7.2 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y
7.2.1 Crecimiento
En la figura 13, se presenta las curvas de crecimiento con base en el peso seco para cada una de las cepas según el diseño factorial planteado (tabla 7) donde se obtuvieron diferentes resultados. En todas las cepas se obtuvo que el tratamiento 7, que corresponde a las condiciones de 35o C y 200 rpm, resulto ser el más adecuado para el crecimiento, debido a que se obtuvo el mayor peso seco en comparación al resto de los tratamientos. La cepa LR4 (figura 13b) presentó el mejor crecimiento donde a las 24 h obtuvo un peso seco de 9.28 ±
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
62 0.44 g/L, seguido de la cepa LR2 (figura 13a) donde al mismo tiempo se logró un peso seco de 7.58 ± 0.62 g/L.
a) Candida glabrata (LR2)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Peso seco (g/L)
0 2 4 6 8 10
b) Candida tropicalis (LR4)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Peso seco (g/L)
0 2 4 6 8 10
c) Candida glabrata (LR5)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Peso seco (g/L)
0 2 4 6 8 10
d) Candida glabrata (T1)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Peso seco (g/L)
0 2 4 6 8 10
Figura 13. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Tratamiento 1 (35o C, 0 rpm, círculo rojo), Tratamiento 2 (40o C y 0 rpm, círculo naranja), Tratamiento 3 (45º C y 0 rpm, triangulo invertido verde claro), Tratamiento 4 (35oC y 100 rpm, triángulo verde oscuro), Tratamiento 5 (40o C y
100 rpm, cuadrado azul turquesa), Tratamiento 6 (45o C y 100 rpm, azul marino), Tratamiento 7 (35o C y 200 rpm, rombo morado), Tratamiento 8 (40o C y 200 rpm, rombo rojo), Tratamiento 9 (45o C y 200 rpm, triángulo
naranja).
Para la cepa LR5 (figura 13c) y T1 (figura 13d), se obtuvo que los tratamientos 7 (35o C y 200 rpm) y 5 (40o C y 100 rpm) podrían ser los más adecuados para tener un buen crecimiento de estos microorganismos, para la cepa LR5 a las 24 h se obtuvo un peso seco de 6.32 ± 0.62 g/L en el tratamiento 7 y de 7.16 ± 0.56 g/L en el tratamiento 5, para la cepa T1 a las 24 h, se obtuvo un peso seco de 6.94 ± 0.32 g/L en el tratamiento 7 y 5.92 ± 0.01 g/L en el tratamiento
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
63 5. En el resto de los tratamiento el crecimiento vario dependiendo de las condiciones empleadas, se observa en la mayoría una fase exponencial constante durante las 24 h de fermentación esto podría indicar que los microorganismos están consumiendo otros sustratos como fuente de carbono debido a que el medio donde se crecieron (YPD) es rico en proteínas y otras estructuras carbonadas y la glucosa ya se había agotado o se encontraba en baja concentración. Los resultados menos favorables en general se presentaron con el tratamiento 9 (45o C y 200) las condiciones más altas del diseño factorial, ya que para las cepas LR2, LR4 y LR5 no presentaron crecimiento, aunque la cepa T1 tuvo un ligero crecimiento. La cepa LR4 también no pudo crecer con las condiciones del tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) por lo que una nula agitación o un exceso de agitación combinado con una alta temperatura desfavorecería su crecimiento y por consecuencia la producción del metabolito de interés.
Los resultados cinéticos promedio de crecimiento se presentan en la tabla 12 donde se especifican los datos obtenidos en cada tratamiento probado de las cuatro cepas utilizadas, los datos corresponden al tiempo en que se obtuvo la mayor producción de alcohol. Se puede asumir que el tratamiento 7 (35o C y 200 rpm) es el más adecuado para lograr un mayor población, peso seco y Yx/s para las cuatro cepas. Entre los microorganismos utilizados la cepa LR2 obtuvo la población más alta de 439 ± 2.83 x 106 cel/mL y la cepa LR4 fue la que más creció con base en el peso seco 4.72 ± 0.17 g/L. Salmon y col., (1998) y Fromanger y col., (2010) comentan que cierta cantidad de oxígeno es necesaria para que el microorganismo genere ácidos grasos, indispensables para la membrana celular. También una fermentación aeróbica estimularía el crecimiento e incrementaría la viabilidad celular, condiciones reportadas por Valero y col., (2001).
Las µmáx (h-1) más altas y los tiempos de duplicación (h) más bajos se alcanzaron para las cepas LR2 y LR4 en el tratamiento 4 (35o C y 100 rpm) con 0.60 ± 0.00 y 0.69 ± 0.03, respectivamente, y en el tratamiento 5 (40o C y 100 rpm) para las cepas LR5 y T1 con 0.62±0.02 y 0.71±0.03, respectivamente, donde entre las cuatro cepas la T1 tuvo el valor más alto de µmáx. El mayor Yx/s se obtuvo en el tratamiento 7 para la cepa LR4 con 0.25 ± 0.01.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
64
Tabla 12. Parámetros cinéticos para el crecimiento de las diferentes cepas según el diseño 32. Trat T
(oC)
Agitación
(RPM) CEPAS Pob. Máx.
(x106 cel/mL)
Peso seco
(g/L) µmáx (h-1) Td (h) Yx/s
1 35 0
LR2 179±11.31 1.87±0.04 0.34±0.02 2.10±0.07 0.10±0.00 LR4 53±13.43 1.70±0.09 0.34±0.06 2.04±0.38 0.09±0.00 LR5 198±2.12 1.75±0.18 0.55±0.22 1.26±0.45 0.09±0.01 T1 186±7.78 1.72±0.07 0.41±0.10 1.77±0.46 0.09±0.01
2 40 0
LR2 129±7.77 1.73±0.18 0.27±0.00 2.53±0.00 0.09±0.01 LR4 31±1.41 1.70±0.35 0.41±0.32 1.70±1.32 0.09±0.01 LR5 95±0.70 1.38±0.01 0.40±0.18 1.54±0.55 0.07±0.00 T1 164±0.70 1.55±0.09 0.36±0.07 1.93±0.37 0.08±0.00
3 45 0
LR2 227±6.36 1.53±0.14 0.26±0.01 2.63±0.03 0.08±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.01
LR5 92±5.65 1.48±0.00 0.46±0.03 1.52±0.11 0.08±0.00 T1 75±4.94 1.40±0.03 0.42±0.05 1.68±0.18 0.09±0.01
4 35 100
LR2 293±5.65 2.80±0.00 0.60±0.00 1.15±0.01 0.15±0.00 LR4 130±1.21 2.99±0.05 0.69±0.03 1.00±0.04 0.16±0.01 LR5 227±20.50 2.46±0.07 0.55±0..05 1.28±0.11 0.13±0.00 T1 453±0.70 3.14±0.17 0.41±0.04 1.72±0.18 0.17±0.01
5 40 100
LR2 248±6.36 2.83±0.07 0.38±0.89 1.81±0.86 0.15±0.00 LR4 95±19.09 2.14±0.38 0.41±0.11 1.70±0.48 0.11±0.02 LR5 199±14.14 1.97±0.06 0.62±0.02 1.13±0.04 0.12±0.00 T1 262±3.53 2.92±0.10 0.71±0.03 0.98±0.04 0.17±0.01
6 45 100
LR2 272±14.14 2.70±0.94 0.58±0.07 1.20±0.15 0.14±0.05 LR4 105±3.53 3.30±0.04 0.55±0.12 1.25±0.26 0.18±0.01 LR5 236±14.14 3.02±0.03 0.56±0.07 1.35±0.02 0.16±0.00 T1 227±12.72 2.79±0.01 0.52±0.15 1.41±0.43 0.15±0.01
7 35 200
LR2 439±2.83 4.22±0.31 0.57±0.04 1.22±0.09 0.22±0.01 LR4 219±13.43 4.72±0.17 0.55±0.05 1.26±0.01 0.25±0.01 LR5 327±34.65 3.84±0.29 0.43±0.01 1.61±0.03 0.20±0.01 T1 388±24.75 3.29±0.33 0.45±0.04 1.55±0.15 0.17±0.01
8 40 200
LR2 124±4.24 3.90±0.20 0.45±0.07 1.55±0.22 0.20±0.01 LR4 142±31.81 3.12±0.77 0.43±0.25 1.63±0.056 0.17±0.01 LR5 170±2.82 1.84±0.52 0.43±0.01 1.60±0.01 0.14±0.04 T1 205±9.89 2.26±0.05 0.51±0.02 1.35±0.08 0.13±0.04
9 45 200
LR2 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 LR4 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 LR5 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 T1 16±0.00 0.15±0.06 0.29±0.14 2.71±1.33 0.04±0.01 LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata.
Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto (figura 14) y de interacción para cada una de las cepas probadas. En la figura 14a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR2 se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. Para la respuesta de Yx/s (figura 14c), se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la temperatura y para la respuesta de µmáx (figura 14b)no se observa efecto por los factores.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
65 Con el gráfico de interacción (figura 14d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención del mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una agitación de 200 rpm.
Figura 14. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa LR2 en medio YPD
En la figura 15a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR4 se observa que el factor de temperatura, agitación y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. La temperatura es el principal factor que tiene la mayor influencia en la respuesta de peso seco.
Para la respuesta de Yx/s (figura 15c), se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µmáx (figura 15b)se obtuvo un efecto significativo por temperatura. Con el gráfico de interacción (figura 15d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención del mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 45o C y una agitación de 100 rpm, que el microorganismo logre crecer a altas temperaturas es de gran interés ya que en un proceso a mayor escala los reactores utilizados para el proceso de fermentación no necesitarían refrigeración por lo que beneficiaría en el costo del proceso para la producción de alcohol.
Gráfica de pareto para Peso seco (g/L)
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4
B:Agitación A:Temperatura AB
+ -
Gráfica de Pareto para µmáx
Efectos estandarizados
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4
B:Agitación A:Temperatura AB
+ -
Gráficas de Pareto para Yx/s
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4
B:Agitación AB A:Temperatura
+ -
Temperatura (oC)
Peso seco (g/L)
Gráfica de interacción
Agitación 0 100 200
0 1 2 3 4 5
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
66
Figura 15. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa LR4 en medio YPD
En la figura 16a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR5 se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. La interacción es el principal factor que tiene influencia en el peso seco. Para la respuesta de Yx/s (figura 16c), se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µmáx (figura 16b)se obtuvo un efecto significativo por temperatura y agitación, siendo la agitación la que dé mayor influencia sobre la variable.
Con el gráfico de interacción (figura 16d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención del mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 45o C y una agitación de 100 rpm, si se observa los resultados de la temperatura de 45o C para el crecimiento por peso seco se indica que cierta agitación es necesaria para el crecimiento de este microorganismos pero un exceso de este factor podría afectar las características en su desarrollo para la obtención de alcohol, por lo que es importante conocer las condiciones más adecuadas para una buena fermentación.
Gráfica de Pareto para Peso seco (g/L)
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4
AB B:Agitación A:Temperatura
+ -
Gráfica de Pareto para µmáx
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Efectos estandarizados B:Agitación
AB A:Temperatura
+ -
Efectos estandarizados Gráfica de Pareto para Yx/s
0 1 2 3 4 5
B:Agitación A:Temperatura AB
+ -
Gráfica de interacción
Temperatura (oC)
Peso seco (g/L)
Agitación 0 100 200
0 1 2 3 4 5
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
67
Figura 16. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa LR5 en medio YPD
En la figura 17a, para la respuesta de peso seco de la cepa T1 se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. Siendo la temperatura el principal factor que tiene influencia en el peso seco. Para la respuesta de Yx/s
(figura 17c), se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µmáx (figura 17b)no se obtuvo un efecto significativo por temperatura y agitación, así como tampoco de la interacción de estos factores.
Con el gráfico de interacción (figura 17d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención del mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 35o C y una agitación de 100 rpm, estos dos tratamientos podrían son los más adecuados para el crecimiento de la cepa T1 sin diferencia significativa.
Gráfica de Pareto para Peso seco (g/L)
0 1 2 3 4
Efectos estandarizados B:Agitación
A:Temperatura AB
+ -
Efectos estandarizados Gráfica de Pareto para µmáx
0 1 2 3 4
AB A:Temperatura B:Agitación
+ -
Efectos estandarizados Gráfica de Pareto para Yx/s
0 1 2 3 4
B:Agitación A:Temperatura AB
+ -
Gráfica de interacción
Temperatura (oC)
Peso seco (g/L)
Agitación 0 100 200
0 1 2 3 4
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
68
Figura 17. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa T1 en medio YPD