UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
EXTRACCIÓN ENZIMÁTICA DE COLÁGENO DE PIEL Y CARTÍLAGO DE HUESOS (RESIDUOS) DE TRUCHA (Oncorhynchus mykiss)
PRESENTADO POR LAS BACHILLERES:
CRISTOBAL ORE, Beatriz Ludy CRISTOBAL ORE, Patricia Katerine
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
HUANCAYO - PERÚ 2023
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
“Año de la unidad, la paz y el desarrollo”
INFORME Nº 001-2023-NGM-FAIIA PARA: Dr. RODOLFO TELLO SAAVEDRA
Decano de la Facultad de INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS ASUNTO: REPORTE DE SIMILITUD DE CONTENIDO (Turnitin)
FECHA: 26 de setiembre del 2023
Mediante el presente me dirijo a usted, después de haber precedido a la verificación de similitud con el turnitin en cumplimiento a la ley universitaria Nº 30220, Estatuto de la UNCP, reglamento de investigación y al Código de Ética de investigación de la UNCP (Resolución Nº 2064-CU-2017), el resultado fue el siguiente:
TÍTULO DE LA TESIS TESISTA RESULTADOS
DE SIMILITUD
“Extracción enzimática de colágeno de piel y cartílago de huesos (residuos) de
trucha (Oncorhynchus mykiss)”
Beatriz Ludy CRISTOBAL
ORE 18 %
Lo cual adjunto el documento de visualización que se informa para los fines correspondientes; y haber alcanzado un porcentaje aceptable de acuerdo a la reglamentación (≤25 % de similitud).
Atentamente:
Msc Norma Nelida Gamarra Mendoza DNI: 19877534
CODIGO ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6559-6720
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
“Año de la unidad, la paz y el desarrollo”
INFORME Nº 002-2023-NGM-FAIIA PARA: Dr. RODOLFO TELLO SAAVEDRA
Decano de la Facultad de INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS ASUNTO: REPORTE DE SIMILITUD DE CONTENIDO (Turnitin)
FECHA: 26 de setiembre del 2023
Mediante el presente me dirijo a usted, después de haber precedido a la verificación de similitud con el turnitin en cumplimiento a la ley universitaria Nº 30220, Estatuto de la UNCP, reglamento de investigación y al Código de Ética de investigación de la UNCP (Resolución Nº 2064-CU-2017), el resultado fue el siguiente:
TÍTULO DE LA TESIS TESISTA RESULTADOS
DE SIMILITUD
“Extracción enzimática de colágeno de piel y cartílago de huesos (residuos) de
trucha (Oncorhynchus mykiss)”
Patricia Katerine
CRISTOBAL ORE 18 %
Lo cual adjunto el documento de visualización que se informa para los fines correspondientes; y haber alcanzado un porcentaje aceptable de acuerdo a la reglamentación (≤25 % de similitud).
Atentamente:
Msc Norma Nelida Gamarra Mendoza DNI: 19877534
CODIGO ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6559-6720
M.Sc. Norma Nelida Gamarra Mendoza DNI: 19877534
FECHA: 26/09/2023
EXTRACCIÓN ENZIMÁTICA DE COLÁGENO DE PIEL Y CARTÍLAGO DE HUESOS (RESIDUOS) DE TRUCHA (Oncorhynchus mykiss)
M.Sc. Norma Nelida Gamarra Mendoza
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO EL PERÚ FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
JURADO EVALUADOR
Presidente
Jurado
Jurado Secretario
ASESORA
M.Sc. NORMA NÉLIDA GAMARRA MENDOZA
AGRADECIMIENTOS
A Dios por bendecirnos y proveernos de fortaleza para alcanzar nuestra meta.
A la M.Sc. Norma Nélida Gamarra Mendoza por brindarnos su confianza, paciencia y asesoramiento en la elaboración de esta investigación a pesar de todos los inconvenientes presentados.
A todos los docentes de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú que nos brindaron sus conocimientos en el trayecto de cada semestre.
A nuestros padres, Bartolomé y Olga quienes han sido nuestro apoyo y han sabido guiarnos haciendo más ligeros los malos momentos y celebrando nuestras alegrías.
Al Programa Nacional de Innovación en Pesca y Acuicultura (PNIPA) y a la entidad Ejecutora INNOVATREN por el Financiamiento en la Ejecución del Subproyecto de Investigación: PNIPA – ACU – SIADE – PP – 0519: Biotransformación de residuos de piel y huesos de trucha para la producción de colágeno/ gelatina de uso industrial para consumo humano. Y elaboración de fertilizantes orgánicos para el cultivo de papas nativas orgánicas en la región Junín.
Y a cada una de las personas que de una u otra forma nos apoyaron de manera incondicional, nuestras más sinceras gracias.
DEDICATORIA
A mis padres Bartolomé CRISTOBAL PECHO y Olga ORE SULCARAY por ser los mejores guías de valentía, perseverancia y fortaleza, por haberme brindado su confianza, motivación y apoyo incondicional;
el cual, me permitió alcanzar mis metas.
A mis hermanos por el impulso, confianza y apoyo en todo momento.
A mis amigos por sus consejos y motivarme a culminar esta investigación.
CRISTOBAL ORE, Patricia Katerine
DEDICATORIA A mi papá Bartolomé CRISTOBAL PECHO por su motivación y estar presente en todas las etapas de crecimiento profesional, a mi mamá Olga ORE SULCARAY por su ejemplo de lucha, perseverancia y apoyo en esta etapa profesional; a mi esposo Abelardo MENDOZA ADAUTO por el apoyo y la motivación incondicional que siempre me brinda y a cada miembro de la familia, quienes de una u otra manera han hecho posible que siga adelante en el camino a ser un profesional.
CRISTOBAL ORE, Beatriz Ludy
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ………..12
I. INTRODUCCIÓN ... 13
II. MARCO TEÓRICO ... 15
2.1 ANTECEDENTES ... 15
2.2 BASES TEÓRICAS... 16
2.2.1 Trucha ... 16
2.2.1.1 Clasificación taxonómica ... 17
2.2.1.2 Composición química ... 17
2.2.1.3 Residuos de la trucha ... 18
2.2.1.4 Producción de trucha ... 18
2.2.1.5 Comercialización de trucha ... 19
2.2.2 Colágeno ... 20
2.2.2.1 Composición ... 23
2.2.2.2 Colágeno marino ... 26
2.2.3 Métodos de extracción ... 26
2.2.3.1 Extracción ácida ... 26
2.2.3.2 Extracción enzimática ... 27
2.2.4 Propiedades físico-químicas y microbiológicas del colágeno ... 27
2.2.4.1 Punto de fusión ... 27
2.2.4.2 Viscosidad ... 27
2.2.4.3 pH ... 27
2.2.4.4 Análisis proximales ... 27
2.2.4.5 Composición de aminoácidos ... 28
2.2.4.6 Electroforesis ... 28
2.2.4.7 Análisis microbiológico ... 28
2.2.5 Influencia en la producción de colágeno... 28
2.2.6 Usos y aplicaciones del colágeno ... 29
III. MATERIALES Y MÉTODOS ... 30
3.1 Lugar de ejecución ... 30
3.2 Tipo de investigación ... 30
3.3 Materia prima ... 30
3.4 Equipos e instrumentos, materiales y reactivos ... 32
3.4.1 Equipos e instrumentos ... 32
3.4.2 Materiales ... 32
3.4.3 Reactivos ... 33
3.4.4 Enzima ... 34
3.5 Proceso de extracción del colágeno ... 34
3.5.1 Primera etapa ... 34
3.5.2 Segunda etapa ... 35
3.5.3 Tercera Etapa ... 38
3.5.3.1 Cálculo del rendimiento aparente ... 38
3.5.3.2 Cuantificación de hidroxiprolina ... 39
3.5.3.3 Análisis fisicoquímico: punto de fusión y viscosidad de colágeno y pH .. 39
3.5.3.4 Análisis químico proximal de colágeno ... 40
3.5.3.5 Composición de aminoácidos del colágeno, determinado por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ... 40
3.5.3.6 Análisis de electroforesis de colágeno ... 40
3.5.3.7 Análisis microbiológico ... 40
3.6 Diseño experimental estadístico ... 41
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES ... 44
4.1 Análisis fisicoquímico de piel y hueso de truchas ... 44
4.2 Rendimiento de colágeno ... 45
4.2.1. Piel ... 45
4.2.2. Huesos ... 53
4.3 Análisis químico proximal... 59
4.4 Composición de aminoácidos de colágeno, determinado por HPLC ... 60
4.5 Análisis de electroforesis ... 63
4.6 Análisis microbiológico del colágeno obtenido ... 65
V. CONCLUSIONES ... 67
VI. RECOMENDACIONES ... 68
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 69
VIII. ANEXOS ... 74
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición química de la trucha arcoíris 17
Tabla 2. Porcentaje de residuos de trucha arco iris 18
Tabla 3. Extracción de trucha por departamento en TM (2010-2020) 19
Tabla 4. Aminoácidos presentes en el colágeno 24
Tabla 5. Niveles de los factores para el diseño 41
Tabla 6. Tratamientos para la obtención de colágeno de piel 42
Tabla 7. Tratamientos para la obtención de colágeno de huesos 42
Tabla 8. Análisis fisicoquímico de piel y huesos fresco de trucha 44
Tabla 9. Rendimiento de colágeno de piel de trucha 46
Tabla 10. Análisis de varianza para el rendimiento aparente de colágeno de piel 47
Tabla 11. Análisis de varianza (SC tipo III) en los tratamientos para la extracción de colágeno aparente en piel de trucha 48
Tabla 12. Prueba Tukey para los tratamientos para la extracción de colágeno aparente en piel de trucha 48
Tabla 13. Análisis de varianza para el rendimiento de colágeno en términos de hidroxiprolina de piel de trucha 50
Tabla 14. Análisis de varianza (SC tipo III) en los tratamientos para el rendimiento de colágeno (g colágeno/ g proteína total) en piel de trucha 50
Tabla 15. Prueba Tukey para los tratamientos para rendimiento de colágeno (g colágeno/ g proteína total) en piel de trucha 51
Tabla 16. Rendimiento de colágeno de huesos de trucha 53
Tabla 17. Análisis de varianza para el rendimiento aparente de colágeno de huesos 54 Tabla 18. Análisis de varianza (SC tipo III) en los tratamientos para rendimiento aparente en huesos de trucha 54
Tabla 19. Prueba Tukey para los tratamientos para la extracción de colágeno aparente en huesos de trucha 55
Tabla 20. Análisis de varianza para el rendimiento de colágeno en términos de hidroxiprolina de huesos de trucha 56
Tabla 21. A nálisis de varianza (SC tipo III) para los tratamientos para el rendimiento de colágeno (g colágeno/ g proteína total) en huesos de trucha 57
Tabla 22. Prueba Tukey para los tratamientos para el rendimiento de colágeno (g colágeno/ g proteína total) en huesos de trucha 57 Tabla 23. Composición químico proximal de colágeno de piel y huesos de trucha 59 Tabla 24. Composición de aminoácidos de colágeno de piel tratamiento PC3T1 60 Tabla 25. Composición de aminoácidos de colágeno de hueso tratamiento HC2T2 61 Tabla 26. Análisis microbiológico para colágeno 65 Tabla 27. Análisis físico para colágeno 66 Tabla 28. Absorbancia obtenidos para la curva patrón de hidroxiprolina 74
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 16
Figura 2. Venta interna de recursos hidrobiológicos 2020 20
Figura 3. Exportación de trucha por continente 2020 20
Figura 4. Secuencia de aminoácidos en el colágeno 21
Figura 5. Contenido aproximado de colágeno en diferentes tejidos 22
Figura 6. Curva de fusión del colágeno 23
Figura 7. Estructura del colágeno 24
Figura 8. Formula estructural de la prolina y la hidroxiprolina 25
Figura 9. Formula estructural de la glicina 25
Figura 10. Formula estructural de la prolina 26
Figura 11. Tamaño de mercado de colágeno 2018 – 2024 29
Figura 12. Recepción de materia prima (huesos) 30
Figura 13. Recepción de materia prima (piel) 31
Figura 14. Recepción de materia prima (piel) 31
Figura 15. Metodología propuesta para la extracción de piel y huesos de trucha 36
Figura 16. Gráfica de barras de medias para rendimiento aparente en piel 49
Figura 17. Gráfica de barras de medias para rendimiento de colágeno en piel 52
Figura 18. Gráfica de barras de medias para rendimiento de colágeno aparente en huesos 56
Figura 19. Gráfica de barras medias para rendimiento de colágeno en huesos 58
Figura 20. Electroferograma de colágeno de piel y hueso de trucha extraído en medio enzimático 64
Figura 21. Curva patrón para la cuantificación de hidroxiprolina en las muestras de colágeno 75
RESUMEN
La Trucha (Oncorhynchus mykiss) es una especie de gran importancia comercial, el consumo genera residuos sólidos de vísceras, huesos, piel, cabeza y aletas, que no son reutilizados y existen pocos estudios de investigación sobre la obtención por métodos enzimáticos de colágeno de piel y cartílago de huesos de truchas, como una alternativa de manejo y disposición y al uso de piel de ganado vacuno y porcino por los riesgos sanitarios de estas especies terrestres. El objetivo de investigación fue determinar la concentración de pepsina y tiempo de extracción de colágeno y su rendimiento. Las muestras fueron acondicionadas, se lavó y desinfectó con hipoclorito de sodio en 250 ppm, se cortó en tamaños de 0,5 cm x 0,5 cm para piel y 0,5 cm de largo para huesos. La extracción de colágeno de piel y huesos fue por separado y en la etapa de tratamiento enzimático, se utilizó pepsina de 0,0375 %, 0,075 % y 0,15 % w/v y tiempos de 3 h y 25,5 h para piel, y para huesos se varió el tiempo 6 h y 51 h. Se aplicó el diseño completo al azar, los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza con un nivel de significancia del 5 %. El tratamiento 5, PC3T1 (0,15 % de pepsina y 3 h) presento el mayor rendimiento de colágeno (g colágeno/ g proteína total) de piel con una diferencia significativa de p ≤ 0,05, mientras que para huesos no hubo diferencia estadística significativa entre tratamientos. Finalmente, el colágeno fue analizado fisicoquímica y microbiológicamente.
Palabras claves: colágeno, pepsina, hidroxiprolina, punto de fusión, viscosidad.
I. INTRODUCCIÓN
La trucha es un pez de agua dulce, resistente y de fácil crecimiento, es capaz de habitar diferentes medios, la temperatura óptima para su cultivo es por debajo de los 21 °C, por ello la temperatura y disponibilidad de alimento predominan en su crecimiento y maduración, haciendo que su edad de madurez varie (Food and Agriculture Organization [FAO], 2009).
La producción nacional de truchas fue de 54269 t (Ministerio de la producción [PRODUCE], 2021) y el consumo nacional de recursos hidrobiológicos en el año 2020 fue del 86,6
% de trucha, 4,4 % de paco, 3,7 % de tilapia, 1,6 % de langostino, 0,5 % concha de abanico y 3,1 % de otras especies (PRODUCE, 2021). Dado que hay mayor demanda de los consumidores por el filete generan aproximadamente el 30 % de residuos, que consisten en piel y huesos (Gómez-Guillén, et al., 2002), que no son reutilizados, más por el contrario contaminan el medio ambiente, los criadores y productores de trucha en la región y en el país desconocen el manejo y disposición de los residuos biológicos (vísceras, piel, huesos, aletas, cabeza, etc.) de las truchas comerciales, incluso aplican prácticas indebidas como el uso, de estos residuos, para la alimentación de perros y cerdos, alimento para truchas en estanque contaminando el agua, o desechados en los contenedores de basura o enterrados en el suelo, todas estos hechos conllevan a la contaminación ambiental.
Lleren y Rodríguez (2017), mencionan que los residuos de pescado constituyen alrededor del 50 % de la materia prima. Para las industrias tradicionales de procesamiento de recursos hidrobiológicos, los residuos sólidos que producen crean problemas de eliminación.
Jafari, et al. (2020) dicen, que el colágeno es la proteína estructural más abundante en la matriz extracelular de los diversos tejidos conectivos del cuerpo; es decir, piel, huesos, ligamentos, tendones y cartílago. El colágeno es una estructura única de triple hélice, en el cual sus características moleculares obedecen a la repetición constante de glicina seguida de prolina e hidroxiprolina (Martínez-Ortiz, et al., 2015). Los residuos de pescado son una fuente importante de colágeno, que se puede utilizar como sustitución de las fuentes de mamíferos. Al respecto Ahmad y Benjakul (2010) mencionan, con los procesos tradicionales se obtiene un bajo rendimiento de colágeno, dado que se ha informado que la pepsina escinde péptidos en la región telopeptídica, la extracción de colágeno parcialmente escindido por la pepsina da como resultado un mayor rendimiento.
Existen pocos estudios de investigación referido a la obtención de colágeno de piel y cartílago de huesos de truchas, mediante extracción de colágeno en medio ácido y enzimático (pepsina), siendo esto una alternativa de manejo y disposición de estos residuos.
La investigación es un trabajo experimental explicativo donde se evaluó el rendimiento en la extracción de colágeno usando diferentes concentraciones de pepsina y diferentes tiempos de extracción en residuos de trucha (piel y huesos), mediante el método ácido-enzimático; además, las muestras fueron tratadas por separado y se desarrolló en tres etapas, la primera, de acondicionamiento y análisis fisicoquímico de la muestra inicial, en la segunda etapa se realizó la extracción de colágeno donde la muestra fue sometida a las variables independientes y en la tercera etapa se analizaron las variables dependientes en relación a las variables independientes.
Por ello, la investigación busca darles un valor agregado a los residuos de trucha con la obtención de colágeno por método ácido-enzimático; el cual, tendrá un impacto significativo en el ámbito ambiental, comercial y económico.
Objetivo general:
• Evaluar el efecto de la pepsina en el rendimiento de obtención de colágeno (g colágeno/g proteína total) a partir de residuos biológicos de trucha.
Objetivos específicos
• Determinar el rendimiento de extracción de colágeno (rendimiento aparente) a diferentes tiempos de agitación y concentración de pepsina.
• Caracterizar las propiedades químicas (químico proximal, composición de aminoácidos y peso molecular del colágeno), microbiológica y físicas (viscosidad y punto de fusión) del colágeno obtenido con mayor rendimiento (g colágeno/g proteína total) en piel y huesos.
Hipótesis
• Ho: con la adición de pepsina en la extracción se incrementa el rendimiento en la obtención de colágeno a partir de piel y cartílago de huesos (residuos) de trucha.
• Ha: no se evidencia incremento del rendimiento en la obtención de colágeno a partir de piel y cartílago de huesos de trucha con la adición de pepsina.
II. MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES
Quintero y Zapata (2017) evaluaron el efecto de temperatura y concentración del agente hidrolizante en la extracción de colágeno soluble en acido a partir de tres regiones anatómicas de la tilapia roja (Orcochromis spp) escamas, espinas y pieles. Optimizaron el proceso de extracción aplicando dos diseños experimentales en cada matriz estudiada en las etapas de hidrolisis básica (NaOH) para la liberación de proteínas del tejido conectivo (PTC) e hidrolisis ácida (CH3-COOH) para la obtención del colágeno. Los resultados dieron a conocer que, a 25 °C y 0,4 M de NaOH en la hidrolisis básica, se obtiene la mayor liberación de PTC en las matrices estudiadas. Además, se pudieron alcanzar el máximo porcentaje de colágeno (% Cl) en la hidrólisis ácida con una solución 0,7 M de CH3-COOH y temperaturas de 18,5 °C, 11,0 °C y 21,5 °C para piel (0,88 %), escamas (2,16 %) y espinas (0,51 %), respectivamente.
En el 2017, Rodríguez et al. compararon 3 metodologías para la extracción de colágeno soluble en ácido de escamas de tilapia de Nilo (Oreochromis niloticus), el método M1 propuesto por Pati et al. (2010) con algunas modificaciones, en el cual hacen una desproteinización con NaCl 1 M, seguido de una desmineralización con EDTA 0,44 M y una extracción con ácido acético 0,5 M; el método M2 propuesto por Duan et al. (2009) lo realizaron con ligeras modificaciones, donde hacen la desproteinización con NaOH 0,1 M, después la desmineralización con EDTA 0,44 M y la extracción con ácido acético 0,5 M; por último el método M3 está basado en el propuesto por Duan et al. (2009), con varias modificaciones, en el cual inician con la desmineralización con EDTA 0.2 M, siguiendo con la desproteinización con NaOH 0,1 M, la extracción de hidroxiapatita con ácido cítrico 0,5 M y la extracción de colágeno con ácido cítrico 0,5 M. De ello destaca el método propuesto (M3); el cual, les permitió obtener la mayor cantidad de colágeno soluble en ácido (20,3 %) sobre los otros dos probados (11,9 y 13,9 % para M1 y M2 respectivamente).
Martínez-Ortiz et al. (2015) utilizaron ácido acético y pepsina para la extracción de colágeno soluble e insoluble, respectivamente de pieles de conejo. Los tratamientos se hicieron con ácido acético 0,5 M a pieles pretratadas cortadas en pequeños cuadrados de 1 cm2. El tratamiento enzimático les arrojó mayor cantidad de colágeno (71 %); también, caracterizaron este colágeno extraído, encontrando
a 36 °C aproximadamente la temperatura de desnaturalización en dos técnicas diferentes: reómetro y calorimetría diferencial de barrido (DSC). Sus resultados de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio les mostraron tres bandas diferentes que reflejaban dos cadenas alfa y una cadena beta con pesos moleculares de 102, 118 y 220 kDa, respectivamente.
La determinación de hidroxiprolina dio evidencia de que el material extraído era colágeno. Concluyeron que la piel de conejo podría ser una fuente alternativa para la extracción de colágeno (Martínez-Ortiz, et al., 2015).
2.2 BASES TEÓRICAS
2.2.1 Trucha
La Trucha (Oncorhynchus mykiss) es una especie de gran importancia comercial, con el mayor volumen de producción en el sector acuicultura en la región sur del Perú, especie epipelágica, se encuentran habitualmente en aguas frías y limpias de ríos y lagos, posee un cuerpo alargado, comprimido, engrosado en el centro y apuntado en la cabeza y la cola cubiertas con escamas (Figura 1). Es verde azulada, oscura en el dorso y blanca en el vientre.
Sus vetas son negras y la franja de sus flancos es naranja o rojiza (Quispe y Gutiérrez, 2019).
Figura 1
Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
Fuente: (Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos [JACUMAR], 2022)
2.2.1.1 Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica de la trucha según Mittani (2016) es la siguiente:
• Reino: Aninmalia.
• Sub reino: Metazoa
• Filo: Chordata.
• Subfilo: vertebrata.
• Clase: Osteichtyes
• Sub clase: Actinopterygii.
• Orden: Isospondyli
• Sub orden: Salmoneidei
• Familia: Salmonidae
• Género: Oncorhynchus
• Especie: Oncorhynchus mykiss
• Nombre común: Trucha arco iris 2.2.1.2 Composición química
García et al. (2004) evaluaron su composición química de trucha arco iris eviscerada y sin riñón, dividiéndolos en 3 grupos por su peso, estos son:
grupo 1 de 69,21 g a 195,06 g, grupo 2 de 205,32 g a 299,56 g y grupo 3 de 301,9 g a 479,5 g, los cuales se muestran en la tabla 1.
Tabla 1
Composición química de trucha arco iris
Variables Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
N 39 23 37
Proteína (%) 19,88 ± 0,18 19,95 ± 0,25 20,88 ± 0,19 Grasa (%) 2,70 ± 0,16 2,41 ± 0,20 2,57 ± 0,21 Humedad (%) 75,91 ± 0,34 75,69 ± 0,44 75,24 ± 0,26 Cenizas (%) 1,23 ± 0,01 1,25 ± 0,02 1,22 ± 0,01
pH 6,66 ± 0,02 6,67 ± 0,03 6,62 ± 0,02
Fuente: García et al. (2004)
2.2.1.3 Residuos de la trucha
Los residuos o subproductos de trucha conforman las partes del pez que no poseen un valor comestible y comercial, los cuales son: la cabeza, piel, aletas, huesos, escamas, vísceras y agallas.
Existen investigaciones relacionadas a la evaluación y utilización de residuos de pescado en la industria, informaron sobre obtención de colágeno, gelatina, aceite, entre otros.
García et al. (2004) determinaron el porcentaje de residuos de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) en 3 grupos por su peso, estos son: grupo 1 de 69,21 g a 195,06 g, grupo 2 de 205,32 g a 299,56 g y grupo 3 de 301,9 g a 479,5 g, los cuales se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Porcentaje de residuos de trucha arco iris
Variables (%) Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
N 39 23 37
Riñón 2,12 ± 0,10 1,61 ± 0,14 1,40 ± 0,08 Vísceras 12,39 ± 0,55 10,65 ± 0,51 10,37 ± 0,57
Piel 5,81 ± 0,11 6,41 ± 0,21 6,04 ± 0,13
Hueso 5,73 ± 0,16 5,78 ± 0,16 5,47 ± 0,13 Cola y aletas 5,96 ±0,09 5,76 ± 0,16 6,98 ± 0,09 Cabeza y agallas 11,41 ± 0,25 11,87 ± 0,27 11,95 ± 0,15 Merma 3,44 ± 0,15 2,67 ± 0,24 2,58 ± 0,14 Fuente: García et al. (2004)
2.2.1.4 Producción de trucha
La acuicultura en el Perú viene dando un acelerado incremento en la producción en los últimos años, siendo la trucha (Oncorhynchus mykiss) la principal especie acuícola que ha generado el crecimiento. Este crecimiento viene sostenido por una gran cantidad de recursos hídricos, especialmente en las zonas altoandinas; sin embargo, las condiciones ambientales beneficiosos para el cultivo de la trucha no garantizan su éxito, ello está relacionado con un mercado que acepte el producto y políticas públicas que permitan la difusión de esta actividad. (Zárate et al., 2018)
La trucha arco iris es una especie que se ha adaptado eficazmente a las zonas alto andinas y se viene criando a nivel comercial en toda la sierra peruana, predominando en su producción en el año 2020 las regiones de Puno, Pasco, Huancavelica y Junín (Tabla 3).
Tabla 3
Extracción de trucha por departamento en TM (2010-2020)
N° Región 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020
1 Amazonas 25 61 41 36 89 293 276 363 409 352
2 Ancash 128 136 659 82 79 86 79 82 89 52
3 Apurímac 36 54 75 90 104 125 153 157 182 135
4 Arequipa 137 140 142 166 105 19 92 96 74 65
5 Ayacucho 209 240 265 304 483 544 781 781 771 811 6 Cajamarca 294 329 328 175 75 139 162 182 186 183 7 Cusco 476 621 882 317 699 1124 1287 841 552 1311 8 Huancavelica 1122 1144 1222 1444 3387 3704 3454 4112 4321 5826 9 Huánuco 110 148 198 269 259 247 286 294 325 443 10 Junín 1967 3413 2127 1615 1778 2263 2687 3000 3198 2699
11 La Libertad 7 9 10 49 122 120 125 138 184 274
12 Lambayeque 1 6 11 8 8
13 Lima 83 128 197 220 253 372 476 679 724 363
14 Moquegua 1
15 Pasco 122 90 88 89 128 234 332 2800 7213 7728
16 Piura
17 Puno 15622 18510 29149 28311 34208 43337 46973 50949 32580 33986
18 San Martin 1 1 1 8 9 8 8 8 8 8
19 Tacna 21 47 37 68 52 33 37 37 84 32
Tot Al 20361 25077 35432 33252 41237 52647 57211 64517 50900 54269
Fuente: PRODUCE (2021)
2.2.1.5 Comercialización de trucha
Su comercialización se realiza tanto en el mercado nacional e internacional (figuras 2 y 3 respectivamente), otorgándole un reconocimiento a la calidad de la trucha que se produce en nuestro país.
Figura 2
Venta interna de recursos hidrobiológicos 2020
Fuente: PRODUCE (2021) Figura 3
Exportaciones de trucha por continente 2020
Fuente: PRODUCE (2021) 2.2.2 Colágeno
El colágeno es una proteína constituyente de los tejidos conjuntivos, se encuentran en la piel, los tendones y el hueso, es la proteína más abundante del organismo. Se caracteriza principalmente por su notable resistencia: una fibra de 1 mm de diámetro puede soportar una carga de 10 a 40 kg. El colágeno está constituido por un conjunto de tres cadenas polipeptídicas (1000 α-L- aminoácidos por cadena), agrupadas en una estructura helicoidal. La glicina
constituye la tercera parte de los aminoácidos de cada cadena, hecho único entre todas las proteínas del organismo. La repetición de 333 tripletes de forma Gly-X-Y preside la estructura de cada una de las cadenas como se observa en la figura 4. En posición X se encuentra, en la mayoría de los casos, la prolina; en posición Y, se encuentran la hidroxiprolina y la hidroxilisina, dos aminoácidos que no abundan en la constitución de las otras proteínas del organismo. Existen como mínimo cuatro tipos de colágeno genéticamente distintos, en función de la estructura de las cadenas polipeptídicas o cadenas alfa. La estructura helicoidal, responsable de la rigidez y la resistencia de las fibras, es específica de la molécula de colágeno (Prockop y Guzmán, 1981).
Figura 4
Secuencia de aminoácidos en el colágeno
Fuente: (Torres y Falconí, 2018)
Las importaciones de productos derivados de colágeno hidrolizado en el Perú, se han incrementado en un 110 % en el 2018 en comparación al 2017; ya que la necesidad de prevenir y mejorar el funcionamiento de las articulaciones, músculos, así como el cuidado de la piel se ha vuelto de vital importancia (Arker y Pujol, 1996).
Los peces poseen colágeno, el cual es producido principalmente por las células del tejido conectivo a los que aporta fuerza y elasticidad. Se encuentra
principalmente en la dermis, huesos, tendones (tipo I) y cartílagos (tipo II). Este compuesto evita la destrucción del colágeno de la piel por la disminución de producción de estrógenos, mejora la salud de piel, uñas y pelo, protege las articulaciones al estimular la síntesis de líquido sinovial, lo que ayuda a solucionar problemas reumáticos y evitar lesiones en deportistas (Sato et al., 1986).
El colágeno se encuentra en un 90 % en el hueso desmineralizado, 80 - 90 % en tendones, 50 – 70 % en piel, 50 – 70 % en cartílago y 10 – 25 % en arterias, todos expresados en base seca, como se muestra en la figura 5. El colágeno es la proteína más abundante en el cuerpo humano (representa el 25 % de la proteína corporal total) al elevarse la temperatura, se provoca la disociación de las fibrillas y separación de las hélices, obteniéndose cadenas de proteínas individuales, aunque conservan su estructura helicoidal; así como, se observa en la figura 6. Si se continúa calentando, se pierde la estructura helicoidal y se obtiene una estructura orientada al azar, en la que todas las cadenas interactúan, esta se conoce como gelatina (Primo, 1997).
Figura 5
Contenido aproximado de colágeno en diferentes tejidos
Fuente: (Jafari, et al., 2020)
Figura 6
Curva de fusión del colágeno
Fuente: (Primo, 1997) 2.2.2.1 Composición
Lehninger (1985) citado en Rosales y Gates (1990) manifiesta que la mayor parte de los colágenos contiene alrededor de 35 % de glicina, 11
% de alanina, 12 % de prolina y 9 % de hidroxiprolina.
El colágeno presenta alto contenido en glicina (20,6 %), prolina (11,2 %) es la única proteína que contiene las formas hidroxiladas de la prolina y Lisina, los aminoácidos presentes se pueden observar en la tabla 4 y su estructura en la figura 7.
Tabla 4
Aminoácidos presentes en el colágeno
Fuente: Ramírez-Guerra et al. (2013) Figura 7
Estructura del colágeno
Fuente: (Jafari, et al., 2020)
✓ Hidroxiprolina
Todas las proteínas son polímeros y los α-aminoácidos son los monómeros que se combinan para formarlas. Es de nuestro especial
Amino ácidos No Esenciales (%)
Glicina 20,60
Glutamato 12,60
Hidroxiprolina 11,40
Prolina 11,20
Arginina 8,20
Alanina 7,80
Aspartato 6,50
Serina 3,60
Hidroxilisina 1,20
Tirosina 0,60
Lisina 3,70
Leucina 2,90
Valina 2,50
Fenilalanina 2,00
Treonina 1,90
Isoleucina 1,20
Histidina 1,10
Metionina 0,80
interés la prolina, un aminoácido cíclico, que posee características similares a los aminoácidos alifáticos como la alanina y la glicina.
Las prolinas tienen la capacidad de modificarse químicamente un ensamblado en las proteínas, para convertirse en 4-hidroxiprolina, como se ilustra en la Figura 8 (Quispe y Gutiérrez, 2019).
Figura 8
Fórmula estructural de la prolina y la hidroxiprolina
Fuente: (Quispe y Gutiérrez, 2019).
✓ Glicina
La glicina es un α-L-aminoácido condicionalmente esencial. La glicina permite que la hélice de colágeno forme su estructura helicoidal única y su forma estructural la podemos observar en la figura 9 (Bravo y Murayari, 2019).
Figura 9
Fórmula estructural de la glicina
Fuente: Bravo y Murayari (2019)
✓ Prolina
La prolina es un aminoácido condicionalmente esencial y es el precursor de la hidroxiprolina. La fórmula estructural lo podemos observar en la figura 10 (Bravo y Murayari, 2019).
Figura 10
Fórmula estructural de la prolina
Fuente: Bravo y Murayari (2019) 2.2.2.2 Colágeno marino
Jafari et al. (2020), señalan que el colágeno marino, como de la piel, los huesos, los cartílagos y las escamas de pescado, incluidos los vertebrados marinos y las fuentes de invertebrados, son más biodisponibles en comparación con el colágeno bovino o porcino y tienen una mayor capacidad de absorción (hasta 1,5 veces más eficiente en el cuerpo) y más rápido circulación sanguínea debido a su bajo peso molecular y tamaño de partícula pequeño; además, los colágenos marinos son similares al colágeno bovino y porcino convencional, en términos de composición de α-L-aminoácidos y biocompatibilidad.
2.2.3 Métodos de extracción 2.2.3.1 Extracción ácida
De acuerdo a Jafari et al. (2020) la extracción por medio ácido es cuando el colágeno se extrae solo con ácido. Los ácidos (como ácido clorhídrico y ácido acético) hidrolizan la triple hélice del colágeno y solubilizan sus cadenas simples en solución. El ácido acético es el compuesto más usado para la extracción de colágeno.
2.2.3.2 Extracción enzimática
Jafari et al. (2020) mencionan que la extracción por medio enzimático, es la extracción de colágeno con una enzima que facilita el rompimiento de enlaces cruzados presentes en la hélice de colágeno. La extracción de ácido acético asistida por pepsina es el segundo método principal para la extracción de colágeno, que permite la ruptura de las regiones telopeptídicas de la triple hélice, lo que facilita la extracción de los péptidos de colágeno en solución y aumenta los rendimientos de extracción. Varios factores son importantes en la eficacia de los métodos de extracción por medio enzimático, como la concentración de enzima, el tiempo de hidrólisis y la relación sólido-líquido (S/L) en el colágeno solubilizado.
2.2.4 Propiedades físico-químicas y microbiológicas del colágeno 2.2.4.1 Punto de fusión
La temperatura o punto de fusión de una sustancia se define como la temperatura en la cual ésta se encuentra completamente fundida. Es una propiedad intrínseca de las sustancias, la cual es utilizada, junto a otros ensayos, para la confirmación de identidad de la misma; así como indicador de pureza (Barrenechea, 2019).
2.2.4.2 Viscosidad
Binsi et al. (2009) mencionan, la viscosidad depende de la concentración del gel y de la concentración de sólidos totales. El punto isoeléctrico de la gelatina obtenida por un proceso acido esta entre pH 7 y 9; si el valor del pH está cerca del punto isoeléctrico, la viscosidad y la hinchazón de la gelatina son bajas, la turbidez, la fuerza del gel y la sinéresis alta.
2.2.4.3 pH
Es importante el pH final; puesto que, cuando es bajo proporciona resistencia al desarrollo microbiano (Mittani, 2016).
2.2.4.4 Análisis proximales
De acuerdo con Chaves (2019), los análisis proximales permiten una determinación cuantitativa del contenido de humedad, cenizas, grasa, proteínas entre otros, como se describe a continuación:
• Contenido de humedad; se obtiene mediante la medición de pérdida de peso en una muestra.
• Contenido de cenizas; cuantifica la cantidad de materia inorgánica presente en la muestra.
• Contenido de grasa; mediante el uso de solventes se realiza la extracción y cuantificación de los componentes grasos presente en la muestra.
• Contenido de proteínas; cuantifica el contenido total de nitrógeno de la muestra.
2.2.4.5 Composición de aminoácidos
El colágeno es el único entre las proteínas debido a su composición inusual de aminoácidos. Se caracteriza por un alto contenido en aminoácidos cíclicos, prolina e hidroxiprolina que representan alrededor del 13 – 15 % del colágeno. También es rico en glicina y alanina, la cisteína está notablemente ausente (Anima, 1999).
2.2.4.6 Electroforesis
Chaves (2019) indica que, para analizar condiciones como la pureza e identidad de proteínas, se utiliza la electroforesis; además, que la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS- PAGE) genera una suspensión semisólida en agua y es posible obtener información sobre el peso molecular. El colágeno en su estado nativo presenta bandas por arriba de los 100 kDa.
2.2.4.7 Análisis microbiológico
Los criterios microbiológicos garantizan la calidad sanitaria e inocuidad de los alimentos y bebidas en estado natural, elaborados o procesados para ser apto para el consumo humano (Ministerio de la salud [MINSA], 2008).
2.2.5 Influencia en la producción de colágeno
Los parámetros de temperatura y tiempo de extracción son influyentes para obtener mayor rendimiento y fuerza de gel. La concentración del hidrolizante básico (NaOH) se considera para la liberación de proteínas del tejido conectivo
e hidrolisis acida (CH3-COOH) para la obtención del colágeno (Miano et al., 2014).
2.2.6 Usos y aplicaciones del colágeno
La aplicación de colágeno en la industria farmacéutica y cosmética son importantes, se utiliza para el tratamiento de arrugas, a partir de los 25 años se va perdiendo colágeno del organismo humano esto va produciendo señales de envejecimiento; además, se usa para la elaboración de medicamentos y parches para la curación de heridas, se usa en la elaboración de inyecciones subcutáneas, geles, mascarillas, lociones y cremas ya que el complemento alimenticio penetra hasta las capas más profundas de la piel, porque los aminoácidos que componen el colágeno son adsorbidos y utilizados para la renovación del tejido. Además, el colágeno se usa como complemento nutricional de uso oral, como bebidas refrescantes, galletas o aditivos.
(Serrano, 2011)(Torres y Falconí, 2018).
La industria de los cosméticos según Aqua pacífico (2019), es la de mayor tamaño, 262 millones de dólares el 2018 con un crecimiento compuesto proyectado del 7,6 % para el periodo hasta el año 2024. Le sigue la industria de los nutracéuticos como se muestra en la figura 11.
Figura 11
Tamaño de mercado de colágeno 2018 - 2024
Fuente: (Aqua pacífico, 2019)
III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Lugar de ejecución
El trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio del INNOVATREN y el Laboratorio de Química de Alimentos de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias FAIIA - UNCP.
3.2 Tipo de investigación
a. Tipo de investigación: Experimental b. Nivel de Investigación: Explicativo 3.3 Materia prima
La materia prima que se utilizó fue la piel y los huesos de trucha (Oncorhynchus mykiss) de un peso aproximado de 200 a 250 g, recolectados de la entidad APRODETRUCHA del distrito de Moya, provincia de Huancavelica, departamento de Huancavelica.
Figura 12
Recepción de materia prima (huesos)
Fuente: Elaboración propia
Figura 13
Recepción de materia prima (piel)
Fuente: Elaboración propia Figura 14
Recepción de materia prima (piel)
Fuente: Elaboración propia
3.4 Equipos e instrumentos, materiales y reactivos 3.4.1 Equipos e instrumentos
• Agitador magnético CAT M de 2 a 1600 rpm.
• Agitador orbital Daihan scientific, modelo SHO-2D.
• Agitador vórtex con velocidad regulable en rpm, marca Daihan scientific, modelo MaXshake VM30.
• Autoclave Gemmy, modelo SA-232X
• Balanza analítica de marca Ohaus, modelo PX224/E.
• Baño maría Daihan scientific.
• Campana desecadora.
• Centrifuga con temperatura y velocidad regulable 1000 – 6000 rpm de marca Centurion scientific, modelo C2006.
• Congeladora Coldex, modelo CH10.
• Determinador de punto de fusión Daihan scientific MP360D.
• Destilador de agua Daihan scientific, modelo CWS-4.
• Equipo soxhlet.
• Espectrofotómetro UV-VIS con una celda, marca thermo scientific, modelo genesys 30.
• Estufa marca Daihan scientific, modelo OF-50.
• Incubadora Memmert, modelo IN55.
• Medidor multiparámetro AZ, modelo 86031.
• Mufla Daihan scientific.
• pH metro de mesa Ohaus, modelo ST3100.
• Refrigeradora de marca Samsung, modelo RT29K571JS8.
• Viscosimetro marca Guoming, serie ND2 bloom viscosity tester 3.4.2 Materiales
• Bombilla de succionador.
• Buretas de 50 mL.
• Capsulas de porcelana.
• Celdas para espectrofotómetro.
• Cucharas.
• Cuchillo.
• Crisoles.
• Embudos de vidrio.
• Frascos de color ámbar.
• Fiolas de 10, 25, 50, 100, 250 y 500 mL.
• Gradilla
• Mallas de plástico de 0.5 mm.
• Matraces de 1000 y 2000 mL.
• Matraz con tapa rosca de 250 mL.
• Micropipetas de 100, 1000 y 10000 µL.
• Mortero.
• Papel aluminio.
• Papel toalla.
• Papel Whatman N° 42.
• Pinzas de metal.
• Pipetas de 5 y 10 mL.
• Placas de Petri.
• Probetas de 10, 25, 250 y 500 mL.
• Tabla de corte de material acrílico.
• Tips para 100, 1000 y 10000 µL.
• Tubos de ensayo de 10 mL.
• Tubos falcón de 25 y 50 mL
• Varilla de vidrio.
• Vasos de precipitado de 250, 600, 1000 y 2000 mL.
3.4.3 Reactivos
• Hidróxido de sodio p.a,
• Acetato de sodio trihidratado p.a.
• Ácido acético p.a
• Ácido cítrico p.a.
• Ácido clorhídrico p.a.
• Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), p.a
• Acido perclórico p.a.
• Cloramina T p.a.
• Etanol p.a.
• Hexano p.a.
• Hidroxi L-prolina p.a.
• Metanol p.a.
• Propanol p.a.
• p-dimetilaminobenzaldehído p.a.
• Placas petrifilm
• Peptona
3.4.4 Enzima
• Pepsina de grado analítico, marca Sigma aldrich - Merk
3.5 Proceso de extracción del colágeno
Las muestras fueron tratadas por separado (piel y espinas) y se desarrollaron en 3 etapas. En la primera etapa se realizó el acondicionamiento y el análisis fisicoquímico de la muestra inicial, en la segunda etapa se realizó la extracción de colágeno donde la muestra fue sometida a las variables independientes y en la tercera etapa se analizaron las variables dependientes en relación a las variables independientes y se realizó el análisis fisicoquímico y microbiológico.
3.5.1 Primera etapa
En esta etapa, se realizó el análisis químico proximal de piel y de huesos de trucha, para los análisis se utilizó métodos analíticos oficiales:
• Humedad, AOAC 934.01 (2012).
• Cenizas, AOAC 942.05 (2012).
• Grasa por método Soxhlet con hexano, AOAC 920.39 (2012).
• Proteínas por método Kjeldahl, AOAC 954.01 (2012).
Así mismo se realizó el análisis de pH de la piel y huesos, para el cual se utilizó el pHmetro de mesa Ohaus.
Para el acondicionamiento antes de la extracción se lavó la piel y huesos de trucha de forma independiente para eliminar residuos como sangre y músculo, después se realizó la desinfección con hipoclorito de sodio a 250 ppm y se guardó en congelación hasta su uso. Antes de su uso se descongeló en refrigeración a 4 °C por 24 h, y se trozó la piel en pedazos de 0,5 cm x 0,5 cm y el hueso en 0,5 cm de largo.
3.5.2 Segunda etapa
La extracción de colágeno se propuso mediante el diseño completo al azar de acuerdo al método descrito por Martínez-Ortiz et al. (2015) en el caso de piel y el de Quintero y Zapata (2017) para el caso de huesos, en ambos métodos de extracción se realizó algunas modificaciones, el tiempo de extracción de colágeno de piel de truchas fue de 3 h a 25,5 h y de 6 h a 51 h para huesos, para la extracción de colágeno de piel y de hueso, se utilizó pepsina (enzima proteolítica) de 0,0375 % a 0,15 % (w/v). El proceso de extracción de colágeno se hizo después de ser descongeladas a 4 °C por 24 h y trozadas a 0,5 cm x 0,5 cm para piel y 0,5 cm de largo para huesos como se muestra en la figura 15.
Figura 15
Metodología propuesta para la extracción de piel y huesos de trucha
LAVADO Y DESINFECTADO NaCIO
250ppm
TROZADO Piel: 0.5 x 0.5 cm Hueso: 0.5cm de largo
DESCALCIFICADO (Huesos)
180rpm 1:5 (w/v) t= 48h EDTA 0.5M pH 8
H2O LAVADO pH neutro
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
(piel)
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA CH3-COOH 0,5M
ENZIMA: PEPSINA 225rpm
Tamb1:10 (w/v)
225Rpm Tamb1:10 (w/v) CH3-COOH 0,5M
ENZIMA:PEPSINA
FILTRADO Residuo de muestra (piel y huesos) PRECIPITADO
CENTRIFUGADO
SECADO T=4°C
t=48h
ALMACENADO T=4°C
RECEPCIÓN (Piel y huesos)
NaOH 1M
Sobrenadante HIDROLISIS
BÁSICA (Huesos)
NaOH 0,4 M 180rpm
1:5 (w/v) t= 24h LAVADO
H2O pH neutro
Fuente: Elaboración propia
a) Hidrólisis básica
Este proceso de hidrólisis se realizó a los huesos, por el tejido muscular adherido que se encontró; el cual, afecta en la extracción de colágeno. Se utilizó una solución de hidróxido de sodio 0,5 M en proporción muestra:
solución de 1:5 (w/v) durante 24 h con una agitación de 180 rpm a temperatura ambiente.
b) Lavado
Se desechó la solución de la hidrolisis básica y se realizó el lavado de los huesos con agua destilada hasta obtener un pH neutro en el agua del lavado, con lo cual se eliminó el exceso de NaOH utilizado en el proceso anterior.
c) Descalcificado
Se realizó a los huesos por su contenido de calcio que afecta la pureza del colágeno. Se utilizó una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M a pH 8 en proporción muestra: solución de 1:5 (w/v) durante 48 h a temperatura ambiente y con una agitación de 180 rpm.
d) Lavado
Se realizó el lavado de los huesos ya descalcificados con agua destilada hasta obtener un pH neutro en el agua del lavado, con lo cual se eliminó el exceso de EDTA adherido a los huesos. El lavado también nos ayudó a acondicionar los huesos para el siguiente tratamiento en medio ácido.
e) Hidrólisis enzimática
La piel acondicionada (picada de 0,5 cm x 0,5 cm) y los huesos tratados fueron sometidos por separado con una solución de ácido acético 0,5 M, en una proporción muestra: solución de 1:10 (w/v), además a una concentración de pepsina según los tratamientos propuestos (Tabla 6 y 7) y luego se agitó a 225 rpm y temperatura ambiente, por un tiempo de 3 h y 25,5 h para piel y 6 h y 51 h para huesos.
f) Filtrado
Finalmente, el tratamiento en ácido acético se filtró con tela de fibra de algodón con un embudo de vidrio. El sobrenadante se recuperó tanto de huesos como de piel por separado y los residuos se eliminaron.
g) Precipitado
Posteriormente, a la solución ácida se le adicionó una solución al 1 M de NaOH, hasta pH 7, con lo cual se logró precipitar el colágeno obtenido de hueso y piel por separado, se dejó sedimentar por 45 minutos y se eliminó el sobrenadante.
h) Centrifugado
El precipitado de piel y huesos fue centrifugado a 6000 rpm por 20 min, en tubos falcón de 50 mL a temperatura de 4 °C, para acelerar el proceso de precipitación y así eliminar el reactivo en el sobrenadante.
i) Secado
El colágeno obtenido por separado de piel y huesos fue secado en placas Petri en refrigeración a 4 °C por 48 h; después de ello, se molió para poder almacenarlo.
j) Almacenado
El colágeno obtenido se guardó en un envase de plástico herméticamente cerrado en refrigeración para evitar la ganancia de humedad y su análisis posterior.
3.5.3 Tercera Etapa
3.5.3.1 Cálculo del rendimiento aparente
El rendimiento del proceso de obtención de colágeno es un cociente entre la masa del residuo de trucha ingresados al proceso y la masa de colágeno extraído y se representa como la siguiente formula descrita por Binsi et al.
(2009):
𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑤𝑐𝑜𝑙á𝑔𝑒𝑛𝑜
𝑤𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜 𝑥 100%
Donde:
w colágeno: Peso (gramos) de colágeno seco extraído w residuo: Peso húmedo (gramos) de los residuos de trucha
utilizados.
3.5.3.2 Cuantificación de hidroxiprolina
Para la cuantificación de hidroxiprolina de las muestras se usó 2 metodologías, la descrita por Quintero y Zapata (2017) para la hidrólisis que fue con HCl 6 M y la segunda por Reddy y Enwemeka (1996) para la cuantificación propiamente dicho, después se midió la absorbancia a 563 nm.
3.5.3.3 Análisis fisicoquímico: punto de fusión y viscosidad de colágeno y pH
a) Punto de fusión, se utilizó el equipo analítico Daihan scientific MP360D;
para el cual, se aseguró encender la luz del visor y la temperatura para el calentamiento del equipo. 1 mg de la muestra de colágeno fue colocado en el capilar de vidrio de alta resistencia a la temperatura. En el equipo se regula la temperatura y velocidad de ajuste. En seguida se coloca los capilares de vidrio con la muestra en el dispositivo del equipo y se procede con el calentamiento hasta que la temperatura funda el colágeno en forma total y esto se visualiza por el visor. Inmediatamente se realiza la lectura de la temperatura registrada en la pantalla del equipo y el punto de fusión es reportado en grados Celsius (°C).
b) La viscosidad, expresa la facilidad que tiene un fluido para fluir cuando se aplica una fuerza externa, esta de determinó con el instrumento Bloom viscosity tester ND – 2; para el cual, 6,67 % de colágeno en polvo fue solubilizado con ácido acético al 0,1 M, y seguidamente se completó a 120 ml con agua destilada, y se llevó a calentamiento a 61 °C, el capilar del viscosímetro fue sumergido en baño de agua a 60 °C. Se adicionó el colágeno solubilizado en el capilar y se dejó fluir y automáticamente mediante sensores fue registrado el flujo y el tiempo de la muestra en estudio. El reporte de la viscosidad determinada, fue en unidades de mPa.s (Ahmad y Banjakal, 2010).
c) pH, pH de la piel, para el cual se utilizó el pHmetro de mesa Ohaus.
3.5.3.4 Análisis químico proximal de colágeno
Se realizó el análisis químico proximal al colágeno extraído de piel y de huesos de trucha, para los análisis se utilizó métodos analíticos
oficiales:
• Humedad, AOAC 934.01 (2012).
• Cenizas, AOAC 942.05 (2012).
• Grasa por método Soxhlet con hexano, AOAC 920.39 (2012).
• Proteínas por método Kjeldahl, AOAC 954.01 (2012).
3.5.3.5 Composición de aminoácidos del colágeno, determinado por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)
Esta técnica se utiliza porque permite separar mezclas, purificar y cuantificar sus componentes; en la cromatografía liquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La separación cromatográfica es el resultado de las interacciones especificas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria, así se determinó el perfil de aminoácidos del colágeno extraído de cada una de nuestras materias por separado.
3.5.3.6 Análisis de electroforesis de colágeno
Se realizó con el método propuesto por Laemmli (1970) citado en Zhang et al. (2011), donde se usó gel de apilamiento al 4 % y gel de resolución al 8
%. Se basa en la separación de las proteínas cargadas catiónica o aniónica en un gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PG – SDS) en un campo eléctrico con electrodos de carga opuesta (Smith y Nicolas, 1983).
De esta manera se puede identificar las proteínas en relación a su peso molecular. Asimismo, sirve para determinar la pureza de la proteína aislada de la matriz.
3.5.3.7 Análisis microbiológico
Se realizó al colágeno extraído con mayor rendimiento en piel y huesos por separado de acuerdo a la norma sanitaria que establece los criterios
microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad de alimentos y bebidas de consumo humano (MINSA, 2008), se tomó en cuenta el análisis microbiológico para gelatina que es similar al colágeno:
• Coliformes (ufc/g)
• Staphylococcus aureus (ufc/g)
• Mohos (ufc/g)
3.6 Diseño experimental estadístico
Se planteó un diseño completo al azar para la extracción de colágeno por separado de piel y de hueso; para el cual, se evaluó el efecto de la pepsina en diferentes concentraciones y tiempo de acción de la enzima como se observa en la tabla 5. Se probó 6 tratamientos por cada residuo de trucha, tal como se muestra en las tablas 6 y 7; en seguida, se realizó un análisis de varianza con un error al 5 % para determinar las diferencias significativas entre tratamientos, es decir el efecto de la concentración de pepsina y tiempo de catálisis de la enzima en medio ácido.
Tabla 5
Niveles de los factores para el diseño
Residuo Factor Hidrólisis ácida
Nivel inferior Nivel superior Piel Concentración de
pepsina
0,0375 0,15
tiempo 3 25,5
Huesos Concentración de pepsina
0,0375 0,15
tiempo 6 51
Fuente: Elaboración propia
En la tabla 6, se muestra los tratamientos en la hidrólisis enzimática en medio ácido para la obtención de colágeno de piel.
Tabla 6
Tratamientos para la obtención de colágeno de piel N° Tratamiento Concentración de
pepsina (%) Tiempo (h)
1 PC1T1 0,0375 3
2 PC1T2 0,0375 25,5
3 PC2T1 0,075 3
4 PC2T2 0,075 25,5
5 PC3T1 0,15 3
6 PC3T2 0,15 25,5
Fuente: elaboración propia
En la tabla 7, se muestra los tratamientos en la hidrólisis enzimática en medio ácido para la obtención de colágeno de huesos.
Tabla 7
Tratamientos para la obtención de colágeno de huesos
Fuente: elaboración propia
Se utilizó el programa InfoStat (versión estudiantil) para el análisis estadístico.
a. Variables Dependientes:
• Rendimiento de colágeno
• Contenido de hidroxiprolina
N° Tratamiento Concentración de
pepsina (%) Tiempo (h)
1 HC1T1 0,0375 6
2 HC1T2 0,0375 51
3 HC2T1 0,075 6
4 HC2T2 0,075 51
5 HC3T1 0,15 6
6 HC3T2 0,15 51
b. Variables Independientes:
• Tiempo (h)
• Concentración de enzima. (%) c. Variable interviniente:
• Temperatura de extracción: temperatura ambiente
• Relación sustrato/ solución en la extracción: 1:10
• pH del medio de extracción: 2,5 - 3,0
• Precipitación: NaOH 1 M Modelo estadístico
𝑌𝑖 = 𝜇 + T𝑖 + 𝑒𝑖 … (1) 𝑌𝑖: Rendimiento en el contenido de colágeno.
𝜇: Efecto de la media general.
Ti = Efecto del i-ésimo tratamiento i = 1, 2, 3, 4, 5 y 6 𝑒𝑖: Efecto del error aleatorio.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 Análisis fisicoquímico de piel y hueso de truchas Tabla 8
Análisis fisicoquímico de piel y hueso fresco de trucha
Composición Piel (%) Huesos (%)
Humedad (%) 67,0 ± 0,21 50,16 ±0,201
Grasa (%) 5,52 ± 0,18 19,55 ± 0,15
Proteína (%) 25,8 ± 0,32 9,2 ±0,06
Ceniza (%) 1,5 ± 0,08 11,1 ± 0,1
Ph 7,38 ± 0,05 7,12 ± 0,09
Fuente: Elaboración propia
En la tabla 8, se observa que la humedad en piel de trucha es 67 % y en huesos 50,16 %, Nollet (2004) dice que la determinación de secado en estufa se basa en la pérdida de peso de la muestra por evaporación del agua y que el principio operacional del método de determinación de humedad utilizando estufa y balanza analítica, incluye la preparación de la muestra, pesado, secado, enfriado y nuevamente pesado de la muestra, método utilizado en la presente investigación lo cual significa que se obtuvo resultados confiables. En la piel se observa mayor contenido de humedad respecto al hueso, esto debido a su propia naturaleza. El contenido grasa en huesos es 19,55 % mayor que en el caso de piel 5,52 %, esto debido a que restos de carne quedan adheridos al hueso y componentes de la médula ósea. En el contenido de proteínas es mayor en piel con un 25,8 % que en huesos un 9,2 %. El contenido de ceniza en piel fue de 1,5 % mientras que en el hueso 11,1 % debido a su naturaleza, en gran parte por su alto contenido de calcio que le suministra la dureza. El pH en la piel de trucha fue de 7,38 y en el hueso 7,12.
Solari y Córdova (2015) determinaron la humedad de residuos de anchoveta (espinazos, espinas, escamas), obteniendo 62,8 % de humedad, mayor a lo reportado en huesos de trucha determinado.
Lee et al. (2016) evaluaron la humedad, grasa, proteína y cenizas de piel de trucha de mar y de trucha de agua dulce, con un peso de 0,9 a 1,0 kg, el cual
reporta 74,2 % y 75,3 % respectivamente en contenido de humedad, mayor a lo reportado en el presente proyecto, en contenido de grasa reportan 3,3 % y 3,6
% respectivamente, ello muestra que las truchas evaluadas tenían menor contenido de grasa que las de esta investigación, además en el contenido de proteínas dieron como resultado 22,4 % en trucha de mar y 21,2 % en trucha de agua dulce, los cuales son menores a lo observado en esta investigación, por último su contenido de cenizas dan como 0,3 % y 1,0 % respectivamente, estos son menores a los determinados en el proyecto.
García et al. (2004) evaluaron el pH a la carne de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) del estado de Chihuahua, las truchas los dividieron en tres grupos de acuerdo a su peso, grupo 1: de 69,21 a 195,06 g, grupo 2: de 205,32 a 299,56 g y el grupo 3 de 301,90 a 479,50 g, dando como resultado un pH de 6,66 para el grupo 1, 6,67 para el grupo 2 y 6,62 para el grupo 3, resultados menores a los obtenidos en esta investigación, esto puede deberse a diversos factores, como la edad del animal, la estación del año, el estado metabólico en el momento de la muerte, el estado nutricional o el estrés post mortem. Además Ortiz y Aubourg (2014) reportan que el pescado después del post mortem tiene un pH inicial promedio de 7, debido a la acumulación de ácido láctico; varía de acuerdo a la formación de compuestos básicos (amino y aminas) que se genera por la actividad de microorganismos y Mittani (2016) señala que un pH elevado puede ser producido por un estrés ante mortem, casi siempre de naturaleza prolongada como la captura, también menciona que el incremento de pH es a consecuencia de una mayor concentración de amonio compuesto, otras moléculas alcalinas y debido a la capacidad amortiguadora del músculo del pescado.
4.2 Rendimiento de colágeno 4.2.1. Piel
Tabla 9
Rendimiento de colágeno de piel de trucha N° Tratamiento Rendimiento
aparente (%) *
g Colágeno/ g proteína total
1 PC1T1 2,0307 ± 0,006 5,8785 ± 0,006
2 PC1T2 3,7678 ± 0,003 6,6022 ± 0,588
3 PC2T1 2,9894 ± 0,012 6,0742 ± 0,231
4 PC2T2 2,9980 ± 0,017 6,2370 ± 0,327
5 PC3T1 2,3662 ± 0,000 18,3081 ± 0,512
6 PC3T2 3,6277 ± 0,003 5,6534 ± 0,253
* g de muestra obtenida de la extracción por 100g de piel.
Fuente: Elaboración propia
La tabla 9, muestra el rendimiento de colágeno de piel de trucha extraído en la hidrólisis enzimática en medio ácido; en el cual, se observa que como rendimiento aparente (g de muestra obtenida de la extracción por 100g de piel), el mayor rendimiento es el tratamiento PC1T2 con 3,7678 %, en el cual se utiliza una concentración de pepsina de 0,0375 w/v y un tiempo de extracción de 25,5 h, pero el rendimiento real en base a la hidroxiprolina (g colágeno/ g de proteína total), el mayor rendimiento da el tratamiento PC3T1 con 18,3081 %, donde se utiliza una concentración de pepsina de 0,15 w/v y un tiempo de extracción de 3 h, esto debido a que la pepsina ayuda a hidrolizar la estructura molecular de la piel de trucha y por consiguiente el aislamiento del colágeno se incrementa en medio ácido; sin embargo, en el tratamiento PC3T2 donde se usa una concentración de pepsina de 0,15 w/v y 25,5 h de tiempo de extracción el rendimiento real disminuye a un 5,6534 %, debido a que la pepsina en un mayor tiempo de extracción hidroliza el colágeno, eliminándose así colágeno en el sobrenadante del filtrado.
Ahmad y Benjakul (2010), extrajeron colágeno solubilizado con pepsina (PSC) de la piel de chaqueta de cuero de unicornio (Aluterus monócero), utilizando ácido acético 0,5 M en presencia de pepsina de atún blanco, atún aleta amarilla y pepsina porcina a un nivel de 20 unidades/ g de piel desengrasada, donde obtuvieron rendimientos de 8,48 %, 8,40 % y 7,56 % (en peso húmedo) respectivamente, resultados que son menores a los obtenidos en piel de trucha
