRENTE AL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS (Escherichia
coli y Staphylococcus aureus).
TESIS
PRESENTADO POR LAS BACHILLERES:
HUANQUIS ALBINAGORTA, LOURDES LEON ROBLADILLO, MARTHA
PARA OPTAR EL TÍTULO DE PROFESIONAL DE:
INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS HUANCAYO – PERÚ
2015
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
JURADO EXAMINADOR
M.Sc. EDGAR RAFAEL, ACOSTA LOPEZ Presidente
M.Sc. VILMA JULIA, REYES DE LA CRUZ Jurado
M.Sc. ELIZABETH, PAITAN ANTICONA Jurado
M.Sc. LUIS, ARTICA MALLQUI Jurado
Ing. WAGNER, ORIHUELA VÁSQUEZ Secretario
ii
ASESORA
Dra. ESPINOZA SILVA CLARA RAQUEL
iii DEDICATORIA
A Dios por estar siempre conmigo dándome fuerzas necesarias y sabiduría en cada paso que doy en mi vida. A mi querida y estimada familia en especial a mi padre por estar siempre a mi lado en los momentos de felicidad y triunfo pero sobre todo en los momentos más difíciles; por brindarme su apoyo incondicional, por enseñarme valores, principios, pero sobre todo un buen ser humano con amor y cariño. A mis amigos por la compañía sincera y los momentos vividos, cada uno de ustedes ocupa un lugar muy especial en mi corazón, los quiero mucho.
Lourdes
A Dios quien guía mi camino, que me da fuerzas para seguir adelante y no desmayar en los problemas que se me presentaban .A mi madre, por ser el pilar más importante y por demostrarme siempre su cariño y su apoyo incondicional sin importar nuestras diferencias de opiniones. A mis hermanos por estar siempre presentes, acompañándome para poderme realizar. A mis maestros de la F.A.I.I.A. por su dedicación y compartir sus conocimientos.
A mis amigas Katherine, Narda y en especial a Lourdes por haber iniciado este proyecto conmigo, por su valiosa amistad y por vivir conmigo la gran experiencia de iniciar y culminar este trabajo. A todos ellos se los agradezco desde el fondo de mi alma y que Dios les bendiga siempre.
Martha.
iv
AGRADECIMIENTOS
Le agradecemos a Dios por habernos acompañado y guiado a lo largo de nuestra carrera, por ser nuestra fortaleza en los momentos de debilidad y por brindarnos un camino lleno de aprendizajes, experiencias, amistad y felicidad.
A nuestros padres que gracias a sus consejos, enseñanzas, paciencia y apoyo supieron guiarnos y alentarnos para culminar esta etapa en nuestras vidas.
A nuestra asesora de tesis, Dr. Clara Raquel Espinoza Silva, Por brindarnos sus conocimientos, amistad, tiempo y paciencia, que siendo digna de admiración profesional nos orientó y guio en cada etapa de la Tesis.
Al Ing. Ana Aguilar Gálvez quien nos dio su apoyo incondicional para la realización de la investigación.
Al Ing: Wagner Orihuela Vásquez por su ayuda , orientación y supervisión, quien con sus conocimientos, experiencia, paciencia y motivación, no solo nos transmitió valores profesionales sino también valores humanos, haciendo posible la culminación de esta tesis.
Un agradecimiento especial al ingeniero Luis Artica Mallqui por su disponibilidad de tiempo en absolver nuestras dudas, por guiarnos y brindarnos su apoyo constante en la elaboración correcta de la tesis.
Al Ing. Nora Veliz Sedano, Yesenia Ugarte, Miguel Ángel Quispe Solano, Don Andrés Taipe y Don José Pérez, por su apoyo en la realización de la investigación.
A los ingenieros de la facultad que nos entregan sus conocimientos de buen corazón.
¡Muchas Gracias!
v
ÍNDICE GENERAL
ASESOR ii
DEDICATORIA ii
AGRADECIMIENTO iv
INDICE v
ÍNDICE DE TABLAS ix
ÍNDICE DE FIGURAS xii
RESUMEN
INTRODUCCIÓN 1
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3
2.1. Mastuerzo (Tropaeolum majus L.) 3
Taxonomía 3
Nomenclatura 3
Descripción botánica 3
Origen, distribución geográfica y hábitat 4
Usos 4
Toxicidad 5
2.1.6.1. Principios activos tóxicos 5
Composición química 5
2.1.7.1. Composición química de las hojas 5
2.2. Antimicrobianos naturales 6
2.3. Fito-antimicrobianos 7
2.4. Los compuestos fenólicos 8
2.5. Terpenoides 13
2.6. Mecanismos de acción de los antimicrobianos 14
2.7. Selección de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad 16
Tetraciclinas 16
2.7.1.1. Mecanismo de acción de la tetraciclinas 16
Cloranfenicol 16
2.7.2.1. Mecanismo de acción del cloranfenicol 17
2.7.2.2. Resistencia a cloranfenicol 17
2.8. Extracto vegetales 18
Métodos generales para la obtención del extracto vegetal 18 2.9. Consistencia los extractos se clasifican en cuatro grupos 20
Conservación de los extractos 20
2.10.Microorganismos de importancia en la microbiología de los alimentos 21
Infección 22
vi
Intoxicación 22
2.11.Crecimiento bacteriano 22
2.12.Microorganismos indicadores 23
Parámetros para el crecimiento de los microorganismos. 24
2.13.Staphylococcus aureus 27
Taxonomía 27
Características generales del Staphylococcus aureus 27
Características bioquímicas y fisiológicas 28
Factores que afectan al crecimiento y supervivencia del 28 Staphyloccocus aureus
Componentes estructurales 29
Enzimas 30
Acción patógena del Staphylococcus aureus 31
Identificación del Staphylococcus aureus 32
Persistencia bacteriana 33
2.14.Escherichia coli 33
Taxonomía 33
Características generales de la Escherichia coli 33 Factores que afectan al crecimiento y supervivencia de la E. coli 34
Componentes estructurales 35
Estructura antigénica de Escherichia coli 36
Acción patógena del Escherichia coli 36
Identificación del Escherichia coli 38
Sensibilidad a los antimicrobianos del Escherichia coli 38 2.15.Método de difusión (método del antibiograma disco-placa) 38
Preparación del inóculo. 39
Inoculación de las placas. 39
Dispensación de los discos. 39
Lectura de los resultados. 40
2.16.Preparación del patrón de turbidez 0.5 de la escala de McFarland 40
2.17.Antecedentes de la investigación 42
MATERIALES Y MÉTODOS 45
3.1. Lugar de ejecución 45
3.2. Muestras vegetales 45
3.3. Material microbiológico 45
3.4. Equipos, materiales y reactivos 45
3.5. Metodología 48
vii
Obtención y recolección del material vegetal 48
Análisis de los polvos de las hojas y flores del mastuerzo 48
3.5.3.1. Análisis granulométrico 48
Extracción de compuestos fenólicos 49
3.5.4.1. Obtención de los extractos metanólicos de las hojas y flores 49
mastuerzo (Tropaeolum majus L.) 49
3.5.4.2. Determinación de pH de las concentraciones de los extractos 50 metanólicos hojas y flores
Cuantificación de fenoles totales 50
3.5.5.1. Preparación de las muestras para la lectura de fenólicos totales 51 Obtención y preparación de las cepas bacterianas 51
3.5.6.1. Cepas bacterianas 51
3.5.6.2. Activación de las cepas 51
Preparación y estandarización del inóculo 52
3.6. Evaluación de actividad antimicrobiana por el método de difusión por disco 53 Preparación del medio para la prueba de sensibilidad 53
Inoculación bacteriana para disco difusión 53
Aplicación de los discos en las placas inoculadas 53
Incubación 54
3.7. Cálculo del porcentaje de inhibición 54
3.8. Diseño experimental de la actividad antibacteriana 55
Análisis estadístico 56
Procesamiento de datos 57
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 58
4.1. Análisis de los polvos de las hojas y flores del mastuerzo 58 Análisis granulométrico de los polvos de las flores y hojas 58 Obtención de los extractos metanólicos de las hojas y flores 59 pH de las concentraciones de los extractos metanólicos 60 4.2. Contenido de fenoles totales de los extractos metanólicos 61 4.3. Determinación de la actividad antibacteriana de los extractos metanólicos 64 4.4. Efecto de inhibición de los extractos metanólicos de las hojas y flores 72
CONCLUSIONES 78
RECOMENDACIÓN 79
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80
ANEXOS 83
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Valores aproximados correspondientes al pH máximo y mínimo 25 necesario para el crecimiento de los microorganismos
Tabla 2 Condiciones de crecimiento de las toxinas producidas por 29 Staphylococcus aureus
Tabla 3 Factores que afectan al crecimiento y a la supervivencia de 34 Escherichia coli
Tabla 4 Preparación de los estándares de McFarland 41 Tabla 5 Concentraciones de los extractos metanólicos de las 50 hojas y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Tabla 6 Análisis granulométrico de los polvos de las flores del 58
mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Tabla 7 Análisis granulométrico de los polvos de las hojas del 58
mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Tabla 8 pH de los extractos metanólicos de las hojas y flores del 60 mastuerzo (Tropaeolum majus L.) a diferentes concentraciones
Tabla 9 Cantidad de compuestos fenólicos en los extractos metanólicos de las 62 hojas y flores del mastuerzo en las diferentes concentraciones
Tabla 10 Promedio de los diámetros de halos de inhibición (mm) 65 de los extractos metanólicos de las hojas y flores del
mastuerzo (Tropaeolum majus L.) frente a la inhibición de la Escherichia coli.
Tabla 11 Promedio de los diámetros de halos de inhibición (mm) de 68 las concentraciones de los extractos metanólicos de las
hojas y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.) frente
a la inhibición del Staphylococcus aureus.
Tabla 12 Efecto de inhibición de los extractos metanólicos de las 72 hojas y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
frente a la Escherichia
Tabla 13 Efecto de inhibición de los extractos metanólicos de las 74 flores y hojas del mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
frente al Staphylococcus aureus.
N0 TITULO PAG
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Mastuerzo (Tropaeolum majus L.) 3
Figura 2 Compuestos fenólicos identificados en extractos 6
metanólicos de hojas de murta
Figura 3 Estructura química del fenol 8
Figura 4 Estructura básica del esqueleto flavonolico 9 Figura 5 Estructura química de la sinigrina presenta en 12
Semillas de mostaza negra
Figura 6 Estructura química del cloranfenicol 17
Figura 7 Modelos matemáticos del crecimiento bacteriano, 22 Figura 8 Diferencia estructural entre las bacterias Gram 24 positivas (Gram+) y Gram negativas (Gram-).
Figura 9 Características macro y microscópicas de Staphylococcus aureus, 27 Figura 10 Características macro y microscópicas de Escherichia coli. 33
Figura 11 Dispensación de los discos 40
Figura 12 Fórmula 1 para el cálculo del porcentaje de inhibición 54 Figura 13 Diseño experimental para la determinación de la actividad 55 antibacteriana de los extractos metanólicos
Figura 14 Comparación de los promedios de contenido de fenoles totales 63 de hojas y flores del mastuerzo en diferentes concentraciones.
Figura 15 Promedio de los diámetros de inhibición de los extractos 66 metanólicosde las hojas del mastuerzo, cloranfenicol y
agua frente a Escherichia coli
Figura 16 Comparación múltiple del diámetro de inhibición de los extractos 67 acuosos de las de las flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.),
cloranfenicol y agua frente al Escherichia coli Figura 17 Promedio de los diámetros de inhibición de los extractos 69
metanólicos de las hojas del mastuerzo, cloranfenicol y
agua, frente al Staphylococcus aureus.
Figura 18 Promedio de los diámetros de inhibición de los extractos 69
N0 TITULO PAG
x
metanólicos de las flores del mastuerzo, cloranfenicol y
agua frente al Staphylococcus aureus.
Figura 19 Efecto de inhibición de los extractos metanólicos de hojas 72 y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.) frente a la
Escherichia coli.
Figura 20 Efecto de inhibición de los extractos metanólicos de hojas 74 y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.) frente al
xi
RESUMEN
El presente estudio se realizó con el objetivo de evaluar la actividad antibacteriana de los extractos metanólicos de las hojas y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.), frente a las bacterias patógenas Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Adicional a este propósito, se cuantifico fenólicos totales mediante el método de Folin-Ciocalteu, los extractos se obtuvieron por maceración en un solvente metanólico por 24 horas con constante movimiento para luego ser concentrados al vacío en un rotaevaporador a una temperatura de 40 °C. En donde las mayores concentraciones de fenólicos totales, se presentaron en la primera concentración (60 %) tanto para las flores y hojas, en el caso de las flores con 150,751 mg de ácido gálico / mL de extracto metanólico con una desviación estándar de ± 2,471, seguida de las hojas en la primera concentración que fue de 114,464 mg de ácido gálico / mL de extracto metanólico con una desviación estándar de ± 0,137.
Para determinar la actividad antimicrobiana en las 36 muestras de extractos metanólicos de las hojas y flores de mastuerzo, por medición de halos de inhibición con el método de disco difusión, se preparó el inoculo a partir de un cultivo puro y fresco de Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Los resultados obtenidos indican que los extractos metanólicos de las hojas de mastuerzo a concentraciones de 10 ,30 y 60 % respectivamente tienen poca actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus.
En el caso de la Escherichia coli en las tres concentraciones si presentaron mayor medida de halos de inhibición, igual manera para flores en la cual se probó mayor halo de inhibición en las concentraciones de 10, 30 y 60 % para el Staphylococcus aureus comparadas con la Escherichia coli respectivamente.
1 INTRODUCCIÓN
Actualmente existe una amplia demanda de agentes antimicrobianos naturales es por ello que surge la necesidad de buscar nuevas fuentes naturales que inhiban el crecimiento bacteriano; descubriendo en las plantas presencia de principios activos para tal. Las especies vegetales exhiben actividad antimicrobiana y se les atribuye a los compuestos bioactivos, conocidos también como fitoquímicos que son metabolitos secundarios.
Dentro de estos destacan los compuestos fenólicos que son de particular interés por las múltiples aplicaciones que se han descubierto, tanto en la industria farmacéutica y alimentaria (Martínez, 2013). Por ejemplo, se han desarrollado productos antimicrobianos naturales, a base de extractos vegetales cuyas características poco tóxicas, además de mantener la calidad sensorial del alimento (productos mínimamente procesados), han permitido alargar la vida útil de éstos (Sánchez , 2012).
El uso de aditivos alimentarios de origen natural implica la extracción, purificación e estabilización e incorporación de dichos compuesto con fines antimicrobianos a los alimentos sin que afecte negativamente a las características sensoriales, nutritivas y a su garantía sanitaria. Es así que aparecen los llamados conservantes biológicos que comprenden un amplio grupo de productos naturales a partir de plantas que pueden ser útiles para prolongar la vida útil de los alimentos reduciendo o eliminando las bacterias patógenas e incrementando la calidad de los productos alimenticios (Acosta, 2006).
Debido a la demanda actual de agentes antimicrobianos naturales, a la búsqueda de principios naturales biológicamente activos y con el objeto de aprovechar racionalmente los recursos naturales presentes en nuestro país, se planteó el desarrollo del presente trabajo de investigación en la que se fundamenta la capacidad antimicrobiana de los extractos metanólicos de las hojas y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus, L) para ello se determinó y cuantifico (fenoles totales) del mismo y su efecto antibacteriano de sus extractos metanólicos en diferentes concentraciones contra cultivos puros y frescos de Escherichia coli y Stapylococcus aureus bacterias infectocontagiosas relacionadas con la contaminación de los alimentos y de esta manera contribuir a validar su uso vulnerable. Así mismo se concluye que dicha actividad biológica se debe a la presencia de compuestos bioactivos (fenoles totales). Por lo cual esta especie vegetal representa una fuente alternativa de compuestos para el control de microorganismos patógenos.
La información de trabajos de investigación relacionados con la especie vegetal mastuerzo (Tropaeolum majus L.) y su uso como antibacteriano es escaso, es por ello que se llevó a cabo este trabajo de evaluar el efecto de inhibición de los extractos metanólicos frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
2 Con este trabajo de investigación se pretende aportar información para futuras investigaciones de antibacterianos naturales y su posterior aplicación innovadora en el campo de la industria de alimentos.
OBJETIVOS:
Extraer y cuantificar fenólicos totales en las diferentes concentraciones de los extractos metanólicos de las hojas y flores del mastuerzo (Tropaeolum majus L.).
Evaluar la actividad antibacteriana de extractos metanólicos de las hojas y flores de la especie vegetal mastuerzo (Tropaeolum majus L.) frente a los microorganismos patógenos Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Mastuerzo (Tropaeolum majus L.) Taxonomía
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Brassicales Familia: Tropaeolaceae Género: Tropaeolum Especie: T.majus
Nombre Binomial: Tropaeolum majus
Figura 1: Mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Nomenclatura
Bernardo (2013) señala que esta planta ornamental tiene varias denominaciones como: mastuerzo de indias, marañuela, pelón, pelonchili, espuela de galán, flor de sangre (la de color vermell més intens), llagas de Cristo (Nomenclatura tradicional espanyola) Caputxina, morrimort d’Índies, murrisà, bequera (Nomenclatura tradicional catalana).
Descripción botánica
Se trata de una planta anual herbácea de tallos suculentos y sinuosas que crece en forma de enredadera, con hojas pecioladas y simples. Las hojas en disposición alternada, presentan formas orbiculares. El tallo es estipulada, redondeada y se presenta característicamente en zigzag con un diámetro medio de 1cm con una longitud que puede alcanzar los 100 centímetros. Presenta tonalidades de color verde brillante sobre una base en la zona central que se dispersa en colores rosas claras. Las flores son
4 solitarias, axilares y presentan un espolón de entre 2,2 y 3,5 cm en la parte posterior formado por 5 sépalos verdosos unidos en la base, presentan un cáliz unido, la corola formada por cinco pétalos desiguales de color amarillo anaranjado. El fruto es un esquizocarpo trilobulado, de mericarpos de 1 cm de largo por 1,5 cm de diámetro y rugosos en la madurez, en cuyo interior encontramos las semillas, (Calderón, 2002).
Origen, distribución geográfica y hábitat
Bernardo (2013) señala que esta planta es originaria de américa del sur, en la región de los andes desde Chile a Colombia, actualmente se ha extendido por todo el planeta en forma de planta ornamental dado sus vivos colores y su fácil propagación.
Calderón (2002) afirma que esta especie vegetal crece en zonas cálidas y soleadas, en exterior en jardineras de ventana o como planta colgante, también de manera silvestre en zonas húmedas a lo largo de cursos de agua como ríos.
Usos
También se ha extendido, dado a los usos que se le dan en la alimentación, usándose las hojas crudas en ensaladas para dar un toque ácido y los frutos como sucedáneo de las alcaparras. El uso de Tropaeolum majus L. se conoce en la cocina típica de la india, en donde se utiliza como condimento y donde se han realizado mayor cantidad de estudios de esta planta aportando información relevante para esta investigación. Dentro de los usos planteados en la medicina popular están su aplicación en las decocciones de las ramas y flores para tratar infecciones, (Acosta ,2012).
Fitoterapia (2012) afirma que el mastuerzo es un expectorante, fluidizante de las secreciones bronquiales y antibiótico (específico para Escherichia, Salmonella, Estafilococo, bacilos Gram positivo y negativo) y quizás aumenta las fuerzas defensivas del organismo. Es rubefaciente de uso externo, de ahí su aplicación como antidermatosico por su contenido de esteres de ácidos grasos que posee la esencia de sus semillas, también se usa como estimulante del cuero cabelludo.
5 Toxicidad
2.1.6.1. Principios activos tóxicos
El principio activo tóxico principal es un aceite esencial glucósido llamado tiocianato de bencilo o glucotropaeolina que ingerido en dosis terapéuticas se le atribuyen propiedades bacteriostáticas, virustaticas y antimicóticos, aplicado tópicamente presenta actividad hiperèmica. El aceite esencial, rico en este mismo principio activo, es empleado ampliamente también en afecciones pulmonares, así como resfriados y congestión por sus actividades expectorantes, balsámicas y como se ha comentado anteriormente, antibióticas (Bernardo, 2013).
Composición química
Perry (2004) descrito en Acosta (2006) afirma que la composición química del mastuerzo no reporta ningún estudio profundo, algunos estudios menores indican que contiene glucotropaeolosidio, isotiocinato de benzilo que se manifiesta como vasodilatador coronario. Además se ha usado como expectorante y antibiótico específico para E.coli y S. aureus, posee carotenoides, ácidos- fenólicos y heterosidios flavonicos, quercitina en las hojas y Kaempferol en las flores.
2.1.7.1. Composición química de las hojas
Piña (2011) afirma que según el análisis químico realizados en el laboratorio confirman la presencia de compuestos polifenólicos y triterpenos en las hojas de murtilla. Además los estudios farmacológicos realizados hasta ahora y los que están actualmente en curso, han permitido encontrar una relación entre la capacidad antioxidante de los extractos con su concentración de compuestos fenólicos, recientemente se han desarrollado estudios que permitirán establecer la composición química de esta especie, con el objetivo de determinar que componentes son los responsables de su actividad antioxidante. Así para la hoja se han descrito polifenoles como: epicatequina, diramnósido de miricetina, ramnósido de miricetina, glucósido de miricetina, diramnósido de quercetina, ramnósido de quercetina, glucósido de quercetina y el glucósido de canferol, cuyas estructuras se presentan en la figura 2.
6 Figura 2: Compuestos fenólicos identificados en extractos etanolicos de hojas de murta
(Piña, 2011).
2.2. Antimicrobianos naturales
Henao y Trujillo (2007) indican que muchos alimentos contienen compuestos naturales con actividad antimicrobiana en estado natural, estos compuestos pueden desempeñar el papel de prolongadores de vida útil de los alimentos.
Incluso muchos de ellos han sido estudiados por su potencial como antimicrobianos alimentarios directos. El uso de aditivos alimentarios de origen natural implica la extracción, purificación, estabilización e incorporación de dichos compuestos con fines antimicrobianos a los alimentos sin que ellos afecten negativamente a las características sensoriales, nutritivas y a su garantía sanitaria. Esto tiene que lograrse manteniendo los costos de formulación, procesado y comercializado.
Acosta, (2006) afirma que los conservantes son un grupo de antimicrobianos naturales que provienen de cualquiera de los sistemas naturales presentes en Epicatequina Di-ramnósido de miricetina
Di-ramnosido de quercetina
Glucósido de quercetina Glucósido de miricetina
Glucósido de canferol Raminósido de quercetina Raminósido de miricetina
7 el ecosistema incluyendo plantas o microrganismos que pueden ser usadas para alargar la vida útil de los alimentos reduciendo o eliminado la carga bacteriana patógena ya que poseen actividad antibacterial, antifungica o antiviral.
Henao y Trujillo (2007) señalan que muchas especias y hierbas exhiben actividad antimicrobiana; entre las más usadas en alimentos se encuentran por ejemplo el apio, el cilandro, laurel, almendra albahaca, café, etc. Los compuestos presentes en especias y hierbas que tienen actividad antimicrobiana son derivados simples y complejos de fenol, los cuales son volátiles a temperatura de ambiente.
Según Lindsay (1996) comenta que las partes de plantas, arbustos y árboles, como tallos u hojas suaves y aromáticas; mientras las especies son raíces, rizomas, cortezas, flores, frutos y semillas. Comúnmente las hierbas provienen de plantas de clima templado o subtropical y las especies de plantas de clima tropical. Las especias son comercializadas frescas o secas, y las secas se pueden extraer con solventes como el etanol, también pueden ser sometidas a destilación, presión fría o extraídas con dióxido de carbono supercrítico para obtener aceites esenciales. También comenta que las civilizaciones antiguas reconocieron al potencial antiséptico y antimicrobiano de varios extractos vegetales pero la caracterización fitoquimica se dio gracias a los avances de la técnica de separación molecular que permiten hoy en día aislar los compuestos fito-antimicrobianos.
2.3. Fito-antimicrobianos
Los fito-antimicrobianos son sustancias presentes en las plantas, ya sea en sus tallos, hojas, flores y/o frutos que han demostrado tener capacidades antimicrobianas. El uso creciente de especias, hierbas y sus aceites esenciales como aditivos alimentarios demuestran la gran capacidad antimicrobiana que estos componentes antimicrobianos, que resultan muy bajas para ser usadas efectivamente sin afectar las características sensoriales de los alimentos.
Entre los antimicrobianos más estables que se han encontrado hasta el momento en hierbas y especias se hallan en los componentes de la canela, clavos de olor, semillas de mostaza, romero, salvia, tomillo y vainilla. También, ciertos agentes fito- fenolicos tales como las oleorresinas del aceite de oliva que han demostrado aportar beneficios fisiológicos al consumidor y por lo tanto un atractivo favorable para la industria de la comida saludable (Acosta ,2006).
8 2.4. Los compuestos fenólicos
Rodríguez (2011) afirma que los compuestos fenólicos tales como los ácidos:
cafeico, clorogénico, p-cumáríco, ferúlico y químico están presentes en partes de plantas que son usadas como especias. La actividad antimicrobiana de esos y otros ácidos como hidroxicinámico y cinámico pueden retardar la invasión microbiana así como también la putrefacción de frutas y vegetales, bacterias Gram positivas (Gram+) y Gram negativas (Gram -), mohos y levaduras comúnmente encontradas como organismos deteriorativos, son sensibles a los derivados del ácido hidroxicinnámico. Los ácidos cafeico, ferúlico y pcumárico, por ejemplo, inhiben E. coli, S. aureus y B. cereus. Otros compuestos fenólicos que han demostrado tener actividad antimicrobiana son los taninos y el ácido tánico, este último por ejemplo es inhibitorio para L. monocytogenes, E. coli, S.
Enteritidis, S. aureus, A.hydrophila y S. faecalis
Los compuestos fenólicos poseen una estructura química especialmente adecuada para ejercer una acción antioxidante actuando como captores de radicales libres neutralizando peligrosas especies reactivas de oxígeno e iones metálicos quelantes, además, debido a su reactividad, se encuentran en la mayoría de los casos combinadas con un ácido orgánico, un azúcar o bien con ellas mismas para formar un polímero (Gracia, 2007).
Ávalos y Pérez-Urria (2009) afirman que las plantas sintetizan una gran variedad de productos secundarios que contienen un grupo fenol. Estas sustancias reciben el nombre de compuestos fenólicos, polifenoles o fenilpropanoides y derivan todas ellas del fenol, un anillo aromático con un grupo hidroxilo (Fig. 3).
Figura 3: Estructura química del fenol (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).
Desde el punto de vista de la estructura química, son un grupo muy diverso que comprende desde moléculas sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros complejos como los taninos y la lignina. En el grupo también se encuentran pigmentos flavonoides.
9 Ávalos y Pérez-Urria (2009) mencionan que la extracción de los diferentes flavonoides se realiza a partir del material fresco o incluso seco, siempre y cuando no se altere su composición. Se utilizan inicialmente disolventes no polares o ligeramente polares para separar las clorofilas, gomas y agliconas de flavonoides altamente metoxiladas.
Gracia (2007) afirma que los flavonoides que poseen un gran número de grupos hidroxilos insustituidos o azúcares, son considerados polares, por lo que son ligeramente solubles en disolventes polares, como el metanol, etanol, acetona, DMSO o agua. El filtrado final se concentra y todo el disolvente se remueve, este proceso es favorable para la extracción de la mayoría de los flavonoides pero no para antocianidinas o flavonoides de baja polaridad los cuales aparecen en la superficie de las plantas
a) Los flavonoides
Los flavonoides, uno de los dos grandes grupos de compuestos fenólicos junto con los ácidos fenólicos, son un grupo extenso de compuestos derivados del benzo-γ-pirano; poseen varios grupos hidroxilos enlazados a estructuras anulares, C6-C3-C6, designadas como A, B y C mostradas en la figura 4. Dependiendo del grado de oxidación y de sustitución del anillo pirano central pueden subdividirse en flavonas, flavonoles, flavononas, isoflavonas, flavanos y antocianinas. El anillo pirano puede ser abierto (chalconas) y reciclado en un anillo furano (auronas).
Figura 4: Estructura básica del esqueleto flavonolico (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).
Está comprobado que los flavonoides son importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas al protegerlas contra agentes agresores externos, como la radiación UV, microorganismos, animales herbívoros y del medio ambiente. Pueden actuar como señalizadores químicos, indicando a los insectos que planta es apropiada para su alimentación, oviposición o simplemente guiándolos y facilitando así la polinización. En su relación con el hombre, se utilizan para tratar enfermedades relacionadas con procesos
10 inflamatorios y desordenes cardiovasculares debido a la actividad que ejercen sobre el sistema circulatorio mejorando la circulación periférica, la movilización del colesterol y disminuyendo la fragilidad capilar. Algunos flavonoides pueden presentar actividad hepática protectora, antialérgica, antitrombótica, anticancerígena, antibacteriana, antifúngica, e incluso pueden ejercer efectos inhibidores sobre algunas enzimas (Ávalos y Pérez- Urria 2009).
Acosta (2006) señala que los flavonoides representan uno de los compuestos bioactivos más interesantes, actualmente alrededor de 40 plantas son usadas como fito medicinas debido a su contenido en flavonoides. En estas plantas, los flavonoides comúnmente suceden como glicosidos; las clases de flavonoides más comunes son: los flavonoles, flavonas y sus derivados, seguidos por las antocianinas e isoflavonas.
Paladino (2010) afirma que los flavonoides, en particular exhiben una amplia gama de efectos biológicos, incluyendo actividad antibacteriana, antiviral, antiinflamatoria, antialérgica, antioxidante, antitrombótica y vasodilatadora.
Método de extracción
Los flavonoides son inestables y pueden ser degradados por la acción de las enzimas en las plantas frescas, por lo tanto es necesario un cuidadoso procesamiento, se recomienda la liofilización de la planta, ya que se obtiene un polvo que puede ser almacenado en recipientes sellados en un congelador, sin deterioro del compuesto. Para cuantificar el contenido de flavonoides se recomienda un rápido congelamiento en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cosecha. En la práctica, si las antocianinas o taninos no están involucrados se puede optar por el secado en una estufa a 100 °C, luego de este procedimiento, el material seco puede almacenarse en una bolsa de plástico por varios meses bajo refrigeración para prevenir la pérdida de flavonoides. El secado por aire a temperatura de ambiente no es recomendado ya que podría causar degradación enzimática, una buena alternativa es realizar la extracción del material fresco picando la muestra en un procesador con un solvente apropiado. La actividad enzimática puede evitarse si un alcohol es incluido como solvente de extracción (Acosta, 2006).
11 Espectro antimicrobiano y mecanismo de acción de los
flavonoides
Acosta (2006) menciona que los flavonoides son lipofilicos, características que les proporciona actividad antimicrobiana, pues esta propiedad está asociada a la habilidad de traspasar membranas biológicas. Los flavonoides como la quercitina, bioflavonoide ampliamente distribuido en frutas, verduras y en él te y la morina. Se evaluaron y se encontró que poseían actividad virustatica contra el herpes simple. Se cree que los flavonoides que muestran actividad antiviral interactúan sobre la capsula de las proteínas de los virus .los efectos biológicos de la qu ercitina y algunos de sus derivados han sido reportados como el efecto inhibitorio contra células malignas, su mecanismo está básicamente ligado a interrumpir el ciclo de replicación.
b) Glucosinolatos
Este componente bioactivo en el rabano y mostaza han sido usados como estimulantes, aplicándolos en las proteínas grasas de los pescados y la carne. Los glucosinolatos volátiles tales como los isotiocianatos han mostrado un amplio rango de efectos antibacteriales antifungicos, también se han sugerido la aplicación de alil-isotiocianatos gaseosos como preservativos en alimentos empacados. Los glucosinolatos están presentes en varias especies de la familia de las cruciferae como en el coliflor, la mostaza, el rábano, repollo, brócoli, colinabo entre otros ; también se conoce su presencia en algunas variedades de la familia de la capparaceae y de las tropaeolaceae, dentro de esta última se encuentran el mastuerzo de las indias (Tropaeolum majus L.) que además contiene un tipo de aceite de mostaza, la producción de los glusinolatos dentro de la planta ocurre cuando está amenazada por los insectos ( Acosta, 2006).
Ávalos y Pérez-Urria (2009) señalan que los glucosinolatos, también llamados glicósidos del aceite de mostaza, se degradan y desprenden sustancias volátiles responsables del aroma, el olor y el gusto de condimentos como la mostaza y de vegetales como el repollo, brócoli o coliflor (Brassicaceae). La sinigrina (Fig. 5) es el glucosinolato que se encuentra en las semillas de mostaza negra (Brassica negra).
12 Figura 5: Estructura química de la sinigrina presenta en semillas de
mostaza negra, (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).
Los glucosinolatos al igual que los glicósidos cianogénicos, están separados espacialmente de las enzimas hidrolíticas que los degradan y actúan también como repelentes de herbívoros.
Método de extracción
Los métodos de extracción para los glucosinolatos varían dependiendo de su propiedad molecular. Existen varios tipos de glucosinolatos que pueden ser extraídos desde una simple lixiviación con agua con solventes como:
cetonas, benceno, etanol al 95%, repasando lavados con estos mismos, el punto de coincidencia en estas extracciones es el tipo de almacenamiento que debe darse al, extracto obtenido y es el mantenimiento a bajas temperaturas Acosta (2006).
Espectro antimicrobiano y mecanismo de acción de los glucosinolatos
El efecto inhibitorio de un glucosinolato alil-isotiocianato (AITC) contra E.Coli, S.Aureus, B.Subtiles, entre otras (Acosta ,2006).
c) Taninos
Son sustancias polifenólicas hidrosolubles no nitrogenadas, de origen vegetal de peso molecular entre 500 y 3000, que además de dar las reacciones clásicas de los fenoles, precipitan gelatina, sales de alcaloides y metales pesados.
El tanino se encuentra principalmente en las raíces, la corteza y de vez en cuando en las hojas de la planta. Estos compuestos tienen propiedades antibacterianas, astringentes y antisépticas. Se encuentran especialmente en las familias de las ericáceas, leguminosas, rosáceas y salicáceas, (López, 2012).
d) Quinonas
Son dicetonas aromáticas procedentes de la oxidación de fenoles existen
13 varios tipos:
•Para benzoquinonas: derivadas del benceno, muy activas (antimicrobianas, antifúngicas)
• Naftoquinonas: Derivadas del naftaleno, antibacterianas y antifíngicas.
•Antraciclinonas: Derivadas del naftaceno, constituyen el núcleo de antibióticos muy importantes como la daunomicina y la doxorubicina, y las tetraciclinas.
•Antraquinonas y fenantraquinonas: derivadas del antraceno y el fenantreno, son principios activos laxantes y purgantes, en sus formas de heterósido, (López, 2012).
e) Cumarinas
Son benzo − α – pironas; con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios activos fenólicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en común una estructura química de 2H-1-benzopiran- 2-ona, denominada cumarina, sobre esta estructura se disponen sustituyentes de distinta naturaleza química lo que da lugar a distintos tipos de cumarinas: sencillas y complejas (López, 2012).
f) Lignanos
Son moléculas cuya estructura resulta de la unión de 2 unidades del fenil propano (C6 – C3). Son muy abundantes en el reino vegetal, por ejemplo:
la podofilotoxina, se encuentra en el rizoma del podófilo (Podophyllum peltatum) y es la precursora de 2 sustancias (etopósido y tenipósido) empleadas en terapia antitumoral. También la silimarina, que es hepatoprotectora y se obtiene del cardo mariano (Sylibum marianum).
(López, 2012).
2.5. Terpenoides
López (2012) señala que los terpenoides están formados por la unión de un número entero de unidades de isopreno (C5). Entre ellos agrupamos a: aceites esenciales iridoides, lactonas sesquiterpénicas y Saponinas.
Iridoides
Son compuestos monoterpénicos, su nombre proviene de unas hormigas australianas (Iridomirmex sp) a partir de las cuales se aisló el iridodial, el compuesto más sencillo de este grupo. Se suelen encontrar en los vegetales en forma de heterósidos, en las familias gencianáceas y valerianáceas (López, 2012).
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Lactonas sesquiterpénicas
Se encuentran abundantemente en la familia de las compuestas, lauraceas y magnoliaceas, y son responsables del sabor amargo de muchas drogas como el cardo santo (Cnicus benedictus), el ajenjo (Artemisia absinthium) o el diente de león (Taraxacum officinale) tienen actividad antibacteriana y antifúngica. Algunas producen dermatitis en la piel ya que inducen la formación de alérgenos (López, 2012).
Saponinas
O saponósidos del latín sapo = jabón, son sustancias que tienen poder espumante en soluciones acuosas, y son tensoactivos naturales. Muchas poseen propiedades hemolíticas (desintegración de los eritrocitos), resultando muy tóxicas inyectadas en sangre. La toxicidad se reduce administrándolas vía oral son tóxicas para los animales de sangre fría (López, 2012).
2.6. Mecanismos de acción de los antimicrobianos
Rodríguez (2011) afirma que el modo de acción de éstos pueden inactivar enzimas esenciales, reaccionar con la membrana celular o alterar la función del material genético. El mecanismo de ataque de los antimicrobianos dentro de una célula se lleva a cabo en partes y/o funciones importantes para la sobrevivencia de la célula puede llevarse a cabo en la pared celular, membrana celular, en la síntesis de proteína y en la síntesis de su genética, esto puede causar daños irreparables a una célula.
Existen pocos estudios enfocados a comprender el mecanismo involucrado en la inhibición microbiana por especias y sus aceites esenciales. Sin embargo, se supone que dada la estructura fenólica de muchos de los compuestos con actividad antimicrobiana presentes en las especias y sus aceites esenciales, el modo de acción debe ser similar al de otros compuestos. Los compuestos fenólicos sensibilizan la membrana célula y al saturarse los sitios de acción la célula sufre un daño grave, provocando que colapse la membrana (Rodríguez, 2011).
Según García-Rodríguez y Picazo (2008) señalan que los principales mecanismos de acción a los antimicrobianos son:
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Inhibición de la síntesis de la pared celular
La pared celular es un elemento protector de la integridad bacteriana pues impide el estallido de la misma, ya que en el interior existe una gran presión osmótica. Los antimicrobianos que inhiben la síntesis de la pared bacteriana en general son bactericidas, ejercen su acción sobre todo cuando la bacteria se encuentra en las fases de crecimiento activo. Y en general son poco tóxicos, ya que la pared no existe en las células superiores.
Acción sobre la membrana citoplasmática
La membrana bacteriana actúa como una barrera selectiva, controlando la composición del medio interno celular. Por ello cuando es modificada se alteraran los procesos de permeabilidad y las células pierden proteínas, iones, ácidos nucleicos y se produce de esta forma la lisis bacteriana.
Inhibición de la síntesis proteica
La síntesis comienza con la transcripción a ARNm de la información genética presente en el ADN del cromosoma bacteriano, por la intervención de un ARN-polimerasa. El procedimiento se realiza en tres etapas:
iniciación, elongación (que comprende tres fases: reconocimiento, transferencia y translocación) y terminación son varios los antimicrobianos que inhibe la síntesis proteica. En general, los antimicrobianos que inhiben la síntesis proteica son bacterostaticos, excepto los aminoglucosidos y la mupirocina.
Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos
Se puede bloquear interfiriendo la réplica del ADN o impidiendo la transcripción. Las quinolonas interfieren en la replicación del ADN por que inhiben el ADN girasa o topoisomerasa II. Se les conoce como inhibidores de la girasa. Esta enzima es la que corta la doble hélice del ADN cromosómico en fragmentos a los que se superenrrolla en sentido negativo para posteriormente proceder al sellado de los extremos de ADN que fueron cortados.
Interfiriendo las vías metabólicas
Al inhibir la síntesis de metabolitos esenciales (bases pura o pirimidicas) también se altera la síntesis de ácidos nucleicos .De esta forma actúan las sulfamidas y las diaminopirimidas (trimetoprim).
16 2.7. Selección de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad Malbrán (2001) señala que las consideraciones que se han considerado en la designación de un agente antimicrobiano a un grupo específico incluyen:
eficacia, prevalencia de resistencia, costo, indicaciones del FDA, recomendaciones, consenso para drogas de primera elección y alternativos.
Con respecto al nombre genérico (Malbrán ,2001) afirma que para minimizar confusiones todos los antibióticos deberán ser referidos por su nombre genérico.
Tetraciclinas
Son sólidos ligeramente amargos y débilmente hidrosolubles pero sus derivados clorhidratos son más solubles. Las soluciones acuosos son inestables todas tienen prácticamente la misma actividad antibacteriana con pequeñas diferencias (López, Mezzano, Morando, y Oxemberg, 2005).
2.7.1.1. Mecanismo de acción de la tetraciclinas
Las tetraciclinas son principalmente bactereostaticas inhiben la síntesis de proteínas al unirse a la fracción 30S de los ribosomas en los microorganismos sensibles, después de esa unión, la fijación del complejo aminoacil-t-RNA con el ribosoma-Mrna queda interferida y como resultado, la cadena de peptidos no puede crecer descrita por López et al., (2005).
Malbrán (2001) menciona que existen clases de antibióticos con una única droga entre ellas están el cloranfenicol, clindamicina y rifampicina son antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas.
No presentan otros compuestos relacionados y deben ensayarse en los test invitro. La nitrofurantoina actúa inhibiendo varios pasos en la síntesis proteica.
Cloranfenicol
López et al., (2005) mencionan que el cloranfenicol se obtuvo inicialmente del streptomyces venezuelae, luego se sintetizo químicamente y en la actualidad es un producto comercial sintético.
17 Figura 6: Estructura química del cloranfenicol (López, 2005).
Es un sólido cristalino blanco amarillento bastante estable en solución acuosa que resiste la ebullición, pero debe protegerse de la luz, tiene una sustitución nitrobencénica que probablemente sea la responsable de su actividad antibacteriana y de su sabor tan amargo descrita por López et al., (2005)
2.7.2.1. Mecanismo de acción del cloranfenicol
López et al., (2005) señalan que el cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas bacterianas al interferir con la
“transferencia” de la cadena peptídica en elongación al recién unido aminoacil-Trna en el complejo ribosoma-Mrna, se fija específicamente a la fracción 50S del ribosoma e impide de tal modo el acceso de un aminoacil-t RNA al sitio aceptor para la incorpas aisladas son actualmente resistentes a este antibiótico.
Liscano y Vergara (2008) mencionan que el cloranfenicol en la mayoría de los microorganismos susceptibles produce un efecto bacteriostático.
2.7.2.2. Resistencia a cloranfenicol
García-Rodríguez y Picazo (2008) afirman que el principal mecanismo de resistencia es la modificación enzimática por la producción de una acetiltransferasa. Las formas acetiladas no se unen a los ribosomas. El control es plasmidico de bacterias Gram negativas y Staphylococcus aureus y cromosómico en entereococos, estreptococos, incluidos neumococos, clostridios y bacillus spp. También puede inactivarse por una nitroreductasa presentes en algunas especies como B. fragilis.
La resistencia a la disminución de la permeabilidad y acumulación se ha detectado en entereobacterias, P.aureuginosa y H influenzae debido a la perdida de proteínas de la membrana externa, en algunos casos identificados con purinas.
18 2.8. Extracto vegetales
Liscano y Vergara. (2008) mencionan que los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido por tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados, tales como el agua, etanol, metanol o éter, de elementos solubles, constituidos por una mezcla de principios activos y sustancias inertes que se producen de la totalidad o de partes de una planta fresca o seca.
Métodos generales para la obtención del extracto vegetal
Barreto (1997) afirma que los métodos de extracción de los extractos vegetales deben obedecer a la información de la naturaleza química de las sustancias presentes en la planta y el propósito de la investigación.
En el caso de búsqueda de sustancias para la comprobación de actividad biológica, la extracción del material vegetal debe hacerse en agua o con una solución disotonica (0.9 % NaCl). Frecuentemente se usa la extracción con solventes orgánicos de bajo punto de ebullición (alcohol, acetato de etilo) y de baja reactividad, algunas veces es conveniente desengrasar el material vegetal con éter de petróleo (extracto etéreo) o hexano.
El alcohol es generalmente más eficaz para recuperar la mayoría de los metabolitos secundarios. Los extractos son evaporados bajo presión reducida o liofilizados, en el caso de extracción con agua.
Los métodos de extracción se basan en las diferentes solubilidades de los diversos compuestos encontrados en el material vegetal, así para sustancias de baja polaridad (lípidos) se utilizan como solventes el éter de petróleo y cloroformo; para sustancias de mediana y alta polaridad el acetato de etilo, el etanol y la cetona.
García (2011) menciona que existen varios métodos extractivos para obtener los principios activos, a continuación se les mencionan:
a) Fluidos supercríticos (EFS)
La extracción mediante fluidos supercríticos es más respetuosa con el medio ambiente que los métodos de extracción convencionales, ya que utiliza gases como el CO2 a elevada presión, en estado líquido o supercrítico, en lugar de disolventes clorados, que producen residuos tóxicos. El CO2 es lo que se denomina un disolvente ecológico (comúnmente denominado en inglés green solvent) Como características de un fluido supercrítico podemos destacar:
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• Tienen un gran poder disolvente y una enorme capacidad de penetración en sólidos, lo que permite el agotamiento rápido y prácticamente total de los sólidos extraíbles.
• Se pueden separar totalmente y de forma sencilla de los extractos, sólo modificando la presión o la temperatura, hasta el extremo, si es necesario, en que el fluido pasa al estado gaseoso. El principal inconveniente de los fluidos supercríticos es el tiempo de extracción, que es generalmente largo. De hecho, en algunos casos puede llegar a tardar 24 horas (Bruneton, 2001).
b) Extracción por solución.
Se lleva a cabo una extracción con disolventes orgánicos, que penetran en la materia vegetal y disuelven las sustancias, que son evaporadas y concentradas a baja temperatura, después se elimina el disolvente, obteniendo la fracción deseada. La selección del disolvente pretende que sea capaz de disolver rápidamente todos los principios y la menor cantidad de materia inerte, que tenga un punto de ebullición bajo y uniforme que permita eliminarlo rápidamente, pero evitando pérdidas por evaporación, no soluble en agua, químicamente inerte, para no reaccionar con los componentes de los aceites, no inflamable y barato.
Este disolvente ideal no existe, y los más empleados son el éter de petróleo, con punto de ebullición de 30 a 70 ºC, se evapora fácilmente y es inflamable, benceno, que disuelve también ceras y pigmentos, y alcohol, que es soluble en agua (Bruneton, 2001).
c) Extracción líquido - líquido.
Consiste en extraer los analitos de una muestra líquida mediante un disolvente inmiscible en ella, como puede ser una fase acuosa con un disolvente orgánico no miscible. El pH es fundamental para conseguir buen rendimiento (Bruneton, 2001).
d) Extracción sólido – líquido
Cuando se trata de una muestra sólida, se pulveriza y a continuación, se extraen los analitos mediante un disolvente en el que sean muy solubles, que los diferencie de las sustancias presentes en la matriz, que han de ser muy insolubles en ese disolvente. Se suele hacer con agitación, temperatura o ultrasonidos para una mayor eficacia.
Según García (2011) señala que en el laboratorio el método más utilizado es la extracción por maceración, la cual implica sumergir el
20 material vegetal en un disolvente adecuado, por la que la totalidad de la planta contacta con el disolvente y la difusión de los principios activos se producirá en todas las direcciones hasta alcanzar el equilibrio y posteriormente se filtra. El extracto se obtiene eliminando parcial o totalmente el disolvente al vacío utilizando un rotavapor trabajando a una temperatura inferior a 40 °C.
Los extractos obtenidos por medio de las técnicas mencionadas anteriormente, se utilizan para realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana (antibiograma o examen bacteriológico), que permite apreciar la sensibilidad de una bacteria frente a distintos antibióticos en las que se encuentran: pruebas de sensibilidad por dilución en agar, pruebas de sensibilidad por macro dilución en caldo , pruebas de sensibilidad por difusión en discos y pruebas de sensibilidad estandarizadas por difusión con discos, conocidas como técnica de Bauer-Kirby (García ,2011).
2.9. Consistencia los extractos se clasifican en cuatro grupos
Liscano y Vergara (2008) mencionan que los extractos vegetales se clasifican en cuatro grupos y son:
Extractos blandos: Tiene la consistencia de la miel espesa; algunas veces debido a la absorción de la humedad atmosférica, presentan una consistencia menos densa.
Extractos firmes o de consistencia pilular: Como su nombre lo indica deben de tener una estrecha semejanza con la masa con la cual se fabrican o manufacturan las píldoras, deben de tener la característica especial de no adherirse a los dedos.
Extractos secos: Son los extractos en los cuales el disolvente ha sido casi completamente eliminado ,contiene tan solo del 5 al 8 % de agua. Se reducen fácilmente a polvo y facilitan su manipulación y su dosificación.
Extracto fluidos: Son preparados en una forma tal que el peso del extracto corresponde exactamente al peso de la sustancia empleada como medicamente, desecha al aire y pulverizada.
Conservación de los extractos
Barreto (1997) menciona que los extractos son medicamentos en donde la alteración modifica y varia notoriamente la naturaleza del producto .En principio, extracto seco o de tipo pilular se conserva mejor que un extracto
21 acuoso. Algunos extractos se descomponen al aire, otros absorben humedad atmosférica, algunos se recubren de hongos y permiten el desarrollo de gérmenes bacterianos. Por otra parte las alteraciones más frecuentes consisten en modificaciones químicas no aparentes como sucede con los extractos de flores verdes que por la oxidación de la clorofila pierden su color, los extractos a base de alcaloides bajan de título alcaloidico, es especialmente sensibles a los extractos blandos de aspecto pilular y bastante menos notorio en los extractos secos. La conservación de los extractos es indispensable y deben de cumplirse las siguientes condiciones:
Se deben conservar protegiéndolos de la luz.
Los envases deben de estar bien tapados.
Se deben de conservar en un ambiente seco.
2.10. Microorganismos de importancia en la microbiología de los alimentos Madueño (1997) señala que algunos microorganismos producen cambios beneficiosos en los alimentos (fermentados). Los microorganismos de interés para la microbiología analítica de los alimentos pueden subdividirse en microorganismos indicadores, patógenos y putrefactivos. Los microorganismos indicadores, tales como la E.coli, los estreptococos, Coliformes y fecales se supone que revelan un manejo no higiénico de los alimentos, con la posible presencia de ciertos patógenos, se utilizan mucho para determinar la calidad microbiología de los alimentos y del agua.
Los microorganismos patógenos son los que producen infecciones o intoxicaciones transmitidas por los alimentos, como por ejemplo las especies del género salmonella, Clostridium botulinum y Staphylococcus aureus. Entre los microorganismos que producen la descomposición de los alimentos figuran las bacterias , levaduras y los mohos, que originan cambios perjudiciales, color, olor, gusto o aroma del alimento.
Cervantes, Chalte y Tapia (2008) afirman que las enfermedades transmitidas por alimentos, se adquieren al consumir alimentos o bebidas contaminados por diversos microorganismos. Las enfermedades transmitidas por alimentos pueden provocar:
22 Infección
Es la enfermedad ocasionada por comer alimentos que contienen organismos dañinos, como la salmonelosis, shigelosis y listeriosis son infecciones alimentarias.
Intoxicación
Es una enfermedad ocasionada por comer alimentos que contienen toxinas de bacterias, mohos y venenos de ciertas plantas o animales, el staphylococus y botulismo son ejemplos de intoxicaciones alimentarias.
2.11. Crecimiento bacteriano
(Henao y Trujillo, 2007) afirman que el crecimiento de bacterias al igual que el crecimiento de los demás seres vivos está ligado a dos aspectos: la adaptación al medio ambiente y a la disponibilidad de alimento; al cumplirse estas dos condiciones el crecimiento de bacterias se caracteriza por ser relativamente rápida y estar dividido en cuatro etapas principales.
a) Fase lag o de adaptación: Durante esta etapa los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
b) Fase exponencial o logarítmica: En ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio, la evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.
Figura 7: Modelos matemáticos del crecimiento bacteriano, (Henao y Trujillo, 2007).
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el
23 crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.
c) Fase estacionaria: En ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial, (Henao y Trujillo, 2007).
d) Fase de muerte: Se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.
2.12. Microorganismos indicadores
Son organismos habitualmente asociados a la presencia de patógenos; en las pruebas de inhibición se utilizan para evaluar la capacidad inhibitoria de las sustancias antimicrobianas estudiadas.
Las bacterias Gram negativas (Gram-) presentan 10 % de peptidoglicano en la pared celular, poseen una capa adicional que está compuesta de lipopolisacaridos, esta capa representa de hecho una segunda bicapa lipídica, que contienen además polisacáridos y proteínas (Madigan, 2011). Las bacterias Gram positivas (Gram+) presentan a menudo polisacáridos ácidos unidos a la pared celular denominados ácidos teicoicos, que incluye a toda la pared,membrana o polímeros capsulares que contienen glicerolfosfato o residuos de fosfato de ribitol. La carga negativa neta de la superficie celular es aportada por los ácidos teicoicos y puede servir para el trasiego de iones a través de la pared celular, además presenta una capa de peptidoglicano que representa hasta 90 % de la pared y es la responsable de su rigidez (Madigan, 2011).
Las paredes celulares de las bacterias permiten resistir a la presión de turgencia; consecuencia de la concentración de solutos disueltos dentro de la célula, además son las responsables de la forma y rigidez de la célula, las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares, permite distinguir a las bacterias en Gram positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram- ) mediante una tinción diferencial denominada tinción de Gram (Aliaga, 2013).
24 Figura 8: Diferencia estructural entre las bacterias Gram positivas (Gram+) y Gram negativas
(Gram-), (Sáenz, 2007).
Parámetros para el crecimiento de los microorganismos.
Según James (1978) menciona que los parámetros que son parte inherente de los tejidos vegetales y animales se denominan intrínsecos, este parámetro es el pH.
Gram negativa (Gram-) Gram positiva (Gram+)
25 Tabla 1. Valores aproximados correspondientes al pH máximo y mínimo
necesario para el crecimiento de los microorganismos.
Organismo mínimo máximo
Escherichia coli 4,4 9,0
Salmonella typhi 4,5 8,0
Streptococcus lactis 4,3 4,8
Lactobacillus spp 3,0 7,2
Thiobacillus thiooxidans* <1,0 9,8 Estaphylococcus aureus 4,5 9,3
Mohos 1,5-2 11
Levaduras 2,5 8,0-8,5
Acontium velatum (hongo)
0,2-0,7 7
Fuente: James (1978).
pH, se ha demostrado claramente que la mayor parte de los microorganismos se multiplican con valores de pH alrededor de 6,6-7,5 mientras que solo algunos crecen por debajo de 4 (véase la tabla 1).las bacterias suelen ser más exigentes que los mohos y levaduras, siendo además las bacterias patógenas las más sensibles en relación con este factor de pH. En relación con los pH máximos y mínimos de los microorganismos, los limites que figuran en la tala 1, no deben tomarse como esenciales ya que sus valores reales para crecer dependen de otros parámetros por ejemplo, se ha demostrado que el pH mínimo al que medran determinados lactobacilos dependen del tipo de ácido que se utilice, de forma que los ácidos cítricos, HCl, fosfórico y tartárico favorecen el crecimiento a pH más bajo que los ácidos acético o láctico.
Madueño (1997) señala que el pH óptimo para muchos microorganismos es el próximo al punto neutro ,es decir a un pH 7.0 los organismos que toleran los ácidos se encuentran en un medio acido, en una situación ventajosa con respecto a la otros microorganismos que son inhibidos por los ácidos, los mohos y las levaduras toleran, por lo general los ácidos y esta es una de las razones por las que tales de los organismos suelen encontrarse en los alimentos ácidos especialmente en los frutos, muchos tipos de bacterias no toleran los ácidos y por consiguiente se encuentran raramente en los frutos normalmente sanos por esta razón se utilizan
26 varios ácidos, como el ácido acético, el ácido benzoico y el ácido propionico para conservar los alimentos en pH 4.5 o inferior es mortal para la salmonella y los estafilococos.
Rodríguez (2011) afirma que las bacterias crecen a pH cercanos a la neutralidad (pH 6.5 a 7.5) pero sin embargo son capaces de tolerar un rango de pH entre 4 y 9. La célula microbiana normalmente refleja este equilibrio atendiendo al mantenimiento de un pH interno cercano a la neutralidad. La homeostasis es la tendencia de una célula a sostener un equilibrio químico a pesar de las fluctuaciones en el ambiente. Este balance se mantiene por medio de la interacción de una serie de mecanismos químicos, causando su alteración la destrucción de las células microbianas. Las proteínas, los ácidos nucleicos y fosfolípidos pueden ser alterados estructuralmente por los cambios de pH.
Rodríguez (2012) afirma que los principales factores que afectan el crecimiento de los microorganismos son:
Efecto de la atmosfera de incubación sobre el crecimiento: El requerimiento de oxigeno varían entre las bacterias y de acuerdo a ello pueden clasificarse en: aerobias, facultativas, microaerofilicas y anaerobias, Las aerobias requieren oxígeno para su crecimiento. Las facultativas pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Las microaerofilicas requieren una baja tensión de oxígeno. Las anaerobias no requieren el oxígeno para su metabolismo.
Efecto de la temperatura sobre el crecimiento: La temperatura de incubación afecta drásticamente a la tasa de crecimiento de las bacterias debido a que influye en la actividad enzimática. Con base en la temperatura optima de crecimiento y el intervalo de temperatura en el cual se puede desarrollar las bacterias se dividen en cuatro categorías principales psicrófilos (que gustan del frio), los mesófilos (que gustan de temperatura moderadas), los termófilos (que gustan del calor) y los hipertermófilos (que gustan de temperaturas mayores de 80 °C).
Efecto del pH del medio de cultivos sobre el crecimiento: La mayoría cree mejor cerca de la neutralidad (pH 7,0) en un ámbito relativamente estrecho
Efecto de la presión osmótica sobre el crecimiento.
27 2.13. Staphylococcus aureus
Taxonomía
Dominio: Bacteria o Eubacteria Filo: Firmicutes
Clase: Cocci Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus (Rosenbach, 1884) Especie: Staphyloccocus aureus
Fuente: García y Rojas. (2012).
Figura 9: Características macro y microscópicas de Staphylococcus aureus (Liscano y Vergara, 2008).
Características generales del Staphylococcus aureus
Tello (2011) señala que según las características microbiológicas del S.
aureus es un coco inmóvil, Gram positivo (Gram+), cuyo diámetro varía de 0,5 a 1,5 μm que se divide en tres planos para formar grupos de células irregulares semejantes a racimos de uvas.
Unas pocas cepas producen una capsula o capa de baba que incrementa la virulencia del microorganismo y no originan esporas.
Los estafilococos son aerobios y anaerobios facultativos tiene actividad metabólica tanto oxidativa como fermentativa, son relativamente resistentes al calor aunque su temperatura óptima de crecimiento es de 36 ± 1 ºC, pueden desarrollarse también a 45 ºC y hasta soportan temperaturas de 60 ºC durante media hora presentan una buena tolerancia a la desecación y son más resistentes que otras bacterias a ciertos desinfectantes como cloruro de mercurio y fenol.
