Son organismos habitualmente asociados a la presencia de patógenos; en las pruebas de inhibición se utilizan para evaluar la capacidad inhibitoria de las sustancias antimicrobianas estudiadas.
Las bacterias Gram negativas (Gram-) presentan 10 % de peptidoglicano en la pared celular, poseen una capa adicional que está compuesta de lipopolisacaridos, esta capa representa de hecho una segunda bicapa lipídica, que contienen además polisacáridos y proteínas (Madigan, 2011). Las bacterias Gram positivas (Gram+) presentan a menudo polisacáridos ácidos unidos a la pared celular denominados ácidos teicoicos, que incluye a toda la pared,membrana o polímeros capsulares que contienen glicerolfosfato o residuos de fosfato de ribitol. La carga negativa neta de la superficie celular es aportada por los ácidos teicoicos y puede servir para el trasiego de iones a través de la pared celular, además presenta una capa de peptidoglicano que representa hasta 90 % de la pared y es la responsable de su rigidez (Madigan, 2011).
Las paredes celulares de las bacterias permiten resistir a la presión de turgencia; consecuencia de la concentración de solutos disueltos dentro de la célula, además son las responsables de la forma y rigidez de la célula, las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares, permite distinguir a las bacterias en Gram positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram- ) mediante una tinción diferencial denominada tinción de Gram (Aliaga, 2013).
24 Figura 8: Diferencia estructural entre las bacterias Gram positivas (Gram+) y Gram negativas
(Gram-), (Sáenz, 2007).
Parámetros para el crecimiento de los microorganismos.
Según James (1978) menciona que los parámetros que son parte inherente de los tejidos vegetales y animales se denominan intrínsecos, este parámetro es el pH.
Gram negativa (Gram-) Gram positiva (Gram+)
25 Tabla 1. Valores aproximados correspondientes al pH máximo y mínimo
necesario para el crecimiento de los microorganismos.
Organismo mínimo máximo
Escherichia coli 4,4 9,0
Salmonella typhi 4,5 8,0
Streptococcus lactis 4,3 4,8
Lactobacillus spp 3,0 7,2
Thiobacillus thiooxidans* <1,0 9,8 Estaphylococcus aureus 4,5 9,3
Mohos 1,5-2 11
Levaduras 2,5 8,0-8,5
Acontium velatum (hongo)
0,2-0,7 7
Fuente: James (1978).
pH, se ha demostrado claramente que la mayor parte de los microorganismos se multiplican con valores de pH alrededor de 6,6-7,5 mientras que solo algunos crecen por debajo de 4 (véase la tabla 1).las bacterias suelen ser más exigentes que los mohos y levaduras, siendo además las bacterias patógenas las más sensibles en relación con este factor de pH. En relación con los pH máximos y mínimos de los microorganismos, los limites que figuran en la tala 1, no deben tomarse como esenciales ya que sus valores reales para crecer dependen de otros parámetros por ejemplo, se ha demostrado que el pH mínimo al que medran determinados lactobacilos dependen del tipo de ácido que se utilice, de forma que los ácidos cítricos, HCl, fosfórico y tartárico favorecen el crecimiento a pH más bajo que los ácidos acético o láctico.
Madueño (1997) señala que el pH óptimo para muchos microorganismos es el próximo al punto neutro ,es decir a un pH 7.0 los organismos que toleran los ácidos se encuentran en un medio acido, en una situación ventajosa con respecto a la otros microorganismos que son inhibidos por los ácidos, los mohos y las levaduras toleran, por lo general los ácidos y esta es una de las razones por las que tales de los organismos suelen encontrarse en los alimentos ácidos especialmente en los frutos, muchos tipos de bacterias no toleran los ácidos y por consiguiente se encuentran raramente en los frutos normalmente sanos por esta razón se utilizan
26 varios ácidos, como el ácido acético, el ácido benzoico y el ácido propionico para conservar los alimentos en pH 4.5 o inferior es mortal para la salmonella y los estafilococos.
Rodríguez (2011) afirma que las bacterias crecen a pH cercanos a la neutralidad (pH 6.5 a 7.5) pero sin embargo son capaces de tolerar un rango de pH entre 4 y 9. La célula microbiana normalmente refleja este equilibrio atendiendo al mantenimiento de un pH interno cercano a la neutralidad. La homeostasis es la tendencia de una célula a sostener un equilibrio químico a pesar de las fluctuaciones en el ambiente. Este balance se mantiene por medio de la interacción de una serie de mecanismos químicos, causando su alteración la destrucción de las células microbianas. Las proteínas, los ácidos nucleicos y fosfolípidos pueden ser alterados estructuralmente por los cambios de pH.
Rodríguez (2012) afirma que los principales factores que afectan el crecimiento de los microorganismos son:
Efecto de la atmosfera de incubación sobre el crecimiento: El requerimiento de oxigeno varían entre las bacterias y de acuerdo a ello pueden clasificarse en: aerobias, facultativas, microaerofilicas y anaerobias, Las aerobias requieren oxígeno para su crecimiento. Las facultativas pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Las microaerofilicas requieren una baja tensión de oxígeno. Las anaerobias no requieren el oxígeno para su metabolismo.
Efecto de la temperatura sobre el crecimiento: La temperatura de incubación afecta drásticamente a la tasa de crecimiento de las bacterias debido a que influye en la actividad enzimática. Con base en la temperatura optima de crecimiento y el intervalo de temperatura en el cual se puede desarrollar las bacterias se dividen en cuatro categorías principales psicrófilos (que gustan del frio), los mesófilos (que gustan de temperatura moderadas), los termófilos (que gustan del calor) y los hipertermófilos (que gustan de temperaturas mayores de 80 °C).
Efecto del pH del medio de cultivos sobre el crecimiento: La mayoría cree mejor cerca de la neutralidad (pH 7,0) en un ámbito relativamente estrecho
Efecto de la presión osmótica sobre el crecimiento.
27 2.13. Staphylococcus aureus
Taxonomía
Dominio: Bacteria o Eubacteria Filo: Firmicutes
Clase: Cocci Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus (Rosenbach, 1884) Especie: Staphyloccocus aureus
Fuente: García y Rojas. (2012).
Figura 9: Características macro y microscópicas de Staphylococcus aureus (Liscano y Vergara, 2008).
Características generales del Staphylococcus aureus
Tello (2011) señala que según las características microbiológicas del S.
aureus es un coco inmóvil, Gram positivo (Gram+), cuyo diámetro varía de 0,5 a 1,5 μm que se divide en tres planos para formar grupos de células irregulares semejantes a racimos de uvas.
Unas pocas cepas producen una capsula o capa de baba que incrementa la virulencia del microorganismo y no originan esporas.
Los estafilococos son aerobios y anaerobios facultativos tiene actividad metabólica tanto oxidativa como fermentativa, son relativamente resistentes al calor aunque su temperatura óptima de crecimiento es de 36 ± 1 ºC, pueden desarrollarse también a 45 ºC y hasta soportan temperaturas de 60 ºC durante media hora presentan una buena tolerancia a la desecación y son más resistentes que otras bacterias a ciertos desinfectantes como cloruro de mercurio y fenol.
28 Granados y Villaverde (2011) afirman que el género Staphylococcus aureus no forman esporas. Es frecuente que formen parte de la flora normal de las mucosas y de la piel e incluso en procesos infecciosos como intoxicaciones alimentarias, heridas y en general en distintos procesos patógenos.
Características bioquímicas y fisiológicas
Pahissa (2009) afirma que la mayoría de las especies produce catalasa, una enzima que permite desdoblar el peróxido de hidrogeno (H2O2) en H2O y oxigeno libre, esta característica se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positiva) de los géneros Streptococcus y Enterococus, que no producen esta enzima (catalasa negativo).
Tras 24 horas de incubación Staphylococcus aureus crece formando colonias lisas, elevadas brillantes y de bordes enteros; típicamente las colonias presentan una consistencia cremosa con una coloración amarillenta o dorada debido a la producción de un pigmento carotenoide.
Las colonias de otras especies ofrecen un aspecto variable, dependiendo de la especie, pero suelen ser color blanco intenso no pigmentado.
La principal característica que diferencia a Staphylococcus aureus de las demás especies de estafilococos es la producción del enzima coagulasa, que permite a la bacteria coagular el plasma. Las demás especies no producen esta enzima (coagulasa negativos) y de forma genérica se agrupa con esta denominación a todas las especies de Staphylococcus diferentes de Staphylococcus aureus (coagulasa positiva).
Factores que afectan al crecimiento y supervivencia del Staphyloccocus aureus
Elika, (2013) señala que el Stapylococcus aureus es una de las bacterias patógenas humanas formadoras de toxinas más resistente y puede sobrevivir durante largos periodos de tiempo en un ambiente seco, y son muy persistentes en alimentos con contenido alto en sales y azúcares.
Asimismo sus toxinas son altamente estables, y resistentes al calor, congelación e irradiación, por lo que una vez formadas en el alimento, es extremadamente difícil eliminarlas.
29 Tabla 2. Condiciones de crecimiento de las toxinas producidas por
Staphylococcus aureus.
Parámetros Rango de crecimiento
Mínimo Optimo Máximo
Temperatura 10 40-45 48
pH 4 7-8 9,6
Actividad de agua 0,85 0,98 0,99
Fuente: Elika, (2013).
Componentes estructurales
Pared celular
Pahissa (2009) como la mayoría de las bacterias Gram positivas (Gram +) los componentes fundamentales de la pared celular son el peptidoglicano y los ácidos teicoicos. El peptidoglicano representa la mitad del peso de la pared celular y proporciona forma y estabilidad al microorganismo además, tiene actividad de tipo endotoxina por lo que interviene de forma importante en la patogenia de infección.
Los ácidos teicoicos representan el 40 % del peso de la pared, son polímeros compuestos por ribitol y N-acetil-glucosamina (polisacárido A) y son específicos de especie están unidos covalentemente al peptidoglicano de la pared o ligados a los lípidos de la membrana celular. Los ácidos teicoicos median la unión de Staphylococcus aureus a las superficies mucosas mediante uniones especificas a la fibronectina. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus (pero no las de estafilococos coagulasa negativos) están recubiertas uniformemente de una proteína denominada proteína A, la cual se utiliza para una prueba específica de aglutinación con anticuerpos monoclonales en la identificación de Staphylococcus aureus. Otra proteína asociada a la pared celular es la coagulasa, que se puede encontrarse ligada a la célula (coagulasa ligada o clumping factor) la coagulasa ligada es capaz de convertir directamente, sin intervención de factores plasmáticos, el fibrogeno en fibrina produciendo la coagulación del plasma. La coagulasa libre requiere unirse a la protrombina para activarse y catalizar la conversión del fibrogeno en fibrina. La detección de la proteína A, el clumping factor o la coagulasa libre es fundamental en
30 la identificación de Staphylococcus aureus. Otras proteínas de superficie median la adherencia a los tejidos del huésped mediante uniones específicas al colágeno, elastina y fibronectina.
Membrana citoplasmática
Pahissa (2009) afirma que la membrana citoplasmática está formado por un complejo de proteínas, lípidos e hidratos de carbono y sirve de barrera osmótica para la célula.
Capsula
Pahissa (2009) afirma que algunas cepas de Staphylococcus aureus están recubiertas por una capa de polisacáridos externos, denominados smile o capsula mucoide, que confiere en ciertas condiciones una mayor capacidad de adherencia, así como un aumento del efecto antifagocitico.
Enzimas
Tello (2011) afirma que las enzimas producidas por el Staphylococcus aureus son:
-Catalasa. La descomposición del agua oxigenada en agua y oxigeno molecular, por la catalasa, podrían interferir en la destrucción intrafagocítica mediada por radicales tóxicos de oxígeno.
-Coagulasa libre. Es un profermento que en presencia de protrombina, o un cofactor del plasma de conejo (coagulase reacting factor, CRF), o ambos, forman el fibrinógeno en fibrina, determinando la formación de coágulos intravenosos.
-Hialuronidasa. Aumenta el poder invasivo de los estafilococos al hidrolizar el ácido hialurónico, mucopolisacarido constituyente fundamental de los tejidos.
-Estafilocinasa. Actúa sobre la fibrina por activación de una profibrinolisina, destruyendo los coágulos de fibrina y pudiendo, al menos teóricamente, facilitar la formación de microtrombos y las metástasis sépticas.
-Lipasas. Tales como fosfolipasas esterasas, capaces de metabolizar las grasas cutáneas.
-Nucleasas. Hidrolizan el ADN de las células eucariotas, por lo que podrían contribuir a las lesiones tisulares.
31 Acción patógena del Staphylococcus aureus
Granados y Villaverde (2003) afirman que el efecto más o menos patógeno de S. aureus para el hombre dependerá de:
Antígenos presentes en la pared celular (polisacárido A, proteína A y otras proteína con carácter antigénico).
Toxinas (hemolisinas, fibrinolisinas o estafiloquinasa y penicilinasas).
Con respecto a los antígenos de superficie, es decir que se encuentran en la pared celular, nos encontramos sobre todo con polisacáridos A y proteína A, que presentan propiedades antifagocitarias e inducen a la liberación de factores quimiotacticos que intervienen en la formación de estructura piógenas muy características de las lesiones producidas por Staphylococcus. Las toxinas más importantes van a corresponder a hemolisinas, cuya composición es proteica y que en general lisan con facilidad los eritrocitos además de tener efectos tóxicos sobre otras células como por ejemplo macrófagos y leucocitos. Debido a esta propiedad estas exotoxinas son conocidas también como citotóxicas son en general muy sensibles al calor se conocen un total de cuatro que son:
-Hemolisina alfa: De naturaleza fosfolipidica y responsable de los fenómenos de hemólisis alrededor de las colonias en medios agar sangre o chocolate.
-Hemolisina beta: Compuesta por una esfingomielinasa, responsable de los procesos de hemolisis parcial en glóbulos rojos en los carneros 37 °C.
-Hemolisina gama y delta: Intervienen en lesiones y heridas, pero tienen poca importancia patógena. No producen hemolisis dentro de las toxinas, además de las hemolisinas, nos encontramos otras como la toxina exfoliativa, que es una exotoxina proteica causante de eritemas en la piel, si pueden resultar graves por ultimo nos encontramos con las enterotoxinas que son responsables de intoxicaciones alimentarias y cuadros de enterocolitis este tipo de toxinas son exotoxinas de carácter proteínico, capaces de anular la acción del jugo gástrico.
Existen distintas enterotoxinas las más conocidas son las del tipo A, B y D que pertenecen a la cepa de S. aureus responsables de intoxicaciones alimentarias en los dos primeros casos y enterocolitis en el ultimo. Si afecta al aparato digestivo se produce cuadros de intoxicación alimentaria debido a la acción de la enterotoxina que crece muy bien en
32 alimentos ricos en hidratos de carbono, como por ejemplo, las cremas y muchos productos de pastelería, también a través de portadores asintomáticos de S. aureus que manipulan los alimentos o cuando las condiciones de conservación no son las adecuadas o sobre todo en épocas veraniegas, donde el aumento de la temperatura facilita el crecimiento de Stapylococcus.
Identificación del Staphylococcus aureus
Pahissa (2009) menciona que una vez aisladas el Staphylococcus aureus, la identificación puede realizarse mediante unas pocas pruebas bioquímicas convencionales. Inicialmente, la detección de catalasa permite diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positivo) de los géneros Streptococcus y enterococcus (catalasa negativos). La fermentación de glucosa permite diferenciar el género Staphylococcus del genero Micrococcus, que es también catalasa positivo pero no fermenta glucosa en anaerobiosis.
La prueba de la coagulasa sigue siendo la más utilizada para la identificación de Staphylococcus aureus se basa en la capacidad de la cepas de Staphylococcus aureus para producir este enzima extracelular que coagula el plasma; la detección de coagulasa permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de todas las demás especies de estafilococos (coagulasa negativos). Se han desarrollado diferentes técnicas comerciales que permitan detectar mediante hemaglutinación o aglutinación en látex el clumping factor (coagulasa ligada) y la proteína A, utilizando partículas de látex sensibilizadas con fibrinógeno humano y un anticuerpo monoclonal frente a la proteína A.
Otra característica especifica de Staphylococcus aureus es la producción de ADNsa termoestable que se puede edificarse fácilmente mediante cultivo en medios que contienen ADN, por ejemplo el medio ADN verde –malaquita. Algunas especies de estafilococos coagulas negativos pueden presentar una actividad ADNsa débil. Otras pruebas que ayudan en la identificación de Staphylococcus aureus, aunque no son específicas de esta especie, son la fermentación de manitol y la producción de fosfatasa alcalina.
33 Persistencia bacteriana
Pahissa (2009) menciona que una vez colonizada la superficie tisular o protésica el Staphylococcus aureus tiene la capacidad de construir una biocapa bacteriana mediada principalmente por la producción de una sustancia denominada polisacárido de adhesión intracelular (PIA) mediado, a su vez por un gen denominado ica, la constitución de biocapas bacterianas protege a Staphylococcus aureus de la actividad de los mecanismos de defensa de los huésped y de los antimicrobianos.
Esta bacteria además parece tener la capacidad de sobrevivir intracelularmente, incluso en células endotelias. Algunas cepas de Staphylococcus aureus pueden formar lo que se conoce con el nombre de variantes de colonias pequeñas que se hallan en estado de semilatencia, evadiendo de esta manera la acción de los mecanismo de defensa y de algunos antimicrobianos.
2.14. Escherichia coli