Caracterización de las partículas pseudovirales de la TEV CP

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Una vez confirmada la obtención de las partículas pseudovirales del virus del jaspeado del tabaco autoensambladas a partir la proteína recombinante His-TEV-CP, se evaluaron los siguientes parámetros fisicoquímicos y biológicos: i) Distribución en tamaño de las VLPs en solución, ii) Efecto del pH de la solución en el patrón de absorción de luz de las VLPs, y iii) Presencia/contenido de ácidos nucleicos en las preparaciones puras de las VLPs. Los resultados se describen a continuación.

Para confirmar la distribución en tamaño de las partículas pseudovirales autoensambladas a partir de la proteína recombinante His-TEV-CP se realizó un ensayo de ultracentrifugación en gradiente (10 al 60%) de sacarosa. Las fracciones colectadas fueron cargadas en un gel SDS-PAGE (Figura 14). Se puede observar que las partículas en solución se encuentran a lo largo de todo el gradiente, indicando la presencia de agregados de diferente peso molecular. Para virus filamentosos de esta longitud no se encontraron valores de referencia respecto a la fracción donde se debe observar la mayor cantidad de partículas pseudovirales. Se observó una distribución mayor de partículas en la fracciones comprendidas entre el 20 y 40 % de sacarosa. Al final del gradiente se observa una baja proporción de partículas, lo cual indica la baja presencia de agregados insolubles de muy alto peso molecular. Los resultados indican la presencia de agregados proteicos de alto peso molecular, con una distribución en tamaño dispersa. En conjunto con las micrografías obtenidas, se confirma la obtención de las partículas pseudovirales de la TEV CP, versión His-TEV-CP.

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Figura 14. Análisis de sedimentación de una preparación pura de partículas pseudovirales ensambladas a partir de la proteína de la cápside del virus del jaspeado tabaco, versión His-TEV-CP. Se empleó ultracentrifugación en gradiente de sacarosa, del 10 al 60%, colectado en 11 fracciones y analizados mediante SDS-PAGE. Se

usó marcador de peso molecular de proteínas de amplio rango (Bio-Rad).

Respecto a la influencia del pH de las soluciones que contienen las partículas pseudovirales autoensambladas a partir de la proteína recombinante His-TEV-CP, las preparaciones puras de la versión His-TEV-CP fueron diafiltradas en diferentes buffers para obtener cuatro valores de estudio para pH (5, 6 ,7 ,8). El efecto del pH fue evaluado mediante un ensayo de espectrofotometría en el espectro UV-Vis (200-500 nm) para observar los cambios en el patrón de absorción de luz de las proteínas recombinantes de la His-TEV-CP (Figura 15).

El espectro de absorción obtenido es típico para proteínas, observando un aumento en la absorción en el rango cercano a los 280 nm. Este comportamiento es independiente del pH de la solución. Se puede observar que a pH 6, 7 y 8 las muestras presentan la misma magnitud en unidades de absorbancia a 280 nm. Sin embargo, a pH 5 las muestras presentan un aumento considerable en la magnitud de la absorbancia. Esto se puede deber a la presencia de agregados proteicos en solución por efecto del pH. Al inspeccionar las muestras de manera visual, se pudo notar la presencia de un precipitado insoluble en el fondo de un microtubo de ensayo en las muestras preparadas a pH, el cual se volvió notoriamente visible después de una hora de incubación a temperatura ambiente o incubación toda la noche a 4 °C. A pH 6, este efecto es visible después de unos días e

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incubación a 4 °C. A pH 7 y 8, las muestras no presentaron agregados visibles aun después de 6 semanas de almacenamiento a 4 °C. Lo anterior puede indicar la inestabilidad de las partículas pseudovirales de la TEV CP, versión His-TEV-CP, a valores de pH por debajo de 6. El pI teórico del monómero de la His-TEVCP es aproximadamente de 6.2 (CLC Main Workbench). Diversos estudios resaltan la habilidad de las partículas pseudovirales de varios virus, entre ellos virus de plantas, para responder a cambios de pH sin perder su estructura (Kalnciema, I. y cols., 2012 y Kalnciema, I. y cols., 2015). Los resultados obtenidos indican que las VLP autoensambladas a partir de la proteína His-TEV-CP son estables en el rango de pH fisiológico.

Figura 15. Espectro UV-Vis de una preparación pura de partículas pseudovirales ensambladas a partir de la proteína de la cápside del virus del jaspeado tabaco, versión His-TEV-CP, a diferentes pH en solución (pH 5 –

buffer citratos, pH 6 – buffer MES, pH 7 – buffer fosfatos, pH8 – buffer tris.

Para evaluar el contenido de ácidos nucleicos en las preparaciones puras de las partículas pseudovirales de la TEV CP, versión His-TEV-CP, se realizó un ensayo de movilidad electroforética en geles de agarosa (Figura 16). En las muestras procesadas en buffer TAE tratadas con y sin calor, se puede observar la presencia de ácidos nucleicos en los geles teñidos con SYBR Safe, sin embargo, en las muestras teñidas con azul de Coomasie no se identificó la presencia de proteínas en la muestra. En las muestras procesadas en buffer de

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Laemmli con SDS y tratadas con calor, se observó la presencia de una banda definida de ácidos nucleicos y una banda definida de proteínas, en los geles respectivos para identificar cada molécula (Figura 16a y 16b). Las bandas identificadas de ácidos nucleicos y proteínas migraron a la misma altura en ambos geles. Los resultados obtenidos muestran que la preparación de las proteínas puras de la proteína recombinante His-TEV-CP contiene complejos proteicos de alto peso molecular asociados a material genético del hospedero. La disociación del complejo ácido nucleico-proteína fue visualizado cuando las proteínas son desnaturalizadas usando SDS y calor. En este análisis se concluye que las VLPs de la TEV CP autoensambladas a partir de la proteína His-TEV-CP colocalizan con la presencia de ácidos nucleicos. En otros trabajos, se ha descrito como un evento típico la presencia de material genético del hospedero (ARNm de la CP, ARN 16S y ARN32S) en el interior de virus y VLPs recombinantes, como en el caso de las VLPs del virus M de la papa (PVM, del inglés potato virus M) (Kalnciema, E. y cols., 2015). Por otro lado, Wilson y Murphy patentaron una metodología para separar ARN mediante columnas de cromatografía empacadas con Ni⁺², lo cual arroja la posibilidad que las columnas usadas para purificar la proteína His-TEV-CP, además, permitan unir ARN del huésped (Wilson, R. y Murphy, J., 2004), el cual podría favorecer el proceso de formación de las partículas pseudovirales de la TEV CP. Sin embargo, es necesario realizar más estudios para establecer el papel de los ácidos nucleicos acarreados, empaquetados o asociados a las proteínas de la His-TEV-CP y su función en el proceso de autoensamblaje de las VLPs recombinantes.

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Figura 16. Análisis del contenido de ácidos nucleicos en las preparaciones puras de las partículas pseudovirales ensambladas a partir de la proteína de la cápside del virus del jaspeado tabaco, versión His-

TEV-CP. a) Análisis en gel de agarosa al 8% teñido con SYBR-Safe. b) Análisis en gel de agarosa al 8%

teñido con Azul de Coomasie.