Ensamblaje de la proteína de la cápside de seis histidinas del virus de la moteada del tabaco en partículas pseudovirales con actividad proteica adyuvante. 49 - Figura 11. Perfil proteico en una preparación pura de partículas pseudovirales de la proteína de la cápside del virus del moteado del tabaco, versión His-TEV CP. a) Análisis SDS-PAGE.
INTRODUCCIÓN
Los principales hallazgos confirman la expresión en forma soluble de las proteínas CP de VTE. Los resultados indican el uso potencial de las VLP de TEV CP para el desarrollo de adyuvantes para vacunas de subunidades que utilizan antígenos recombinantes.
ANTECEDENTES
Las partículas virales como andamios para el desarrollo de nanoestructuras
Plataformas tecnológicas basadas en nanopartículas derivadas de virus
El rango de tamaño de las partículas virales (20 a 500 nm) sugiere que son absorbidas eficientemente por células presentadoras de antígenos (APC) profesionales, como las células dendríticas y los fagocitos, lo que a su vez promueve la presentación activa a las células. T (Jennings G T. y Bachmann M F. 2008). Las partículas virales se pueden producir en una variedad de sistemas de expresión heterólogos, incluidas plantas, células de mamíferos, células de insectos, levaduras y bacterias (Griffin, J F T. 2002, Palucha, A., et al. 2005).
Ingeniería de andamios moleculares basados en virus
Los virus de plantas como plataformas para el desarrollo de vacunas y
Actualmente, la mayoría de las vacunas inducen principalmente la formación de anticuerpos que neutralizan el patógeno objetivo, pero se sabe que la respuesta inmune celular también es necesaria para proteger contra enfermedades infecciosas. Actualmente, se han aprobado tres VLP para su uso en humanos, la vacuna contra.
Nanopartículas basadas en virus de plantas
Potvyvirus quiméricos: partículas tipo virus como acarreadores para vacunas
La formulación de proteínas de subunidades recombinantes generalmente requiere el uso de un adyuvante fuerte para provocar una respuesta inmune razonable contra el antígeno presentado. Estos PVLP tienen la capacidad de presentar péptidos antigénicos en forma multimérica en el contexto de una partícula (Jagadish, M.
La proteína de la cápside de los potyvirus
Jagadish y sus colaboradores desarrollaron por primera vez un sistema de expresión con propiedades de autopolimerización, utilizando la proteína de la envoltura de un potyvirus y un huésped de expresión como E. Incluso in vitro, estas partículas procesadas pueden disociarse en sus monómeros y reasociarse en pseudovirus. partículas, lo que indica que la región central CP es suficiente para el ensamblaje de VLP (Figura 4).
Expresión y producción de VLPs quiméricas de potyvirus
La formación de VLP tiene lugar en el interior de la célula, formando estructuras de hasta 2 µm. Además, reemplazar 62 de los 68 aminoácidos en el extremo N con un péptido completo genera una proteína de fusión de 52 kDa que se expresa abundantemente, pero no genera VLP dentro de la célula.
Purificación de VLPs quiméricas de potyvirus
La purificación de los monómeros mediante cromatografía de afinidad y su posterior concentración dan como resultado la formación de VLP que son más espesas que las obtenidas con la proteína nativa (Jagadish, M. N., et al. 1993). Reemplazar parte del extremo C-terminal con un péptido de 229 aa no permite la formación de VLP dentro de la célula, pero se pueden obtener VLP durante el proceso de extracción y aislamiento, posiblemente debido al bajo nivel de expresión o a la formación de partículas distribuidas en su interior. la célula, que se enriquecen durante el proceso de purificación.
Inmunogenicidad de VLPs quiméricas de potyvirus
La proteína quimérica del virus del síndrome respiratorio y reproductivo
Existen vacunas disponibles comercialmente, pero su efectividad varía dependiendo de la región geográfica donde se utilizan (Uribe-Flores, JA. et al. 2017). Existen en el mercado dos tipos de vacunas contra el PRRSV, que utilizan virus debilitados o virus inactivados, de cepas americanas y europeas. Aunque estas vacunas reducen los síntomas de la enfermedad y la viremia, no previenen la infección y la protección cruzada contra virus heterólogos es variable.
Por esta razón, muchos estudios se han dirigido al desarrollo de nuevas vacunas, que incluyen diferentes vectores para el desarrollo de vacunas de ADN, la evaluación de diferentes proteínas estructurales. Todas estas estrategias no han logrado desarrollar una vacuna eficaz contra el PRRSV, y este objetivo sigue siendo un desafío importante (Rogan, D. y Babuik, L A. 2005). Cada una de estas vacunas brinda protección en diferentes etapas de la vida productiva de los cerdos.
Sin embargo, como ya se mencionó, su efectividad es controvertida cuando se enfrentan a cepas heterólogas, además del riesgo latente de reversión de virulencia en este tipo de vacunas. En todo el mundo se han realizado grandes esfuerzos para encontrar una vacuna eficaz que prevenga la enfermedad PRRS, pero hasta ahora no han tenido éxito. Para el desarrollo de nuevas vacunas contra el virus PRRS, en particular, son necesarias vacunas basadas en epítopos que induzcan una respuesta de anticuerpos rápida y específica contra el virus, pero uno de los principales problemas asociados al uso de vacunas peptídicas es la baja inmunogenicidad que provocan. lo que a menudo requiere el uso de adyuvantes apropiados para lograr la respuesta inmune deseada, por ejemplo, las VLP que tienen un efecto adyuvante e inmunomodulador pueden permitir el manejo de infecciones virales en animales (Crisci, E., et al. 2013).
JUSTIFICACIÓN
HIPOTESIS
OBJETIVO
- Estrategia de clonación
- Ensayos de expresión y pruebas analíticas (SDS-PAGE, ELISA y WB)
- Estrategia de purificación mediante cromatografía de afinidad tipo IMAC,
- Estudios de microscopia electrónica de transmisión, ultracentrifugación en
- Diseño, expresión y purificación de la proteína quimérica del virus de PRRS
- Esquema de inmunización y sangrado en ratones
- Ensayos de ELISA
Para la generación de construcciones genéticas TEV CP, se modificó el gen tev cp de 789 nucleótidos (GenBank: . JX512813.1) para contener un codón que codifica glicina (Gly, G, codificado por el codón ggc), antes del primer codón del secuencia de codificación. Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción NcoI y XhoI se insertaron mediante PCR en los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos del gen, respectivamente. Se insertó un codón de parada (tga) antes del sitio de reconocimiento de la enzima XhoI.
Para confirmar la presencia de las proteínas TEV CP recombinantes, las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida inmovilizada en una membrana de nitrocelulosa (Amersham-GEHealthcare) utilizando el método de electrotransferencia estándar. La estimación de la concentración de la fracción soluble de las proteínas CP de TEV se realizó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando el kit de detección TEV DAS ELISA para TEV (Agdia). Las preparaciones de muestras se cuantificaron utilizando el método de Bradford y se ajustaron a una concentración final de 0,2 mg/ml.
La solución que contenía proteínas solubles de TEV CP parcialmente purificadas se adsorbió en rejillas de cobre recubiertas de carbono formvar y se tiñó 1:1 v/v con una solución de acetato de uranilo al 2% (p/v). Se realizó una exploración del espectro UV-Vis para evaluar la agregación a diferentes pH de la solución y el comportamiento de dispersión de luz y proteínas de preparaciones puras de la variante His-TEV-CP. Análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) para evaluar el patrón de dispersión de la luz en solución y la formación de agregados de proteínas de alto peso molecular (para moléculas preferiblemente con una estructura esférica) en preparaciones puras de PRRSchim.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Diseño y obtención de las construcciones de la TEV CP
- Evaluación y verificación de la expresión de la TEV CP
- Obtención de las proteínas puras de la TEV CP
- Obtención de las partículas pseudovirales de la TEV CP
- Caracterización de las partículas pseudovirales de la TEV CP
- Obtención de la proteína quimérica del virus de PRRS
- Evaluación del efecto adyuvante de las partículas pseudovirales de la TEV
Las fracciones de elución 2 y 3 contienen la mayor cantidad de proteína pura de la versión His-TEV-CP. Se confirmó la presencia de las bandas contaminantes observadas por la purificación, presumiblemente un producto de degradación y/o dimerización de la proteína His-TEV-CP (Figura 11a). Los resultados obtenidos confirman la adquisición de proteínas recombinantes de la versión His-TEV CP en forma pura.
Las preparaciones de la versión His-TEV CP son estables durante meses cuando se almacenan a 4 °C en el tampón de matriz. Los resultados obtenidos indican que los filamentos de las partículas pseudovirales de la versión His-TEV-CP tienen una longitud entre 21 y 1950 nm. La versión His-TEV-CP se utilizó para obtener partículas pseudovirales TEV CP puras que se autoensamblaron a partir de la proteína His-TEV-CP recombinante.
Junto con las micrografías obtenidas se confirma la obtención de partículas pseudovirales TEV CP, versión His-TEV-CP. Análisis de sedimentación de una preparación pura de partículas pseudovirales ensambladas a partir de la proteína de la cápside del virus de la mancha del tabaco, versión His-TEV-CP. Los resultados obtenidos indican que las VLP autoensambladas a partir de la proteína His-TEV-CP son estables en el rango de pH fisiológico.
En el grupo control, inmunizado con VLP His-TEV-CP (TEV VLPs25), se observó una respuesta inespecífica frente a PRRSVchim. Perfil de anticuerpos anti-His-TEV-CP generados por preparaciones de partículas pseudovirales de las proteínas de la cápside del virus del brogue del tabaco en un ensayo.
CONCLUSIÓN
In this study, we demonstrated that TEV CP lysines exposed on the surface of particles can be used for antigen conjugation through chemical conjugation. The observed increase in mass suggests binding of TEV CP to the reagent, because a molecule of Sulfo-NHS-SS-Biotin is attached. Under reducing conditions, the TEV CP signal was significantly reduced due to the partial cleavage of biotin by Sulfo-NHS-SS-Biotin.
Western blot revealed a band corresponding to ~31 kDa for each version of TEV CP (Fig. 1a), similar to that. As assessed by ELISA, His-TEV-CP was expressed at a higher level compared to the untagged version (Fig. 1a). Additionally, purified His-tagged TEV CP VLPs were analyzed for the presence of nucleic acids.
Conversely, PRRSVchim induced a low response of IgG2a and IgG2b isotypes, similar to the non-specific response to TEV CP VLPs. Furthermore, the assembly of His-tagged versions of TEV CP into VLPs was not addressed, in contrast to the results shown here. Based on PRRSVchim antibody response, it appears that TEV CP VLPs have a role in balancing both arms of the immune system, humoral and cellular response, against PRRSVchim.
To our knowledge, there is no report on the use of TEV CP-based particles, some of them longer than 1μm, to aid the immune response against a soluble antigen. The immune response of pigs immunized with these TEV CP VLPs/PRRSVchim formulations needs to be investigated.
