Conclusions

154

155

1. S’ha posat a punt un protocol d’expressió i purificació de Npu DnaE activa formant una única cadena polipeptídica (cis), per les subunitats IN i IC per separat (trans) formant un complex i de la subunitat IN aïllada.

2. L’estabilitat tèrmica de Npu DnaE activa formant una única cadena polieptídica, en forma de complex IN-IC i la subunitat IN aïllada, presenta un màxim a pHs lleugerament bàsics (al voltant de 8). La millor estabilitat es troba quan la inteïna es troba formant una única cadena polipeptídica. Per altra banda, la menor estabilitat tèrmica s’observa per la subunitat I_N aïllada. La correlació entre estabilitat i pH té també un sentit funcional: els valors de pH lleugerament bàsics afavoririen que les Cys 1 i +1 catalítiques es trobessin parcialment ionitzades i actuessin com a nucleòfils, afavorint així l’activitat de la inteïna.

3. El replegament de la inteïna es veu condicionat per com es troben associades les seves subunitats. Quan formen una única cadena polipeptídica s’observa un millor percentatge de replegament que no pas quan es troben associades formant un complex. El replegament de la subunitat IN aïllada és nul. Aquestes observacions estarien d’acord amb un procés cooperatiu en el plegament d’ambdues subunitats de la inteïna per assolir l’estat natiu.

4. La mutació C+1S disminueix de manera molt significativa l’activitat de la inteïna a temperatures baixes tant quan es troba en cis com en trans. L’activitat en aquests mutants es recupera al incrementar la temperatura i millora considerablement a partir dels 40ºC. En el cas del mutant C+1S en trans, malgrat presentar un t_1/2 inferior al que s’observa en el cas de la inteïna salvatge, la formació del producte de tall i unió format a les 24h és el mateix a 50 i 60ºC.

5. El mutant C1S i el doble mutant C1S-C+1S disminueixen de manera molt significativa l’activitat de la inteïna en trans a temperatures baixes. Aquesta activitat no millora malgrat s’incrementi la temperatura. Aquests resultats indiquen que la C1 és més crítica que no pas la C+1 en el mecanisme del procés de tall i unió d’aquesta inteïna. La mutació C+1S podria ser utilitzada en aplicacions basades en el tall i unió condicionat per temperatura, sempre i quan l’exteïna presentés una bona estabilitat tèrmica i amb l’avantatge d’eliminar una Cys en l’exteïna C i per tant en el producte final del tall i unió.

6. Els resultats del dicroisme circular han mostrat que el plegament global de la inteïna està relacionat amb la longitud de la IC unida a la IN. S’ha observat que la subunitat IN presenta un nivell molt baix d’estructura secundària i que aquesta va augmentant a mesura que s’incrementa la longitud de subunitat I_C. El dicroisme circular ha permès comprovar també

156

que les variants I_NI_C_sc114, I_NI_C_sc123 i I_NI_C_sc131 presenten una estructura secundària principalment formada per cadenes β, fet que concorda amb el plegament de la inteïna completa Npu DnaE.

7. Els espectres monodimensionals de ¹H han permès fer una primera observació del grau d’estructuració de cada una de les variants. En els espectres obtinguts s’ha observat com la subunitat IN i la variant INIC_sc114 presenten una estructura de glòbul fos i que, s’adopta una estructura més estable i ordenada en les variants INIC_sc123 i INIC_sc131.

8. A partir de l’assignació de NOE’s dels espectres bidimensionals NOESY i el càlcul dels desplaçaments químics del protons s’ha observat que la majoria de residus de les variants INIC_sc123 i INIC_sc131 es troben en elements d’estructura secundària seguint un patró molt similar al que presenten els residus en la inteïna completa.

9. La visualització, de tots els NOE’s de mitja i llarga distància assignats, en models tridimensionals ha estat essencial per veure quines regions d’aquestes variants eren les més desestructurades i diferents respecte la inteïna completa. Concretament les regions més desestructurades han estat les que es trobaven més pròximes a la regió de la part de la subunitat IC absent a cada una de les variants.

10. Els NOE’s NH-NH i NH-HA han permès determinar l’orientació de les cadenes β de cada una de les variants i observar que l’orientació de les cadenes β de cada una de les variants es conserva respecte a la inteïna completa. A més, s’ha pogut veure de manera molt clara, a cada una de les variants, com es forma la cadena β11 formada per residus de la subunitat IC. Aquesta observació ha permès concloure que els residus que constitueixen β11 es pleguen de manera independent a la resta de residus de la subunitat IC.

11. El grau d’estructura observat a INIC_sc123 i INIC_sc131 és pràcticament el mateix. Els residus que té de més I_NI_C_sc131 són els que constitueixen β13 i aquests estableixen de manera significativa moltes interaccions amb els residus que constitueixen β14 absents en aquesta variant. Per aquest motiu, els residus de β13 no han pogut formar les interaccions necessàries i es troben desordenats en INIC_sc131.

12. Com a conclusió global a aquest treball, s’ha obtingut un millor coneixement de la inteïna Npu DnaE, s’ha comprovat que és una inteïna robusta, que presenta una bona termoestabilitat a pHs lleugerament bàsics i que les mutacions C+1S i C1S disminueixen de manera significativa la seva activitat Aquesta disminució però, és reversible mitjançant temperatura en el cas del mutant senzill C+1S. Per altra banda, s’ha pogut corroborar la

157

sinèrgia en el plegament que presenten les subunitats I_N i I_C i com els primers residus de la subunitat IC contribueixen de forma crítica en el plegament global de Npu DnaE.

158

159